KR20210034024A - 극성 비수성 용매 중의 가교 결합된 엘라스토머 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

극성 비수성 용매 중의 가교 결합된 엘라스토머 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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매튜 조던 스미스
마이클 은-석 리
미첼 조셉 하인리히
폴 제임스 제렌
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볼트 쓰레즈, 인크.
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Abstract

본 명세서에는 개선된 가교 결합된 레실린 조성물 및 이러한 개선된 조성물의 제조 방법이 개시된다. 이것은 레실린 조성물을 가교 결합시키는 새로운 방법, 가교 결합된 레실린 고체 조성물 및 레실린 발포체 조성물의 물질 특성을 조정하기 위한 극성 비수성 용매의 용도 및 이의 제조 방법을 포함한다.

Description

극성 비수성 용매 중의 가교 결합된 엘라스토머 단백질 및 이의 용도
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/700,197호(출원일: 2018년 7월 18일)의 이익을 주장하며, 이 기초출원의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
엘라스토머 단백질(elastomeric protein)은 점탄성 기계적 특성을 나타내고, 엘라스틴(elastin), 레실린(resilin), 어브덕틴(abductin) 및 문어 동맥 엘라스토머를 포함하는 폴리펩타이드이다. 레실린이 특히 흥미로운 엘라스토머 단백질인데, 그 이유는 그것이 로딩(loading) 및 언로딩(unloading) 동안 매우 적은 에너지를 소멸시키기 때문이다. 레실린은 다수의 곤충에서 발견되며, 낮은 에너지 소멸은 다수의 곤충 종이 매우 효율적으로 점프하거나 날개를 회전시킬 수 있는 놀라운 능력을 가능하게 한다. 레실린의 고유한 특성은 이것을 다양한 산업 응용을 가질 수 있는 흥미로운 엘라스토머 물질로 만든다. 따라서 필요한 것은, 바람직한 기계적 특성을 가지며 대규모의 효율적인 생산에 적합한 새로운 레실린 조성물 및 이를 제조하는 방법이다.
천연 레실린 및 레실린-유사 단백질(레실린 서열을 기반으로 함)의 변형은 이.콜라이(E. coli) 배양에서 다수의 군에 의해 재조합 방식으로 생산되었으며, 세포를 용해시켜 재조합 방식으로 발현된 단백질을 추출하고, 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리시킴으로써 단리되었다.(Elvin et al., 2005; Charati et al.; 2009, McGann et al., 2013). 재조합 방식으로 생산된 레실린 및 레실린-유사 단백질은 천연 레실린에 가교 결합을 또한 형성하는 타이로신 잔기를 표적화하여 가교 결합된다(예를 들어, 문헌[Elvin et al., 2005; Qin et al., 2011] 참조). 재조합 방식으로 생산된 레실린은 또한 라이신 잔기(Li et al., 2011) 또는 시스테인 잔기(McGann et al., 2013)를 표적화하여 가교 결합되었다. 가교 결합 방법은 효소에 의해서 촉매화된 가교 결합 및 광활성화된 가교 결합을 포함하였다. 가교 결합의 효소적 촉매작용을 위한 효소는 최종 조성물로부터 제거되기 어려울 수 있는 반면, 광활성화된 가교 결합은 불순물을 또한 남기면서, 단지 표면이 광에 노출되기 때문에 비효율적일 수 있다. 효소 불순물은 레실린을 분해할 수 있는 반면, 최종 고체 가교 결합된 조성물에 남아있는 효소 또는 광촉매로부터의 불순물은 바람직하지 않은 기계적 특성을 야기할 수 있다. 따라서, 불순물을 유발하는 분해를 남기지 않고, 대량으로 효율적으로 수행될 수 있는 재조합 레실린 단백질을 가교 결합시키는 새로운 방법이 필요하다.
본 명세서에는 개선된 가교 결합된 레실린 조성물 및 이러한 개선된 조성물의 제조 방법이 개시된다. 이것은 레실린 조성물을 가교 결합시키는 새로운 방법 및 가교 결합된 레실린 고체 조성물의 물질 특성을 조정하기 위한 극성 비수성 용매의 용도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 정제된 재조합 레실린을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 상기 재조합 레실린을 과황산암모늄을 포함하는 가교 결합 용액 중에 배치하는 단계; 상기 재조합 레실린을 상기 가교 결합 용액 중에서 적어도 60℃의 온도에서 인큐베이션시킴으로써, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션은 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 90분 또는 적어도 2시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 가교 결합 용액 중의 재조합 레실린은 60℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 85℃ 또는 75℃ 내지 85℃의 온도에서 인큐베이션된다.
일부 실시형태에서, 인큐베이션은 적어도 2시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 가교 결합 용액은 광촉매 또는 가교 결합 효소를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 5일 초과, 10일 초과, 20일 초과 또는 40일 초과 동안 실온에서 안정적이다.
일부 실시형태에서, 정제된 재조합 레실린은 배양물 중의 변형된 유기체에서 상기 재조합 레실린을 암호화하는 유전자를 재조합 방식으로 발현시키는 단계 및 발현된 재조합 레실린을 상기 배양물로부터 정제시키는 단계에 의해서 제조된다.
또한 본 명세서에는 일부 실시형태에 따라서 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 재조합 레실린은 상기 레실린을 과황산암모늄 및 열에 노출시킴으로써 가교 결합되었다. 일부 실시형태에서, 조성물은 가교 결합 효소를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 광촉매를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 극성 비수성 용매 중에 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하는 재조합 레실린 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 비양성자성 용매는 DMSO이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 20 내지 40중량%의 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 레실린은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린이다.
일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 상기 용매의 적어도 60부피%, 적어도 70부피%, 적어도 80부피%, 적어도 90부피%, 적어도 95부피%, 적어도 98부피% 또는 적어도 99부피%이다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 수성 용매 중의 유사한 가교 결합된 재조합 레실린보다 더 높은 탄성률(elastic modulus)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 적어도 10의 경도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 약 10 내지 약 50의 경도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D7121에 의해서 측정되는 경우 약 40% 내지 약 60%의 반발 탄력성(rebound resilience)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D575에 의해서 측정되는 경우 약 6 내지 약 8psi의 25%에서의 압축 응력을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 즈빅 압축 시험(Zwick compression test)에 의해서 측정되는 경우 2kN 미만의 압축력에서 탄성에서 가소성 전이를 경험하지 않는다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 발포 물질이다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 및 상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 교환하는 단계를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 비양성자성 용매는 DMSO이다.
일부 실시형태에서, 용매 교환은 적어도 8시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 용매 교환은 약 60℃에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가교 결합된 재조합 고체 조성물은 과황산암모늄 및 본 명세서에 기재된 가열 방법에 의해서 제조된다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 수성 용매를 포함하는 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 및 용매 교환을 수행하여 상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 대체하는 단계를 포함하는, 가교 결합된 재조합 레실린 고체를 포함하는 고체 조성물의 물질 특성을 조정하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 용매를 대체하는 단계는 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물의 상기 탄성률, 상기 탄력성, 상기 경도, 최대 탄성 압축 하중(maximum elastic compressive load) 또는 물질 수명을 변화시킨다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 정제된 재조합 레실린을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 상기 재조합 레실린을 과황산암모늄을 포함하는 수성 용매 중에 배치하는 단계; 상기 재조합 레실린을 상기 수성 용매 중에서 적어도 60℃의 온도에서 인큐베이션시킴으로써, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 생성시키는 단계; 및 상기 수성 용매를 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 DMSO로 이루어진 군으로부터 선택된 극성 비수성 용매와 교환하는 단계를 포함하는, 재조합 가교 결합된 레실린 고체를 제조하는 방법이 제공된다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 교환하는 단계; 및 하나 이상의 기포를 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물에 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 레실린 발포체의 제조 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매이다. 일부 실시형태에서, 비양성자성 용매는 DMSO이다.
일부 실시형태에서, 용매 교환은 적어도 8시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 용매 교환은 약 60℃에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 가교 결합된 재조합 고체 조성물은 과황산암모늄 및 본 명세서에 기재된 가열 방법에 의해서 제조된다.
일부 실시형태에서, 도입하는 단계는 발포제를 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물에 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발포제는 화학 발포제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학 발포제는 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 암모늄, 아조다이카본아마이드, 아이소사이아네이트, 하이드라진, 아이소프로판올, 5-페닐테트라졸, 트라이아졸, 4,4'옥시비스(벤젠설포닐 하이드라자이드)(OBSH), 트라이하이드라진 트라이아진(THT), 인화수소(hydrogen phosphate), 타타르산, 시트르산 및 톨루엔설포닐 세미카바자이드(TSS)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학 발포제는 중탄산나트륨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발포제는 물리적 발포제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 물리적 발포제는 클로로플루오로카본(CFC), 용존 질소, N2, CH4, H2, CO2, Ar, 펜탄, 아이소펜탄, 헥산, 메틸렌 다이클로라이드 및 다이클로로테트라-플루오로에탄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 물리적 발포제는 용존 질소를 포함한다.
일부 실시형태에 따라서, 본 명세서에는 재조합 레실린 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 재조합 숙주 세포의 집단을 발효로 배양하는 단계로서, 상기 재조합 숙주 세포는 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 재조합 숙주 세포는 상기 분비된 레실린 암호 서열에 의해서 암호화된 재조합 레실린 단백질을 분비하는, 상기 배양하는 단계; 및 상기 재조합 레실린 단백질을 상기 발효물로부터 정제시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 전장 또는 절두된 네이티브 레실린이다. 일부 실시형태에서, 네이티브 레실린은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래된다: 도르소필라 세켈리아(Drosophila sechellia), 아크로마이르멕스 에키네이티어(Acromyrmex echinatior), 애쉬나(Aeshna), 해마토비아 이리탄스(Haematobia irritans), 크테노세팔리데스 펠리스(Ctenocephalides felis), 봄부스 테레스트리스(Bombus terrestris), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 아피스 멜리페라(Apis mellifera), 나소니아 비트리페니스(Nasonia vitripennis), 페디쿨러스 휴마너스 코포리스(Pediculus humanus corporis), 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae), 글로시나 모시탄스(Glossina morsitans), 아타 세팔로테스(Atta cephalotes), 아노펠레스 달링기(Anopheles darlingi), 아시토시폰 피줌(Acyrthosiphon pisum), 도르소필라 비릴리스(Drosophila virilis), 도르소필라 에렉타(Drosophila erecta), 루초미아 롱기팔피스(Lutzomyia longipalpis), 로드니우스 프롤릭수스(Rhodnius prolixus), 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invicta), 쿨렉스 퀸퀘파시아투스(Culex quinquefasciatus), 박트로세라 쿠쿠비태(Bactrocera cucurbitae) 및 트리코그라마 프레티오섬(Trichogramma pretiosum). 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 서열번호 4를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 알파 메이팅 인자 분비 신호(alpha mating factor secretion signal)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 FLAG-태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 하나 초과의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 효모 세포는 메틸로트로픽(methylotrophic) 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 종이다: 피치아 (코마가탤라) 파스토리스(Pichia (Komagataella) pastoris), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 아르쿨라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 애로위아 리폴리티카, 피치아 (쉐퍼로소마이세스) 스티피티스(Pichia (Scheffersomyces) stipitis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피치아 (코마가탤라) 파스토리스, 한세눌라 폴리모파, 아르쿨라 아데니니보란스, 애로위아 리폴리티카, 피치아 (쉐퍼로소마이세스) 스티피티스, 피치아 메타놀리카, 사카로마이세스 세레비시애 및 클루이베로마이세스 락티스.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과의 속도로 재조합 레실린을 생산한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 재조합 숙주 세포에 의해서 발현되는 총 재조합 레실린 단백질과 비교할 때 50% 초과인 재조합 레실린의 분비 분율을 생산한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과의 속도로 재조합 레실린을 분비한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 중 80% 초과는 상기 발효물에서 재조합 숙주 세포 외부에 존재한다. 일부 실시형태에서, 발효물은 적어도 2g 재조합 레실린/ℓ를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 재조합 레실린 단백질을 정제시키는 단계는 발효물을 원심분리시킴으로써 제1 펠릿 분획 및 제1 상청액 분획을 생성시키는 단계; 및 제1 펠릿 분획으로부터 재조합 레실린 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 레실린 단백질을 정제시키는 단계는 카오트로프(chaotrope)를 제1 펠릿 분획에 첨가하여 재조합 레실린 단백질이 가용성인 용액을 생성시키는 단계; 상기 카오트로프를 포함하는 제1 펠릿 분획을 원심분리시킴으로써 제2 상청액 분획 및 제2 펠릿 분획을 생성시키는 단계; 및 제2 상청액 분획으로부터 가용성 전장 레실린을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 전장 또는 절두된 네이티브 레실린을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 변형된 전장 또는 절두된 네이티브 레실린을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 변형된 레실린은 또 다른 레실린에 가교 결합할 수 있는 아미노산 잔기의 위치에 삽입, 감산, 대체 또는 변화를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전장 또는 절두된 네이티브 레실린은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래된다: 도르소필라 세켈리아(Drosophila sechellia), 아크로마이르멕스 에키네이티어(Acromyrmex echinatior), 애쉬나(Aeshna), 해마토비아 이리탄스(Haematobia irritans), 크테노세팔리데스 펠리스(Ctenocephalides felis), 봄부스 테레스트리스(Bombus terrestris), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 아피스 멜리페라(Apis mellifera), 나소니아 비트리페니스(Nasonia vitripennis), 페디쿨러스 휴마너스 코포리스(Pediculus humanus corporis), 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae), 글로시나 모시탄스(Glossina morsitans), 아타 세팔로테스(Atta cephalotes), 아노펠레스 달링기(Anopheles darlingi), 아시토시폰 피줌(Acyrthosiphon pisum), 도르소필라 비릴리스(Drosophila virilis), 도르소필라 에렉타(Drosophila erecta), 루초미아 롱기팔피스(Lutzomyia longipalpis), 로드니우스 프롤릭수스(Rhodnius prolixus), 솔레놉시스 인빅타(Solenopsis invicta), 쿨렉스 퀸퀘파시아투스(Culex quinquefasciatus), 박트로세라 쿠쿠비태(Bactrocera cucurbitae) 및 트리코그라마 프레티오섬(Trichogramma pretiosum).
일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 서열번호 4를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 하나 이상의 A-반복부 또는 유사-A-반복부를 포함하는 재조합 레실린을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 하나 이상의 B-반복부 or 유사-B-반복부를 포함하는 재조합 레실린을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 하나 이상의 A-반복부 또는 유사-A-반복부 또는 하나 이상의 B-반복부 또는 유사-B 반복부 중 어느 하나(둘 다는 아님)를 포함하는 재조합 레실린을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 하나 이상의 A-반복부 또는 유사-A-반복부 및 하나 이상의 B-반복부 또는 유사-B-반복부를 포함하는 재조합 레실린을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 키틴 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 알파 메이팅 인자 분비 신호를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 FLAG-태그를 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 하나 초과의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 3개의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
또한 본 명세서에는 일부 실시형태에 따라서, 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 효모 세포는 메틸로트로픽 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 종이다: 피치아 (코마가탤라) 파스토리스(Pichia (Komagataella) pastoris), 한세눌라 폴리모파, 아르쿨라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 애로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피치아 (쉐퍼로소마이세스) 스티피티스, 피치아 메타놀리카, 사카로마이세스 세레비시애 및 클루이베로마이세스 락티스.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 3개의 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과의 속도로 재조합 레실린을 생산한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 50% 초과인 재조합 레실린의 분비된 분획을 갖는다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과의 속도로 레실린을 분비한다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포 및 재조합 숙주 세포를 성장시키기에 적합한 배양 배지를 포함하는 발효물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 발효물은 적어도 2g 재조합 레실린/ℓ를 포함한다.
발효물의 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 중 80% 초과는 재조합 숙주 세포 외부에 존재한다.
발효물의 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 전장 재조합 레실린이다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포 및 재조합 숙주 세포를 성장시키기에 적합한 배양 배지를 포함하는 발효물로부터 유래된 재조합 레실린을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 60중량%의 재조합 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 유사한 양의 네이티브 레실린을 포함하는 조성물과 비교하여 유사한 특성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 유사한 양의 네이티브 레실린을 포함하는 조성물과 비교하여 상이한 특성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 조성물은 50% 초과의 탄력성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 10㎫ 미만의 압축 탄성률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 10㎫ 미만의 인장 탄성률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1㎫ 미만의 전단 탄성률(shear modulus)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1% 초과의 파단 연장률(extension to break)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 0.1㎪ 초과의 최대 인장 강도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 90 미만의 쇼어 OO 경도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물은 전장 레실린을 포함한다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 재조합 레실린을 포함하는 조성물의 생산 방법이 제공되며, 이 방법은 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 재조합 숙수 세포를 배양하여 재조합 숙주 세포로부터 재조합 레실린의 분비를 촉진시키는 조건 하에서 발효물을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린을 포함하는 조성물의 생산 방법은 상기 재조합 레실린을 정제시켜 전장 네이티브 레실린을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 레실린을 정제시켜 전장 네이티브 레실린을 생산하는 단계는 발효물을 원심분리시킴으로써 제1 펠릿 분획 및 제1 상청액 분획을 생성시키는 단계; 및 제1 펠릿 분획으로부터 재조합 레실린 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 펠릿 분획으로부터 재조합 레실린 단백질을 정제시키는 단계는 카오트로프를 제1 펠릿 분획에 첨가하여 재조합 레실린 단백질이 가용성인 용액을 생성시키는 단계; 상기 카오트로프를 포함하는 제1 펠릿 분획을 원심분리시킴으로써 제2 상청액 분획 및 제2 펠릿 분획을 생성시키는 단계; 및 제2 상청액 분획으로부터 재조합 레실린 단백질을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린을 포함하는 조성물의 생산 방법은 복수의 상기 재조합 레실린을 가교 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 가교 결합은 효소적 가교 결합이다. 일부 실시형태에서, 상기 가교 결합은 광화학적 가교 결합이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 전장 레실린 단백질을 포함한다.
또한 본 명세서에는, 일부 실시형태에 따라서, 배양 배지 및 재조합 숙주 세포를 포함하는 발효물이 제공되며, 여기서 재조합 숙주 세포는 벡터를 포함하며, 벡터는 분비된 레실린 암호 서열을 포함하고, 재조합 숙주 세포는 적어도 2㎎/g 건조 세포 중량/시간의 속도로 재조합 레실린을 분비한다.
유사한 참조 부호가 상이한 도면 전체에서 동일한 부분을 지칭하는 첨부 도면에 예시된 바와 같이, 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 본 발명의 특정 실시형태의 하기 설명으로부터 자명할 것이다. 도면은 반드시 축적에 따를 필요는 없고, 대신 본 발명의 다양한 실시형태의 원리를 설명할 때 강조될 것이다.
도 1은 예시적인 레실린의 구조를 개략적으로 도시한 도면.
도 2는 재조합 레실린을 포함하는 조성물의 생산을 위한 방법의 흐름도.
도 3은 3개의 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 벡터의 예시적인 맵.
도 4는 다양한 형상 및 형태의 가교 결합된 정제된 재조합 레실린을 포함하는 단백질성 블록 공중합체의 사진.
도 5는 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하는 단백질성 블록 공중합체의 압축의 사진.
도 6은 과황산암모늄과 열(ammonium persulfate plus heat: AP)을 통해서; 과황산암모늄과 열 그리고 3회 세척하여 과량의 가교 결합 용액을 제거함으로써(AP 3× 세척); 그리고 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP)를 통한 효소 가교 결합을 통해서 가교 결합된 레실린 고체 조성물로부터의 레실린 상에서 FLAG 태그에 특이적인 항체를 사용하여 ELISA에 의해서 측정되는 경우 총 절단된 레실린을 도시한 도면.
도 7은 10wt% 퓸드 실리카(좌측) 및 5wt% 퓸드 실리카(우측)를 갖는 레실린 발포체의 사진.
도 8은 5wt% 퓸드 실리카를 갖는 레실린 발포체의 사진. 비교를 위해 25센트 동전이 포함된다.
도 9는 가교 결합(상단) 후 그리고 1주 동안 밀봉하지 않고 저장한 7일 후(하단) 글리세롤계 가교 결합된 레실린 조성물 및 수계 가교 결합된 레실린 조성물의 영상.
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 하기 가교 결합된 레실린 조성물에 대해서 레오미터로 측정되는 경우 응력 변형률 곡선을 도시한 도면: 60% 글리세롤 용매 교환, 그 다음 100% 글리세롤 용매 교환으로 제조된 글리세롤 용매 중의 27중량% 레실린(도 10a); 프로필렌 글리콜 용매 중의 27중량% 레실린(도 10b); 및 프로필렌 글리콜 용매 중의 27% 전장 레실린(즉, 모든 레실린의 분율로서 약 80% 전장 레실린)(도 10c).
도 11은 5wt% 퓸드 실리카를 갖는 레실린 발포체의 응력-변형률 곡선.
도 12는 하기 가교 결합된 레실린 고체 조성물 각각에 대해서 레오미터에 의해서 측정되는 경우 탄력성 및 탄성률의 상대적인 값의 플롯: 20wt% 레실린, 프로필렌 글리콜("A"); 27wt% 레실린, 프로필렌 글리콜("B"); 40wt% 레실린, 프로필렌 글리콜("C"); 레실린 코아서베이트(coacervate), 프로필렌 글리콜("D"); 27wt% 전장 레실린, 프로필렌 글리콜("E"); 27wt% 레실린, 60 내지 100% 글리세롤("F"); 27wt% 레실린, 100% 글리세롤("H"); 및 27wt% 레실린, 에틸렌 글리콜("I").
도 13은 하기 가교 결합된 레실린 고체 각각에 대한 즈빅 인장 시험기로부터 측정되는 경우 인가력 대 응력 곡선의 플롯을 도시한 도면. 27wt% 레실린 에틸렌 글리콜 고체("A"), 27wt% 레실린 프로필렌 글리콜 고체("C), 코아서베이트 레실린 프로필렌 글리콜 고체("D"), 27wt% 레실린 60 내지 100% 글리세롤 고체("G") 및 27wt% 레실린 100% 글리세롤 고체("H").
도면은 단지 예시의 목적을 위해서 본 개시내용의 다양한 실시형태를 도시한다. 당업자는, 본 명세서에 예시된 조 및 방법의 대안적인 실시형태가 본 명세서에 기재된 원리로부터 벗어나지 않으면서 사용될 수 있다는 것을 하기 논의로부터 쉽게 인지할 것이다.
본 발명의 다양한 실시형태 관한 세부사항은 하기 상세한 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 자명할 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세에 사용된 바와 같은 단순 표현 및 유사한 지시어는 본 명세서에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 지칭한다.
용어 "약", "대략" 또는 "유사한"은 값이 측정되는 방법에 부분적으로 의존할 수 있는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미한다. 또는 측정 시스템의 한계에 따라 결정된다. 하기에 기재된 모든 범위 및 양은 근사치이며 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 범위 및 숫자가 사용되는 경우, 통계적 범위 또는 측정 오류 또는 변동을 포함하도록 근사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 측정치는 ± 10%일 수 있다.
아미노산은 단일 문자 암호 또는 3 문자 암호로 지칭될 수 있다. 단일 문자 암호, 아미노산 명칭 및 3 문자 암호는 하기와 같다: G - 글리신(Gly), P - 프롤린(Pro), A - 알라닌(Ala), V - 발린(Val), L - 류신(Leu), I - 아이소류신(Ile), M - 메티오닌(Met), C - 시스테인(Cys), F - 페닐알라닌(Phe), Y - 타이로신(Tyr), W - 트립토판(Trp), H - 히스티딘(His), K - 라이신(Lys), R - 아르기닌(Arg), Q - 글루타민(Gln), N - 아스파라긴(Asn), E - 글루탐산(Glu), D - 아스파트산(Asp), S - 세린(Ser), T - 트레오닌(Thr).
용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "갖는다", "를 갖는", 또는 이의 변형은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함하는 것을 의도한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "미생물"은 미세유기체를 지칭하고, 단세포 유기체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어는 모든 박테리아, 모든 고세균, 단세포 원생 생물, 단세포 동물, 단세포 식물, 단세포 진균, 단세포 조류, 모든 원생 동물 및 모든 염색체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "네이티브"는 천연 비변형 상태로 자연에서 발견되는 조성물을 지칭한다.
용어 "선택적인" 또는 "선택적으로"는 특징 또는 구조가 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있거나, 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있다는 것을 의미하고, 그 설명은 특정 특징 또는 구조가 존재하는 예 및 특징 또는 구조가 존재하지 않는 예 또는 사건 또는 상황이 일어난 예 및 사건 또는 상황이 일어나지 않은 예를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "분비된 분획"은 세포에 의해서 생산된 총 레실린과 비교한 세포로부터 분비된 재조합 레실린의 분획을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "분비 신호"는 폴리펩타이드에 융합될 때 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 매개하는 짧은 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "분비된 레실린 암호 서열"은 N-말단에서 분비 신호 및 선택적으로 C-말단에서 태그 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합된 본 명세서에 제공된 바와 같은 레실린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
폴리펩타이드(예를 들어, 레실린)과 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 재조합 숙주 세포에서 생산된 폴리펩타이드 또는 재조합 핵산으로부터 합성된 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 핵산"은 자연 발생 환경으로부터 제거된 핵산, 또는 자연에서 발견될 때 핵산에 인접하거나 근접하는 핵산의 전부 또는 일부와 회합되지 않은 핵산, 또는 자연에서 연결되지 않은 핵산에 작동 가능하게 연결된 핵산, 또는 자연에서 발생하지 않는 핵산, 또는 자연에서 핵산에서 발견되지 않는 변형(예를 들어, 인간 개입에 의한, 삽입, 결실 또는 인공적으로 도입된 점 돌연변이)을 함유하는 핵산, 또는 이종 부위에 염색체에 통합된 핵산을 지칭한다. 이 용어는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 클로닝된 DNA 단리물 및 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"인데, 이것은 일반적으로 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있지만, 또한 선형 이중 가닥 분자, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해서 증폭으로부터 생성된 것 또는 제한 효소를 사용하여 원형 플라스미드의 처리로부터 생성된 것을 포함하는 환형 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 다른 벡터는 박테리오파지, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC) 및 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC)를 포함한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 여기서 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이것이 도입되는 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어, 세포에서 기능하는 복제 기원을 갖는 벡터). 다른 벡터는 세포 내에 도입될 때 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 따라서 세포 게놈과 함께 복제된다.
아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "반복부"는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 연결된 서열(연결된 서열)) 내에 1회를 초과로 존재하는 하위 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 임의의 개재 서열 없이 반복 서열의 직접적인 반복을 가질 수 있거나, 개재 서열과 반복 서열의 비-연속적 반복을 가질 수 있다. 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유사-반복부"는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 걸쳐서 부정확하게 반복되는(즉, 여기서 유사-반복 하위서열의 일부 부분이 유사-반복부 사이에서 가변적임) 하위-서열이다. 반복하는 폴리펩타이드 및 DNA 분자(또는 폴리펩타이드 또는 DNA 분자의 부분)는 반복 하위-서열(즉, 정확한 반복부) 또는 유사-반복 하위-서열(즉, 부정확한 반복부) 중 어느 하나로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "네이티브 레실린"은 곤충에 의해서 생산된 엘라스토머 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 네이티브 레실린의 비제한적인 예의 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession No.)는 하기 NCBI 서열 번호를 포함한다: NP 995860(도르소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)), NP 611157(도르소필라 멜라노가스터), Q9V7U0(도르소필라 멜라노가스터), AAS64829, AAF57953(도르소필라 멜라노가스터), XP 001817028(트리볼리움 카스타네움) 및 XP001947408(아시토시폰 피줌).
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "변형된"은 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드 서열과 조성이 상이한 단백질 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭하며, 여기서 기능성 특성은 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드 특성의 10% 내에서 보존된다. 일부 실시형태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드와 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드 간의 차이는 1차 서열에 존재할 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 제거, 삽입 또는 치환됨) 또는 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화, 포스포릴화)일 수 있다. 아미노산 결실은 단백질로부터의 하나의 이상의 아미노산의 제거를 지칭한다. 아미노산 삽입은 단백질 또는 폴리펩타이드에 도입될 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 아미노산 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산의 서열내 삽입뿐만 아니라 N-말단 및/또는 C-말단 융합부를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 비보전적 또는 보존적 치환을 포함하며, 여기서 보존적 아미노산 치환 표는 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds)] 참조). 일부 실시형태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 및 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 동일성은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 염기의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "절두된"은 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드보다 길이가 더 짧은 단백질 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 절두된 단백질 또는 폴리펩타이드는 네이티브 단백질 또는 폴리펩타이드의 길이의 10% 초과 또는 20% 초과 또는 30% 초과 또는 40% 초과 또는 50% 초과 또는 60% 초과 또는 70% 초과 또는 80% 초과 또는 90% 초과일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "동종" 또는 "실질적으로 유사성"은, 폴리펩타이드, 핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때, 또 다른 아미노산 또는 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 적절한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬되는 경우, 서열 동일성의 임의의 공지된 알고리즘, 예컨대, 상기에 논의된 바와 같은 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해서 측정되는 경우, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 염기의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "레실린"은 가교 결합하여 엘라스토머를 형성할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 단백질 또는 폴리펩타이드는 네이티브 레실린, 또는 변형된 네이티브 레실린, 또는 절두된 네이티브 레실린이다. 본 발명의 레실린은 바람직하게는 재조합 레실린이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 숙주 세포로부터 이종으로 발현되고, 분비된 레실린 또는 레실린 단편(예를 들어, 곤충으로부터 단리됨)을 암호화하는 천연 또는 변형된(예를 들어, 절두된 또는 연결된) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 분비된 재조합 레실린 단백질은 숙주 세포에 대해서 세포외부에서 용액으로부터 수집된다. 일부 실시형태에서, 레실린은 발포 물질의 형태, 예를 들어, 고체 발포체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "엘라스토머"는 (존재하는 경우, 분자들 간의 공유 가교 결합 제외) 점탄성 및 전형적으로 약한 분자간 힘을 갖는 중합체를 지칭한다. 점탄성은 탈형을 겪을 때 점성 및 탄성 특성을 둘 다를 나타내기 때문에, 시간 의존적인 변형을 나타내는 물질의 특성이다. 탄성은 정렬된 고체에서 결정학적 평면을 따라 연신되는 결합과 연관되며, 점도는 비정질 물질 내부의 원자 또는 분자의 확산 결과이다. 따라서 점탄성인 엘라스토머는 일반적으로 다른 물질에 비해 영률이 낮고, 파괴 변형률이 높다. 물질의 점성 성분으로 인해, 점탄성 물질은 하중을 가한 후, 제거할 때 에너지를 소멸한다. 이 현상은 점탄성 물질의 응력-변형 곡선에서 이력현상으로 관찰된다. 하중이 가해질 때 특정 응력-변형 곡선이 존재하며, 하중이 제거될 때 하중 제거 시 응력-변형 곡선이 하중 동안의 곡선의 것과 상이하다. 소멸되는 에너지는 하중 및 비하중 곡선 사이의 면적이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비수성"은 물이 아닌 하나 이상의 화합물을 주로 포함하는 용매를 지칭한다. 이것은 용매로 존재하는 물의 비율이 전반적으로 감소하고, 즉, 물이 용매로서 물이 아닌 분자로 대체된, 용매와의 용매 교환 과정을 겪은 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비수성 용매는 50% 미만의 물을 포함하는 것이다. 가교 결합된 레실린 조성물을 위한 용매와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 극성 비수성 용매는 레실린을 용해시킬 수 있는 임의의 비수성 용매를 지칭한다.
본 명세서에서 값의 범위의 언급은 본 명세서에서 달리 지시하지 않는 한, 범위 내에 포함되는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 제공되는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 바와 같이 본 명세서에 포함된다.
레실린 조성물
본 명세서에는 재조합 레실린을 포함하는 조성물 및 이의 생산 방법이 제공된다.
레실린은 석유계 엘라스토머에 비교되는 다수의 고유한 특성을 갖는다. 특히, 레실린은 변형에 투입되는 에너지 중 매우 적은 에너지가 열로 손실되는 극도의 탄성 효율(즉, 탄력성)을 가지고 있다. 레실린의 다른 바람직한 특성은 예를 들어, 압축 탄성률, 인장 탄성률, 전단 탄성률, 경도, 반발 및 압축 변형을 포함한다. 또한 레실린은 단백질이기 때문에, 생분해될 수 있고, 이것은 석유계 중합체보다 환경 친화적이다. 또한 레실린은 생체적합성이기 때문에, 인간 또는 동물과의 접촉을 포함하는 응용 분야에 사용될 수 있다. 마지막으로, 재조합 레실린의 기계적 특성은 다양한 단백질 서열, 단백질 구조, 분자간 가교 결합의 양 및 가공 변수를 통해 조정되어 광범위한 특정 응용을 위해 설계된 엘라스토머를 생산할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 바람직한 기계적 특성을 갖는 가교 결합된 레실린 조성물 및 이의 생산 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 큰 배취로 효율적으로 수행될 수 있고, 가교 결합 반응으로부터 남은 불순물로부터의 분해에 민감하지 않은 가교 결합된 레실린 고체를 형성하기 위해서 레실린을 가교 결합시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 가교 반응은 레실린을 과황산염, 예컨대, 과황산암모늄에 노출시키는 것을 포함한다. 과황산염에 의해 촉매되는 가교 결합 반응을 개시하기 위해 열을 가할 수 있다. 이러한 유형의 가교 결합 반응은 조성물에 광활성 또는 효소 화합물을 남기지 않는다. 또한, 이러한 가교 결합 반응은 광활성화를 필요로 하지 않아서 광이 가교 결합 용액의 모든 부분에 도달할 필요 없이 큰 배취를 효율적으로 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교 결합은 수득된 재조합 레실린 조성물이 특정 형상 또는 형태를 갖도록 용기 또는 주형에서 일어난다.
본 명세서에서 제공된 가교 결합된 레실린 고체 조성물은 또한 특정 응용에서 바람직한 목적하는 기계적 특성, 예컨대, 탄성률, 경도, 최대 탄성 압축 하중, 탄력성 및 물질 수명/피로를 제공하기 위해 극성 비수성 용매를 포함하는 가교 결합된 레실린 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 수성 용매를 비수성 용매로 대체하기 위해 레실린 조성물로 용매 교환을 수행함으로써 제조된다. 가교 결합된 레실린과 용매 교환을 수행할 수 있는 용매는 비-가교 결합된 형태의 레실린을 용해시키는 용매를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 비수성 용매는 비-휘발성이고 수용성 또는 극성이다. 일부 실시형태에서, 용매의 분자량은 약 100 이하이다. 일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 DMSO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매 교환은 극성 비수성 용매 구배(예를 들어, 60% 내지 100% 글리세롤)를 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 가교 결합된 레실린 조성물은 예를 들어, 바람직한 경우 적용된 힘으로부터 에너지를 흡수하기 위한 것을 포함하는 개선된 물성을 갖는 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 가교 결합된 레실린 조성물은 고무를 함유하는 기존 제품을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물 중 일부는 비탄성 물질로 전이되지 않으면서 많은 양의 힘을 흡수할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 중창(mid-sole)로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 골프 공을 위한 코어의 일부로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 예를 들어, 스포츠 장비, 예컨대, 골프 클럽 또는 테니스 라켓용 핸들 또는 그립에, 자전거 그립 또는 오토바이 그립으로서 또는 공구 및 산업 용도, 예컨대 망치, 못총, 착암기 및 에너지를 흡수하고 복귀시키는 것이 바람직한 임의의 기타 공구에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 브러싱 또는 평판(dampening), 예를 들어, 스케이트 보드 트럭 또는 하드 드라이브 플래터 진동 감쇠기에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가교 결합된 레실린 조성물은 휠, 예컨대, 스케이트 보드, 롤러 블레이드 또는 스쿠터를 위한 우수한 재료로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 안전 및 보호 기어를 위해서, 예컨대, 보호 장비, 예컨대, 헬멧, 팔꿈치 또는 무릎 패드 또는 안전모를 위한 패딩을 위해서 또는 피부를 찰과상으로부터 보호하기 위한 보호 외부층으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 자동차 부품, 예를 들어, 서스펜션 성분, 예컨대, 브러싱 또는 충격 흡수제용으로 또는 내부 쿠션, 예컨대, 시트 볼스터(seat bolster) 및 요추 지지대(lumbar support)용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 타이어 및 내부 튜브용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 슈버볼(suberball)용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 신발 밑창, 중창 및 겉창(outsole)으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 패디드 매트(padded mat)용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 몇몇 유형의 가스켓(gasket) 또는 O-링용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 내충격성을 증가시키기 위해서 플라스틱 아이템에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 보호용 케이스, 예컨대, 전화기 또는 태블렛 케이스용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 고무 스탬프용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 롤러용으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 고무 밴드용으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 슈 솔, 지하 바닥, 음악 스튜디오를 위한 소음 보호, 차 범퍼, 쿠션 패드, 도어 매트, 요가 매트, 드럼 패드, 창 와이퍼, 차량 타이어, 소방 호스, 전기 와이어링 절연체, 고무 밴드, 고무 보트(rubber duck), 탄성 글러브, 조리 기구, 레인 부츠, 티씽 토이(teething toy), 자전거 타이어, 시계, 병, 가스켓, 헤어 타이, 플립-플롭(flip-flop), 전화기 케이스, 의료용 볼, 탄력 공, 물 또는 먼지로부터의 오염을 방지하기 위한 전자 장치용 시일(seal), 냉장고 또는 냉동고 도어 시일, 챔버 내부 또는 외부로의 공기 유동을 방지하기 위한 시일, 트램폴린, 젖꼭지, 창문 시일, 할로윈 마스크, 가든 호스, 탁구 라켓, 컨베이어 벨트, 덕팅, 스탬프, 풍선, 피부 및 머리카락의 케어 및 보호용 화장품 조성물, 네일 조성물 또는 색조 화장품용 제제를 위해서 사용될 수 있다.
적합한 피부 화장품 조성물은 예를 들어, 얼굴 토닉, 얼굴 마스크, 예를 들어, 시트 마스크, 데오도란트 및 다른 화장품 로션이다. 색조 화장품에서 사용하기 위한 조성물은 예를 들어, 컨실링 스틱, 스테이지 메이크업, 마스카라 및 아이 섀도, 립스틱, 콜 펜슬(kohl pencil), 아이라이너, 블러셔, 파우더 및 아이브로우 펜슬을 포함한다.
사용 분야에 따라서, 본 명세서에 기재된 조성물은 스킨케어, 예를 들어, 크림, 폼(foam), 젤, 스틱, 무스, 밀크, 스프레이(펌프 스프레이 또는 추진제-함유 스프레이) 또는 로션에 적합한 형태로 도포될 수 있다.
도 1은 네이티브 레실린의 예를 예시하는데, 이것은 공통 아미노산 서열 YGXP("A-반복부")(식 중, X는 임의의 아미노산임)을 포함하는 복수의 반복 단위를 포함하는 N-말단 A-도메인; 키틴-결합 유형 RR-2 (C) 도메인(Pfam reference PF00379; Rebers JE & Willis, JH. A conserved domain in anthropod cuticular proteins binds chitin. Insect Biochem Mol Biol 31:1083-1093); 및 공통 아미노산 서열 UYZXZ("B-반복부")(식 중, U는 글리신 또는 세린이고; Z는 세린, 글리신, 아르기닌 또는 프롤린이고; X는 임의의 아미노산임)를 포함하는 복수의 반복 단위를 포함하는 C-말단 B-도메인을 함유한다. 모든 자연 발생 레실린이 A-, C- 및 B-도메인을 갖는 것은 아니다. 다양한 곤충에 의해서 생산된 네이티브 레실린은 전형적으로 유사-반복부 사이에 일부 아미노산 변형으로 A-도메인 및/또는 B-도메인 내에 부정확한 반복부(즉, 유사-반복부)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린은 하나 이상의 A-반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 각각 공통 서열 SXXYGXP(식 중, S는 세린이고, X는 아미노산이며, Y는 타이로신이고, G는 글리신이며, P는 프롤린임)를 갖는 A-반복부 및/또는 유사-A-반복부 아미노산 하위-서열의 복수의 블록을 포함하는 N-말단 A-도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린은 하나 이상의 B-반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 각각 공통 서열 GYZXZZX 및/또는 SYZXZZX(식 중, G는 글리신이고; Y는 타이로신이며; Z는 세린, 글리신, 프롤린 또는 아르기닌이고; S는 세린이며; X는 임의의 아미노산임)를 갖는 B-반복부 및/또는 유사-B-반복부 아미노산 하위-서열의 복수의 블록을 포함하는 C-말단 B-도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린은 하나 이상의 A-반복부를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 재조합 레실린은 1 내지 100개의 A-반복부, 또는 2 내지 50개의 A-반복부 또는 5 내지 50개의 A-반복부 또는 5 내지 20개의 A-반복부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 하기 화학식으로 기재된 하나 이상의 공통 서열을 포함한다:
(X1-X2-X3-X4)n (1)
식 중, 괄호는 공통 서열의 반복부 또는 유사-반복부를 열거하고;
n은 A-반복부 또는 유사-A-반복부의 수를 기재하고, 1 내지 100 또는 2 내지 50 또는 5 내지 50 또는 5 내지 20이며;
X1은 4개 아미노산 길이인 모티프이고, X1의 제1 아미노산은 Y이고, X1의 나머지 아미노산은 GAP, GLP, GPP, GTP 또는 GVP이고;
X2는 3 내지 20개 아미노산 길이인 모티프이며;
X2는 GGG, GGGG, N, NG, NN, NGN, NGNG, GQGG, GQGN, GQGQ, GQGQG 또는 3개 이상의 글리신 잔기이거나, X2의 잔기 중 50% 이상은 글리신 또는 아스파라긴이거나 또는 X2의 잔기 중 60% 이상은 글리신 또는 아스파라긴이거나 또는 X2의 잔기 중 70% 이상은 글리신 또는 아스파라긴 또는 X2의 잔기 중 80% 이상은 글리신 또는 아스파라긴이고;
X3은 2 내지 6개 아미노산 길이인 모티프이고, X3은 GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS 또는 GGGG이며;
X4는 1 내지 2개 아미노산 길이인 모티프이고, X4는 S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN 또는 TS이다.
일부 이러한 실시형태에서, 재조합 레실린은 모티프 X1, X2, X3 및 X4를 포함하는 반면, 다른 실시형태에서, 재조합 레실린은 모티프 X1, X2, X3 또는 X4 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린은 하나 이상의 B-반복부를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 재조합 레실린은 1 내지 100개의 B-반복부, 또는 2 내지 50개의 A-반복부 또는 5 내지 50개의 A-반복부 또는 5 내지 20개의 A-반복부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 하기 화학식으로 기재된 하나 이상의 공통 서열을 포함한다:
(X11-X12-X13) m (2)
식 중, 괄호는 공통 서열의 반복부 또는 유사-반복부를 열거하고;
m은 B-반복부 또는 유사-B-반복부의 수를 기재하고, 1 내지 100이며;
X11은 1 내지 5개 아미노산 길이인 모티프이고, 제1 아미노산은 Y이며, 나머지 아미노산은 GAP, GPP, SSG 또는 SGG를 포함할 수 있으며;
X12는 2 내지 5개 아미노산 길이인 모티프이고, GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG 또는 SN을 포함하며; 그리고
X13은 4 내지 30개 아미노산 길이인 모티프이고, GG, DLG, GFG, GGG, RDG, SGG, SSS, GGSF, GNGG, GGAGG 또는 3개 이상의 글리신 잔기이거나, 잔기 중 30% 이상은 글리신이거나 또는 잔기 중 40% 이상은 글리신이거나 또는 잔기 중 50% 이상은 글리신이거나 또는 잔기 중 60% 이상은 글리신이다.
일부 이러한 실시형태에서, 재조합 레실린은 모티프 X11, X12 및 X13를 포함하는 반면, 다른 실시형태에서, 재조합 레실린은 모티프 X11, X12 또는 X13 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린은 하나 이상의 A-반복부, 하나 이상의 B-반복부 및/또는 하나 이상의 C-도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 하나 이상의 A-반복부 또는 하나 이상의 B-반복부(둘 다는 아님)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 B-반복부 또는 C-도메인이 아닌 하나 이상의 A-반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 A-반복부 또는 C-도메인이 아닌 하나 이상의 B-반복부를 포함한다. 재조합 레실린이 C-도메인을 포함하는 실시형태에서, C-도메인은 A-반복부 또는 B-반복부의 N-말단 또는 C-말단 면 상에 또는 A-반복부와 B-반복부 사이에 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 서열 XXEPPVSYLPPS를 더 포함하며, 식 중, X는 임의의 아미노산이다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 서열은 A-반복부 또는 B-반복부의 N-말단 면 상에 위치된다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 비-네이티브 환경에서 발현되는 전장 네이티브 레실린이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 네이티브 레실린의 절두된 버전을 포함한다. 일부 실시형태에서, 절두된 네이티브 레실린은 적어도 하나의 A-반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절두된 네이티브 레실린은 적어도 하나의 B-반복부를 포함한다. 전장 및 절두된 네이티브 레실린의 비제한적인 예는 서열번호 1 내지 44로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 전장 도르소필라 세켈리아 레실린(서열번호 1)이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 절두된 아크로마이르멕스 에키네이티어 레실린(서열번호 4)이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 비-네이티브 방식으로 가교 결합(예를 들어, 더 적거나 더 많은 가교 결합, 상이한 아미노산 잔기를 통한 가교 결합)된 전장 또는 절두된 네티이브 레실린이다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 변형된 전장 또는 절두된 네이티브 레실린이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 전장 도르소필라 세켈리아 레실린(서열번호 1)과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 절두된 아크로마이르멕스 에키네이티어 레실린(서열번호 4)과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일하다.
뉴클레오타이드 서열 또는 단백질 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열을 FASTA, Gap 또는 Bestfit을 사용하여 비교할 수 있는데, 이것은 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(GCG)의 Wisconsin Package 버전 10.0의 프로그램이다. FASTA는 질문 서열과 탐색 서열 간의 최상의 오버랩 영역의 정렬 및 백분율 서열 동일성을 제공한다(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98, 1990] 참조). 예를 들어, 핵산 서열 간의 백분율 서열 동일성은 디폴트 파라미터(6의 단어 크기 및 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)를 갖는 FASTA를 사용하거나 또는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 디폴트 파라미터를 갖는 Gap를 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 서열을 컴퓨터 프로그램, BLAST(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish and States, Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656, 1997), 특히 blastp 또는 tblastn(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 사용하여 비교할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 레실린은, 변형된 레실린이 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 상이한 하나 이상의 위치 및/또는 상이한 양 및/또는 상이한 유형의 번역 후 변형을 갖도록 번역 후 변형된(예를 들어, 글리코실화된, 포스포릴화된) 아미노산 잔기 내의 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 상이하다. 일부 실시형태에서, 변형된 레실린은, 변형된 레실린이 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 상이한 하나 이상의 위치 및/또는 상이한 양 및/또는 상이한 유형의 가교 결합에 관여된 아미노산을 갖도록 가교 결합에 관여된 아미노산 잔기 내의 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 상이하다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 레실린은 하나 이상의 추가의 또는 더 적은 타이로신 잔기, 하나 이상의 추가의 또는 더 적은 라이신 잔기 및/또는 하나 이상의 추가의 또는 더 적은 시스테인 잔기를 포함한다는 점에서 전장 또는 절두된 네이티브 레실린과 상이하다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 연결된 네이티브 또는 절두된 네이티브 레실린 또는 연결된 변형된 레실린을 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결된 네이티브 또는 절두된 네이티브 레실린 또는 연결된 변형된 레실린은 적어도 2개의 A-반복부(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결된 절두된 네이티브 레실린 또는 연결된 변형된 레실린은 적어도 2개의 B-반복부(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)를 포함한다.
단백질 정량 및 순도 분석
일부 실시형태에서, 조성물 중의 전장 레실린의 총량은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 역상 고성능 액체 크로마토그래피 또는 당업계에 공지된 바와 같은 다른 방법(예를 들어, 정량 웨스턴 블롯(quantitative Western blot))으로 결정된다. 다양한 실시형태에서, 동일하거나 유사한 검정을 사용하여 단량체 형태 및 응집물 형태의 전장 레실린의 상대적인 양을 평가할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 구체적인 실시형태에서, 레실린 조성물 중의 레실린(즉, 단량체 전장 레실린)의 우세한 종의 상대적인 양을 특징규명하는 데이터는 하기와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로부터 결정된다: 레실린 분말을 5M 구아니딘 티오사이아네이트 중에 용해시키고, Yarra SEC-3000 SEC-HPLC 칼럼에 주입시켜 분자량 기준으로 구성성분을 분리시킨다. 굴절률을 검출 양상으로 사용한다. BSA는 모든 단백질의 90% 초과가 서로 약 7% 이내의 dn/dc 값(굴절률의 반응 인자)을 나타낸다는 가정 하에 일반 단백질 표준품으로 사용된다. 체류 시간 표준품으로 폴리(에틸렌 옥사이드)를 사용하고, 방법의 일관된 성능을 보장하기 위해 BSA 교정제를 검출 표준품으로 사용한다. 단량체 전장 레실린에 상응하는 범위는 60 내지 40kDa에서 평가되고; 응집물 또는 중합된 전장 레실린에 상응할 수 있는 관찰된 더 높은 피크는 이 정량에 포함되지 않는다. 이러한 레실린 피크의 상대적인 백분율은 전체 레실린의 일부로서 조성물에서 전장 레실린의 양을 결정하기 위해 질량% 및 면적%로 보고된다.
가교 결합
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 재조합 레실린을 가교 결합시켜 본 명세서에 제공된 재조합 레실린 조성물을 얻는 단계를 추가로 포함한다(도 2의 단계(1005)). 가교 결합제와 함께 목적하는 용매 중의 재조합 레실린을 작은 형상의 주형에 충전시켜 가교 결합 후 생성된 고체의 형상을 제어할 수 있다. 생성된 재조합 레실린 고체의 예를 도 4에 도시한다.
일부 실시형태에서, 가교는 타이로신 잔기를 통해 달성된다. 레실린은 대부분의 길이에 걸쳐 15 내지 24개 아미노산마다 타이로신 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 레실린의 가교 결합은 레실린에서 다이- 및 트라이-타이로신 가교 결합을 생성시켜 레실린 고체를 형성한다.
다른 실시형태에서, 가교 결합은 라이신 잔기를 통해 달성된다. 일부 실시형태에서, 가교 결합은 시스테인 잔기를 통해 달성된다. 일부 실시형태에서, 가교 결합은 트랜스글루타미나제를 사용한다(예를 들어, 문헌[Kim Y, Gill EE, Liu JC. Enzymatic Cross-Linking of Resilin-Based Proteins for Vascular Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules. 17(8):2530-9] 참조). 일부 실시형태에서, 가교 결합은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 사용한다(McGann CL, Levenson EA, Kiick KL. Macromol. Chem. Phys. 2013, 214, 203-13; McGann CL, Akins RE, Kiick KL. Resilin-PEG Hybrid Hydrogels Yield Degradable Elastomeric Scaffolds with Heterogeneous Microstructure. Biomacromolecules. 2016;17(1):128-40).
일부 실시형태에서, 재조합 레실린은 효소적 가교 결합을 통해 가교 결합된다(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제). 이 방법은 거대 레실린 용액을 효율적으로 가교 시킬 수 있지만, 생성된 가교 결합된 생성물은 가교 결합된 레실린 고체에 공유적으로 혼입된 활성 효소를 포함한다. 이것은 레실린의 단백질 골격을 분해하는 라디칼 연쇄 반응을 일으킨다.
다른 실시형태에서, 재조합 레실린은 광화학적 가교 결합을 통해 가교 결합된다(예를 들어, 문헌[Elvin CM, Carr AG, Huson MG, Maxwell JM, Pearson RD, Vuocolo T, Liyou NE, Wong DCC, Merritt DJ, Dixon NE. Nature 2005, 437, 999-1002; Whittaker JL, Dutta NK, Elvin CM, Choudhury NR. Journal of 물질s Chemistry B 2015, 3, 6576-79; Degtyar E, Mlynarczyk B, Fratzl P, Harrington MJ. Polymer 2015, 69, 255-63] 참조).
이러한 가교 결합 반응은 또한 활성 촉매를 물질로부터 완전히 투석시키기 어렵고, 비교적 높은 촉매 로딩을 사용하고, 주형 전체에서의 광활성화가 어려울 수 있는 반응에 효율적이지 않은 활성 촉매를 레실린 고체에 혼입시키는 결과를 초래한다.
본 명세서에는 분해를 방지하고, 에너지 흡수의 양 및 형태가 중요한 특정 응용에 바람직한 일부 기계적 특성을 갖는 고체 물질을 제조하는 새로운 재조합 레실린 가교 결합 화학물질이 제공된다.
바람직한 실시형태에서, 재조합 레실린은 과황산암모늄을 포함하는 용매 및 열 적용을 통해 가교 결합된다(예를 들어, 약 80℃의 온도에서 약 2.5시간 동안의 인큐베이션). 이러한 가교 결합 반응은 효율적이며, 레실린 고체에 활성 촉매를 남기지 않아서, 단백질 분해가 적은 조성물이 생성된다.
일부 실시형태에서, 레실린 가교 결합 반응을 위한 과황산암모늄의 최종 농도는 약 30 내지 40mM이다. 일부 실시형태에서, 과황산암모늄 및 레실린을 함유하는 가교 결합 용액을 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 60분, 적어도 90분 또는 적어도 2시간 동안 인큐베이션시켜, 바람직한 기계적 특성을 갖는 고체를 형성하기에 충분한 가교 결합을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 다른 과황산염이 사용된다.
일부 실시형태에서, 과황산암모늄 및 레실린 조성물 용액에 가해지는 열은 적어도 40℃, 적어도 45℃, 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃, 적어도 70℃, 적어도 75℃ 또는 적어도 80℃이다. 일부 실시형태에서, 과황산암모늄 및 레실린의 가교 결합 용액에 가해지는 열은 50℃ 내지 90℃ 또는 from 60℃ 내지 90℃ 또는 70℃ 내지 90℃ 또는 75℃ 내지 85℃ 또는 70℃ 내지 80℃이다. 일부 실시형태에서, 가교 결합 용액은 효소적 촉매를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 가교 결합 용액은 광활성 촉매를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 가교 결합 용액은 총 가교 결합 용액의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%, 1% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10%; 10% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%; 20% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 내지 30%; 30% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 40%; 40% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50%; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80%, 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 또는 90% 내지 100중량%의 레실린를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 레실린은 20% 내지 30중량%의 레실린의 농도로 가교 결합 용액 중에 용해된다. 일부 실시형태에서 총 레실린은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해서 측정되는 경우 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 전장 레실린을 포함한다.
용매-교환된 레실린 고체
가교 결합된 레실린은 수성 용매에서 형성되어, 에너지 흡수 및 강성도(stiffness)이 요구되는 특정 응용에 덜 적합한 낮은 경도 및 탄성률을 갖는 조성물을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적하는 물질 특성을 제공하도록 수성 용매를 극성 비수성 용매로 대체하기 위해 가교 결합된 레실린 조성물에 대해 용매 교환을 수행한다. 일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 DMSO를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비수성 용매는 수-혼화성이다. 일부 실시형태에서 비수성 용매는 비-휘발성 용매이다. 일부 실시형태에서, 비수성 용매는 복수의 알코올 작용기를 갖는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비수성 용매는 분자량이 약 100g/mol 미만인 분자 또는 분자들을 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 탄성률, 경도, 최대 탄성 압축 하중, 탄력성 및 물질 수명/피로를 포함하는 가교 결합된 레실린 조성물의 물질 특성은 용매 교환을 사용하여 조정될 수 있다. 가교 결합된 레실린과 용매 교환을 수행할 수 있는 용매는 비-가교 결합된 형태의 레실린을 용해시키는 용매를 포함한다.
일부 실시형태에서, 레실린의 수성 용매를 극성 비수성 용매로 대체하는 용매 교환은 열의 존재 하에서, 예를 들어, 약 60℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 용매 교환 공정은 레실린 고체에 대해서 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 5×, 적어도 10× 또는 적어도 20× 부피의 교환 용매를 함유하는 용액 중에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 용매 교환은 적어도 1 시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 8시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 DMSO가 가교 결합된 레실린 고체 조성물을 위한 교환 용매로서 사용된다.
일부 실시형태에서, 사용되는 교환 용매 및 농도의 선택은 용매 설계로부터, 목적하는 조정 가능한 기계적 특성, 예컨대, 강성도를 달성하도록 선택된다. 이것은 목적하는 응용(예를 들어, 슈 솔, 골프 공 등)에 따라서 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 용매 교환 공정에 의해서 그리고 비수성 용매 중에서 형성된 가교 결합된 레실린 조성물은 실온에서 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일 또는 적어도 50일 동안 안정적이다. 일부 실시형태에서, 상기 용매 교환 공정에 의해서 그리고 비수성 용매 중에서 형성된 가교 결합된 레실린 조성물은 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일 또는 적어도 50일 동안 곰팡이 성장에 대해서 저항성이다. 일부 실시형태에서, 상기 용매 교환 공정에 의해서 그리고 비수성 용매 중에서 형성된 가교 결합된 레실린 조성물은 적어도 7일 또는 적어도 14일 동안 탈수에 대해서 저항성이다. 이에 반해서, 수계의 가교 결합된 레실린 고체는, 주변 조건 하에서 개방 환경에 저장된 경우 2주 내에 완전히 탈수되고, 5 내지 14일 내에 곰팡이 성장이 관찰되었다. 또한, 수계 레실린 고체의 10㎜×5㎜ 디스크는 220lbs의 힘이 가해질 때 파괴된 반면, 글리세롤계 레실린 고체의 10㎜×5㎜ 디스크는 220lbs의 힘 하에서 파괴되지 않는다.
일부 실시형태에서, 연속적으로 시험된 물질 간의 상대적인 물질 특성을 레오미터를 사용하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 가교 결합된 레실린 조성물을 원통형 주형으로 형성할 수 있고, 생성된 레실린 원통을 레오미터를 사용하여 압축 시험에 적용한다. 재조합 레실린 원통은 어떠한 파괴도 없이 7.3㎜(평균 폭 5.4㎜)의 초기 높이로부터 0.66㎜ 미만까지 압축될 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 원통은 압축 하중의 해제 시 6.7㎜(평균 폭 5.6㎜)의 높이로 복귀되었다.
일부 실시형태에서, 극성 비수성 용매는 상기 용매의 부피 기준으로 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 극성 비수성 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 상기 용매의 부피 기준으로 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 DMSO를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 레실린 조성물은 수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린보다 더 높은 탄성률을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 가교 결합된 레실린 조성물은 50 이상, 40 이상, 30 이상, 20 이상, 10 이상, 10 내지 50, 40, 30 또는 20; 20 내지 50, 40 또는 30; 30 내지 50 또는 40; 또는 40 내지 50의 쇼어 OO 경도를 갖고; 일부 실시형태에서, 레실린에서 경도 측정은 ASTM D2240에 따라서 수행된다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 적어도 10의 경도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 적어도 30의 경도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 약 10 내지 약 50의 경도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가교 결합된 레실린 조성물의 경도는 교정용 솔(orthopedic sole)과 대등하다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D7121에 의해서 측정되는 경우 약 40% 내지 약 60%의 반발 탄력성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 ASTM D575에 의해서 측정되는 경우 약 6psi 내지 약 8psi의 25%에서의 압축 응력을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 즈빅 압축 시험에 의해서 측정되는 경우 2kN 미만의 압축력에서 탄성에서 가소성 전이를 경험하지 않는다.
일부 실시형태에서, 레실린 고체 물질 특성, 예컨대, 탄력성, 압축 탄성률, 인장 탄성률, 전단 탄성률, 파단 연장률, 최대 인장 강도, 경도, 강성도 및 반발률을 사용된 용매 및 용매 교환이 수행된 방법에 기초하여 조정할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 구배를 사용하거나 사용하지 않고, 레실린 고체로 교환될 수 있어서, 상이한 결과적인 물질 특성을 야기한다. 레실린 고체 중의 레실린의 농도 및 총 레실린의 부분으로서의 전장 레실린의 양을 또한 가교 결합된 레실린 고체 조성물의 물질 특성에 영향을 미치기 위해서 조정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 수계 레실린 조성물(즉, 수성 용매 중의 가교 결합된 레실린 조성물)을 극성 비수계 레실린 조성물(즉, 극성 비수성 용매 중의 가교 결합된 레실린 조성물)로 대체하기 위한 용매 교환은 유사한 탄력성 및 유사한 탄성을 갖는 더 높은 강성도의 물질을 야기한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%; 10% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%; 20% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30%; 30% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 40%; 40% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50%; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 또는 90% 내지 100중량%의 재조합 레실린을 포함한다. 재조합 레실린은 동일한 재조합 레실린 또는 적어도 2개의 상이한 아미노산 서열을 갖는 재조합 레실린의 혼합물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 각각의 조성물 중의 총 레실린의 부분으로서 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%; 10% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%; 20% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30%; 30% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 40%; 40% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50%; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 또는 90% 내지 100중량%의 전장 재조합 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 발포 물질이다. 일부 실시형태에서, 가교 결합된 레실린 조성물은 발포 물질, 예를 들어, 발포된 고체이다. 일부 실시형태에서, 발포 물질은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 공극률을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 공극률은 덩어리의 부피에 대한 물질의 공극의 부피의 백분율을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발포 물질의 밀도는 비-발포 물질의 밀도의 적어도 1/3, 예를 들어, 비-발포 가교 결합된 레실린 조성물의 밀도의 적어도 1/2, 적어도 3/4 또는 적어도 2배이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발포 물질 중의 기포의 평균 직경은 약 0.01㎜ 내지 약 3㎜, 예를 들어, 약 0.02㎜ 내지 약 1㎜, 약 0.05㎜ 내지 약 2㎜, 약 0.1㎜ 내지 약 3㎜, 약 0.2㎜ 내지 약 4㎜, 약 0.5㎜ 내지 약 5㎜, 약 1㎜ 내지 약 1.5㎜ 또는 약 1.5㎜ 내지 약 2㎜이다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 발포 물질의 하나 이상의 층을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발포 물질의 하나 이상 층은 목적하는 정렬로, 예를 들어, 순차적인 구성 또는 교호하는 구성으로 구성되며, 여기서 지지 층이 발포 물질의 2개의 층 사이에 배치된다. 발포 물질의 하나 이상 층은 당업계에 공지된 임의의 방식으로, 예를 들어, 분무 건조, 사출 성형으로 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 발포 물질의 하나 이상의 층은 하나 이상의 공극 공간을 포함한다. 각각의 층의 지형 및 함께 포개진 발포 물질의 하나 이상의 층의 성향은 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공극 공간은 하나 이상의 면 상에 유동 채널을 제공하여 가이드 공기 유동을 돕고 추가적인 흡수 능력을 제공한다.
기계적 특성
다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 가교 결합된 레실린을 포함하는 조성물에 비해서 상이한 특성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 합성 탄성 물질에 비해서 유사한 특성을 갖는다. 이러한 특성의 비제한적인 예는 탄력성, 압축 탄성률, 인장 탄성률, 전단 탄성률, 경도, 반발 및 압축 변형을 포함한다. 특정 기계적 특성을 갖는 조성물을 수득하도록 변형될 수 있는 파라미터는 예를 들어, 재조합 레실린의 길이 및/또는 서열, 재조합 레실린의 번역후 변형의 정도 및/또는 유형, 재조합 레실린의 가교 결합의 정도 및/또는 유형 및 가교 결합된 레실린 조성물의 용매의 특성을 포함한다.
일부 실시형태에서, 기계적 특성, 예컨대, 최대 인장 강도, 압축 탄성률, 인장 탄성률, 전단 탄성률, 파단 연장률 및 탄력성은 엘라스토머 샘플에 대한 응력-변형 측정을 수행하는 다수의 상이한 유형의 인장 및 압축 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 이력현상을 갖는 곡선을 비롯하여, 생성된 응력-변형 곡선은 인장 또는 압축으로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인장 및 압축 시험 시스템은 샘플에 변형을 가하고, 로드 셀을 사용하여 생성된 힘을 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기계적 특성은 거시적 규모(예를 들어, 거시적 압축 시험기를 사용하여), 현미경 또는 나노 규모(예를 들어, 원자력 현미경(atomic-force microscopy: AFM) 또는 나노인덴테이션(nanoindentation) 측정을 사용하여)로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 압축 기계적 특성은 표준 ASTM D575 - 91(2012) 압축 시의 고무 특성에 대한 표준 시험 방법에 따라 측정될 수 있다. 인장 시의 엘라스토머에 대한 기계적 측정은 ASTM D412 - 15a 가황 고무 및 열가소성 엘라스토머 대한 표준 시험 방법-인장을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 인장 강도는 ASTM D624 - 00 종래의 가황 고무 및 열가소성 엘라스토머의 인장 강도에 대한 표준 시험 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 슬랩, 접합 및 성형 엘라스토머의 기계적 특성은 ASTM D3574 - 11 가요성 다공성 물질 - 슬랩, 접합 및 성형 우레탄 발포체에 대한 표준 시험 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 기계적 특성은 ASTM D5992 - 96(2011) 진동 방법을 사용한 가황 고무 및 고무-유사 물질의 동적 시험을 위한 표준 가이드를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 90% 내지 100%; 95% 내지 100%, 90% 내지 99% 또는 95% 내지 99%의 탄력성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 10㎫ 미만, 7㎫ 미만, 5㎫ 미만, 2㎫ 미만, 1㎫ 미만, 0.5㎫ 미만 또는 0.1㎫ 미만; 0.01㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫, 2㎫, 1㎫, 0.5㎫ 또는 0.1㎫; 0.1㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫, 2㎫, 1㎫ 또는 0.5㎫; 0.5㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫, 2㎫ 또는 1㎫; 1㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫ 또는 2㎫; 2㎫ 내지 10㎫, 7㎫ 또는 5㎫; 5㎫ 내지 10㎫ 또는 7㎫; 또는 7㎫ 내지 10㎫의 압축 탄성률을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조성물의 압축 탄성률은 ASTM D575 - 91(2012) 압축 시의 고무 특성에 대한 표준 시험 방법에 정의된 바와 같이 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 10㎫ 미만, 7㎫ 미만, 5㎫ 미만, 2㎫ 미만, 1㎫ 미만, 0.5㎫ 미만 또는 0.1㎫ 미만; 0.01㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫, 2㎫, 1㎫ 또는 0.5㎫; 0.5㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫, 2㎫ 또는 1㎫; 1㎫ 내지 10㎫, 7㎫, 5㎫ 또는 2㎫; 2㎫ 내지 10㎫, 7㎫ 또는 5㎫; 5㎫ 내지 10㎫ 또는 7㎫; 또는 7㎫ 내지 10㎫의 인장 탄성률을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 1㎫ 미만, 100㎪ 미만, 50㎪ 미만, 20㎪ 미만, 10㎪ 미만 또는 1㎪ 미만; 0.1㎪ 내지 1㎫, 100㎪, 50㎪, 20㎪, 10㎪ 또는 1㎪; 1㎪ 내지 1㎫, 100㎪, 50㎪, 20㎪ 또는 10㎪; 10㎪ 내지 1㎫, 100㎪, 50㎪ 또는 20㎪; 20㎪ 내지 1㎫, 100㎪ 또는 50㎪; 50㎪ 내지 1㎫ 또는 100㎪; 또는 100㎪ 내지 1㎫의 전단 탄성률을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 1% 초과, 10% 초과, 50% 초과, 100% 초과, 300% 초과 또는 500% 초과; 1% 내지 500%, 300%, 100%, 50% 또는 10%; 10% 내지 500%, 300%, 100% 또는 50%; 50% 내지 500%, 300% 또는 100%; 100% 내지 500% 또는 300%; 또는 300% 내지 500%의 파단 연장률을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 0.1㎪ 초과, 1㎪ 초과, 2㎪ 초과, 5㎪ 초과 또는 10㎪ 초과; 0.1㎪ 내지 100㎪, 10㎪, 5㎪, 2㎪ 또는 1㎪; 1㎪ 내지 100㎪, 10㎪, 5㎪ 또는 2㎪; 2㎪ 내지 100㎪, 10㎪ 또는 5㎪; 5㎪ 내지 100㎪ 또는 10㎪; 또는 10㎪ 내지 100㎪의 최대 인장 강도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 기계적 특성, 예컨대, 경도 및 압축 탄성률은 인덴테이션 및 나노인덴테이션 측정 시스템을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 양의 변형에 대해서 샘플을 인덴테이션시키기 위해서 팁을 사용하는 인덴테이션 측정을 사용하여 레실린의 경도 및 압축 탄성률을 측정하고, 생성된 힘을 로드 셀을 사용하여 측정한다. 일부 실시형태에서, 비스커(Vicker) 및 베르보비치(Berkovich) 형상의 팁을 비롯한 상이한 팁 형상을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인덴테이션 기술에 의해서 측정된 경도는 하기 관계식을 특징으로 한다, 경도 = (최대 힘)/(접촉 면적).
일부 실시형태에서, 중합체, 엘라스토머 및 고무의 경도는 경도계를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서 엘라스토머의 경도는 표준 ASTM D2240을 사용하여 측정될 수 있는데, 이것은 특정 스프링력 및 인덴터 구성의 조합을 사용하여 12개의 상이한 경도계 스케일을 인식한다. 가장 일반적인 스케일은 쇼어 OO, A 및 D 경도 스케일이다. 경도 스케일은 0 내지 100 범위인데, 여기서 0은 더 무른 물질이고, 100은 더 단단한 물질이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만 또는 20 미만; 10 내지 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 또는 20; 20 내지 90, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30; 30 내지 90, 80, 70, 60, 50 또는 40; 40 내지 90, 80, 70, 60 또는 50; 50 내지 90, 80, 70 또는 60; 60 내지 90, 80 또는 70; 70 내지 90 또는 80; 또는 80 내지 90의 쇼어 OO 경도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 레실린의 경도 측정은 ASTM D2240에 따라서 수행된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "반발"은 탈력성의 특정 척도를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 반발은 진자 도구 및 드롭 볼을 비롯한 다양한 도구로 측정될 수 있다. 진자 유형 측정에서, 일반적으로 반발 백분율이라고 불리는 RB는 하기 수학식으로부터 결정된다:
Figure pct00001
반발 탄력성은 하기와 같이 계산될 수 있다:
Figure pct00002
식 중, h = 반발의 정점 높이, H = 초기 높이. 반발 탄력성은 또한 반발 각도의 측정에 의해서 결정될 수 있다. 엘라스토머에서 반발을 결정하기 위한 시험의 일부 예는 ASTM D2632 - 15 및 ASTM D7121 - 05(2012)이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 90% 내지 100%; 95% 내지 100%, 90% 내지 99% 또는 95% 내지 99%의 반발을 갖는다. 일부 실시형태에서, 레실린의 반발 측정은 ASTM D2632 - 15 또는 ASTM D7121 - 05(2012)에 따라서 수행된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "압축 변형"은 적용된 힘이 제거된 후 남아있는 영구적인 탈형의 척도를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 압축 변형은 공기 중에서 일정한 힘 하에서의 압축 변형(압축 변형 A로 지칭), 공기 중에서 일정한 편향 하에서의 압축 변형(압축 변형 B로 지칭) 및 물질 경도를 고려하여 공기 중에서 일정한 편향 하에서의 압축 변형(압축 변형 C로 지칭)을 비롯하여, 상이한 방식으로 측정될 수 있다. 압축 변형 A(CA)는 하기 표현에 의해서 계산된다: CA = [(to - ti)/to] x 100, (식 중, to는 본래 시편 두께이고, ti는 시험 후 시편 두께임). 압축 변형 B(CB)는 CB = [(to - ti)/(to - tn)] x 100로 주어지고, 식 중, to는 본래 시편 두께이고, ti는 시험 후 시편 두께이고, tn은 시험 동안 스페이서 두께 또는 시편 두께이다. 엘라스토머의 압축 변형을 결정하기 위한 시험 방법의 일부 예는 ASTM D3574 - 11 및 ASTM D395 - 16이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 90% 내지 100%; 95% 내지 100%, 90% 내지 99% 또는 95% 내지 99%의 압축 변형 A 또는 압축 변형 B를 갖는다. 일부 실시형태에서, 레실린의 압축 변형 측정은 ASTM D3574 - 11 및 ASTM D395 - 16에 따라서 수행된다.
레실린을 제품으로 가공 및 형성하는 것은 상이한 응용을 위해서 다수의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물은 겔, 다공성 스폰지, 필름, 가공 가능한 고체, 캐스트 형태(cast form), 성형 형태 및 복합재를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 형상 및 형태를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "밀도"는 샘플의 질량을 밀도로 나눈 값을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머는 공기 기포를 제거하기 위해서 물 대신에 알코올을 사용하는 피크노미터(pycnometer)를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 밀도는 유체정력학적 방법(hydrostatic method)을 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "압축 부피 밀도"는 샘플 질량 대 샘플의 압축 부피의 비를 지칭하고, 여기서 "압축 부피"는 피스톤-원통 시험 챔버 인클로저의 주변 형상에 완전히 일치할 때까지 유동하게 하기에 충분한 압축력에 적용될 때 엘라스토머 샘플에 의해서 달성된 최종 평형 부피로서 정의된다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 압축 부피 밀도는 압축 부피 덴시오미터를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 0.5㎎/㎤ 내지 2.0㎎/㎤ 또는 1.0㎎/㎤ 내지 1.5 ㎎/㎤ 또는 1.1㎎/㎤ 내지 1.4㎎/㎤ 또는 1.2㎎/㎤ 내지 1.35㎎/㎤의 밀도 또는 압축 부피 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 엘라스토머의 밀도 또는 압축 부피 밀도의 결정은 ASTM D297 - 15 고무 제품에 대한 표준 시험 방법 - 화학적 분석을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 제공된 조성물은 특히 항공우주, 자동차, 스포츠 장비, 진동 차단, 신발 및 의류에서의 응용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 용도를 갖는다. 이러한 카테고리의 일부 응용은 비제한적인 예로 열거된다. 바람직한 탄성 효율로 인해서, 레실린은 기계적 에너지를 저장하고 회수하기 위한 에너지 저장 장치(예를 들어, 고무 밴드)로 사용될 수 있다. 자동차 서스펜션 시스템은 레실린 부싱(bushing)을 적용하여 임의의 속도로 범프(bump)를 지나고 움푹 패인 곳을 통과할 때 도로에서 더 양호한 타이어 접촉을 유지시킴으로써 개선될 수 있다. 추가로, 골프공 코어, 테니스 라켓 그립, 골프 클럽 그립 및 탁구 패들을 포함하여 다르게 조정된 기계적 특성을 갖는 레실린에 대한 다수의 스포츠 장비 응용이 존재한다.
본 명세서에 제공된 레실린 조성물의 고유한 특성으로 인해서 신발이 특히 흥미롭다. 밑창 또는 중창으로서, 레실린은 발 충격을 완충하고, 그러한 발 충격으로부터의 더 많은 에너지를 전방 운동량으로 복원함으로써 신발의 편안함과 생체효율성을 개선시킬 수 있다. 중창으로서, 레실린은 전체 중창을 구성하거나 또는 그 특성을 보완하기 위해 또 다른 물질(예를 들어, 마모 또는 내마모성 물질 또는 견인을 위해 조정된 물질) 내에 캡슐화될 수 있다. 레실린 중창은 또한 향상된 성능을 제공하기 위해 협력하여 작동하는 상이하게 조정된 기계적 특성을 갖는 복수의 레실린 물질을 함유할 수 있다(예를 들어, 더 부드러운 뒤꿈치 타격 영역 및 더 단단한 아치 지지대).
벡터, 숙주 세포 및 발효
추가로 본 명세서에는 재조합 레실린을 암호화하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포 및 이러한 재조합 숙주 세포 및 재조합 레실린을 포함한 발효물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 벡터는 N-말단에서 분비 신호에 융합되고, 그리고 선택적으로 C-말단에서 태그 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합된 레실린 폴리펩타이드를 암호화하는 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 특정 숙주 세포에서 발현을 위해서 코돈 최적화된 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다.
적합한 분비 신호는 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 분비를 매개하는 분비 신호이다. 적합한 분비 신호의 비제한적인 예는 사카로마이세스 세레비시애의 알파 메이팅 인자(α-MF), 피치아 파스토리스의 산 포스파타제(PHO1) 및 일반 콩 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로부터의 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin: PHA-E)의 분비 신호이다. 추가 분비 신호는 당업계에 공지되어 있거나 또는 숙주 세포에 의해서 분비된 단백질을 식별하고, 그 다음 분비된 단백질을 게놈 분석하고, 미번역된 N-말단 서열을 식별함으로써 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Huang et al. A proteomic analysis of the Pichia pastoris secretome in methanol-induced cultures. Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Apr;90(1):235-47] 참조).
분비된 레실린 암호 서열에 의해서 암호화된 레실린은 태그 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 추가로 융합될 수 있다. 태그 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 친화성 태그(즉, 특정 작용제 또는 매트릭스에 결합하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 가용화 태그(즉, 단백질의 적절한 접힘을 보조하고, 침전을 방지하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 크로마토그래피 태그(즉, 단백질의 크로마토그래피 특성을 변경하여 특정 분리 기술을 통해서 상이한 분할을 제공하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 에피토프 태그(즉, 항체에 의해서 결합된 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 형광 태그(즉, 여기 시 짧은 파장의 광과 함께 높은 파장의 광을 방출하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 색소생산성(chromogenic) 태그(즉, 가시광 스펙트럼의 특정 부분을 흡수하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 효소 기질 태그(즉, 특정 효소 반응을 위한 기질인 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 화학적 기질 태그(즉, 특정 화학적 변형을 위한 기질인 펩타이드 또는 폴리펩타이드) 또는 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 친화성 태그의 비제한적인 예는 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), poly(His) 태그, SBP-태그, 스트렙트-태그 및 카모둘린-태그를 포함한다. 적합한 용해도 태그의 비제한적인 예는 티오레독신(TRX), poly(NANP), MBP 및 GST를 포함한다. 크로마토그래피 태그의 비제한적인 예는 다음이온성(polyanionic) 아미노산(예를 들어, FLAG-태그[GDYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK(서열번호 45)]) 및 폴리글루타메이트 태그를 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 V5-태그, VSV-태그, Myc-태그, HA-태그, E-태그, NE-태그 및 FLAG-태그를 포함한다. 형광 태그의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 주황색 형광 단백질(OFP), 적색 형광 단백질(RFP) 및 이들의 유도체를 포함한다. 색소생산성 태그의 비제한적인 예는 GFP-유사 패밀리의 단백질의 비형광 구성원(예를 들어, BlitzenBlue, DonnerMagenta; DNA2.0, 미국 캘리포니아주 뉴워드 소재)을 포함한다. 효소 기질 태그의 비제한적인 예는 바이오티닐화(biotinilation)에 적합한 서열 내에 라이신을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예를 들어, AviTag, Biotin Carboxyl Carrier Protein[BCCP])를 포함한다. 화학 기질 태그의 비제한적인 예는 FIAsH-EDT2와의 반응에 적합한 기질을 포함한다. 레실린에 대한 C-말단 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 융합은 (예를 들어, TEV 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 또는 엔테로펩티다제에 의해서) 절단 가능할 수 있거나 절단 가능하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 단일 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 2개 이상(예를 들어, 3, 4 또는 5개)의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열은 동일하다. 이러한 다른 실시형태에서, 분비된 레실린 암호 서열 중 적어도 2개는 동일하지 않다. 분비된 레실린 암호 서열 중 적어도 2개가 동일하지 않은 실시형태에서, 적어도 2개의 분비된 레실린 암호 서열은 레실린 및/또는 분비 서열 및/또는 이들이 암호화하는 선택적인 태그 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 서로 상이할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 분비된 레실린 암호 서열의 발현을 유도하도록 분비된 레실린 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도성 프로모터의 유도는 글루코스 억압, 갈락토스 유도, 수크로스 유도, 포스페이트 억제, 티아민 억제 또는 메탄올 유도를 통해서 일어난다. 적합한 프로모터는 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포에서 단백질의 발현을 매개하는 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터의 비제한적인 예는 AOX1 프로모터, GAP 프로모터, LAC4-PBI 프로모터, T7 프로모터, TAC 프로모터, GCW14 프로모터, GAL1 프로모터, λPL 프로모터, λPR 프로모터, 베타-락타마제 프로모터, 스파(spa) 프로모터, CYC1 프로모터, TDH3 프로모터, GPD 프로모터, TEF1 프로모터, ENO2 프로모터, PGL1 프로모터, SUC2 프로모터, ADH1 프로모터, ADH2 프로모터, HXT7 프로모터, PHO5 프로모터 및 CLB1 프로모터를 포함한다. 분비된 레실린 암호 서열의 발현을 용이하게 하는 데 사용될 수 있는 추가적인 프로모터가 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 분비된 레실린 암호 서열의 전사의 종결을 달성하도록 분비된 레실린 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 종결자를 포함한다. 적합한 종결자는 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포에서 전사를 종결하는 종결자를 포함한다. 적합한 종결자의 비제한적인 예는 AOX1 종결자, PGK1 종결자 및 TPS1 종결자를 포함한다. 분비된 레실린 암호 서열의 전사의 종결을 달성하는 추가적인 종결자가 당업계에 공지되어 있다.
벡터가 2개 이상의 레실린 암호 서열을 포함하는 실시형태에서, 2개 이상의 레실린 암호 서열은 동일한 프로모터 및/또는 종결자 또는 2개 이상의 상이한 프로모터 및/또는 종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 제공된 벡터는 재조합 숙주 세포에서 벡터의 증식에 적합한 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 요소의 비제한적인 예는 박테리아 복제 기원 및 선택 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자 및 영양요구성(auxotrophic) 마커)를 포함한다. 박테리아 복제 기원 및 선택 마커는 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 선택 마커는 약물 내성 마커이다. 약물 내성 마커는 그렇지 않았으면 세포를 사멸시켰을 외인성으로 첨가된 약물을 세포가 해독할 수 있게 한다. 약물 내성 마커의 예시적인 예는 항생제, 예컨대, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 하이그로 마이신, 네오마이신, 제오신(Zeocin)™ 등에 대한 내성에 대한 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 선택 마커는 영양요구성 마커이다. 영양요구성 마커는 세포가 필수 성분(보통 아미노산)을 합성하면서, 필수 성분이 부족한 배지에서 성장하도록 한다. 선택 가능한 영양요구성 유전자 서열은 예를 들어, hisD를 포함하며, 이는 히스티딘올의 존재 하에서 히스티딘 무함유 배지에서 성장을 가능하게 한다. 본 발명의 벡터에 적합한 다른 선택 마커는 블레오마이신-내성 유전자, 메탈로티오네인 유전자, 하이크로마이신 B-포스포트랜스퍼라제 유전자, AURI 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, 티미딘 키나제 유전자 및 잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함한다.
본 발명의 벡터는 분비된 레실린 암호 서열을 숙주 세포 게놈의 특정 위치로 통합하는 표적화 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표적화 서열의 비제한적인 예는 숙주 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 숙주 세포의 게놈에서 반복적 요소와 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 숙주 세포의 게놈에서 전이성(transposable) 요소와 동일하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 예를 들어, 상동성 재조합 또는 표적화된 통합을 통해, 재조합 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내에 안정적으로 통합된다. 게놈 통합에 적합한 부위의 비제한적인 예는 사카로마이세스 세레비시애 게놈 내의 Ty1 유전자좌, 피치아 파스토리스 게놈 내의 rDNA HSP82 유전자좌 및 재조합 숙주 세포의 게놈 전체에 산재된 카피를 갖는 전이 요소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 재조합 숙주 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합되지 않고, 오히려 염색체외에 존재한다.
재조합 숙주 세포는 포유동물, 식물, 조류, 진균 또는 미생물 기원 일 수 있다. 적합한 진균의 비제한적인 예는 메틸로트로픽 효모, 필라멘트성 효모, 아르쿨라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼길루스 니거 바르. 아와모리(Aspergillus niger var. awamori), 아스퍼길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 칸디다 에?M시(Candida etchellsii), 칸디다 귈리어몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 후밀리스(Candida humilis), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 버사틸리스(Candida versatilis), 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 엔도티아 파라시티카(Endothia parasitica), 애레모테큠 아쉬비이(Eremothecium ashbyii), 푸사리움 모닐리포름(Fusarium moniliforme), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 터모톨러란스(Kluyveromyces thermotolerans), 모테이렐라 비나세애 바르. 라피노세우틸리저(Morteirella vinaceae var. raffinoseutilizer), 무코 미에헤이(Mucor miehei), 무코 미에헤이 바르. 쿠니 엣 에머슨(Mucor miehei var. Cooney et Emerson), 무코르 푸실러스 린트(Mucor pusillus Lindt), 페니실리엄 로퀘포르티(Penicillium roquefortii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(코마가탤라 파피(Komagataella phaffii)), 피치아(Pichia)(쉐퍼소마이세스(Scheffersomyces) 스티피티스(stipitis), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 로도토룰라 종(Rhodotorula sp.), 사카로마이세스 베이아누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 베티쿠스(Saccharomyces beticus), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 체발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 엘립소이데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 사카로마이세스 사케(Saccharomyces sake), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 스포리디오볼러스 존소니(Sporidiobolus johnsonii), 스포리디오볼루스 살로니컬러(Sporidiobolus salmonicolor), 스포로볼로마이세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), 트리코더마 레시(Trichoderma reesi), 잔토필로마이세스 덴드로로우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 애로위아 리폴리티카, 지고사카로마이세스 로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) 및 이들의 유도체 및 잡종을 포함한다.
적합한 미생물의 비제한적인 예는 아세토박터 수복시단스(Acetobacter suboxydans), 아세토박터 질리넘(Acetobacter xylinum), 악티노플레인 미소우리엔시스(Actinoplane missouriensis), 아트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 에웨리키아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 레우터리(Lactobacillus reuteri), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 락티스 란세필드 그룹 N(Lactococcus lactis Lancefield Group N), 류코노스토크 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 류코노스토크 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 류코노스토크 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주 NRRL B-512(F), 마이크로코쿠스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 스피룰리나(Spirulina), 스트렙토코쿠스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 락티스 섭스페시에스 다이아세틸락티스(Streptococcus lactis subspecies diacetylactis), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토마이세스 차타노오겐시스(Streptomyces chattanoogensis), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 나탈렌시스(Streptomyces natalensis), 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 올리보크로모게네스(Streptomyces olivochromogenes), 스트렙토마이세스 루비기노수스(Streptomyces rubiginosus), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 및 이들의 유도체 및 잡종을 포함한다. 재조합 숙주 세포로서 사용될 수 있는 추가 균주는 당업계에 공지되어 있다. 용어 "재조합 숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하도록 의도된다. 특정 변형이 어느 하나의 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속적인 생성에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실상, 모체 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"의 범주에 여전히 포함된다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 본 명세서에 제공된 재조합 레실린의 생산을 개선시키는 유전자 변형을 포함한다. 이러한 유전자 변형의 비제한적인 예는 변경된 프로모터, 변경된 키나제 활성, 변경된 단백질 접힘 활성, 변경된 단백질 분비 활성, 변경된 유전자 발현 유도 경로 및 변경된 프로테아제 활성을 포함한다.
본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포는 적합한 기원의 세포를 본 명세서에 제공된 벡터로 형질전환시킴으로써 생성된다. 이러한 형질전환을 위해서, 벡터는 환식 또는 선형일 수 있다. 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포 형질전환체는 예를 들어, 세포 성장에 대한 선택을 허용하는 벡터에 의해 암호화된 약물 내성 또는 영양요구성 마커를 발현하거나 또는 다른 수단(예를 들어, 벡터에 포함된 발광 펩타이드의 검출, 예를 들어, 제한 효소 매핑, PCR 증폭 또는 단리된 염색체외 벡터 또는 염색체 통합 부위의 서열 분석에 의한 개별 재조합 숙주 세포 집락의 분자 분석)에 의해 쉽게 식별될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포는 본 명세서에 제공된 재조합 레실린의 높은 역가를 생산할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 4㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 6㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 8㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 12㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 14㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 16㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 18㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 25㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과; 2 내지 40, 30, 20, 10 또는 5㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 5 내지 40, 30, 20 또는 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 10 내지 40, 30 또는 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 20 내지 40 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 또는 30 내지 40㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간의 속도로 재조합 레실린을 생산한다. 이러한 다른 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 4㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 6㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 8㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 12㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 14㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 16㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 18㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 25㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과; 2 내지 40, 30, 20, 10 또는 5㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 5 내지 40, 30, 20 또는 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 10 내지 40, 30 또는 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 20 내지 40 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 또는 30 내지 40㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간의 속도로 재조합 레실린을 분비한다. 생산된 재조합 레실린의 아이덴티티는 HPLC 정량, 웨스턴 블롯 분석, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 2차원 질량 분광법(2D-MS/MS) 서열 식별을 통해 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포는 본 명세서에 제공된 재조합 레실린의 분비된 분획을 갖는다. 일부 이러한 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 90% 내지 100% 또는 90%; 또는 90% 내지 100%인 재조합 레실린의 분비된 분획을 갖는다.
재조합 레실린의 생산 및 분비는 재조합 숙주 세포에 포함된 분비된 레실린 암호 서열의 카피의 수 및/또는 재조합 숙주 세포에 포함된 분비된 레실린 암호 서열의 전사 속도에 영향을 받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 단일의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 강한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 강한 프로모터의 비제한적인 예는 피치아 파스토리스의 pGCW14 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 중간 프로모터에 작동 가능하게 연결된 분비된 레실린 암호 서열을 포함한다. 이러한 중간 프로모터의 비제한적인 예는 피치아 파스토리스의 pGAP 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 약한 프로모터의 제어 하에서 레실린을 암호화하는 암호 서열을 포함한다.
명세서에 제공된 발효물은 본 명세서에 기재된 재조합 숙주 세포 및 재조합 숙주 세포를 성장시키는 데 적합한 배양 배지를 포함한다.
발효물은 세포 생존 및/또는 성장 및 재조합 레실린의 분비를 위해 재조합 숙주 세포에 필요한 영양분을 제공하는 배양 배지에서 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 얻어진다. 이러한 배양 배지는 전형적으로 과량의 탄소 공급원을 함유한다. 적합한 탄소 공급원의 비제한적인 예는 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 단당류의 비제한적인 예는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 리보스, 자일로스, 아라비노스, 리보스 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 이당류의 비제한적인 예는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 다당류의 비제한적인 예는 라피노스, 전분, 글리코겐, 글리칸, 셀룰로스, 키틴 및 이들의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발효물은 총 발효물의 적어도 1%, 5%, 10%, 20% 또는 30%; 1% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10%; 10% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%; 20% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30%; 30% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% 또는 40%; 40% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50%; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70% 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80% 또는 70%; 70% 내지 100%, 90% 또는 80%; 80% 내지 100% 또는 90%; 또는 90% 내지 100중량%의 양의 재조합 레실린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발효물은 적어도 2g/ℓ, 5g/ℓ, 10g/ℓ, 15g/ℓ, 20g/ℓ, 25g/ℓ 또는 30g/ℓ; 2g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ, 60g/ℓ, 50g/ℓ, 40g/ℓ, 30g/ℓ, 20g/ℓ 또는 10g/ℓ; 10g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ, 60g/ℓ, 50g/ℓ, 40g/ℓ, 30g/ℓ 또는 20g/ℓ; 20g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ, 60g/ℓ, 50g/ℓ, 40g/ℓ 또는 30g/ℓ; 30g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ, 60g/ℓ, 50g/ℓ 또는 40g/ℓ; 40g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ, 60g/ℓ 또는 50g/ℓ; 50g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ, 70g/ℓ 또는 60g/ℓ; 60g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ, 80g/ℓ 또는 70g/ℓ; 70g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ, 90g/ℓ 또는 80g/ℓ; 80g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ, 100g/ℓ 또는 90g/ℓ; 90g/ℓ 내지 300g/ℓ, 200g/ℓ 또는 100g/ℓ; 100g/ℓ 내지 300g/ℓ 또는 200g/ℓ; 또는 200g/ℓ 내지 300g/ℓ의 양의 재조합 레실린을 포함한다.
재조합 레실린의 생산 방법
추가로 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 재조합 레실린의 생산 방법이 제공된다.
이 방법은 달리 제시되지 않는 한 일반적으로 당업계에 널리 공지된 종래의 방법에 따라서 그리고 본 명세서 전체에 논의되거나 인용된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990; Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press, 2003; Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press, 1976; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press, 1976; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999] 참조).
일부 실시형태에서, 레실린을 숙주 세포로부터 세포외로 분비하기 위한 신규 방법이 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법은 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 벡터를 작제하는 단계(도 2의 단계 1001), 벡터를 숙주 세포에서 형질전환시키는 단계(도 2의 단계 1002), 및 이어서 재조합 숙주 세포를 배양하여 세포외에서 레실린을 분비하는 단계(도 2의 단계 1003)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 2㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 4㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 6㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 8㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 12㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 14㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 16㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 18㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간, 25㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간 초과; 2 내지 40, 30, 20, 10 또는 5㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 5 내지 40, 30, 20 또는 10㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 10 내지 40, 30 또는 20㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 20 내지 40 또는 30㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간; 또는 30 내지 40㎎ 레실린/g 건조 세포 중량/시간의 속도로 세포외로 레실린을 분비하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이어서 분비된 레실린을 정제시키고(도 2의 단계 1004), 및 정제된 레실린을 가교 결합시켜 엘라스토머를 형성한다(도 2의 단계 1005). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 벡터로 세포를 형질전환시키는 단계 (도 2의 단계 1002)를 포함한다. 세포를 벡터로 형질전환시키는 방법을 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 인산칼슘 형질주입, 덴드리머 형질주입, 리포솜 형질주입(예를 들어, 양이온성 리포솜 형질주입), 양이온성 중합체 형질주입, 전기천공, 세포 압착, 소노포레이션(sonoporation), 광학 형질주입, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 수력학적 전달, 유전자 총, 자기감염(magnetofection) 및 바이러스 형질도입을 포함한다. 당업자는 벡터를 도입하기 위한 특정 기술이 특정 유형의 세포에 대해 더 양호하게 작동한다는 당업계의 지식에 기초하여 본 명세서에 제공된 벡터로 세포를 형질전환시키기 위한 하나 이상의 적합한 방법을 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 제공된 발효물을 수득하기에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 본 명세서에 제공된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계(도 2의 단계 1003)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조건 및 배양 배지는 재조합 숙주 세포로부터 배양 배지로의 재조합 단백질의 분비를 촉진시키기에 적합하다. 이러한 방법에 사용하기에 적합한 배양 배지는 적합한 배양 조건과 마찬가지로 당업계에 공지되어 있다. 효모 숙주 세포를 배양하는 예시적인 상세사항은 문헌[Idiris et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 86:403-417, 2010; Zhang et al., Biotechnol. Bioprocess. Eng. 5:275-287, 2000; Zhu, Biotechnol. Adv. 30:1158-1170, 2012; Li et al., MAbs 2:466-477, 2010]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 제공된 발효물로부터 분비된 재조합 레실린을 정제시켜 본 명세서에 제공된 재조합 레실린을 얻는 단계(도 2의 단계 1004)를 추가로 포함한다. 정제는 발효물로부터 분비된 단백질을 정제시키기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법의 일반적인 단계는 (세포를 제거하기 위한) 원심분리, 그 다음 침전제 또는 다른 적합한 코스모트로프(예를 들어, 황산암모늄)를 사용하여 단백질을 침전시키는 것을 포함한다. 이어서, 침전된 단백질을 원심분리에 의해서 상청액으로부터 분리시키고, 용매(예를 들어, 인산염 완충 식염수[PBS]) 중에 재현탁시킬 수 있다. 현탁된 단백질을 투석시켜 용해된 염을 제거할 수 있다. 추가로, 투석된 단백질을 가열시켜 다른 단백질을 변성시킬 수 있고, 변성된 단백질을 원심분리에 의해서 제거할 수 있다. 선택적으로, 정제된 재조합 레실린을 코아서베이션시킬 수 있다.
다양한 실시형태에서, 발효물로부터 분비된 재조합 단백질을 정제시키는 방법은 공지된 카오트로프, 예컨대, 유레아 또는 구아니딘 티오사이아네이트를 갖는 전체 세포 브로쓰 또는 세포 펠릿 중에 단백질을 가용화시키는 것과 함께 다양한 원심분리를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 단백질은 전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 세포의 제1 펠릿 및 제1 상청액을 생성시키고, 제1 상청액을 추출시켜 투명한 세포 브로쓰를 생성시킴으로써 정제될 수 있다. 이어서, 제1 상청액을 황산암모늄을 사용하여 침전시키고, 원심분리시켜 제2 펠릿 및 제2 상청액(폐기함)을 생성시킨다. 이어서 제2 펠릿을 투석을 위해서 PBS에 재현탁시킨다. 일부 실시형태에서, 이어서 투석된 용액을 고온에 적용하여, 표적 재조합 단백질보다 덜 안정적인 단백질을 변성시킨다. 이어서, 투석 및 변성된 용액을 원심분리시켜 제3 펠릿 및 제3 상청액을 생성시킴으로써 변성된 단백질을 제거한다. 제3 상청액을 변성된 용액으로부터 유지시키고, 이어서 제3 상청액을 냉각시켜 표적 재조합 레실린 단백질을 함유하는 짙은(dense) 하부층 및 상부층으로 상 분리를 유도함으로써 코아서베이션시킨다. 이러한 방법으로 정제된 샘플을 "CCB" 샘플이라고 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하부층을 유지시키고, 하부층을 더 낮은 온도에서 인큐베이션시켜 추가 상 분리를 유도함으로써 다중 코아서베이션을 수행한다.
일부 실시형태에서, 전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 세포 및 세포에 인접한(예를 들어, 세포에 부착된, 세포의 표면 상의) 단백질 및/또는 불용성 단백질(예를 들어 단백질 응집물)의 제1 펠릿 및 제1 상청액을 생성시키고, 이어서 제1 상청액을 폐기하여 제1 펠릿을 얻음으로써 재조합 레실린 단백질을 정제시킬 수 있다. 이어서 제1 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 재현탁시켜 재조합 레 실린 단백질을 용해시킬 수 있다. 재현탁액을 다시 원심분리시켜 제2 펠릿 및 제2 상청액을 생성시킨다. 이어서, 재조합 레실린 이외의 단백질을 변성시키기 위해서 제2 상청액을 PBS에 대해 투석시키고, 고온에 적용하고 원심분리시켜 제3 펠릿 및 제3 상청액을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 이어서 제3 상청액을 급냉에 의해 코아서베이션시켜 재조합 레실린을 함유하는 짙은 하부층 및 상부층으로 상 분리를 생성시킨다. 이 방법으로 정제된 샘플을 "겔 층" 샘플이라고 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하부층을 유지시키고, 하부층을 더 낮은 온도에서 인큐베이션시켜 추가 상 분리를 유도함으로써 다중 코아서베이션을 수행한다.
일부 실시형태에서, 전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 펠릿 및 상청액을 생성시키고, 이어서 상청액을 폐기하여 세포 및 세포에 인접한(예를 들어, 세포에 부착된, 세포의 표면 상의) 단백질 및/또는 불용성 단백질(예를 들어 단백질 응집물)의 펠릿을 얻음으로써 재조합 레실린 단백질을 정제시킬 수 있다. 이어서, 세포 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 재현탁시켜 세포에 인접한 단백질을 가용화시킨다. 재현탁액을 다시 원심분리시켜 세포의 제2 펠릿 및 제2 상청액을 생성시킨다. 이어서, 제2 상청액을 황산암모늄으로 침전시키고, 원심분리시켜 제3 펠릿 및 제3 상청액을 생성시킨다. 이어서, 제3 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 현탁시킨 다음, PBS에 대해 투석시키고, 고온에 적용하여 재조합 레실린 이외의 단백질을 변성시키고, 원심분리시켜 제4 상청액 및 제4 펠릿을 생성시킨다. 이어서, 급냉에 의해서 제4 상청액을 코아서베이션시켜 상 분리를 수행하였다. 이 방법으로 정제된 샘플을 "침전된 겔 층" 샘플이라고 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 전체 세포 브로쓰에 유레아를 첨가하여 단백질을 가용화시키고, 이어서 전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 제1 펠릿 및 제1 상청액을 생성시킴으로써 재조합 레실린 단백질을 정제시킬 수 있다. 이어서, 제1 상청액을 황산암모늄을 사용하여 침전시키고, 원심분리시켜 제2 펠릿 및 제2 상청액을 생성시킨다. 제2 상청액을 폐기하고, 이어서 제2 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 재현탁시키고, PBS에 대해서 투석시키고, 이어서 재조합 레실린 이외의 단백질을 변성시키기 위해서 고온에 적용하고, 다시 원심분리시켜 제2 펠릿 및 제3 상청액을 생성시킨다. 이어서 제3 상청액을 냉각시켜 재조합 레실린을 함유하는 짙은 하부층 및 상부층으로 상 분리를 유도함으로써 제3 상청액을 코아서베이션시킨다. 이 방법으로 정제된 샘플을 "Urea WCBE" 샘플이라고 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 제1 펠릿 및 제1 상청액을 생성시키고, 이어서 제1 상척액을 폐기하여 세포 및 세포에 인접한(예를 들어, 세포에 부착된, 세포의 표면 상의) 단백질 및/또는 불용성 단백질(예를 들어 단백질 응집물)의 제1 펠릿을 얻음으로써 재조합 레실린 단백질을 정제시킬 수 있다. 이어서, 세포의 제1 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 재현탁시켜 단백질을 가용화시킨다. 재현탁액을 다시 원심분리시켜 세포의 제2 펠릿 및 제2 상청액을 생성시킨다. 이어서, 제2 상청액을 PBS에 대해 투석시킨 후, 원심분리시켜 단백질의 무거운 상, 상청액의 가벼운 상 및 필름을 생성시키고, 가벼운 상으로부터 무거운 상을 분리시킨다. 이어서, 가벼운 상 및 필름을 폐기함으로써 단백질의 무거운 상을 단리시킨다. 이 방법으로 정제된 샘플을 "짙은 층" 샘플이라고 지칭할 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 레실린 조성물은 발포 물질이다. 일부 실시형태에서, 재조합 레실린 발포체의 제조 방법은 수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 상기 수성 용매를 극성 비수성 용매와 교환시키는 단계; 및 하나 이상 기포를 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물에 도입하는 단계를 포함한다. 당업계에 공지된 기포를 도입하는 임의의 방법이 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 기포를 도입하는 방법은 보텍싱, 혼합, 효모 첨가 및 화학 반응을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상 기포를 도입하는 단계는 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계와 동시에 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상 기포를 도입하는 단계는 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계 이후에 일어날 수 있다.
발포제를 전형적으로 중합체 물질에 도입하여 중합체 발포체를 만든다. 일 실시형태에 따르면, 화학 발포제를 중합체와 혼합한다. 화학 발포제는 전형적으로 중합체가 용융되어 가스를 형성하는 조건 하에서, 중합체 물질에서 화학 반응을 겪는다. 화학 발포제는 일반적으로 특정 온도에서 분해되어, 기체, 예컨대, 질소, 이산화탄소 또는 일산화탄소를 방출하는 저분자량 유기 화합물이다.
예시적인 화학 발포제는 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 암모늄, 아조다이카본아마이드, 아이소사이아네이트, 하이드라진, 아이소프로판올, 5-페닐테트라졸, 트라이아졸, 4,4'옥시비스(벤젠설포닐 하이드라자이드)(OBSH), 트라이하이드라진 트라이아진(THT), 인화수소, 타타르산, 시트르산 및 톨루엔설포닐 세미카바자이드(TSS)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 포밍제(foaming agents), 증점제 및/또는 경화제를 재조합 레실린 고체에 첨가한다. 예시적인 포밍제는 잔탄검, 소듐 도데실 설페이트, 암모늄 라우릴 설페이트, 수 혈청 알부민을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 증점제는 퓸드 실리카 및 잔탄검을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 경화제는 지방족 폴리아민, 지방 폴리아마이드, 방향족 폴리아민 경화제, 무수물 경화제, 보론 트라이플루오라이드 경화제 및 경화제(다이사이안다이아마이드)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 실시형태에 따라서, 물리적 발포제, 즉, 주변 조건 하에서 기체인 유체를 용융된 중합체 스트림에 주입하여 혼합물을 형성한다. 혼합물을 압력 강하시켜, 발포제가 팽창하여 중합체에서 기포(셀)가 형성된다. 일부 실시형태에서, 필요한 압력은 약 500psi 내지 약 2000psi, 예를 들어, 약 600psi 내지 약 1000psi, 약 700psi 내지 약 1500psi 및 약 800psi 내지 약 2000psi이다. 일부 실시형태에서, 필요한 압력은 약 500psi이다.
예시적인 물리적 발포제는 클로로플루오로카본(CFC), 용존 질소, N2, CH4, H2, CO2, Ar, 펜탄, 아이소펜탄, 헥산, 메틸렌 다이클로라이드 및 다이클로로테트라-플루오로에탄을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
등가물 및 범주
당업자는 단지 일상적 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 발명에 따라 구체적인 실시형태에 따른 다수의 등가물을 인지하고, 확신할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 그 보다는 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다.
청구범위에서, 단수 표현은 반대로 제시되지 않거나 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 하나 이상을 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 반대로 표시되지 않거나 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 군 구성원의 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이들에 사용되거나, 이들과 달리 관련되는 경우, 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 정확하게 군의 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이들에 사용되거나, 이들과 달리 관련되는 실시형태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이들에 사용되거나, 이들과 달리 관련되는 실시형태를 포함한다.
용어 "포함하는"은 개방적인 것으로 의도되고, 추가적인 요소 또는 단계의 포함을 허용하지만, 이들은 필요하지 않다는 것이 주목된다. 용어 "포함하는"이 본 명세서에 사용되는 경우, 따라서 용어 "이루어진"이 또한 포함되고 개시된다.
범위가 제공된 경우, 종점이 포함된다. 추가로, 달리 제시되지 않거나 또는 문맥 및 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은, 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않는 한, 범위의 하한의 단위의 1/10로, 본 발명의 상이한 실시형태에서의 언급된 범위 내의 임의의 구체적인 값 또는 하위범위를 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
모든 인용된 자료, 예를 들어, 참조문헌, 간행물, 데이터베이스, 데이터베이스 항목 및 본 명세서에 인용된 기술은, 인용문헌에 명확히 언급되지 않더라도, 본 출원에 참조에 의해 원용된다. 인용된 자료 및 본 출원의 설명이 상충되는 경우에, 본 출원의 설명이 우선시될 것이다.
섹션 및 표 제목은 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시형태의 예이다. 본 실시예는 단지 예시 목적을 위해서 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차가 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 제시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에서, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]을 참고하기 바란다.
실시예 1: 재조합 레실린의 생산
GS115(NRRL Y15851) 피치아 파스토리스(코마가탤라 파피(Komagataella phaffii))의 HIS+ 유도체를 분비된 레실린 암호 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시킴으로써 재조합 레실린을 분비하는 피치아 파스토리스 재조합 숙주 세포를 생성시켰다.
벡터는 각각 N-말단 분비 신호(알파 메이팅 인자 리더 및 프로 서열) 및 일부 예에서 C-말단 3xFLAG 태그에 프레임으로 융합된 3개의 레실린 암호 서열을 포함하였다(서열번호 45)(도 3 참조). 분비된 레실린 암호 서열 각각은 프로모터(pGCW14) 및 종결자(tAOX1 pA 신호)가 측접되어 있다. 벡터는 피치아 파스토리스 게놈의 HSP82 유전자좌에 대한 3개의 분비된 레실린 암호 서열의 통합을 지시할 수 있는 표적화 영역, 박테리아 및 효모 형질전환제의 분비를 위한 우성 내성 마커뿐만 아니라 박테리아 복제 기원을 추가로 포함하였다.
레실린 암호 서열은 과학 문헌 및 공개 서열 데이터베이스 검색으로부터 입수하였다. 뉴클레오타이드 서열을 아미노산 서열로 번역하고, 이어서 코돈 최적화하였다. 전장 및 절두된 레실린 서열 둘 다를 선택하였다. 선택된 분비된 레실린 암호 서열을 표 1에 열거한다.
Figure pct00003
벡터를 전기천공을 사용하여 피치아 파스토리스 내에서 형질전환시켜 각각의 분비된 레실린 암호 서열의 3개의 통합된 카피를 포함하는 숙주 균주를 생성시켰다. 형질전환체를 항생제가 보충된 YPD 한천 플레이트에 플레이팅하고, 48시간 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다.
각각의 최종 형질전환으로부터의 클론을 96웰 블록 내의 400㎕의 완충 글리세롤-복합 배지(Buffered Glycerol-complex Medium: BMGY)에 접종하고, 1,000rpm으로 교반하면서 24시간 동안 30℃에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 제거하고, 재조합 숙주 세포를 원심분리를 통해서 펠릿화하고, 상청액을 회수하고, 쿠마시 겔 및 웨스턴 블롯 분석(3xFLAG 태그를 포함하는 폴리펩타이드의 경우)을 통한 레실린 함량의 분석을 위해서 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켰다. FLAG-태그된 단백질의 경우, 남아있는 배양물을 사용하여 ELISA 측정을 위해서 복제물로 최소 배양 배지에 접종하였다. 하나의 복제물을 펠릿화하고, 상청액을 직접 측정하였다. 제2 복제물을 구아니딘 티오사이아네이트로 추출하고, 세포내 및 세포외 분획을 측정하였다.
다수의 종으로부터의 재조합 레실린은 피치아 파스토리스 재조합 숙주 세포에서 성공적으로 발현되었다. 재조합 숙주 세포는 생산된 재조합 레실린의 최대 90%를 분비하였다.
서열 목록의 서열번호 49는 추후에 절단되는 신호 서열과 함께 발현되는 전장 도르소필라 세켈리아 레실린 서열(Ds_ACB)을 제공한다. 제1 서열(이탤릭체)은 신호 펩티다제에 의한 번역 후에 2회 절단되고, 그 다음 Kex2로 절단되는 알파 메이팅 인자 전구체 단백질 신호 서열(서열번호 46)이다. 제2 서열(볼드체)은 Ste13(서열번호 47)에 의해서 절단되는 EAEA 반복부이다. 제3 서열(소문자)은 도르소필라 세켈리아 전장 레실린(서열번호 1)에 상응한다. 제4 서열(볼드체이면서 이탤릭체)은 링커 서열(서열번호 46)에 상응한다. 제5 서열(밑줄)은 3X FLAG 태그(서열번호 45)에 상응한다.
에드만 서열결정(Edman sequencing)은, 대략 110kDa 밴드의 단백질 서열의 N-말단이이 전장 길이 도르소필라 세켈리아 레실린 서열에 상응하였다는 것을 확인해 주었다. 구체적으로, N-말단 서열결정은, N-말단이 각각 EAEA 반복부를 갖거나 갖지 않는 전장 도르소필라 세켈리아 레실린 서열인 "EAEA" 또는 "GRPE"에 상응하였다는 것을 나타내었다.
실시예 2: 재조합 레실린의 정제
비-FLAG-태그된 Ds_ACB 및 Ae_A 재조합 레실린 폴리펩타이드를 하기와 같이 정제시켰다: 균주 RMs1221(Ds_ACB를 발현함) 및 RMs1224(Ae_A를 발현함)를 300rpm으로 교반하면서 30℃에서 48시간 동안 플라스크 내의 500㎖의 BMGY 중에서 성장시켰다.
정제 프로토콜을 문헌[Lyons et al. (2007)]로부터 변형시켰다. 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 상청액을 수집하였다. 황산암모늄을 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질을 소량의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시키고, 재현탁된 샘플을 PBS에 대해 투석시켜 염을 제거하였다. 이어서, 투석된 샘플을 가열시켜 네이티브 단백질을 변성시키고, 변성된 단백질을 원심분리에 의해 제거하였다. 유지된 상청액은 정제된 레실린 폴리펩타이드를 함유하였다. 선택적으로, 유지된 상청액을 급냉시켰고, 이것은 코아서베이션을 유발하여, 농축된 하부상 및 희석된 상부상을 생성시켰다.
전체 세포 브로쓰를 원심분리시켜 세포 및 세포에 인접한(예를 들어, 세포에 부착된, 세포의 표면 상의) 단백질 및/또는 불용성 단백질(예를 들어 단백질 응집물)의 제1 펠릿 및 제1 상청액을 생성시키고, 이어서 제1 상청액을 폐기하여 제1 펠릿을 얻음으로써 제2 샘플 세트를 준비하였다. 제1 펠릿을 구아니딘 티오사이아네이트에 재현탁시켜 Ds_ACB를 가용화시켰다. 재-현탁액을 다시 원심분리시켜 제2 펠릿 및 제2 상청액을 생성시켰다. 이어서, Ds_ACB 이외의 단백질을 변성시키기 위해서 제2 상청액을 PBS에 대해 투석시키고, 고온에 적용하고 원심분리시켜 제3 펠릿 및 제3 상청액을 생성시켰다. 제3 상청액을 급냉에 의해서 코아르베이션시켜 Ds_ACB를 함유하는 진한 하부층 및 상부층으로 상분리시켰다. 이것을 또한 본 명세서에서 겔 층 분리 또는 코아서베이션 샘플로 지칭한다. 일부 겔 층 샘플에서, 하부층을 유지하고, 하부층을 더 낮은 온도에서 인큐베이션시켜 추가 상 분리를 유도함으로써 다중 코아서베이션을 수행하였다.
Figure pct00004
실시예 3: 정제되고 분비된 재조합 레실린의 가교 결합
정제된 레실린을 하기 3가지 방법 중 하나를 통해서 가교 결합시켰다: 광 가교 결합(문헌[Elvin et al. 2005]로부터 변경됨), 효소 가교 결합(문헌[Qin et al. 2009]로부터 변경됨) 또는 본 명세서에 기재된 방법(즉, 과황산암모늄 및 열에 대한 노출).
광 가교 결합
광 가교 결합을 위해서, 레실린 단백질을 과황산암모늄 및 트리스(바이피리딘) 류테늄(II)([Ru(bpy)3]2+)과 혼합하였다. 혼합물을 밝은 백색광에 노출시키고, 그 후 혼합물이 고무 같은 고체를 형성하였다.
구체적으로, 수 중의 10mM Ru(II) 광촉매(CAS 50525-27-4) 및 수 스톡 용액 중의 100mM 과황산암모늄을 제조하였다. 정제된 레실린 분말을 인산염 완충 식염수 중에 20 내지 30wt%의 레실린의 농도로 용해시켜 레실린 스톡 용액을 제조하였다.
2㎕의 10mM Ru(II) 광촉매 용액 및 2㎕의 100mM 과황산암모늄을 첨가하고, 10㎕의 레실린 스톡 용액과 혼합하여 광 가교 결합 용액을 형성하였다. 원심분리에 의해서 기포를 광 가교 결합 용액으로부터 제거하고, 광 가교 결합 용액을 주형에 부었다.
이어서, 광 가교 결합 용액을 백색광(White LED floodlight, Zochlon USPT100W 110V)에 30초 내지 1분 동안 노출시켰다.
효소 가교 결합
효소 가교 결합을 위해서, 레실린 단백질을 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 및 과산화수소와 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 인큐베이션시키고, 그 후 혼합물은 고무 같은 고체를 형성하였다.
구체적으로, 수 중의 10㎎/㎖ 스톡의 호스래디쉬 퍼옥시다제(타입 1, P8125 시그마사(Sigma))(HRP 스톡) 및 수 중의 100mM H2O2 스톡. 정제된 레실린 분말을 인산염 완충 식염수 중에 20 내지 30wt%의 레실린의 농도로 용해시켜 레실린 스톡 용액을 제조하였다.
6㎕의 HRP 스톡을 첨가하고, 21㎕의 레실린 스톡 용액과 혼합하였다. 이어서 3uL의 H2O2 스톡을 첨가하고, 보텍싱에 의해서 혼합하여 효소 가교 결합 용액을 형성하였다. 원심분리에 의해서 효소 가교 결합 용액으로부터 기포를 제거하고, 용액을 4℃에서 유지시키면서 효소 가교 결합 용액을 주형에 부었다. 가교 결합을 수행하기 위해서, 효소 가교 결합 용액을 15분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 생성된 가교 결합된 레실린 조성물은 레실린 고체에 공유 결합된 활성 효소를 포함한다.
과황산염 및 열 가교 결합
과황산암모늄 및 열을 사용하여 정제된 레실린을 가교 결합시켰다.
구체적으로, 정제된 레실린 분말을 인산염 완충 식염수 중에 20 내지 30wt%의 레실린의 농도로 용해시켜 레실린 스톡 용액을 제조하였다. 물 중의 200mM 과황산암모늄 4㎕를 36mM 과황산암모늄의 최종 농도로 레실린 스톡 용액 18㎕와 혼합하였다. 원심분리에 의해서 기포를 과황산염 가교 결합 용액으로부터 제거하고, 과황산염 가교 결합 용액을 주형에 부었다.
가교 결합을 수행하기 위해서, 과황산염 가교 결합 용액을 80℃에서 2.5시간 동안 밀봉된 가습 환경에서 인큐베이션시켰다. 생성된 가교 결합된 레실린 조성물은 레실린 고체에 활성 촉매를 남기지 않고, 덜 분해된 단백질을 갖는 조성물을 생성시킨다.
HRP 가교 결합된 조성물의 분해
매일 관찰을 통해 각각의 가교 결합된 샘플이 고체로 유지된 기간을 결정함으로써 가교 결합된 샘플의 안정성을 시간에 따라 평가하였다. 표 3은 광 가교 결합(Ru+hv), 효소 가교 결합(HRP) 및 과황산암모늄과 열을 통한 가교 결합(AP+heat)을 통해서 제조된 각각의 가교 결합된 샘플에 대한 고체로서의 시간을 나타낸다. 표 3에 제시된 바와 같이, 실온에서, 광 가교 결합을 통해서 또는 과황산암모늄을 통해서 가교 결합된 레실린 조성물은 효소 가교 결합을 통해서 가교 결합된 레실린 조성물보다 훨씬 더 긴 안정성 기간을 가졌다.
Figure pct00005
ELISA에 의해서 측정된 바와 같은 과황산암모늄 가교 결합된 레실린 조성물(AP) 및 효소 가교 결합된 레실린 조성물(HRP)로부터의 총 분해된 레실린을 도 6에 도시한다. AP 샘플과 비교할 때 HRP 샘플에서 가교 결합된 레실린 조성물로부터의 레실린 단편의 증가된 분해 및 분비가 관찰된다.
이 데이터는, 안정적인 레실린 조성물의 제조를 위해서 과황산암모늄 가교 결합이 효소 가교 결합보다 바람직하다는 것을 나타낸다. 효소에 의해서 가교 결합된 레실린 조성물의 경우, 가교 결합 효소는 조성물에서 유지되어, 조성물의 분해를 초래한다.
실시예 4: 가교 결합된 전장 레실린 대 레실린 혼합물의 안정성
다양한 수준의 분해 생성물 및 전장 레실린을 갖는 레실린 샘플을 상기에 기재된 바와 같이 효소 가교 결합시켰다. 매일 관찰을 통해 각각의 가교 결합된 샘플이 고체로 유지된 기간을 결정함으로써 가교 결합된 샘플의 안정성을 시간에 따라 평가하였다. 표 4는 각각의 가교 결합된 샘플에 대한 고체로서의 시간을 나타낸다. 표 4에 제시된 바와 같이, 전장 레실린을 포함하는 샘플은 전장 레실린을 포함하지 않은 샘플보다 더 긴 안정성 기간을 가졌다.
Figure pct00006
실시예 5: 레실린 발포체
증점 첨가제, 예를 들어, 퓸드 실리카 및 중탄산나트륨의 존재 하에서의 레실린의 가교 결합은 비교적 균일한 기포 분포를 갖는 발포된 레실린을 생성하였다. 퓸드 실리카의 양을 변경시키는 것은 평균 기포 크기에 영향을 미치기 때문에, 발포된 레실린 고체를 조정하기 위한 레버를 제공한다. 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00007
레실린의 용액을 제조하였다. 0.81g의 레실린을 7.4의 pH에서 2.19㎖의 PBS 중에 용해시켰다. 포밍제를 첨가하고, 용액을 보텍싱시켜 기포를 도입하고, 열 또는 광을 통해서 가교결합시켰다. 50㎎의 잔탄검을 용액에 첨가하고, 그 다음 225mM 과황산암모늄 0.65㎖를 첨가하였다. 잔탐검을 포밍제로서 사용하였는데, 그 이유는 그것이 또한 용액 중의 기포를 포획하는 데 도움이 되는 점도를 증가시켰기 때문이다. 이어서 용액을 보텍싱시키고, 80℃에서 3.5시간 동안 가열시켰다.
일부 샘플에서, 류테늄(II) 및 백색 광을 사용하여 레실린을 가교 결합시켰다. 이러한 실험에서, 0.405g의 레실린 로트 3을 1.10㎖의 PBS 중에 용해시켰다. 이어서, 0.3㎖의 100mM 과황산암모늄 및 0.3㎖의 10mM Ru(II) 촉매. 다른 샘플에서, 0.405g의 레실린 로트 3을 1.10㎖의 PBS 중에 용해시켰다. 이어서, 25㎎의 잔탄검, 그 다음 0.3㎖의 100mM 과황산암모늄 및 0.3㎖의 10mM Ru(II) 촉매를 첨가하였다.
일부 샘플에서, 중탄산나트륨을 화학 발포제로서 사용하였다. 중탄산나트륨을 레실린 용액에 첨가하고, 가교 결합시켰다. 증점제, 퓸드 실리카를 일부 샘플에 첨가하였다. 너무 많은 중탄산나트륨(33㎎/㎖ 이상)은 겔화를 저해하였다. 6 내지 20㎎/㎖의 중탄산나트륨을 레실린 용액에 사용하면 큰 기포와 함께 80℃에서 3.5시간 후 레실린 고체가 생성되었다. 4 내지 10wt%로 증점제, 퓸드 실리카를 첨가하면 기포가 균일하게 분포된 레실린 발포체가 생성되었다(도 7 및 도 8). 너무 적은 퓸드 실리카는 반만 발포된(half-foamed) 레실린 고체를 생성하였고, 5wt% 초과의 퓸드 실리카를 첨가하면 더 작은 기포를 갖는 발포된 레실린이 생성되었다(도 7). 5wt% 퓸드 실리카를 갖는 레실린 발포체의 기포의 직경은 0.2 내지 2㎜였다. 10wt% 퓸드 실리카를 갖는 레실린 발포체의 기포의 직경은 0.05 내지 0.2㎜였다.
구체적으로, 0.27g의 레실린 로트 3을 7.4의 pH에서 0.73㎖의 PBS에 용해시켰다. 그 다음, 37, 18, 10 또는 6㎎의 중탄산나트륨을 용액에 첨가하고, 0.22㎖의 225mM 과황산암모늄 및 0 내지 10wt%의 퓸드 실리카를 첨가하였다. 용액을 보텍싱시키고, 80℃에서 3.5 시간 동안 가열시켰다. 뚜껑이 있는 2㎖ 튜브에서 실험을 수행하였다.
일부 샘플에서, 83℃에서 레실린을 가교 결합시키면서, ISCO 펌프를 사용하여 1600psi 또는 500psi에서 용존 질소를 도입하였다. 아마도 용존 산소의 증가된 양으로 인해서, 이러한 압력에서의 가교 결합은 대기압에서의 가교 결합보다 더 느린 속도로 진행되었다.
구체적으로, 수 중의 225 또는 550mM 과황산암모늄의 용액 1.1㎖를 PBS 중의 27wt% 레실린 용액 5㎖에 첨가하였다. 이어서, 이 용액을 5분 동안 7197rcf에서 원심분리시키고, ISCO 펌프에 첨가하였다. 이어서, 펌프를 연결하여 질소를 수용하도록 하고, ISCO 펌프를 266㎖의 이의 최대 부피로 설정하고, 질소로 3분 동안 퍼징하고, 이어서 밀봉하였다. 이어서, 펌프를 500psi 또는 1600psi로 설정하고, 2 내지 6시간 동안 83℃에서 가열시켰다. 압력 해제 후, 레실린을 추가로 1 내지 2시간 동안 83℃에서 가열시켰다.
실시예 6: 용매 교환 및 수성 용매 대 극성 비수성 용매 중의 가교 결합된 레실린의 비교
하기에 상세하게 기재된 바와 같이, 수성 용매 중의 재조합 레실린의 가교 결합된 혼합물을 용매 교환으로 처리하여 용매를 극성 비수성 용매로 대체하여 특정 응용에 보다 적합한 물질 특성을 갖는 조성물을 형성하였다.
SEC(크기 배제 크로마토그래피)를 통해서 측정되는 경우, 19질량%의 전장 레실린을 포함하고, 분말의 나머지는 부분적으로 절단된 레실린을 포함하는 레실린 분말을 제조하였다.
이어서 레실린 분말을 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 용해시키고, 기록된 중량 백분율의 레실린을 중량 기준(w/w)으로 칭량한다. 0.27g의 레실린을 0.73g의 PBS 용액에 첨가함으로써 27wt% 레실린 용액 1g을 제조한다. 이어서, 레실린 용액을 주형에서 가교 결합시켜 수계 레실린 고체 조성물을 형성하였다. 형성된 레실린 고체는 15㎜의 직경x5㎜ 높이의 디스크였다.
글리세롤계 레실린 고체를 생성시키기 위해서, 수계 고체를 60℃에서 밀폐된 용기 내에서 16시간 동안 60% 글리세롤(60:40 글리세롤:물(v:v)) 20× 부피 중에서 교환시킨다. 이어서, 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 글리세롤 20× 부피 중에서 교환시킨다.
수계 레실린 고체 샘플 및 글리세롤계 레실린 고체 샘플을 실온에서 1주 동안 밀봉하지 않고 저장하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 수계 레실린 고체는 단지 1주 후에 탈수된 반면, 글리세롤계 레실린 고체는 어떠한 가시적인 분해 또는 탈수 없이 본래 형상을 유지하였다.
실시예 7: 용매 교환 및 다중 극성 비수성 레실린 용매의 특성 비교
극성 비수성 용매 중의 레실린 고체를 하기와 같이 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 가교 결합된 레실린으로부터 제조하였다:
레실린 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 또는 2일 동안(즉, 2 d. inc.) 20× 부피의 프로필렌 글리콜 중에서 교환시킴으로써 프로필렌 글리콜 용매 중의 레실린 고체를 제조하였다.
레실린 고체를 60℃에서 밀폐된 용기 내에서 16시간 동안 20× 부피의 60% 글리세롤(60:40 글리세롤:물(v:v)) 중에서 교환시킴으로써 60 내지 100%의 글리세롤 용매 중의 레실린 고체를 제조하였다. 이어서, 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 글리세롤 20× 부피 중에서 교환시킨다.
레실린 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 또는 2일 동안(즉, 2 d. inc.) 20× 부피의 글리세롤 중에서 교환시킴으로써 100% 글리세롤 용매 중의 레실린 고체를 제조하였다.
레실린 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 20× 부피의 에틸렌 글리콜 중에서 교환시킴으로써 에틸렌 글리콜 용매 중의 레실린 고체를 제조하였다.
레실린 고체를 60℃에서 밀봉되지 않은 용기 내에서 16시간 동안 20× 부피의 프로필렌 글리콜 중에서 교환시킴으로써 프로필렌 글리콜 용매 중의 레실린 고체를 제조하였다.
코아서베이션을 통한 정제에 기초하여 레실린 고체를 형성하기 위해서, 27wt%(w/w)의 레실린 용액을 -5℃에서 인큐베이션시켰고, 액체-액체 상 분리가 일어났다. 하부 코아서베이트층을 단리시키고, 과황산암모늄(APS) 분말을 36mM APS의 최종 농도로 코아서베이트에 혼합하였다. 이어서, 이 용액을 80℃에서 2.5시간 동안 가교 결합시켰다. 이어서, 고체를 전형적인 용매 교환 절차에 따라서 교환시켰다.
달리 제시되지 않는 한, 사용된 레실린 분말은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해서 측정되는 경우 19질량%는 전장이고, 분말의 나머지는 부분적으로 분해된 레실린으로 구성된다. 27wt%의 "전장 레실린" 샘플은 SEC를 통해서 측정되는 경우 87질량%의 전장 단량체 레실린인 레실린 분말로부터 제조되었다.
SEC를 사용하여 레실린 조성물 중의 레실린의 우세한 종의 상대적인 양을 특징규명하기 위해서, 레실린 분말을 5M 구아니딘 티오사이아네이트 중에 용해시키고, Yarra SEC-3000 SEC-HPLC 칼럼에 주입하여 분자량에 기초하여 구성성분을 분리시켰다. 굴절률을 검출 양상으로 사용하였다. 모든 단백질의 90% 초과가 서로 약 7% 이내인 dn/dc 값(굴절률의 응답 인자)을 나타낸다는 가정 하에 BSA를 일반적인 단백질 표준품으로서 사용하였다. 폴리(에틸렌 옥사이드)를 체류 시간 표준품으로 사용하였고, BSA 교정제를 체크 표준품으로서 사용하여 방법의 일관된 성능을 보장하였다. 레실린에 상응하는 범위를 60 내지 40kDa에서 평가하였고; 응집물 또는 중합된 레실린에 상응할 수 있는 관찰된 더 높은 피크는 이 정량에 포함되지 않았다. 이러한 레실린 피크의 상대적인 백분율을 질량% 및 면적%로 보고하여 총 레실린 중의 일부로서 조성물 중의 전장 레실린의 양을 결정하였다.
이어서, Malvern Kinexus Rheometer RNX2110을 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 생성된 조성물 각각에 대한 응력 변형 곡선을 생성시켰다. 하기 프로토콜을 22℃의 온도에 적용하였다: 단계 1: 초기 갭 - 6.5㎜; 단계 2: 최종 갭까지의 감소. 단계 1 및 2를 5회 반복하였다. 레오미터에 의해서 측정된 경우 탄성률의 값은 단지 상대적이며, 상이한 조건 하에서 또는 상이한 기기를 사용하여 시험된 물질과 비교할 수 없다.
공학 응력 대 공학 변형을 플로팅하여 응력-변형 곡선을 생성시켰다. 하기 수학식에 의해서 공학 응력을 계산한다: 공학 응력 = (수직력(N)/A(㎜2) 레오미터 기하학적 형상과 접촉한 레실린 고체)×106. 공학 변형은 압축 변형의 절대값 = ABS((레실린 고체의 압축 높이(㎜)- 압축되지 않은 고체의 높이(㎜))/압축되지 않은 고체의 높이(㎜))*100이다.
도 10a은 60 내지 100% 글리세롤 중의 27wt% 가교 결합된 레실린에 대한 응력-변형 곡선을 도시한다. 도 10b는 프로필렌 글리콜 중의 27wt% 가교 결합된 레실린에 대한 응력-변형 곡선을 도시한다. 도 10c는 프로필렌 글리콜 중의 27wt% 전장의 가교 결합된 레실린에 대한 응력-변형 곡선을 도시한다. 비교 목적으로, 레오메트리 데이터를 또한 숄 박사(Dr. Sholl)의 삽입물로부터 생성시켰다.
도 11에 도시된 바와 같이, 발포된 레실린의 응력-변형 곡선은 하키 스틱과 더 유사한 형상이었다. 이는 먼저 압축되고, 그 다음 레실린 물질이 압축된, 발포된 레실린에서의 공기 포켓의 결과이다.
레오메트리 데이터로부터, 탄성률 및 탄력성의 상대적인 값을 표 5에 제시된 바와 같이 결정하였다. 하중 곡선 하 면적을 얻고, 그것을 공학 응력 대 변형 플롯 상의 비하중 곡선 하의 면적으로 나누고, 이 값에 100을 곱함으로써 상대적인 탄력성(%)을 계산하였다. 10%의 절대 압축 변형률과 20% 절대 압축 변형률 사이의 하중 곡선의 기울기를 취하여 상대적인 탄성률을 계산하였다.
제시된 바와 같이, 수성의 수계 용매로부터 극성 비수성 용매로의 가교 결합된 레실린 용매의 교환은 유사한 탄력성 및 유사한 탄성을 갖는 더 높은 강성도의 물질을 야기하였다. 모든 가교 결합된 레실린 조성물은 시험된 조건(20N 미만의 힘) 하에서 탄성이었다.
레오미터를 또한 사용하여 100% 글리세롤 용매 중에서 발포제로서 퓸드 실리카를 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된 5중량%의 발포된 레실린에 대한 탄력성을 측정하였다. 그 결과를 또한 표 6에 제시한다.
Figure pct00008
표 6으로부터의 탄력성 및 탄성률의 상대적인 값을 도 12에 도시된 바와 같이 플로팅하였다. 이 플롯은 용매 교환을 통해서 가교 결합된 레실린 특성을 조정하는 경우 탄력성과 탄성률 사이에 관계를 나타낸다.
레오미터를 또한 사용하여 별개로 제조된 프로필렌 글리콜 중의 가교 결합된 레실린 고체에 대한 상대적인 탄력성 및 탄성률을 측정하였다. 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00009
레오미터를 또한 사용하여 반복되는 힘의 적용을 통해서 상이한 용매 중의 가교 결합된 레실린 고체에 대한 상대적인 탄력성 및 탄성률을 측정하여 이들 파라미터에 대한 반복되는 힘의 적용의 효과를 결정하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00010
실시예 8: 레실린 고체 대 전형적인 중창의 강성도
가교 결합된 실크 고체 조성물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 물, 60 내지 100% 글리세롤, 100% 글리세롤, 프로필렌 글리콜(16시간 인큐베이션) 및 프로필렌 글리콜(2일 인큐베이션) 중에서 제조하였다. 이들 물질의 강성도를 ASTM: D-2240을 통해서 쇼어 OO 경도계(AD-100-00)를 사용하여 시험하였다. 쇼 박사의 밑창 및 전형적인 중창을 또한 비교 목적을 위해서 시험하였다. 결과를 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00011
실시예 9: 즈빅 압축 곡선에 의해서 측정된 탄성에서 가소성으로의 전이
27wt% 레실린 에틸렌 글리콜 고체("A"), 27wt% 레실린 프로필렌 글리콜 고체("C"), 코아서베이트 레실린 프로필렌 글리콜 고체("D"), 27wt% 레실린 60 내지 100% 글리세롤 고체("G") 및 27wt% 레실린 100% 글리세롤 고체("H")에 대해서 즈빅 압축 데이터를 얻었다. 이들 샘플 각각을 실시예 5에서 기재된 바와 같이 제조하였다.
구체적으로, 상기 샘플에 대한 압축 데이터를 5kN 하중 셀 및 5kN 압축 플래튼(즈빅/로엘(Zwick/Roell) Z5.0)이 장치된 즈빅 인장 시험기를 사용하여 시험하였다. 각각의 고체에 대한 고체 치수는 15㎜×5㎜의 디스크였다. 강성 플라스틱 압축 프로그램의 D695 압축 특성을 사용하여 22C의 온도(주변) 및 65%의 습도(주변)에서 물질을 시험하였다.
각각의 고체에 대한 즈빅 인장 시험기로부터 측정된 바와 같은 힘 대 변형 곡선을 도 13에 도시한다. 2kN까지의 적용된 압축력에서 레실린 고체 중 어느 것도 탄성에서 플라스틱으로의 전이가 인지되지 않는다. 대신에, 레실린 고체가 압축 응력 하에서 파손되는 경우, 그것은 파괴를 통한 것이지 탄성 변형이 아니었다.
실시예 10: 프로필렌 글리콜 레실린 고체의 탄력성 및 압축의 분석
실시예 5에서와 같이 제조된 프로필렌 글리콜로 교체된 27wt% 레실린 고체에 대해서 25% 변형에서의 반발 탄력성 및 압축 응력을 ASTM D7121 및 ASTM D575 시험을 사용하여 측정하였다. 시험된 고체의 치수는 0.8인치의 높이를 갖는 1.125 인치 직경의 디스크였다. 이러한 치수를 갖는 3개의 상이한 샘플을 사용하였다. 결과를 하기 표 10에 나타낸다.
Figure pct00012
표 10에 제시된 데이터를 동일한 ASTM 시험을 통해서 시험된 다른 고무 또는 엘라스토머 시험과 비교할 수 있다. ASTM 시험 번호는 결과를 재현하기에 충분하다. 이러한 데이터 및 경도계 데이터는 엘라스토머의 다른 고무와 직접 비교할 수 있는 유일한 데이터이다.
추가 고려사항
본 개시내용의 실시형태의 상기 설명은 예시의 목적을 위해 제공되었고; 완전하거나 청구범위를 개시된 정확한 형태로 제한하도록 의도되지 않는다. 당업자는 상기 개시내용에 비추어 다수의 변형 및 변경이 가능하다는 것을 인식할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 언어는 가독성 및 교육 목적을 위해 주로 선택되었고, 그것은 본 발명의 발명 대상을 열거하거나 제한하도록 선택되지 않을 수 있다. 따라서 본 개시내용의 범주는 이러한 상세한 설명에 의해서가 아니라, 오히려 본 출원에 기초한 출원에 관한 임의의 청구범위에 의해 제한되도록 의도된다. 따라서, 실시형태의 개시내용은 하기의 청구범위에 제시된 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니라 예시하는 것으로 의도된다.
모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 본 명세서에서 언급된 다른 참고문헌은 전문이 참조에 의해 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선시될 것이다. 또한, 섹션 제목, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고 제한이도록 의도되지 않는다.
서열 목록
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Figure pct00025
<110> BOLT THREADS, INC. <120> CROSS-LINKED ELASTOMERIC PROTEINS IN POLAR NONAQUEOUS SOLVENTS AND USES THEREOF <130> BTT-027WO <140> PCT/US2019/042387 <141> 2019-07-18 <150> 62/700,197 <151> 2018-07-18 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 606 <212> PRT <213> Drosophila sechellia <400> 1 Arg Pro Glu Pro Pro Val Asn Ser Tyr Leu Pro Pro Ser Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Pro Gly Gln Ser Gly Ala Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly 35 40 45 Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 50 55 60 Gly Lys Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn 65 70 75 80 Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly 85 90 95 Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly 100 105 110 Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asn 115 120 125 Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly 130 135 140 Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro 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castaneum <400> 14 Gln Leu Thr Lys Arg Asp Ala Pro Leu Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ala Asn Ser Tyr Leu Pro Pro Gly Gly Ala Ser Gln Pro Ser 20 25 30 Gly Asn Tyr Gly Ala Pro Ser Gly Gly Phe Gly Gly Lys Ser Gly Gly 35 40 45 Phe Gly Gly Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ser Gln Ser Tyr Gly 50 55 60 Ala Pro Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ser Ser Ser Phe Gly Lys Ser Gly 65 70 75 80 Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ser Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Gly Gly 85 90 95 Phe Gly Gly Ser Ser Ser Phe Gly Lys Ser Ser Gly Gly Phe Gly Gly 100 105 110 Ala Pro Ser Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Ser Phe Gly Lys Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ser Gln Ser 130 135 140 Tyr Gly Ala Pro Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ser Ser Ser Phe Gly Lys 145 150 155 160 Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ala Pro Ser Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Ser 165 170 175 Gly Gly Phe Gly Gly Lys Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ala Pro Ser Gln 180 185 190 Ser Tyr Gly Ala Pro Ser Gly Gly Phe Gly Gly Lys Ser Gly Gly Phe 195 200 205 Gly 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Gly Gln Gly Gly 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gly Gln Gly Asn 1 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gly Gln Gly Gln 1 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Gln Gly Gln Gly 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Arg Pro Gly Gly Gln 1 5 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Arg Pro Gly Gly Asn 1 5 <210> 59 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gly Gly Ser Phe 1 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Gly Asn Gly Gly 1 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Gly Gly Ala Gly Gly 1 5 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Any amino acid <400> 62 Xaa Xaa Glu Pro Pro Val Ser Tyr Leu Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: "GRPE" sequence <400> 63 Gly Arg Pro Glu 1 <210> 64 <211> 3000 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide. See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3000) <223> This sequence may encompass 1-100 "Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa" repeating units <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(24) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(24) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(28) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(30) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (33) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(54) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(54) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (55)..(58) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(60) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (63) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(84) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(84) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (85)..(88) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (89)..(90) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (93) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(114) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(114) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (115)..(118) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (119)..(120) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (123) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (125)..(144) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(144) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(148) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (149)..(150) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (153) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (155)..(174) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (155)..(174) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (175)..(178) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (179)..(180) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (183) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (185)..(204) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (185)..(204) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (205)..(208) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (209)..(210) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (213) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (215)..(234) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (215)..(234) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (235)..(238) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (239)..(240) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (243) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (245)..(264) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (245)..(264) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (265)..(268) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(270) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (273) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (275)..(294) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (275)..(294) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (295)..(298) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (299)..(300) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (303) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (305)..(324) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (305)..(324) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (325)..(328) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (329)..(330) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (333) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (335)..(354) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (335)..(354) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (355)..(358) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (359)..(360) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (363) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (365)..(384) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (365)..(384) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (385)..(388) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (389)..(390) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (393) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (395)..(414) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (395)..(414) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (415)..(418) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (419)..(420) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (423) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (425)..(444) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (425)..(444) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (445)..(448) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (449)..(450) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (453) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (455)..(474) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (455)..(474) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (475)..(478) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (479)..(480) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (483) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (485)..(504) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (485)..(504) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (505)..(508) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (509)..(510) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (513) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (515)..(534) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (515)..(534) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (535)..(538) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (539)..(540) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (543) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (545)..(564) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (545)..(564) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (565)..(568) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (569)..(570) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (573) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (575)..(594) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (575)..(594) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (595)..(598) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (599)..(600) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (603) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (605)..(624) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (605)..(624) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (625)..(628) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (629)..(630) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (633) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (635)..(654) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (635)..(654) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (655)..(658) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (659)..(660) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (663) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (665)..(684) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (665)..(684) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (685)..(688) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (689)..(690) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (693) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (695)..(714) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (695)..(714) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (715)..(718) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (719)..(720) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (723) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (725)..(744) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (725)..(744) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (745)..(748) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (749)..(750) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (753) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (755)..(774) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (755)..(774) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (775)..(778) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (779)..(780) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (783) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (785)..(804) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (785)..(804) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (805)..(808) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (809)..(810) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (813) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (815)..(834) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (815)..(834) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (835)..(838) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (839)..(840) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (843) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (845)..(864) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (845)..(864) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (865)..(868) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (869)..(870) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (873) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (875)..(894) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (875)..(894) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (895)..(898) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (899)..(900) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (903) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (905)..(924) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (905)..(924) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (925)..(928) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (929)..(930) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (933) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (935)..(954) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (935)..(954) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (955)..(958) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (959)..(960) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (963) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (965)..(984) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (965)..(984) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (985)..(988) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (989)..(990) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (993) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (995)..(1014) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (995)..(1014) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1015)..(1018) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1019)..(1020) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1023) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1025)..(1044) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1025)..(1044) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1045)..(1048) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1049)..(1050) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1053) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1055)..(1074) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1055)..(1074) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1075)..(1078) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1079)..(1080) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1083) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1085)..(1104) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1085)..(1104) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1105)..(1108) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1109)..(1110) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1113) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1115)..(1134) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1115)..(1134) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1135)..(1138) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1139)..(1140) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1143) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1145)..(1164) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1145)..(1164) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1165)..(1168) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1169)..(1170) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1173) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1175)..(1194) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1175)..(1194) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1195)..(1198) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1199)..(1200) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1203) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1205)..(1224) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1205)..(1224) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1225)..(1228) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1229)..(1230) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1233) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1235)..(1254) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1235)..(1254) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1255)..(1258) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1259)..(1260) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1263) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1265)..(1284) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1265)..(1284) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1285)..(1288) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1289)..(1290) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1293) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1295)..(1314) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1295)..(1314) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1315)..(1318) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1319)..(1320) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1323) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1325)..(1344) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1325)..(1344) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1345)..(1348) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1349)..(1350) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1353) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1355)..(1374) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1355)..(1374) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1375)..(1378) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1379)..(1380) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1383) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1385)..(1404) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1385)..(1404) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1405)..(1408) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1409)..(1410) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1413) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1415)..(1434) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1415)..(1434) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1435)..(1438) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1439)..(1440) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1443) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1445)..(1464) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1445)..(1464) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1465)..(1468) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1469)..(1470) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1473) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1475)..(1494) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1475)..(1494) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1495)..(1498) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1499)..(1500) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1503) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1505)..(1524) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1505)..(1524) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1525)..(1528) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1529)..(1530) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1533) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1535)..(1554) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1535)..(1554) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1555)..(1558) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1559)..(1560) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1563) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1565)..(1584) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1565)..(1584) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1585)..(1588) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1589)..(1590) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1593) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1595)..(1614) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1595)..(1614) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1615)..(1618) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1619)..(1620) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1623) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1625)..(1644) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1625)..(1644) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1645)..(1648) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1649)..(1650) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1653) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1655)..(1674) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1655)..(1674) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1675)..(1678) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1679)..(1680) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1683) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1685)..(1704) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1685)..(1704) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1705)..(1708) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1709)..(1710) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1713) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1715)..(1734) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1715)..(1734) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1735)..(1738) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1739)..(1740) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1743) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1745)..(1764) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1745)..(1764) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1765)..(1768) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1769)..(1770) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1773) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1775)..(1794) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1775)..(1794) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1795)..(1798) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1799)..(1800) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1803) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1805)..(1824) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1805)..(1824) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1825)..(1828) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1829)..(1830) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1833) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1835)..(1854) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1835)..(1854) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1855)..(1858) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1859)..(1860) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1863) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1865)..(1884) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1865)..(1884) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1885)..(1888) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1889)..(1890) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1893) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1895)..(1914) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1895)..(1914) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1915)..(1918) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1919)..(1920) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1923) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1925)..(1944) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1925)..(1944) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1945)..(1948) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1949)..(1950) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1953) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1955)..(1974) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1955)..(1974) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1975)..(1978) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (1979)..(1980) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (1983) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (1985)..(2004) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1985)..(2004) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2005)..(2008) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2009)..(2010) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2013) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2015)..(2034) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2015)..(2034) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2035)..(2038) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2039)..(2040) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2043) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2045)..(2064) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2045)..(2064) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2065)..(2068) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2069)..(2070) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2073) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2075)..(2094) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2075)..(2094) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2095)..(2098) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2099)..(2100) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2103) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2105)..(2124) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2105)..(2124) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2125)..(2128) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2129)..(2130) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2133) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2135)..(2154) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2135)..(2154) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2155)..(2158) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2159)..(2160) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2163) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2165)..(2184) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2165)..(2184) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2185)..(2188) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2189)..(2190) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2193) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2195)..(2214) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2195)..(2214) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2215)..(2218) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2219)..(2220) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2223) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2225)..(2244) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2225)..(2244) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2245)..(2248) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2249)..(2250) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2253) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2255)..(2274) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2255)..(2274) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2275)..(2278) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2279)..(2280) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2283) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2285)..(2304) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2285)..(2304) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2305)..(2308) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2309)..(2310) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2313) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2315)..(2334) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2315)..(2334) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2335)..(2338) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2339)..(2340) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2343) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2345)..(2364) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2345)..(2364) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2365)..(2368) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2369)..(2370) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2373) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2375)..(2394) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2375)..(2394) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2395)..(2398) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2399)..(2400) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2403) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2405)..(2424) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2405)..(2424) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2425)..(2428) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2429)..(2430) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2433) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2435)..(2454) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2435)..(2454) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2455)..(2458) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2459)..(2460) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2463) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2465)..(2484) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2465)..(2484) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2485)..(2488) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2489)..(2490) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2493) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2495)..(2514) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2495)..(2514) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2515)..(2518) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2519)..(2520) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2523) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2525)..(2544) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2525)..(2544) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2545)..(2548) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2549)..(2550) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2553) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2555)..(2574) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2555)..(2574) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2575)..(2578) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2579)..(2580) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2583) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2585)..(2604) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2585)..(2604) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2605)..(2608) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2609)..(2610) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2613) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2615)..(2634) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2615)..(2634) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2635)..(2638) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2639)..(2640) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2643) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2645)..(2664) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2645)..(2664) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2665)..(2668) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2669)..(2670) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2673) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2675)..(2694) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2675)..(2694) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2695)..(2698) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2699)..(2700) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2703) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2705)..(2724) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2705)..(2724) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2725)..(2728) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2729)..(2730) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2733) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2735)..(2754) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2735)..(2754) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2755)..(2758) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2759)..(2760) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2763) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2765)..(2784) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2765)..(2784) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2785)..(2788) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2789)..(2790) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2793) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2795)..(2814) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2795)..(2814) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2815)..(2818) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2819)..(2820) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2823) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2825)..(2844) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2825)..(2844) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2845)..(2848) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2849)..(2850) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2853) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2855)..(2874) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2855)..(2874) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2875)..(2878) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2879)..(2880) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2883) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2885)..(2904) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2885)..(2904) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2905)..(2908) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2909)..(2910) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2913) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2915)..(2934) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2915)..(2934) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2935)..(2938) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2939)..(2940) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2943) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2945)..(2964) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2945)..(2964) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2965)..(2968) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2969)..(2970) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <220> <221> MOD_RES <222> (2973) <223> A, L, P, T or V <220> <221> MOD_RES <222> (2975)..(2994) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2975)..(2994) <223> This region may encompass 3-20 residues <220> <221> MOD_RES <222> (2995)..(2998) <223> This region may encompass one of the following sequences: GG, LS, APS, GAG, GGG, KPS, RPS, or GGGG <220> <221> MOD_RES <222> (2999)..(3000) <223> This region may encompass one of the following sequences: S, D, T, N, L, DS, DT, LS, SS, ST, TN, or TS <400> 64 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 20 25 30 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 260 265 270 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 385 390 395 400 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 405 410 415 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 465 470 475 480 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 485 490 495 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 500 505 510 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 515 520 525 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 530 535 540 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 545 550 555 560 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 565 570 575 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 580 585 590 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 595 600 605 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 610 615 620 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 625 630 635 640 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 645 650 655 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 660 665 670 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 675 680 685 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 690 695 700 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 705 710 715 720 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 725 730 735 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 740 745 750 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 755 760 765 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 770 775 780 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 785 790 795 800 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 805 810 815 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 820 825 830 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 835 840 845 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 850 855 860 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 865 870 875 880 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 885 890 895 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 900 905 910 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 915 920 925 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 930 935 940 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 945 950 955 960 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 965 970 975 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 980 985 990 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 995 1000 1005 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 1010 1015 1020 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1025 1030 1035 1040 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 1045 1050 1055 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1060 1065 1070 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1075 1080 1085 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1090 1095 1100 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1105 1110 1115 1120 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1125 1130 1135 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1140 1145 1150 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1155 1160 1165 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1170 1175 1180 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1185 1190 1195 1200 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1205 1210 1215 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 1220 1225 1230 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1235 1240 1245 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 1250 1255 1260 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1265 1270 1275 1280 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 1285 1290 1295 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1300 1305 1310 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1315 1320 1325 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1330 1335 1340 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1345 1350 1355 1360 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1365 1370 1375 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1380 1385 1390 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1395 1400 1405 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1410 1415 1420 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1425 1430 1435 1440 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1445 1450 1455 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 1460 1465 1470 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1475 1480 1485 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 1490 1495 1500 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1505 1510 1515 1520 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 1525 1530 1535 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1540 1545 1550 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1555 1560 1565 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1570 1575 1580 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1585 1590 1595 1600 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1605 1610 1615 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1620 1625 1630 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1635 1640 1645 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1650 1655 1660 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1665 1670 1675 1680 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1685 1690 1695 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 1700 1705 1710 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1715 1720 1725 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 1730 1735 1740 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1745 1750 1755 1760 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 1765 1770 1775 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1780 1785 1790 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 1795 1800 1805 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1810 1815 1820 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1825 1830 1835 1840 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1845 1850 1855 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1860 1865 1870 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1875 1880 1885 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1890 1895 1900 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1905 1910 1915 1920 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1925 1930 1935 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 1940 1945 1950 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1955 1960 1965 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 1970 1975 1980 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1985 1990 1995 2000 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 2005 2010 2015 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2020 2025 2030 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 2035 2040 2045 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2050 2055 2060 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2065 2070 2075 2080 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2085 2090 2095 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2100 2105 2110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2115 2120 2125 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2130 2135 2140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2145 2150 2155 2160 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2165 2170 2175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 2180 2185 2190 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2195 2200 2205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 2210 2215 2220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2225 2230 2235 2240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 2245 2250 2255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2260 2265 2270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 2275 2280 2285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2290 2295 2300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2305 2310 2315 2320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2325 2330 2335 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2340 2345 2350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2355 2360 2365 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2370 2375 2380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2385 2390 2395 2400 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2405 2410 2415 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 2420 2425 2430 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2435 2440 2445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 2450 2455 2460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2465 2470 2475 2480 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 2485 2490 2495 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2500 2505 2510 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 2515 2520 2525 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2530 2535 2540 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2545 2550 2555 2560 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2565 2570 2575 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2580 2585 2590 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2595 2600 2605 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2610 2615 2620 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2625 2630 2635 2640 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2645 2650 2655 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 2660 2665 2670 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2675 2680 2685 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 2690 2695 2700 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2705 2710 2715 2720 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 2725 2730 2735 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2740 2745 2750 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 2755 2760 2765 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2770 2775 2780 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2785 2790 2795 2800 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2805 2810 2815 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2820 2825 2830 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2835 2840 2845 Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2850 2855 2860 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2865 2870 2875 2880 Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2885 2890 2895 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 2900 2905 2910 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2915 2920 2925 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro 2930 2935 2940 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2945 2950 2955 2960 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Pro Xaa Xaa 2965 2970 2975 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2980 2985 2990 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2995 3000 <210> 65 <211> 4000 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide. See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4000) <223> This sequence may encompass 1-100 "Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa" repeating units <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(5) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(10) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(40) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(40) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(45) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(45) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(50) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(80) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(80) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(85) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(85) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(90) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(120) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(120) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (122)..(125) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (122)..(125) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(130) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (131)..(160) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (131)..(160) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (162)..(165) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(165) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(170) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (171)..(200) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(200) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (202)..(205) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (202)..(205) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (206)..(210) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (211)..(240) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (211)..(240) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (242)..(245) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (242)..(245) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (246)..(250) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (251)..(280) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (251)..(280) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (282)..(285) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (282)..(285) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (286)..(290) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (291)..(320) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (291)..(320) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (322)..(325) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (322)..(325) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (326)..(330) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (331)..(360) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (331)..(360) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (362)..(365) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (362)..(365) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (366)..(370) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (371)..(400) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (371)..(400) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (402)..(405) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (402)..(405) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (406)..(410) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (411)..(440) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (411)..(440) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (442)..(445) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (442)..(445) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (446)..(450) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (451)..(480) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (451)..(480) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (482)..(485) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (482)..(485) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (486)..(490) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (491)..(520) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (491)..(520) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (522)..(525) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (522)..(525) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (526)..(530) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (531)..(560) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (531)..(560) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (562)..(565) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (562)..(565) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (566)..(570) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (571)..(600) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (571)..(600) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (602)..(605) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (602)..(605) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (606)..(610) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (611)..(640) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (611)..(640) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (642)..(645) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (642)..(645) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (646)..(650) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (651)..(680) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (651)..(680) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (682)..(685) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (682)..(685) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (686)..(690) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (691)..(720) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (691)..(720) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (722)..(725) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (722)..(725) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (726)..(730) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (731)..(760) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (731)..(760) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (762)..(765) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (762)..(765) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (766)..(770) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> 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(851)..(880) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (851)..(880) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (882)..(885) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (882)..(885) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (886)..(890) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (891)..(920) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (891)..(920) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (922)..(925) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (922)..(925) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (926)..(930) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (931)..(960) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (931)..(960) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (962)..(965) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (962)..(965) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (966)..(970) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (971)..(1000) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (971)..(1000) <223> This region may encompass 4-30 residues <220> <221> MOD_RES <222> (1002)..(1005) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1002)..(1005) <223> This region may encompass 1-4 residues or this region may be absent in its entirety <220> <221> MOD_RES <222> (1006)..(1010) <223> This region may encompass one of the following sequences: GQ, GN, RPG, RPGGQ, RPGGN, SSS, SKG, or SN <220> <221> MOD_RES <222> (1011)..(1040) <223> Any amino 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395 400 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 405 410 415 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 465 470 475 480 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 485 490 495 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 500 505 510 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 515 520 525 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 530 535 540 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 545 550 555 560 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 565 570 575 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 580 585 590 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 595 600 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1020 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1025 1030 1035 1040 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1045 1050 1055 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1060 1065 1070 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1075 1080 1085 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1090 1095 1100 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1105 1110 1115 1120 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1125 1130 1135 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1140 1145 1150 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1155 1160 1165 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1170 1175 1180 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1185 1190 1195 1200 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1205 1210 1215 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1220 1225 1230 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1235 1240 1245 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1250 1255 1260 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1265 1270 1275 1280 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1285 1290 1295 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1300 1305 1310 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1315 1320 1325 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1330 1335 1340 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1345 1350 1355 1360 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1365 1370 1375 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1380 1385 1390 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1395 1400 1405 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1410 1415 1420 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1425 1430 1435 1440 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1445 1450 1455 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1460 1465 1470 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1475 1480 1485 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1490 1495 1500 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1505 1510 1515 1520 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1525 1530 1535 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1540 1545 1550 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1555 1560 1565 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1570 1575 1580 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1585 1590 1595 1600 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1605 1610 1615 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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3820 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3825 3830 3835 3840 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3845 3850 3855 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3860 3865 3870 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3875 3880 3885 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3890 3895 3900 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3905 3910 3915 3920 Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3925 3930 3935 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3940 3945 3950 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3955 3960 3965 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3970 3975 3980 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 3985 3990 3995 4000

Claims (58)

  1. 재조합 레실린(recombinant resilin)을 가교 결합시키는 방법으로서,
    정제된 재조합 레실린을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    상기 재조합 레실린을 과황산암모늄을 포함하는 가교 결합 용액 중에 배치하는 단계; 및
    상기 재조합 레실린을 상기 가교 결합 용액 중에서 적어도 60℃의 온도에서 인큐베이션시킴으로써, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 생성시키는 단계
    를 포함하는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인큐베이션은 적어도 15분, 적어도 30분, 적어도 45분, 적어도 60분, 적어도 90분 또는 적어도 2시간 동안 수행되는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가교 결합 용액 중의 상기 재조합 레실린은 60℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 85℃ 또는 75℃ 내지 85℃의 온도에서 인큐베이션되는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 적어도 2시간 동안 수행되는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합 용액은 광촉매 또는 가교 결합 효소를 포함하지 않는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 실온에서 5일 초과, 10일 초과, 20일 초과 또는 40일 초과 동안 안정적인, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 재조합 레실린은 배양물 중의 변형된 유기체에서 상기 재조합 레실린을 암호화하는 유전자를 재조합 방식으로 발현시키는 단계 및 발현된 재조합 레실린을 상기 배양물로부터 정제시키는 단계에 의해서 제조되는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  8. 조성물로서, 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하되, 상기 재조합 레실린은 상기 레실린을 과황산암모늄 및 열에 노출시킴으로써 가교 결합된, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  9. 조성물로서, 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하되, 상기 조성물은 가교 결합 효소를 포함하지 않는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  10. 조성물로서, 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하되, 상기 조성물은 광촉매를 포함하지 않는, 재조합 레실린을 가교 결합시키는 방법.
  11. 재조합 레실린 조성물로서, 극성 비수성 용매 중에 가교 결합된 재조합 레실린을 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 양성자성 용매인, 재조합 레실린 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 레실린 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매인, 재조합 레실린 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비양성자성 용매는 DMSO인, 재조합 레실린 조성물.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 중량 기준으로 20 내지 40%의 레실린을 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  17. 제11항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레실린은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린인, 재조합 레실린 조성물.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 상기 용매의 적어도 60부피%, 적어도 70부피%, 적어도 80부피%, 적어도 90부피%, 적어도 95부피%, 적어도 98부피% 또는 적어도 99부피%인, 재조합 레실린 조성물.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 수성 용매 중의 유사한 가교 결합된 재조합 레실린보다 더 높은 탄성률(elastic modulus)을 갖는, 재조합 레실린 조성물.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 적어도 10의 경도를 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 ASTM D2240을 통해서 쇼어 OO 경도계를 사용하여 측정되는 경우 약 10 내지 약 50의 경도를 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 ASTM D7121에 의해서 측정되는 경우 약 40% 내지 약 60%의 반발 탄력성(rebound resilience)을 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 ASTM D575에 의해서 측정되는 경우 약 6 내지 약 8psi의 25%에서의 압축 응력(compressive stress)을 포함하는, 재조합 레실린 조성물.
  24. 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 즈빅 압축 시험(Zwick compression test)에 의해서 측정되는 경우 2kN 미만의 압축력에서 탄성에서 가소성 전이를 경험하지 않는, 재조합 레실린 조성물.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 레실린 조성물은 발포 물질인, 재조합 레실린 조성물.
  26. 재조합 레실린 고체의 제조 방법으로서,
    수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 및
    상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 교환하는 단계를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 양성자성 용매인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 비양성자성 용매는 DMSO인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 교환은 적어도 8시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 수행되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 교환은 약 60℃에서 수행되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린을 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합된 재조합 고체 조성물은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  35. 가교 결합된 재조합 레실린 고체를 포함하는 고체 조성물의 물질 특성을 조정하는 방법으로서,
    수성 용매를 포함하는 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계; 및
    용매 교환을 수행하여 상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 대체하는 단계
    를 포함하는, 고체 조성물의 물질 특성을 조정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 용매를 대체하는 단계는 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물의 상기 탄성률, 상기 탄력성, 상기 경도, 최대 탄성 압축 하중(maximum elastic compressive load) 또는 물질 수명을 변화시키는, 고체 조성물의 물질 특성을 조정하는 방법.
  37. 재조합 가교 결합된 레실린 고체의 제조 방법으로서,
    정제된 재조합 레실린을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    상기 재조합 레실린을 과황산암모늄을 포함하는 수성 용매 중에 배치하는 단계;
    상기 재조합 레실린을 상기 수성 용매 중에서 적어도 60℃의 온도에서 인큐베이션시킴으로써, 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 생성시키는 단계; 및
    상기 수성 용매를 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 DMSO로 이루어진 군으로부터 선택된 극성 비수성 용매로 교환하는 단계
    를 포함하는, 재조합 가교 결합된 레실린 고체의 제조 방법.
  38. 재조합 레실린 발포체(foam)의 제조 방법으로서,
    수성 용매 중의 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물을 제공하는 단계;
    상기 수성 용매를 극성 비수성 용매로 교환하는 단계; 및
    하나 이상의 기포를 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물에 도입하는 단계
    를 포함하는, 재조합 레실린 발포체의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 양성자성 용매인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 양성자성 용매는 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 극성 비수성 용매는 비양성자성 용매인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 비양성자성 용매는 DMSO인, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 교환은 적어도 8시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간 또는 적어도 48시간 동안 수행되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 교환은 약 60℃에서 수행되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물은 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 측정되는 경우 모든 레실린의 일부로서 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 80%의 전장 레실린을 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 결합된 재조합 고체 조성물은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입하는 단계는 발포제(blowing agent)를 상기 가교 결합된 재조합 레실린 고체 조성물에 첨가하는 것을 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  48. 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발포제는 화학 발포제를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 화학 발포제는 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 암모늄, 아조다이카본아마이드, 아이소사이아네이트, 하이드라진, 아이소프로판올, 5-페닐테트라졸, 트라이아졸, 4,4'옥시비스(벤젠설포닐 하이드라자이드)(OBSH), 트라이하이드라진 트라이아진(THT), 인화수소(hydrogen phosphate), 타타르산, 시트르산 및 톨루엔설포닐 세미카바자이드(TSS)를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 화학 발포제는 중탄산나트륨을 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 발포제는 물리적 발포제를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 물리적 발포제는 클로로플루오로카본(CFC), 용존 질소, N2, CH4, H2, CO2, Ar, 펜탄, 아이소펜탄, 헥산, 메틸렌 다이클로라이드 및 다이클로로테트라-플루오로에탄을 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 물리적 발포제는 용존 질소를 포함하는, 재조합 레실린 고체의 제조 방법.
  54. 제1항 내지 제7항, 제25항 내지 제36항 및 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조된 조성물을 포함하는, 신발 밑창(shoe insole).
  55. 조성물로서, 극성 비수성 용매 중에 가교 결합된 레실린 조성물을 포함하되, 상기 가교 결합된 레실린은 발포된, 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 발포된 가교 결합된 레실린은 적어도 50%의 공극률(porosity)을 포함하는, 조성물.
  57. 제55항에 있어서, 상기 발포된 가교 결합된 레실린은 약 0.01㎜ 내지 약 3㎜의 평균 기포 직경을 갖는, 조성물.
  58. 제8항 내지 제25항 및 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신발 밑창.
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