CN104918950A - 亲水性重组蛋白的部分精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中将亲水性重组蛋白部分精制的方法，其包含在上述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取工序；其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂。上述溶解液优选用水系溶剂进行溶剂替换。
Description
技术领域
本发明涉及亲水性重组蛋白的部分精制(partial purification)方法，详细而言，本发明涉及从表达亲水性指数(hydropathy index)为0以下的重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中将该亲水性重组蛋白部分精制的方法。
背景技术
蛛丝纤维已知是具有高强度和韧性的纤维，其比高强度钢、尼龙6(注册商标)纤维等具有更高的强度和韧性。由于这样的特性，蛛丝作为新型原料受到关注，利用基因重组技术进行了使作为蛛丝原料的蛛丝蛋白在大肠杆菌等宿主细胞中的表达、回收。例如专利文献1中公开了通过重组DNA技术制造络新妇蛛(Nephila clavipes)大吐丝管(major ampullate)拖丝蛋白、络新妇蛛小吐丝管(minor ampullate)拖丝蛋白等蜘蛛拖丝蛋白。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-98771号公报
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1中，在使细胞溶解而将细胞内存在的重组蜘蛛拖丝蛋白释放、回收时，通过用细胞残渣溶解而蜘蛛拖丝蛋白不溶解的溶剂进行重复处理来使蜘蛛拖丝蛋白沉淀。但是，在重组蜘蛛拖丝蛋白为水不溶性蛋白时是有效的，当重组蛋白为亲水性重组蛋白时，并不是有效的手段且期望工序的简便化。
本发明为了解决上述以往的问题，提供一种能够从表达亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中简便且高效地将亲水性重组蛋白部分精制的亲水性重组蛋白的部分精制方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中将亲水性重组蛋白部分精制的方法，其特征在于，其包含在上述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取工序，其中，上述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂。
本发明的亲水性重组蛋白的部分精制方法中，上述溶解用溶剂优选偶极矩为3.0D以上，更优选为选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮和N-甲基-2-吡咯烷酮中的一种以上非质子性极性溶剂。上述溶解用溶剂优选为在上述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。上述不溶物的分离可以通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。上述溶解用溶剂相对于上述宿主的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选添加0.5倍以上。优选将上述溶解液用水系溶剂进行溶剂替换。经溶剂替换的溶解液更优选进一步采用选自柱、过滤和离心分离中的一种以上方法处理。上述亲水性重组蛋白优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
发明效果
根据本发明，通过使用非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂，用溶解用溶剂使表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主溶解，将不溶物分离、回收溶解液，能够简便且高效地从宿主中将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白部分精制。
另外，根据本发明，通过使用在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂作为溶解用溶剂，能够以更高的精制率将亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白部分精制。
附图说明
图1为表示实施例1和比较例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的照片。
图2为表示实施例2～6中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的照片。
图3为表示比较例2中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的照片。
图4为表示实施例8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果的照片。
具体实施方式
本发明中，蛋白的亲水性指数(hydropathy index)是如下算出的数值。首先，求出蛋白中存在的氨基酸的亲水性指数的总和。接着，用该总和除以蛋白中的氨基酸残基数求出平均值，将算出的平均值作为蛋白的亲水性指数。其中，关于氨基酸的亲水性指数，使用公知的指标(Hydropathy index：Kyte，J.&Doolittle，R.F.(1982)A simple method for displaying thehydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157，105-132.)。具体而言，各氨基酸的亲水性指数(下文也记为HI)如下表1所示。
表1
| 氨基酸 | HI | 氨基酸 | HI |
| 丙氨酸(Ala) | 1.8 | 亮氨酸(Leu) | 3.8 |
| 精氨酸(Arg) | -4.5 | 赖氨酸(Lys) | -3.9 |
| 天冬酰胺(Asn) | -3.5 | 蛋氨酸(Met) | 1.9 |
| 天冬氨酸(Asp) | -3.5 | 苯丙氨酸(Phe) | 2.8 |
| 半胱氨酸(Cys) | 2.5 | 脯氨酸(Pro) | -1.6 |
| 谷氨酰胺(Gln) | -3.5 | 丝氨酸(Ser) | -0.8 |
| 谷氨酸(Glu) | -3.5 | 苏氨酸(Thr) | -0.7 |
| 甘氨酸(Gly) | -0.4 | 色氨酸(Trp) | -0.9 |
| 组氨酸(His) | -3.2 | 酪氨酸(Tyr) | -1.3 |
| 异亮氨酸(Ile) | 4.5 | 缬氨酸(Val) | 4.2 |
本发明者们发现在表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主中添加非质子性极性溶剂、使细胞溶解、将不溶物分离，能够将上述亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白通过上清液回收而得到部分精制，从而完成了本发明。即发现了，通过用非质子性极性溶剂使宿主细胞溶解，亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白溶解于非质子性极性溶剂，从而完成了本发明。下文中，在没有特别说明的情况下，亲水性蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性蛋白。另外，下文中，在没有特别说明的情况下，重组蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白。
上述非质子性极性溶剂没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选纯度为90％以上、更优选为95％以上。上述非质子性极性溶剂的偶极矩优选为3.0D以上。偶极矩被用作表示分子的极性强度的指标，偶极矩越大则极性强度也越大。通常，偶极矩为3.0D以上的分子的极性强，当溶解蛋白等具有极性的化合物时，极性大的溶剂是有效的。下表2中记载了基于讲谈社Scientific公司出版的溶剂手册(2007年)的各种有机化合物(有机溶剂)的偶极矩。作为偶极矩为3.0D以上的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙腈等。
表2
| 有机溶剂 | 偶极矩(D) | 有机溶剂 | 偶极矩(D) |
| DMSO | 4.3 | NMP | 4.09 |
| DMF | 3.86 | 乙腈 | 3.44 |
| DMA | 3.72 | 丙酮 | 2.69 |
| DMI | 4.05 | 异丙醇 | 1.68 |
当上述溶解用溶剂为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂时，没有特别限定，从提高重组蛋白的纯度(精制度)的观点出发，无机盐的浓度优选为0.1M以上、更优选为0.25M以上、进一步优选为0.5M以上。另外，上述溶解用溶剂中，无机盐的浓度的上限没有特别限定，优选为饱和状态以下，例如可以为2.5M以下。
上述溶解用溶剂的添加量只要是能够溶解上述宿主的量即可，没有特别限定，从提高溶解性的观点出发，相对于上述宿主(细胞)的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选为0.5倍以上、更优选为0.75倍以上、进一步优选为1倍以上。另外，从操作的简便性出发，上述溶解用溶剂的添加量相对于上述宿主的质量以体积(mL)/质量(g)比计优选为10倍以下、更优选为6倍以下、进一步优选为4倍以下。上述宿主(细胞)可以为干燥的状态、也可以为湿的状态。
将上述溶解用溶剂添加到宿主中、将宿主细胞溶解的工序没有特别限定，从重组蛋白的溶解性的观点出发，优选在20℃以上的条件下进行、更优选在45℃以上的条件下进行、进一步优选在50℃以上的条件下进行。另外，从抑制重组蛋白分解的观点出发，上述溶解物获取工序优选在100℃以下的条件下进行、更优选在95℃以下的条件下进行。另外，上述溶解物获取工序没有特别限定，例如优选进行10～300分钟、更优选进行30～180分钟。
本发明中，不溶物的分离只要能够将沉降物分离则没有特别限定。从操作的简便性出发，优选通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。利用过滤的分离可以使用例如滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特别限定。例如可以在室温(20±5℃)、8000×g～15000×g下进行5～20分钟。上述不溶物的分离可以进行2次以上。
上述重组蛋白只要是亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白即可，没有特别限定。从提高提取效率的观点出发，亲水性指数优选为－0.1以下、更优选为－0.3以下。
作为上述重组蛋白，没有特别限定，例如优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原等中的一种蛋白。
上述重组蛛丝蛋白只要是天然型蛛丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白即可，没有特别限定。包括例如天然型蛛丝蛋白的变异体、类似物或衍生物等。上述重组蛛丝蛋白从韧性优异的观点出发，优选为由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述大吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛(Nephila clavipes)来源的大壶状腺丝蛋白(spidroin)MaSp1、MaSp2、十字园蛛(Araneus diadematus)来源的ADF3、ADF4等。另外，上述重组蛛丝蛋白也可以是从蜘蛛的小壶状腺产生的小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述小吐丝管拖丝蛋白，可列举出络新妇蛛来源的小壶状腺丝蛋白MiSp1、MiSp2。另外，上述重组蛛丝蛋白还可以是由蜘蛛的鞭状腺(flagelliform gland)产生的横丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白。作为上述横丝蛋白，可列举出例如络新妇蛛来源的鞭毛状丝蛋白(flagelliform silk protein)等。
作为上述大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出含有2个以上、优选4个以上、更优选6个以上的由式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽。其中，在上述大吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白中，式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式1中，REP1表示聚丙氨酸。上述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为2个残基以上、更优选为3个残基以上、进一步优选为4个残基以上、特别优选为5个残基以上。另外，上述REP1中，连续排列的丙氨酸还优选为20个残基以下、更优选为16个残基以下、进一步优选为14个残基以下、特别优选为12个残基以下。上述式1中，REP2为由10～200个残基的氨基酸构成的氨基酸序列，上述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及丙氨酸的总残基数相对于总氨基酸残基数为40％以上、优选为50％以上、更优选为60％以上。
大吐丝管拖丝中，上述REP1相当于纤维内形成晶体β折叠的晶体区域，上述REP2相当于纤维内更具有柔软性且大部分缺乏整齐排列结构的无定型区域。并且，上述[REP1-REP2]相当于由晶体区域和无定型区域构成的重复区域(反复序列)，其为拖丝蛋白的特征性序列。
作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号1所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。序列号1所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第136个残基。作为编码具有序列号1所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白的基因，可以使用由序列号4所示的碱基序列构成的基因。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号1所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。其中，具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽(ADF3Kai-small-M)的HI为－0.948。
本发明中，“1个或多个”是指例如1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或者1个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个。
另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛋白。序列号2所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第542个残基。作为编码具有序列号2所示的氨基酸序列的ADF3来源的重组蛛丝蛋白的基因，可以使用由序列号5所示的碱基序列构成的基因。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。其中，具有序列号2所示的氨基酸序列的多肽(ADF3Kai-NN)的HI为－0.92。
另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4来源的重组蛛丝蛋白。序列号6所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的ADF4的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47011、GI：1263289)的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列的第1个残基～第318个残基。作为编码具有序列号6所示的氨基酸序列的ADF4来源的重组蛛丝蛋白的基因，可以使用由序列号7所示的碱基序列构成的基因。另外，作为包含2个以上上述式1：REP1-REP2所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号6所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由晶体区域和无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。其中，具有序列号6所示的氨基酸序列的多肽(ADF4Kai-W)的HI为－0.357。
作为上述小吐丝管拖丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式2：(Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala)l(Ala)o所示的氨基酸序列的多肽。
上述式2中，Z是指任意一种氨基酸，特别优选为选自Ala、Tyr和Gln中的一种氨基酸。另外，m优选为1～4范围的整数、l优选为0～4范围的整数、o优选为1～6范围的整数。
蛛丝中，小吐丝管拖丝从蜘蛛网的中心以螺旋状卷绕，其被用作网的补强材料或者用作包裹所捕捉的猎物的丝。已知与大吐丝管拖丝相比，拉伸强度差但伸缩性高。这考虑是由于在小吐丝管拖丝中，大量的晶体区域由甘氨酸与丙氨酸交替连接的区域形成，与仅由丙氨酸形成晶体区域的大吐丝管拖丝相比，晶体区域的氢键更易于变弱的原因。
作为上述横糸蛋白来源的重组蛛丝蛋白，可列举出包含式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽。Gly-Pro-Gly-Gly-X所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式3中，X是指任意一种氨基酸，特别优选为选自Ala、Ser、Tyr和Val中的一种氨基酸。另外，n为4以上的整数、优选为10以上的整数、更优选为20以上的整数。
作为包含上述式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽，可列举出例如具有序列号8所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来源的重组蛋白。序列号8所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的络新妇蛛的鞭毛状丝蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：AAF36090、GI：7106224)的相当于重复部分及基序的第1220个残基～第1659个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)而成的氨基酸序列。作为编码具有序列号8所示的氨基酸序列的鞭毛状丝蛋白来源的重组蛛丝蛋白的基因，可以使用由序列号9所示的碱基序列构成的基因。另外，作为包含上述式3：(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n所示的氨基酸序列的多肽，可以使用由在序列号8所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成、具有由无定型区域构成的重复区域且HI为0以下的多肽。其中，具有序列号8所示的氨基酸序列的多肽(Flag92-short2-UU)的HI为－0.482。
蛛丝中，横丝的一大特征是不具有晶体区域而具有由无定形区域构成的重复区域。大吐丝管拖丝等中，由于具有由晶体区域和无定形区域构成的重复区域，因此推测同时具有高的应力和伸缩性。另一方面，横丝虽然比大吐丝管拖丝的应力差，但具有高的伸缩性。这考虑是由于横丝的大部分由无定形区域构成的原因。
上述重组蛛丝蛋白优选为十字园蛛(Araneus diadematus)的两个主要拖丝蛋白之一的ADF3来源的重组蛛丝蛋白。关于ADF3来源的重组蛛丝蛋白，作为其优点，还可列举出强伸度和韧性基本上高、易于合成。
作为重组节肢弹性蛋白，可以使用例如天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋白。作为天然节肢弹性蛋白来源的重组节肢弹性蛋白，优选包含多个式4：REP3所示的氨基酸序列单元、优选为4个以上、更优选为10个以上、进一步优选为20个以上的多肽。式4中，REP3所示的氨基酸序列单元可以相同也可以不同。
上述式4中，REP3是指由(Ser-J-J-Tyr-Gly-U-Pro)构成的氨基酸序列，J是指任意一种氨基酸，特别优选选自Asp、Ser和Thr中的一种氨基酸。另外，U是指任意一种氨基酸，特别优选选自Pro、Ala、Thr和Ser中的一种氨基酸。
作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白等。序列号10所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：从NCBI的web数据库获得果蝇的节肢弹性蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：Q9V7U0.1、GI：75026432)，在该序列中相当于重复序列和基序的第19个残基～第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列。具有序列号10所示的氨基酸序列的重组节肢弹性蛋白的HI为－1.229。另外，作为包含多个上述式4：REP3所示的氨基酸序列单元的多肽，可以使用由在序列号10所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成且HI为0以下的多肽。
节肢弹性蛋白是存在于昆虫角质层的特定区域的橡胶样蛋白，是优异的弹性材料。该物质的弹力(elasticity)据测为97％，贮藏能量中仅3％以热的形式损失。该弹力考虑是由节肢弹性蛋白中的酪氨酸相互间交联所产生的。二酪氨酸交联而成的节肢弹性蛋白赋予角质层以优异的弹性，在昆虫的飞行系统、跳跃系统中发挥重要的作用。
作为重组胶原，可以使用例如天然胶原来源的重组胶原。作为天然胶原来源的重组胶原，可列举出连续包含5个以上、优选8个以上、更优选10个以上式5：REP4所示的氨基酸序列单元的多肽。上述式5中，REP4是指由Gly-X-Y构成的氨基酸序列，X和Y是指除Gly以外的任意一种氨基酸。上述式5中，REP4所示的氨基酸序列可以相同也可以不同。
作为连续含有10个以上上述式5：REP4所示的氨基酸序列单元的多肽，可列举出例如具有序列号13所示的氨基酸序列的重组胶原。序列号13所示的氨基酸序列为下述氨基酸序列：在从NCBI数据库获得的人的4型胶原的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：CAA56335.1、GI：3702452)的相当于重复部分和基序的第301个残基～第540个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签和Ser-Ser-Gly-Ser-Ser构成的氨基酸序列(序列号15)而成的氨基酸序列。具有序列号13所示的氨基酸序列的重组胶原的HI为－0.792。另外，作为连续含有10个以上上述式5：REP4所示的氨基酸序列单元的多肽，还可以使用由在序列号13所示的氨基酸序列中1或多个氨基酸被替换、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列构成的多肽。
胶原是构成真皮、韧带、肌腱、骨、软骨等的蛋白之一，是多细胞动物的细胞外基质的主成分。人的胶原据报告有30种以上，但在任意胶原中，均具有被称为胶原样序列的REP4所示的氨基酸序列的重复序列，这可列举为其序列特征。
上述重组蛋白可使用采用含有编码重组蛋白的基因的表达载体进行了转化的宿主来制造。基因的制造方法没有特别限制，从基因来源的细胞将编码重组蛋白的基因通过聚合酶链反应(PCR)等进行扩增、克隆或进行化学合成。基因的化学合成方法也没有特别限制，例如可以以重组蛋白的氨基酸序列信息为基础，用AKTA oligopilot plus 10/100(GEHealthcare Japan株式会社制)等将自动合成的寡核苷酸通过PCR等连接来合成。此时，容易进行蛋白的精制和确认，因此可以合成编码由在上述对象蛋白的氨基酸序列的N末端添加由His标签构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白的基因。
作为上述表达载体，可以使用能够从DNA序列表达蛋白的质粒、噬菌体、病毒等。作为上述质粒型表达载体，只要在宿主细胞内能够表达目标基因且自身能够进行扩增即可，没有特殊限定。例如作为宿主使用大肠杆菌Rosetta(DE3)时，可以使用pET22b(+)质粒载体、pCold质粒载体等。其中，从蛋白生产率的观点出发，优选使用pET22b(+)质粒载体。作为上述宿主(细胞)，可以使用蛋白表达体系中使用的动物细胞、植物细胞、微生物等，从生产成本的观点出发，优选使用微生物，从安全性和操作性的观点出发，更优选使用大肠杆菌。
当将大肠杆菌等微生物作为宿主进行重组蛋白生产时，从生产率的观点出发，上述重组蛋白的分子量优选为500kDa以下、更优选为300kDa以下、进一步优选为200kDa以下。
通过对含有上述重组蛋白的溶解液进行溶剂替换可以进行进一步精制。溶剂替换可以通过透析来进行。透析用的溶剂(透析液)可以使用含有水的水系溶剂。作为水系溶剂，可列举出例如水、水与水混和性有机溶剂的混合液、水溶性缓冲液、酸性水溶液、碱性水溶液等。作为水，可以使用例如纯水、蒸馏水、超纯水等。作为酸性水溶液，可列举出甲酸、乙酸、稀盐酸等酸性水溶液，作为碱性水溶液，可列举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液等碱性水溶液。作为水混和性有机溶剂，只要是能够与水混合的有机溶剂即可，可以使用公知的有机溶剂。具体而言，可列举出甲醇、乙醇等醇类。
当将含有上述重组蛋白的溶解液用水系溶剂进行溶剂替换时，上述非质子性极性溶剂优选为不具有环状结构的非质子性极性溶剂。当使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂、并将含有重组蛋白的溶解液用水系溶剂进行溶剂替换时，能够以更高的纯度提取重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等重组蛋白。作为不具有环状结构的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二甲基乙酰胺(DMA)等。
另外，经溶剂替换的溶解液还可以进一步通过选自柱、过滤、离心分离等中的一种以上方法处理。柱可以使用凝胶过滤柱或离子交换柱等，过滤可以使用滤纸或过滤膜等。通过上述处理，目标蛋白(亲水性重组蛋白)的精制度(纯度)进一步提高。
实施例
以下，用实施例对本发明进一步具体地进行说明。需要说明的是，本发明并不限于下述实施例。
(大肠杆菌中的重组蛋白的表达)
<基因合成>
(1)ADF3Kai-small-M的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得作为十字园蛛的两种主要的拖丝蛋白之一的ADF3的部分氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010、GI：1263287)，在该序列的N末端添加由起始密码子、His10标签和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号3)，由该序列的第1个残基～第136个残基的氨基酸(序列号1)构成的多肽。其结果，获得了导入了由序列号4所示的碱基序列构成的ADF3Kai-small-M基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用NdeI和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了ADF3Kai-small-M基因的pET22b(+)载体。
(2)Drosophila-Resilin-Kai的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得果蝇的节肢弹性蛋白的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：Q9V7U0.1、GI：75026432)，由在该序列中相当于重复部分和基序的第19个残基～第321个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子和His6标签构成的氨基酸序列(序列号12)而成的氨基酸序列(序列号10)构成的多肽。其结果，获得了导入有由序列号11所示的碱基序列构成的Drosophila-Resilin-Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Drosophila-Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体。
(3)Collagen-type4-Kai的基因的合成
合成编码下述多肽的基因：从NCBI的web数据库获得人的4型胶原的部分序列(NCBI的Genebank的登录号：CAA56335.1、GI：3702452)，由在该序列中相当于重复部分和基序的第301个残基～第540个残基的氨基酸序列的N末端添加由起始密码子、His6标签和Ser-Ser-Gly-Ser-Ser构成的氨基酸序列(序列号15)而成的氨基酸序列(序列号13)构成的多肽。其结果，获得了导入有由序列号14所示的碱基序列构成的Collagen-type4-Kai基因的pUC57载体(基因在5’末端紧接的上游具有Nde I位点、和在5’末端紧接的下游具有Xba I位点)。其后，用Nde I和EcoR I对该基因进行限制酶处理，然后重组到pET22b(+)表达载体中，得到导入了Collagen-type4-Kai基因的pET22b(+)载体。
<蛋白的表达>
将导入有ADF3Kai-small-M基因的pET22b(+)表达载体、导入有Drosophila-Resilin-Kai基因的pET22b(+)载体、导入有Collagen-type4-Kai基因的pET22b(+)载体分别转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将得到的单菌落在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加到含有氨苄青霉素的140mL的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下进行培养，直至培养液的OD600达到3.5。接着，将OD600为3.5的培养液与50％葡萄糖140mL一起加入到含有氨苄青霉素的7L的2×YT培养基中进一步进行培养，直至OD600达到4.0。其后，向得到的OD600为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使终浓度达到0.5mM，诱导蛋白表达。在IPTG添加后经过2小时的时刻，将培养液离心分离，回收菌体(湿菌体)。使用由IPTG添加前和IPTG添加后的培养液中的菌体制备的蛋白溶液，按照通常的操作规程用SDS-PAGE确认了依赖于IPTG添加的目标蛋白(ADF3Kai-small-M为约12.5kDa、Drosophila-Resilin-Kai为约28.5kDa、Collagen-type4-Kai为约24.5kDa)的表达。ADF3Kai-small-M蛋白的亲水性指数为－0.948、Drosophila-Resilin-Kai的亲水性指数为－1.229、Collagen-type4-Kai的亲水性指数为－0.792。将表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌、表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌、表达Collagen-type4-Kai蛋白的大肠杆菌保存在冰箱(－20℃)中。
(实施例1)
(蛋白的精制)
(1)在表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约15g中添加45ml含有1M的LiCl的DMSO，在60℃下使其溶解30分钟。之后，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离10分钟，回收上清液(溶解液)。
(2)通过对回收的溶解液进行透析，进行DMSO与水的溶剂替换。每隔6小时交换透析液(水)，总共进行48小时透析。将透析后的溶解液用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离10分钟，回收上清液(溶剂替换后的溶解液)。
(3)在溶剂替换后的溶解液40ml中加入50体积％的Ni树脂(与His结合)的浆料2ml，在室温下振荡1小时。接着，将Ni树脂回收，用洗脱缓冲液(50mM Tris、50mM NaCl)10ml洗涤5次，然后用300mM的咪唑使目标蛋白(ADF3Kai-small-M)洗脱，回收洗脱液。
(比较例1)
在表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0.2g中加入纯水500μl，超声破碎、得到超声破碎液。
使用实施例1中得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液和柱洗脱液、以及比较例1中得到的超声破碎液进行SDS-PAGE。具体而言，向各样品30μL中加入2xSDS缓冲液(4w/v％SDS、20w/v％甘油、10w/v％2-巯基乙醇、0.004w/v％溴酚蓝、0.125M Tris、pH为6.8)30μL，在95℃下热处理10分钟，使用在室温下冷却了的经热变性的蛋白溶液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确认条带。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其结果示于图1。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白(重组蛋白)的纯度。将其结果示于下表3。
表3
| 样品 | 纯度(％) | |
| 比较例1 | 超声破碎液 | 19.6 |
| 实施例1 | 溶解液 | 32.4 |
| 实施例1 | 溶剂置换后的溶解液 | 76.1 |
| 实施例1 | 柱洗脱液 | 84.2 |
图1示出了使用了实施例1中得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液和柱洗脱液、以及比较例1中得到的超声破碎液的SDS-PAGE的结果。图1中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1表示比较例1中得到的超声破碎液中所含的蛋白、Lane 2、3、4分别表示实施例1中得到的溶解液、溶剂替换后的溶解液、柱洗脱液中所含的蛋白。图1中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12.5kDa)对应的蛋白的条带。如从图1和表3的结果所确认的，用含有1M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解而得到的溶解液中的ADF3Kai-small-M的纯度比将大肠杆菌超声破碎而得到的超声破碎液中的ADF3Kai-small-M的纯度高，通过用非质子性极性溶剂将大肠杆菌溶解、将不溶物分离，目标蛋白(ADF3Kai-small-M)得到部分精制。另外，通过将溶解液用水进行溶剂替换，目标蛋白(ADF3Kai-small-M)的纯度提高。另外，通过将溶剂替换后的溶解液用柱进行处理，目标蛋白(ADF3Kai-small-M)的纯度进一步提高。
(实施例2)
在表达ADF3Kai-small-M蛋白的大肠杆菌的湿菌体约15g中添加45ml含有1M的LiCl的DMSO，在60℃下使其溶解30分钟。之后，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离10分钟，将上清液(溶解液)回收。
(实施例3)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的DMF，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液(溶解液)。
(实施例4)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的DMA，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液(溶解液)。
(实施例5)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的NMP，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液(溶解液)。
(实施例6)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的DMI，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液(溶解液)。
(比较例2)
代替含有1M的LiCl的DMSO，使用含有1M的LiCl的异丙醇(异丙醇的纯度：90％)，除此以外，与实施例2同样地操作，回收上清液(溶解液)。
使用实施例2～6、比较例2中得到的上清液(溶解液)，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent Gel Stain染色，将其结果示于图2和图3。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio-RADLaboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白(重组蛋白)的精制度。将其结果示于下表4。
表4
| 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 比较例2 | |
| 溶解用溶剂 | DMSO | DMF | DMA | NMP | DMI | 异丙醇 |
| 纯度(％) | 29.9 | 23.0 | 26.3 | 22.2 | 21.6 | 9.6 |
图2中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1、2、3、4、5分别与实施例2、3、4、5、6对应。图2中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12.5kDa)对应的蛋白的条带。从图2可知，通过用非质子性极性溶剂将表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的大肠杆菌溶解，将不溶物分离，能够将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白部分精制。图3中，Lane M表示分子量标记物、Lane 1与比较例2对应。图3中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12.5kDa)对应的蛋白的条带。
从上述表4的结果可知，使用了DMSO等非质子性极性溶剂的实施例中经部分精制的目标重组蛛丝蛋白的纯度为使用了质子性极性溶剂异丙醇的比较例中经部分精制的目标重组蛛丝蛋白的纯度的2.2～3.1倍，通过使用DMSO等非质子性极性溶剂，能够将亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白部分精制。
(实施例7)
在表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0.3g中添加1ml含有1M的LiCl的DMSO，在60℃下静置30分钟，使其溶解。之后，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收上清液(溶解液)。
(比较例3)
在表达Drosophila-Resilin-Kai蛋白的大肠杆菌的湿菌体约0.3g中添加1ml的Tris缓冲液(50mM Tris、100mM NaCl、pH为7.0)，超声破碎、得到超声破碎液。
使用实施例7中得到的上清液(溶解液)和比较例3中得到的超声破碎液，如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用Oriole Fluorescent GelStain染色。用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白(Drosophila-Resilin-Kai)的精制度。实施例7中，目标蛋白(Drosophila-Resilin-Kai)的精制度为14.5％，而比较例3中目标蛋白(Drosophila-Resilin-Kai)的精制度为8.0％。
(实施例8)
在表达Collagen-type4-Kai蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.1g中添加1ml含有1M的LiCl的DMSO，在60℃下静置30分钟，使其溶解。之后，用离心分离机(TOMY精工公司制的“MX-305”)在20℃、11000×g下离心分离5分钟，回收上清液(溶解液)。
使用实施例8中得到的上清液(溶解液)如上所述地进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色，将其结果示于图4。
图4中，用箭头表示的为与Collagen-type4-Kai(分子量为约24.5kDa)对应的蛋白的条带。另外，用分析软件ImageLab(Bio-RAD Laboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，结果目标蛋白(Collagen-type4-Kai)的精制度为11.6％。
产业上的可利用性
本发明能够用于从表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主中将亲水性重组蛋白部分精制。
序列表自由文本
序列号1、2、3、6、8、10、12、13、15：氨基酸序列
序列号4、5、7、9、11、14：碱基序列
Claims (9)
1.一种亲水性重组蛋白的部分精制方法，其为从表达亲水性重组蛋白的宿主中将亲水性重组蛋白部分精制的方法，其特征在于，其包含在所述表达亲水性重组蛋白的宿主中添加溶解用溶剂，使宿主细胞溶解，将不溶物分离来得到溶解液的溶解液获取工序；
其中，所述亲水性重组蛋白的亲水性指数为0以下，所述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂。
2.根据权利要求1所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂的偶极矩为3.0D以上。
3.根据权利要求1或2所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂为选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、和N-甲基-2-吡咯烷酮中的一种以上非质子性极性溶剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂为在所述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述不溶物的分离通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述溶解用溶剂相对于所述宿主的质量以体积/质量比计添加0.5倍以上，其中体积的单位为mL、质量的单位为g。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，将所述溶解液用水系溶剂进行溶剂替换。
8.根据权利要求7所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，将所述经溶剂替换的溶解液进一步用选自柱、过滤、离心分离中的一种以上方法处理。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的亲水性重组蛋白的部分精制方法，其中，所述亲水性重组蛋白为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
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