CN105873594A - 交联的含有节枝弹性蛋白的材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种含一交联聚合物的物质组合物。所述交联聚合物包含多个节枝弹性蛋白多肽部分及至少一个聚合部分，所述至少一个聚合部分是经由至少一个交联部分而共价交联至所述多个节枝弹性蛋白多肽部分，所述交联部分是不包含联苯部分。本发明还公开一种制备所述物质组合物的方法；一种复合材料，其包含所述物质组合物及至少一个附加的聚合物质，所述至少一个附加的聚合物质被结合至所述交联聚合物；一种制造品，其包含所述物质组合物和/或复合材料；以及一种通过植入所述制造品来治疗受试者的组织损伤或缺损的方法。

Description

交联的含有节枝弹性蛋白的材料
技术领域
在本发明的一些实施例中，本发明涉及聚合材料的领域，更具体地但非排他地涉及了包含弹性生物聚合物的材料及其应用。
背景技术
纤维蛋白在重建医学研究中备受关注。天然结缔组织蛋白(如胶原和弹性蛋白)已经被测试且被应用于各种组织工程应用中。
由于胶原是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要成分，因此其广泛地使用纤维蛋白于组织工程。它已经被使用于吸收性缝线、海绵创伤及烧伤的敷料、药物传输微球体和软组织增强(以下述各种形式：薄膜、带、片、海绵、微珠、垫片和更多)中[Velema和Kaplan，Adv Biochem Eng Biotechnol 2006，102:187-238]。
在再生结缔组织上的尝试已经使用单组分支架(主要是从动物源的I型胶原支架)来执行。然而，这些支架具有过有限的成功，因为它们未能提供足够的机械支撑，且随后不能够诱发正确的组织架构[Moutos和Guilak，Biorheology 2008，45:501-512；Stevens，Materials Today 2008，11:18-25；Bagnaninchi等人，British Medical Journal 2007，41:e10；Butler等人，J Orthop Res 2008，26:1-9]。
弹性蛋白在与结缔组织(如皮肤和软骨)中的胶原相关联的脊椎动物中被产生。它也是动脉中的主要成分，允许了血管从心脏的血液的脉动流顺利的成为连续及稳定流[Gosline等人，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2002，357:121-132]。尽管弹性蛋白在哺乳动物中是像胶原一样几乎常见的，但在从动物源的弹性蛋白的重建医学中的应用的发展是远远低于胶原，由于倾向于钙化的和倾向于具有相关的微纤维蛋白(其可能导致一免疫应答)的污染的弹性蛋白所引起的初步纯化困难[Velema和Kaplan，Adv BiochemEng Biotechnol 2006，102:187-238]。
节枝弹性蛋白在许多昆虫内的专门的表皮区域中被发现，特别是需要高回弹性和低刚度且作为能量存储系统的区域中。以其在昆虫飞行和在跳蚤和沫蝉的非凡的跳跃能力中的作用而闻名。
节枝弹性蛋白显示出独特的机械性能，其以非常高的回弹性结合可逆的变形。据报导为最具弹性的生物材料[Weis-Fogh，J Mol Biol 1961，3:520-531；Weis-Fogh，J MolBiol 1961，3:648-667]。
对于作为一用于组织工程应用的基于生物聚合物的支架的重组节枝弹性蛋白的使用已经作出了努力。在自然界中，节枝弹性蛋白形成了以二/三-酪氨酸桥(其是通过酶催化的酪氨酸氧化反应来形成的)稳定的构像的自由的三维网状物。用于酪氨酸残基的体外类似的交联的方法已经被提出，其已被报导，成功地模仿天然蛋白的弹性性质(在光化学交联[Elvin等人，Nature 2005，437:999-1002；Qin等人，Biomaterials 2011，32:9231-9243]上和在节枝弹性蛋白的过氧化物酶催化的交联[Qin等人，Biomacromolecules 2009，10:3227-3234；Qin等人，Biomaterials 2011，32:9231-9243]上)。
Charati等人[Soft Matter 2009，5:3412-3416]描述了如同重组节枝弹性蛋白的肽(RLP)，其中的酪氨酸是以苯基丙氨酸和赖氨酸来取代，以[三(羟甲基)膦基]丙酸(THPP)和反应性羟甲基磷化氢(HMP)来交联。所述交联的材料被报导是高弹性的。
国际专利申请号PCT/IL2008/001542(公布号为WO 2009/069123)不仅描述了含有编码一连接到异源性多糖结合域的纤维多肽(如节枝弹性蛋白、弹性蛋白、蜘蛛丝、蚕丝、胶原和蚌足丝蛋白)的单体的氨基酸序列的多肽，而且描述了含有纤维多肽和多糖的复合体。
国际专利申请号PCT/IL2012/050340描述了含有生物聚合物(如一节枝弹性蛋白序列)和二羟苯基部分的聚合物，且交联聚合物包含交联的二羟苯基部分。交联能够通过二羟苯基部分的氧化来实现。所述聚合物能够以一通过氧化剂激活的粘合剂的形式来使用。类似的聚合物还被描述于Qin等人[Biomaterials 2011，32:9231-9243]中。
Qin等人[Biomacromolecules 2009，10:3227-3234；Biomaterials 2011，32:9231-9243]报导对于交联的节枝弹性蛋白来说，非交联的节枝弹性蛋白具有一相似的弹性的模量，如通过纳米压痕技术所测定的，并建议高回弹性材料的生产并不完全依赖于发生于天然节枝弹性蛋白中的二酪氨酸交联。
羧基和主要的胺类之间的交联能够使用如碳化二亚胺、脲阳离子和磷试剂的偶联剂来得到。一个这样的用于形成一共价酰胺键的碳化二亚胺偶联剂是1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亚胺(本领域中已知的EDC或EDAC)，其能够与作为一活化剂的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来使用。
使用EDC/NHS或EDC/NHS/8-臂端胺基PEG所交联的胶原支架已经被报导而显示出高生物兼容性(相较于戊二醛交联的胶原支架)[Ward等人，Biomacromolecules 2010，11:3093-3101]。
额外的背景技术包括：国际专利申请公开号WO 2004/104043；Benedetti等人[Biotechnol Bioeng 1997，53:232-237]；Bennet-Clark和Lucey[J Exp Biol1967，47:59-76]；Burrows等人[BMC Biology 2008，6:41]；Haas等人[Proc Biol Sci 2000，267:1375-1381]；Fancy和Kodadek[Proc Natl Acad Sci USA 1999，96:6020]；Freitas等人[Journalof Controlled Release 2005，102:313–332]；Gedanken[Chem Eur J 2008，14:3840-3853]；Ruckenstein等人[Polymer 1995，36:2857-2860]；Weis-Fogh[Exp Biol 1960，37:889-907]；Vincent和Wegst[Arthropod Struct Dev 2004，33:187-199]；以及Young和Bennet-Clark[J Exp Biol 1995，198:1001-1020]。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种物质组合物，其包含一交联聚合物。所述交联聚合物包含多个节枝弹性蛋白多肽部分(resilin polypeptide moiety)及至少一个聚合部分(polymeric moiety)，所述至少一个聚合部分是经由至少一个交联部分而共价交联至所述多个节枝弹性蛋白多肽部分的至少一部份，所述交联部分是不包含联苯部分。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种复合材料，其包含本发明中所描述的物质组合物和至少一个附加的聚合物质，所述至少一个附加的聚合物质被结合至所述交联聚合物。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种制造品，其包含本发明中所描述的物质组合物和/或本发明中所描述的复合材料。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种治疗有需要的受试者的组织损伤或缺损的方法，所述方法包含将本发明中所描述的制造品植入于所述受试者中，从而治疗所述组织损伤或缺损。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种制备本发明中所描述的物质组合物的方法，所述方法包含将一节枝弹性蛋白多肽共价交联到至少一个聚合物质，其中所述交联不会产生联苯部分。
根据本发明中所描述的任一实施例的一些，所述节枝弹性蛋白多肽部分包含节枝弹性蛋白、其片段和/或其同源多肽。
根据本发明的一些实施例，所述交联聚合物的至少10重量百分比是所述至少一个聚合部分。
根据本发明的一些实施例，所述交联部分包含一酰胺键。
根据本发明的一些实施例，所述交联部分由一酰胺键组成。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个聚合部分包含多个胺基，且所述酰胺键是由所述聚合部分的至少一个胺基及所述节枝弹性蛋白多肽部分的至少一个羧基构成。
根据本发明的一些实施例，所述羧基构成所述节枝弹性蛋白多肽的氨基酸残基的侧链的一部分，所述节枝弹性蛋白多肽是选自于由谷氨酸残基及天冬氨酸残基所组成的群组。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个聚合部分包含一多肽。
根据本发明的一些实施例，所述多肽包含一胶原(例如，胶原、其片段或其同源多肽)。
根据本发明的一些实施例，所述交联部分是由所述聚合部分的至少一个赖氨酸残基的一侧链生成的。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个聚合部分包含聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)，PEG)。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个聚合部分包含一支化端胺基聚合物(branched amine-terminated polymer)。
根据本发明的一些实施例，所述交联聚合物是处于多个颗粒的形式。
根据本发明的一些实施例，所述颗粒的直径范围是介于1微米(μm)至200微米之间。
根据本发明的一些实施例，所述颗粒实质上是球体。
根据本发明的一些实施例，所述颗粒被相互的共价交联。
根据本发明的一些实施例，所述物质组合物是处于一薄膜的形式。
根据本发明的一些实施例，所述附加的聚合物质包含一多糖，且所述交联聚合物包含一多糖结合域，所述多糖结合域结合至所述多糖。
根据本发明的一些实施例，所述节枝弹性蛋白多肽部分包含所述多糖结合域。
根据本发明的一些实施例，所述多糖包含纤维素。
根据本发明的一些实施例，所述物质组合物和/或所述复合材料是处于一发泡体的形式。
根据本发明的一些实施例，所述物质组合物和/或复合材料具有至少一个选自于由下列所组成的群组的特点：
至少2.5kPa的弹性模量；以及
至少50％的回弹性，在所述发泡体的压缩上。
根据本发明的一些实施例，所述交联聚合物是处于多个颗粒的形式，所述颗粒被埋置于所述至少一个附加的聚合物质中。
根据本发明的一些实施例，所述附加的聚合物质被共价连接至所述交联聚合物。
根据本发明的一些实施例，所述附加的聚合物质经由至少一酰胺键而被共价连接至所述交联聚合物。
根据本发明的一些实施例，所述附加的聚合物质包含胶原。
根据本发明的一些实施例，所述制造品是一医疗装置。
根据本发明的一些实施例，所述医疗装置是一植入式医疗装置。
根据本发明的一些实施例，所述制造品能够形成一支架在所述受试者体内，从而诱发一组织的形成。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个聚合物质包含多个胺基，且所述交联包含将所述胺基与所述节枝弹性蛋白多肽的羧基起反应，以致形成一酰胺键。
根据本发明的一些实施例，所述起反应包含激活所述节枝弹性蛋白多肽的所述羧基，且将所述节枝弹性蛋白多肽与所述至少一个聚合物质进行接触。
根据本发明的一些实施例，所述激活是通过与一碳化二亚胺反应来产生的。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包含在所述交联之前将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质与至少一个附加的聚合物质进行接触，从而产生一复合材料，所述复合材料包含结合至所述至少一个附加的聚合物质的所述交联聚合物。
根据本发明的一些实施例，所述至少一个附加的聚合物质是处于一发泡体的形式。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包含在所述交联之前将一含有所述节枝弹性蛋白多肽及所述至少一个聚合物质的亲水性溶液与一亲水表面进行接触，以致产生薄膜形式的所述物质组合物。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包含在所述交联之前制备多个含有所述节枝弹性蛋白多肽及所述至少一个聚合物质的颗粒，从而在所述交联之上产生含有所述交联聚合物的颗粒。
根据本发明的一些实施例，所述颗粒被相互的共价交联。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包含将所述颗粒埋置于至少一个附加的聚合物质中，从而产生一复合材料，所述复合材料包含埋置于所述至少一个附加的聚合物质中的所述颗粒。
根据本发明的一些实施例，制备所述颗粒包含了所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质的混合物的分散和/或沉淀。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明实施方案的实践或测试中可使用与本文所述的方法和材料相似或相同的方法和材料，但示例性方法和/或材料在下文中描述。如有冲突，以本发明的说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为示例性的而无意于进行必要的限制。
附图说明
在本文参照附图仅通过举例的方式描述了本发明的一些实施方案。具体详细参照附图，应强调的是，所示出的特定方案仅通过举例的方式描述并且出于本发明的实施方案的示例性讨论的目的。就这一点而言，结合附图进行的描述使得如何可实践本发明的实施方案对于本领域技术人员显而易见。
在附图中：
图1呈现稠合至一纤维素结合域(cellulose-binding domain，CBD)的6H-标记的节枝弹性蛋白(外显子1)的示例性DNA序列(SEQ ID NO:12)和蛋白质序列(SEQ ID NO:13)，其中显示组氨酸标签(His tag)(底线)、间隔段(spacer)(波状底线)、TEV蛋白酶裂解序列(TEV protease cleavage sequence)(双底线，裂解位点是在灰色的QG之间)、从选殖工序(cloning process)所添加的氨基酸(虚线的底线)、原生的节枝弹性蛋白连接符(粗底线)和纤维素结合域(粗波状底线)。
图2A和2B呈现2.5％纳米晶纤维素悬浮物的照片(图2A)和显示所述悬浮物中的纤维素纳米棒的隧式电子显微镜图像(图2B)(图2B中的比例尺表示为500纳米)。
图3A和3B呈现纳米晶纤维素发泡体的照片(图3A)和显示所述发泡体的纳米结构的扫描式电子显微镜的图像(图3B)(图3B中的比例尺表示为200微米)。
图4是显示在第一、第二及第三周期的压缩期间示例性纳米晶纤维素(nanocrystalline cellulose，NCC)发泡体、节枝弹性蛋白发泡体、节枝弹性蛋白-NCC混合的复合发泡体和节枝弹性蛋白-NCC浸入的复合发泡体(如本发明中所描述的来制备)的压缩下的弹性模量(y-axis)的柱状图。
图5A至5C是显示在第一(实线)、第二(虚线)和第三(点线)周期的压缩期间示例性节枝弹性蛋白发泡体(图5A)、节枝弹性蛋白-NCC混合的复合发泡体(图5B)和节枝弹性蛋白-NCC浸入的复合发泡体(图5C)的压缩下的应力/应变曲线的曲线图。
图6是显示示例性节枝弹性蛋白-NCC发泡体(实线)和NCC发泡体(点线)的压缩下的应力/应变曲线的曲线图。
图7呈现本发明一些实施例中一示例性交联的节枝弹性蛋白多肽薄膜的光学图像。
图8呈现本发明一些实施例中一示例性交联的胶原-节枝弹性蛋白多肽薄膜的光学图像。
图9呈现根据本发明的一些实施例所制备的示例性非交联的节枝弹性蛋白球体的光学显微镜图像(所述球体的直径范围是介于10至20微米左右之间；比例尺表示为500微米)。
图10呈现本发明的一些实施例中示例性交联的节枝弹性蛋白球体的光学显微镜图像(比例尺表示为500微米)。
具体实施方式
在本发明的一些实施例中，本发明涉及聚合材料的领域，更具体地但非排他地涉及了包含弹性生物聚合物的材料及其应用。
在详细阐述本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明的应用未必局限于下面的说明中提及的或通过范例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方案或以多种方式实践或实施。
当研究节枝弹性蛋白多肽的性质时，本发明人发现了回弹性、生物兼容性和均质性的物质组合物能够通过将节枝弹性蛋白多肽与一含有胺基的聚合物质交联且使用碳化二亚胺化学反应来容易地得到，而非通过经由如天然存在的节枝弹性蛋白的酪氨酸残基来交联节枝弹性蛋白多肽彼此。这样的物质组合物还能够被结合到一附加的物质(例如，一附加的聚合物质)以形成一结合所述物质组合物的回弹性与所述附加的物质的机械性能的复合材料。
请参考附图，图1显示了用于包含一纤维素结合域的节枝弹性蛋白多肽的编码DNA序列和蛋白质序列，所述纤维素结合域有助于一含有所述节枝弹性蛋白多肽的物质组合物结合到纤维素。
图2A和2B显示一纳米晶纤维素悬浮物，且图3A-3B显示一纳米晶纤维素海绵(每个无节枝弹性蛋白多肽)。
图4显示相较于纳米晶纤维素海绵，示例性交联的节枝弹性蛋白多肽海绵和交联的节枝弹性蛋白多肽纳米晶纤维素复合体海绵在压缩下的回弹性。图4至6进一步显示相较于交联的节枝弹性蛋白多肽海绵和纳米晶纤维素海绵，所述交联的节枝弹性蛋白多肽纳米晶纤维素复合体海绵的提高的机械强度。
图7和8显示了一示例性薄膜形式的交联的节枝弹性蛋白多肽的图像。
图9和10显示在图9和随后的图10的所述节枝弹性蛋白多肽的交联之前示例性节枝弹性蛋白多肽球体。所述交联的节枝弹性蛋白多肽球体能够被使用，例如，通过被结合到一附加的物质以形成一复合材料。
根据本发明的实施例的一个方面，提供一种物质组合物，其包含一交联聚合物。所述交联聚合物包含多个节枝弹性蛋白多肽部分及至少一个聚合部分，所述至少一个聚合部分是经由至少一个交联部分而共价交联至所述多个节枝弹性蛋白多肽部分。
因此，所述物质组合物包含至少一个与多个节枝弹性蛋白多肽部分交联的聚合部分，从而交联所述多个节枝弹性蛋白多肽部分。在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物还包含至少一个与一单一节枝弹性蛋白多肽部分共价交联的交联部分，而没有和多个节枝弹性蛋白多肽部分连接在一起。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，至少一部分的节枝弹性蛋白多肽部分与多个聚合部分共价交联，从而形成一共价交联的三维网状物，所述共价交联的三维网状物包含多个节枝弹性蛋白多肽部分和多个聚合部分。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物包含一含有交联的节枝弹性蛋白多肽部分及聚合部分的支架。
如本文所用的术语"支架"描述一二维的支撑框架或一三维的支撑框架。本发明的实施例的支架是由包含本发明中所描述的部分(moiety)(例如，如本发明中所描述的聚合部分和节枝弹性蛋白多肽部分)的单元所组成，所述部分(moiety)在其之间被交联。
不受任何具体理论约束，据信节枝弹性蛋白多肽部分与大量的聚合部分的交联(如本发明中所描述的)在宏观距离上出乎意料地提供了具有相当的机械强度的物质组合物，基本上没有牺牲与节枝弹性蛋白有关系的回弹性。因此，一以相当大的回弹性为特征的物质组合物能够出乎意料地及有利地从无直接交联的节枝弹性蛋白多肽彼此的节枝弹性蛋白(亦即，没有添加聚合物质，如本领域先前所描述的)来得到，其能够是技术上困难的和/或未能提供期望的机械强度。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联聚合物的至少10重量百分比(干重)是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少20重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少30重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少40重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少50重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少60重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少70重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少80重量百分比是所述聚合部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少90重量百分比是所述聚合部分。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联聚合物的至少10重量百分比(干重)是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少20重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少30重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少40重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少50重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少60重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少70重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述交联聚合物的至少80重量百分比是所述节枝弹性蛋白多肽部分。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少50重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少60重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少70重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少80重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少90重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少95重量百分比干重的交联聚合物。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分的总重量代表至少99重量百分比干重的交联聚合物。
在此，短语"节枝弹性蛋白多肽"和"节枝弹性蛋白多肽部分"包含一含有一节枝弹性蛋白、节枝弹性蛋白的片段或其同源多肽的序列的多肽(亦即，同源于本发明中所定义的节枝弹性蛋白或其片段的多肽)。短语"节枝弹性蛋白多肽部分"指的是形成分子的一部份的部分，然而短语"节枝弹性蛋白多肽"可意指为分子本身或形成所述分子的一部份的部分。
在此，一给定多肽的同源多肽包含多肽，其是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或更多(例如100％)同源于所述给定多肽，例如本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽(例如，一列于表1中的序列或其片段)，如采用默认参数(default parameters)使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件来测得的。所述同源多肽还能够意指为一包含其氨基酸替代和它们的生物活性多肽片段的缺失、插入或替代的变体。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一同源多肽为至少80％同源，如上文中所定义的。在一些实施例中，一同源多肽为至少85％同源，如上文中所定义的。在一些实施例中，一同源多肽为至少90％同源，如上文中所定义的。在一些实施例中，一同源多肽为至少95％同源，如上文中所定义的。在一些实施例中，一同源多肽为至少98％同源，如上文中所定义的。在一些实施例中，一同源多肽为至少99％同源，如上文中所定义的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一节枝弹性蛋白(或其同源多肽)的片段在长度上是至少50个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少60个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少70个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少80个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少100个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少125个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少150个氨基酸残基。在一些实施例中，一节枝弹性蛋白的片段在长度上是至少200个氨基酸残基。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白多肽部分主要由节枝弹性蛋白、其片段或其同源多肽组成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白多肽部分除了节枝弹性蛋白、其片段或其同源多肽之外还包含了一或多个肽序列。
节枝弹性蛋白的非限制性范例的基因银行登记号(GenBank Accession Nos.)被列于下表1中。
表1
典型的节枝弹性蛋白NCBI序列号 生物体
NP 995860 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
NP 611157 黑腹果蝇
Q9V7U0 黑腹果蝇
AAS64829 黑腹果蝇
AAF57953 黑腹果蝇
XP 001817028 拟谷盗(Tribolium castaneum)
XP001947408 碗豆蚜(Acyrthosiphon pisum)
根据本发明中所描述的任何实施例的一些，所述节枝弹性蛋白多肽部分包含所述全长节枝弹性蛋白氨基酸序列(亦即，包含从外显子1(exon 1)、外显子2及外显子3的每一个的氨基酸)，例如，如陈列于SEQ ID NO:19中。
根据其他实施例，所述节枝弹性蛋白多肽部分包含外显子1节枝弹性蛋白氨基酸序列(SEQ ID NOs:1、2或16)或一同源的多肽序列，其能够是70％同源于、75％同源于、80％同源于、85％同源于、90％同源于、91％同源于、92％同源于、93％同源于、94％同源于、95％同源于、96％同源于、97％同源于、98％同源于、99％同源于或100％同源于列在SEQ IDNOs:1、2或16中的所述序列，如采用默认参数(default parameters)使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件来测得的。所述同源多肽序列还能够意指为一包含其氨基酸替代和它们的生物活性多肽片段的缺失、插入或替代的变体。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白氨基酸序列包含一外显子1节枝弹性蛋白氨基酸序列和一多糖结合域(例如，一纤维素结合域(CBD)和/或一几丁质结合域，如编码于外显子2中)。
在此，短语"多糖结合域"指的是一多肽或其部分，所述部分能够选择地结合至一多糖。各种多糖结合域在本领域中是已知的。
SEQ ID NO:3或6中提供了节枝弹性蛋白的外显子2中所发现的ChBD序列的范例。
SEQ ID NOs:17和18中提供了纤维素结合域(CBD)氨基酸序列的范例。
国际专利申请公开号WO2009/069123中提供了附加的多糖结合域，其通过引用并入本文中。
所述多糖结合域能够连接到外显子1的C端结构域或外显子1的N端结构域(直接或经由一连接符)。
图1中提供了一连接到纤维素结合域的示例性外显子1节枝弹性蛋白氨基酸序列。
根据再一些其他的实施例，所述节枝弹性蛋白多肽部分氨基酸序列包含至少一个、至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少十六个、至少十七个或更多的节枝弹性蛋白重复单元，如列于SEQ ID NO:4(Gly Gly Arg Pro Ser AspSer Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn)。
根据再一些其他的实施例，所述节枝弹性蛋白多肽部分氨基酸序列包含至少一个、至少二个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少十六个、至少十七个或更多的节枝弹性蛋白重复单元，如列于SEQ ID NO:5(GRPSDSYGA)。
根据再一些其他的实施例，所述节枝弹性蛋白氨基酸序列不包含外显子3氨基酸序列。
根据又一些其他的实施例，所述节枝弹性蛋白氨基酸序列包含外显子3氨基酸序列。
能够使用来表示节枝弹性蛋白的多核苷酸的范例被列于SEQ ID NO:7、8、10、12和14。
6H-标记的节枝弹性蛋白多肽序列的范例是被列于SEQ ID NO:9、11、13和15中。SEQ ID NO:13是一示例性多肽序列。这样的序列能够利用所述6H-标签来容易地分离，且能够被掺入所述物质组合物中或在去除6H-标签后被掺入，如本文所例举的。
国际申请号WO2009/069123和国际专利申请号PCT/IL2012/050340中提供了其他的能够被使用的示例性多肽和多核苷酸序列，其通过引用并入本文中。
如本文所使用的术语"多肽"包含天然肽大分子(例如节枝弹性蛋白多肽)，其包含降解产物、合成制备的肽和重组肽(例如，重组表达于一微生物中)，也包含拟肽类大分子(典型地、合成地合成的肽)，还包含类肽和半类肽的大分子，其是肽类似物，其例如具有转译所述多肽更稳定的修饰。这样的修饰包含但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰、主链修饰和残基修饰。用于制备拟肽类化合物的方法在本领域中是公知的，且例如在Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin PergamonPress(1992)中被指明，其通过引用并入，如同在这里完全阐述。在此方面的更多细节被提供于下文中。
所述多肽中的肽键(-CO-NH-)能够被取代，例如，通过N-甲基化酰胺键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(＝O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、亚硫酰基亚甲基键(-S(＝O)-CH2-)、*-硫唑嘌呤键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-CH2-NH-)、硫键(-CH2-S-)、乙烯键(-CH2-CH2-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)、硫酰胺键(-CS-NH-)、烯的双键(-CH＝CH-)、氟化的烯的双键(-CF＝CH-)、后酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是所述“正”侧链，自然存在于所述碳原子。
这些修饰可发生在沿着所述多肽键的任何键，即使同时间在几个键(2-3)。
天然芳香氨基酸、Trp、Tyr和Phe能够通过非天然芳香氨基酸(例如，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、萘基丙氨酸、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或O-甲基-Tyr)来取代。
本发明中所描述的任何实施例的一些的多肽还可以包含一或多个改性的氨基酸或一或多个非氨基酸单体，例如脂肪酸、复合碳水化合物等等。
术语"氨基酸"被理解为包含20个天然存在氨基酸；这些氨基酸在体内常被后转译地修改，例如包含羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不平常的氨基酸，包含但不限于氨基己二酸(2-aminoadipic acid)、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"包含D-和L-氨基酸两者。
以下的表2和表3列出天然存在的氨基酸(表2)和非传统或改性的氨基酸，例如能够与本发明一些实施例使用的合成物(表3)。
表2
表2(续)
表3
表3(续)
优选地，本发明的一些实施例的多肽被利用于一线性形式，尽管可理解的是，在环化不严重干扰所述多肽的多肽特性、循环方式的情况下还能够被利用。
本发明的一些实施例的多肽能够通过任何的那些本领域技术人员已知的肽合成的技术来合成。对于固相肽合成而言，许多技术的总结能够在J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963以及J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(NewYork)，1973中被发现。对于典型的溶液合成而言，请见G.Schroder和K.Lupke，ThePeptides，vol.1，Academic Press(New York)，1965。
一般来说，这些方法包含一或多个氨基酸或者适当保护的氨基酸连续添加至一成长的多肽链。通常地，所述第一氨基酸的氨基或羧基的基团是通过一合适的保护基团来保护的。接续，在适合于形成所述酰胺键的条件下，所述保护的或衍生的氨基酸能够通过将所述下个氨基酸添加至具有适当保护的称赞的(氨基或羧基)基团的序列中而被连接到一惰性固体支撑物，或者在溶液中被利用。接续，所述保护基团被从这个新增加的氨基酸残基来移除，而后所述下个氨基酸(适当保护的)被添加等等。在所有需要的氨基酸已被连接到所述固有序列中之后，任何剩余的保护基团(和任何固体支撑物)被顺序地移除或同时地移除，以提供所述最终的多肽化合物。通过此一般工序的简单修饰，可能一次将一个以上的氨基酸添加至一成长链，例如，通过以一适当的保护的二肽结合一保护的三肽，而在去保护之后形成一五肽等。多肽合成的进一步描述被揭露于美国专利号6,472,505中。
一本发明的一些实施例的制备多肽的优选方法涉及到固相多肽合成。
大规模的多肽合成是通过Andersson[Biopolymers 2000；55(3):227-50]来描述。
本发明的多核苷酸能够使用以下范例部分中所描述的PCR技术来制备，或能够被化学合成，或通过任何的用于两个不同的DNA序列的连接的本领域中已知的其他方法或工序。例如，请见“当前的分子生物学的规范”，eds.Ausubel等人，John Wiley&Sons，1992。
本发明的多肽能够使用各种标准蛋白纯化技术来纯化，所述标准蛋白纯化技术例如但不限于热处理、例如以硫酸铵的盐析、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀、亲和色谱法、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、逆相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、聚焦层析和微分溶解(differential solubilization)。
为了便于复原，所述表达的编码序列能够被改造以编码本发明的多肽和融合裂解部分(例如，组胺酸)。这样的融合蛋白能够被设计，以致所述多肽能够容易地通过亲和色谱法来分离，例如，通过一特定于所述裂解部分的管柱上的固定(请见下文中的范例部分)。
在一裂解位点被设计在所述多肽和所述裂解部分之间的情况下，所述多肽能够通过以一特定地裂解这个位点上的融合蛋白的合适的酶或试剂来处理而从所述色谱柱来释放[例如，请见Booth等人，Immunol.Lett.19:65-70(1988)；以及Gardella等人，J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
优选地，本发明的多肽在一个"基本上纯"的形式被恢复。
本文中所使用的短语"基本上纯"指的是允许本发明中所描述的应用中的所述蛋白质的有效利用的纯度。
除了可被合成到宿主细胞中，本发明的所述多肽还可以使用体外表达系统来合成。这些方法在本领域中是公知的，且所述系统的组件是市售的。
接着在本发明的多肽的表达式和可选择的纯化，所述多肽能够被交联(例如，如本发明中所描述的)以从一溶液形成一不可溶材料，优选的是一具有相对高浓度的多肽的不可溶材料。根据一个实施例，本发明的节枝弹性蛋白多肽的临界浓度约为50mg/ml(毫克/毫升)。根据一个实施例，所述多肽是通过超速离心法来浓缩的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，本发明中所描述的聚合部分包含一多肽，如本发明中所定义的。
在示例性实施例中，所述聚合部分包含胶原(例如，人类重组胶原、胶原的片段，或者同源于本发明所定义的胶原或其片段的多肽)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，胶原(或其同源多肽)的片段在长度上是至少50个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少60个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少70个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少80个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少100个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少125个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少150个氨基酸残基。在一些实施例中，胶原的片段在长度上是至少200个氨基酸残基。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，本发明中所描述的聚合部分包含一合成的或半合成的聚合物。可以使用在本发明实施例中的合成的和半合成的聚合物的范例包含但不受限于聚烷撑二醇类；聚(乙烯-co-乙烯醇)；聚(羟基戊酸酯)；聚(乳酸)；聚已酸内酯；聚(丙交酯-co-乙交酯)；聚(羟基丁酸)；聚(羟基丁酸-co-戊酸酯)；聚对二氧环己酮；聚脂类；聚酸酐类；聚(乙醇酸)；聚(乙醇酸-co-三亚甲基碳酸酯)；聚氰基丙烯酸酯类；聚(三亚甲基碳酸酯)；聚(亚氨基碳酸盐)；聚亚烷基草酸盐；聚磷腈类；聚氨酯类；聚硅酮类；聚烯烃类(例如，聚乙烯、聚丙烯)；聚丙烯酸酯类和聚甲基丙烯酸酯类；聚丙烯酰胺类和聚甲基丙烯酰胺类；乙烯基卤代聚合物(例如，聚氯乙烯)；聚乙烯醚类(例如，聚乙烯甲醚)；聚乙二烯卤化物(例如，聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯)；聚丙烯腈；聚乙烯酮类；聚乙烯芳香族(例如，聚苯乙烯)；聚乙烯脂类(例如，聚醋酸乙烯酯)；聚酰胺(例如，尼龙66(Nylon 66)和其他的尼龙、聚己内酰胺)；聚碳酸酯类；聚氧亚甲基类；聚酰亚胺类；聚醚类；纤维素和纤维素衍生的聚合物(例如，人造纤维、三醋酸盐人造纤维、醋酸盐纤维素、丁酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、硝酸盐纤维素、丙酸酯纤维素、乙醚纤维素、羧基甲基纤维素)；以及其共聚合物。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分是亲水性的(例如，在水中可膨胀)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分包含一聚亚烷基二醇。
本文中所使用的短语"聚(烷撑二醇)"包含共享以下通式的聚醚聚合物的家族：-O-[(CH2)m-O-]n-，其中m代表存在于每个二元醇单元的亚甲基基团的数量，n代表重复单元的数量，因此表示所述聚合物的尺寸或长度。例如，当m＝2时，所述聚合物被称为聚乙二醇；当m＝3时，所述聚合物被称为聚丙二醇。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，m是大于1的整数(例如，m＝2、3、4等等)。
可选择地，m在所述聚(烷撑二醇)链的单元上会有所不同。例如，聚(烷撑二醇)链能够包含连接在一起的乙二醇(m＝2)单元和连接在一起的丙二醇(m＝3)单元。
短语"聚(烷撑二醇)"还包含其类似物，其中所述氧原子是通过另一个杂原子(例如，S和-NH-等等)来替换。这个术语还包含上述的衍生物，其中一或多个构成所述聚合物的所述亚甲基基团被取代。在所述亚甲基基团上的示例性取代基包含但不限于烷基、环烷基、烷氧基、羟基、硫醇、胺类、卤代、氧代、羰基、羧酸盐和氨基甲酸酯等。
因此，本文中所使用的短语"二元醇单元"包含一-(CH2)m-O-基团或其类似物，如上文中所描述的，其形成所述聚(烷撑二醇)的主链，其中所述(CH2)m(或其类似物)被结合到一属于另一个二元醇单元和/或属于一交联部分的杂原子。
一二元醇单元能够被支化，以致其连接至三个或更多的邻近的二元醇单元，其中所述三个或更多的邻近的二元醇单元的每一个是聚(烷撑二醇)链的一部分。这样的支化二元醇单元是经由其杂原子而被连接到一个邻近的二元醇单元，且剩下的邻近的二元醇单元的杂原子被各自连接到所述支化二元醇单元的碳原子。此外，一杂原子(例如，氮)能够结合多于其中一部分的二元醇单元的一个碳原子，从而形成一支化二元醇单元(例如，[(-CH2)m]2N-等)。
一聚(烷撑二醇)基团的末端杂原子(例如，一氧原子)被结合至一例如为氢原子的原子、一相邻的部分中的原子(例如，本发明中所描述的多肽)或一末端基的一原子(例如，一碳原子)。所述末端基可以是一相对惰性的“帽基”，如一烷基基团(例如，未取代的烷基)或者一更反应性基团(例如，一含有胺的基团)，例如，一与一相邻的部分反应从而使得所述聚(烷撑二醇)连接到所述相邻的部分(例如，本发明中所描述的部分)的基团。
在示例性实施例中，二元醇单元的至少50％是相同的，例如，它们包含相同的杂原子和相同的m值(彼此)。可选择地至少70％、可选择地至少90％和可选择地至少100％的所述二元醇单元是相同的。在示例性实施例中，结合到所述相同的二元醇单元的杂原子是氧原子。在进一步的示例性实施例中，M是2，用于相同的单元。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚(亚烷基二醇)是一聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol)，PEG)。
本文中所用的术语"聚(乙二醇)"描述一聚(乙二醇)，如本发明中所定义的，其中所述二元醇单元的至少50％、至少70％、至少90％和100％(优选地)是-CH2CH2-O-。同样地，短语"聚乙二醇单元"在此定义为-CH2CH2O-的单元。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分是线性的，亦即，其包含一单一的、作为主链的直链。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分包含支链，还称为多触角。在一些实施例中，每一支链是经由一交联部分而被连接到一节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述聚合部分包含支化PEG(例如，"星状PEG")。8-臂PEG是一示例性支化PEG。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分具有至少约2kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约3kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约4kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约5kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约6kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约7kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约8kDa的分子量。在一些实施例中，所述聚合部分具有至少约9kDa的分子量。在示例性实施例中，所述聚合部分具有至少约10kDa的分子量。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分包含末端胺基，例如端胺基PEG。端胺基PEG在此还被称为"PEG-胺"。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分包含一支化端胺基聚合物(例如，支化PEG胺)。这样的聚合物能够包含所有分支上或仅一部份分支上的末端胺基。在一些实施例中，支化端胺基聚合物包含至少3个末端胺基。在一些实施例中，支化端胺基聚合物包含至少4个末端胺基。在一些实施例中，支化端胺基聚合物包含至少6个末端胺基。在一些实施例中，支化端胺基聚合物包含至少8个末端胺基。
8-臂PEG-胺(8-arm PEG-amine)包含了末端的8个胺基，所述8-臂PEG-胺是一示例性支化端胺基聚合物。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，本发明中所描述的交联部分交联了具有一聚合部分的节枝弹性蛋白多肽部分。本发明中所描述的交联部分是不包含联苯部分的部分(moiety)。
在此，"联苯部分"指的是具有以下分子式的任何部分(moiety)：
其中R1-R10的每一个各自地是氢或任何取代基，或者一具有本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽部分和/或聚合部分(例如，部分通过所述联苯部分被交联)的共价键，其中R1-R5的至少一个是一具有一节枝弹性蛋白多肽部分或聚合部分的共价键，且R6-R10的至少一个是一具有一节枝弹性蛋白多肽部分或聚合部分的共价键。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物实质上不包含联苯部分。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物基本上不包含两个羟苯基基团之间的键(例如，两个酪氨酸残基之间的键)所形成的联苯部分，以致R1-R5的至少一个和R6-R10的至少一个为羟基(亦即，-OH)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物基本上不包含两个二羟苯基基团之间的键(例如，两个DOPA残基之间的键)所形成的联苯部分，以致R1-R5的至少一个和R6-R10的至少一个为羟基。
在此，短语"基本上不包含"意味着每20kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。在一些实施例中，每40kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分。在一些实施例中，每60kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。在一些实施例中，每80kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。在一些实施例中，每100kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。在一些实施例中，每150kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。在一些实施例中，每200kDa的交联聚合物未超过一个联苯部分(如本发明中所描述的)。
联苯部分的检测和定量能够通过所述多肽的水解和氨基酸的分析来进行，例如，在国际专利申请号PCT/IL2012/050340中。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联部分包含一酰胺键。
在此，"酰胺键"指的是在–C(＝O)-N(R’)-(亦即，酰胺)基团中C＝O和N(R’)之间的键，其中R’是氢、烷基、环烷基、杂脂环族、芳基或杂芳基。
在示例性实施例中，所述交联部分使得所述酰胺键的裂解导致本发明中所描述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分之间的交联的裂解。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联部分包含一交联剂的残基，所述交联剂连接到所述节枝弹性蛋白多肽部分和本发明中所描述的聚合部分两者。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述N(R’)是由所述聚合部分的一部分(例如，一胺基)构成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述N(R’)是由所述节枝弹性蛋白多肽部分的一部分(例如，一胺基)构成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述C＝O是由所述聚合部分的一部分(例如，一羧基)构成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述C＝O是由所述节枝弹性蛋白多肽部分的一部分(例如，一羧基)构成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联部分是由所述酰胺键组成，亦即，–C(＝O)-N(R’)-(亦即，酰胺)基团中C＝O和N(R’)的每一个是从所述节枝弹性蛋白多肽部分或所述聚合部分的一部分来形成的，所述节枝弹性蛋白多肽部分和聚合部分是经由所述酰胺键而被直接地连接到另一个。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述酰胺键没有在一多肽链的主链中，亦即，所述酰胺键没有在一个氨基酸序列的C端和另一个氨基酸序列的N端之间。
在示例性实施例中，所述N(R’)是从所述聚合部分的一部分来形成的，且所述C＝O是从所述节枝弹性蛋白多肽部分的一部分来形成的。
不受任何具体理论约束，据信节枝弹性蛋白多肽部分序列通常缺乏胺基，而且一具有可用于形成酰胺键的胺基的聚合部分的预备是特别有益于交联节枝弹性蛋白多肽部分。
因此，在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合部分包含多个胺基。这样的聚合部分能够经由多个交联部分而被结合到一或多个节枝弹性蛋白多肽部分，每个包含一从所述聚合部分的胺基所形成的酰胺键。在一些实施例中，所述交联部分由一所述聚合部分的胺基和所述节枝弹性蛋白多肽部分的羧基之间的酰胺键所组成的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述酰胺键是由羧基构成。所述羧基是一氨基酸残基的侧链的一部分，所述氨基酸残基是选自于由谷氨酸残基及天冬氨酸残基所组成的群组。在一些实施例中，这样的氨基酸残基是一节枝弹性蛋白多肽部分残基。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述酰胺键是由一胺基构成。所述胺基是氨基酸残基的一部分，例如，一氨基酸残基的侧链(例如，赖氨酸残基侧链)。在一些实施例中，这样的氨基酸残基是本发明中所描述的聚合部分的一部分(例如，一包含一多肽的聚合部分)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述酰胺键是由一胺基构成。所述胺基是一具有胺基的聚合部分的一部分。在一些实施例中，所述聚合部分包含一具有胺基的聚(亚烷基二醇)，例如PEG。在一些实施例中，所述胺基包含末端胺基，如本发明中所描述的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物是处于多个颗粒的形式。在一些实施例中，所述颗粒的直径(亦即，所述颗粒的边界切线的两相对的并行线之间的最大距离)范围是介于1微米(μm)至200微米之间。在一些实施例中，所述颗粒的直径范围是介于2微米至100微米之间。在一些实施例中，所述颗粒的直径范围是介于4微米至50微米之间。在一些实施例中，所述颗粒的直径范围是介于8微米至25微米之间。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述颗粒实质上是球体。
在此，短语"实质上是球体"指的是形状，其中所述直径(亦即，所述边界切线的两相对的并行线之间的最大距离)是不超过所述宽度(亦即，所述边界切线的两相对的并行线之间的最小距离)的2倍。在一些实施例中，所述直径是不超过所述宽度的1.5倍。在一些实施例中，所述直径是不超过所述宽度的1.2倍。在一些实施例中，所述直径是不超过所述宽度的1.1倍。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述颗粒被相互的共价交联。在一些实施例中，所述颗粒是经由至少一个如本发明中所描述的交联部分而被共价交联。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物是处于一薄膜的形式。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述薄膜的面积是至少1平方厘米(cm2)。在一些实施例中，所述薄膜的面积是至少3平方厘米。在一些实施例中，所述薄膜的面积是至少10平方厘米。在一些实施例中，所述薄膜的面积是至少30平方厘米。在一些实施例中，所述薄膜的面积是至少100平方厘米。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述薄膜的平均厚度是不超过3毫米(mm)。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是不超过2毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是不超过1毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是不超过0.5毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是不超过0.2毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是不超过0.1毫米。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述薄膜的平均厚度是至少0.01毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是至少0.03毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是至少0.1毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是至少0.2毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是至少0.5毫米。在一些实施例中，所述薄膜的平均厚度是至少1毫米。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物具有至少0.1MPa的拉伸强度的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少0.3MPa的拉伸强度的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少1MPa的拉伸强度的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少3MPa的拉伸强度的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少10MPa的拉伸强度的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少30MPa的拉伸强度的特性。高于上述指出的值的任何值是预期的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物具有至少1MPa的弹性的模量的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少2MPa的弹性的模量的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少3MPa的弹性的模量的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少4MPa的弹性的模量的特性。在一些实施例中，所述物质组合物具有至少5MPa的弹性的模量的特性。高于上述指出的值的任何值是预期的。
在此，机械性能指的是在与一水介质(例如，水或20mM磷酸钠水溶液(pH 7.5))接触后所述物质组合物的特性，例如，在一随水介质膨胀的物质组合物中，当所述膨胀的物质组合物中的水介质的程度已趋于稳定(例如，保持不变)时。
不受任何具体理论约束，据信当与一极性溶剂(例如，一水溶剂)膨胀，所述物质组合物(像是节枝弹性蛋白)是特别有弹性和回弹性。
如本文所例举的，所述物质组合物的所述交联聚合物能够被结合到一聚合物质，以致形成一复合材料。
因此，根据本发明的实施例的另一个方面，提供一种复合材料，其包含本发明中所描述的物质组合物及至少一个附加的聚合物质，所述至少一个附加的聚合物质被结合至所述物质组合物的所述交联聚合物。
在此，"复合材料"指的是一含有两个或更多组分材料(例如，本发明中所描述的物质组合物和本发明中所描述的附加的聚合物质)的材料，所述组分材料可在所述复合材料(例如，存在于所述复合材料的分散区域)中保持分散和独立。
所述附加的聚合物质能够包含任何多肽和/或任何其他的聚合物(例如，本发明中所描述的合成或半合成聚合物)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述附加的聚合物质被共价结合到所述交联聚合物。在一些实施例中，所述附加的聚合物质经由至少一个如本发明中所描述的交联部分而被共价连接至所述交联聚合物。在示例性实施例中，所述附加的聚合物质经由至少一个酰胺键而被共价连接至所述交联聚合物。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述附加的聚合物质被共价结合到所述交联聚合物的节枝弹性蛋白多肽部分。在一些实施例中，所述节枝弹性蛋白多肽部分通过本发明中所描述的交联部分而被连接到所述聚合物质。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一共价结合到所述交联聚合物的附加的聚合物质包含一多肽。在示例性实施例中，所述多肽包含胶原。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述附加的聚合物质被非共价地结合到所述交联聚合物。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述交联聚合物结合到所述附加的聚合物质是通过将一多糖结合到一多糖结合域(例如，本发明中所描述的多糖结合域，例如一纤维素结合域(CBD)和/或一几丁质结合域)来产生的。在示例性实施例中，所述多糖是纤维素，所述纤维素是通过一纤维素结合域而被结合。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一物质组合物包含一多糖(例如，作为一聚合部分的一部份)，且所述复合材料的所述附加的聚合物质(例如，多肽)包含一结合至所述多糖的多糖结合域。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一物质组合物包含一多糖结合域(例如，作为一多肽的一部份)，且所述复合材料的所述附加的聚合物质包含一结合至所述多糖结合域的多糖。在一些实施例中，所述多糖结合域是由本发明中所描述的聚合部分所组成。在示例性实施例中，所述多糖结合域是由本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽部分所组成。在此提供了含有一多糖结合域的节枝弹性蛋白多肽序列的范例。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，本发明中所描述的所述物质组合物和/或所述复合材料是处于一发泡体的形式。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述复合材料包含发泡体形式的物质组合物(如本发明中所描述的)，还包含一附加的聚合物质(如本发明中所描述的)，所述附加的聚合物质被结合至所述物质组合物的至少一部分的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述复合材料包含发泡体形式的附加的聚合物质(如本发明中所描述的)，还包含所述物质组合物(如本发明中所描述的)，所述物质组合物被结合至所述附加的聚合物质的至少一部分的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物(其不具有本发明中所描述的附加的聚合物质)是处于一发泡体的形式。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述发泡体的孔隙度为至少50％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少60％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少70％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少80％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少90％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少95％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少98％。在一些实施例中，所述孔隙度为至少99％。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述发泡体在压缩上是弹性的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述发泡体在压缩上具有至少2.5kPa的弹性模量(杨氏模量)的特性。在一些实施例中，所述弹性模量为至少10kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少15kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少20kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少25kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少30kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少40kPa。在一些实施例中，所述弹性模量为至少50kPa。高于上述指出的值的任何值是预期的。
在示例性实施例中，从本发明中所描述的物质组合物(其不是本发明中所描述的复合材料的一部分)所形成的发泡体的弹性模量的范围是介于约2.5kDa至约10kDa之间。
在进一步的示例性实施例中，从本发明中所描述的复合材料所形成的发泡体的弹性模量的范围是介于约15kDa至约80kDa之间。在上述指出的值之间的任何值是预期的。
如本发明中所描述的，且如本文范例中所例示的，一发泡体的弹性模量和弹性能够被调整，这取决于其是否包含本发明中所描述的复合材料，且通过制备所述发泡体的工序。
在此，压缩下所测得的特性指的是随着与一水介质的接触，如本发明中所描述的，在每分钟2毫米的速率上的压缩。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述弹性的特征在于，在40％压缩的一个周期(亦即，沿着40％压缩的轴线减少一材料的高度的压缩)以后所述弹性模量的减少不超过50％。在一些实施例中，在40％压缩的一个周期以后所述弹性模量的减少不超过40％。在一些实施例中，在40％压缩的一个周期以后所述弹性模量的减少不超过30％。在一些实施例中，在40％压缩的一个周期以后所述弹性模量的减少不超过20％。在一些实施例中，在40％压缩的一个周期以后所述弹性模量的减少不超过10％。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述发泡体在压缩上具有至少50％的回弹性的特性。在一些实施例中，所述回弹性为至少60％。在一些实施例中，所述回弹性为至少70％。在一些实施例中，所述回弹性为至少80％。在一些实施例中，所述回弹性为至少90％。在一些实施例中，所述回弹性为至少95％。在一些实施例中，所述回弹性为至少98％。在一些实施例中，所述回弹性为至少99％。在一些实施例中，所述回弹性为至少99.5％。在一些实施例中，所述发泡体具有本发明中所描述的回弹性及本发明中所描述的弹性模量的特性。
本文和本领域的"回弹性"被定义为由变形恢复中所交出的能量至产生所述变形所需的能量的比率。迟滞现象是每变形循环的百分比能量损失，且是内摩擦力的结果。
根据样品的性质、几何形状和制备，回弹性能够使用两个常规方法来测量。对于像是发泡体和凝胶等的肉眼可见的样品，回弹性可以在一拉伸/压缩试验仪(例如，一英斯特朗试验机(Instron tester))上来测量。对于像是薄膜和薄结构的样品，在本领域中接受其使用扫描探针显微镜(scanning probe microscopy，SPM)随着纳米的空间分辨率来测量材料的刚度和回弹性，例如如Huson和Maxwell[Polymer Testing 2006，25:2–11]所描述的。
通过测量在力-距离图的途径和缩回曲线(retract curve)下的区域，所述回弹性能够表示为：
回弹性＝100(P-R)/(P+Q-R)
其中：
P是在力-距离缩回曲线下的区域；
Q是所述力-距离途径和缩回曲线(迟滞现象)之间的区域；以及
R是当没有渗透(亦即，在一坚硬的表面上)时在所述力-距离途径曲线下的区域。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述复合材料包含埋置于所述附加的聚合物质的所述物质组合物的所述交联聚合物。这样的聚合物质在本文中还被称为"基质"。在一些实施例中，所述交联聚合物是处于颗粒的形式(例如，如本发明中所描述的)，所述颗粒被埋置于所述基质中。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述埋置的交联聚合物没有共价结合到所述基质的所述聚合物质。例如，所述交联聚合物和所述基质的聚合物质之间的键可以是主要由所述基质中的所述交联聚合物的物理包容(physical entrapment)所组成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述埋置的交联聚合物被共价结合到所述聚合物质(例如，如本发明中所描述的)。
根据本发明的实施例的另一个方面，提供一种制造品，其包含本发明中所描述的物质组合物和/或本发明中所描述的复合材料。
根据本发明中所描述的任何实施例的一些，所述物质组合物和/或复合材料被使用于增加所述制造品的至少一部份的弹性。
本发明中所描述的许多实施例中的物质组合物和/或复合材料具有高度的生物兼容性，部分原因是由于所述节枝弹性蛋白多肽的生物兼容性。
因此，在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述制造品是一医疗装置。在一些实施例中，所述物质组合物和/或复合材料被塑造成一装置或其组件。在一些实施例中，所述装置主要由所述物质组合物和/或复合材料组成。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述医疗装置是一植入式医疗装置。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，如本发明中所描述的制造品是用于治疗一组织损伤或缺损(例如，一植入式医疗装置用于被植入一受试者中)。
在本发明的实施例的另一个方面中，提供一种在用于治疗组织损伤或缺损的药物的制造中本发明中所描述的制造品的应用(例如，一个用于被植入一受试者中的植入式医疗装置)。
在本发明的实施例的另一个方面中，提供一种治疗组织损伤或缺损的方法，所述方法包含将一本发明中所描述的制造品(例如，本发明中所描述的植入式医疗装置)植入于一受试者中。
在本发明中所描述的任何所述方面的一些实施例中，所述医疗装置能够形成一支架在一受试者体内，从而诱发一组织的形成。所述支架能够与细胞接种，或不能够与细胞接种。
在本发明中所描述的任何所述方面的一些实施例中，一植入式装置可以例如是一组织、一器官或一合成的植入物，如一胶原基的植入物(例如，其中所述聚合部分和/或附加的聚合物质包含胶原)、一机械装置或一支架(例如，一海绵)。所述植入物可以是临时的(例如，生物可降解的)或永久的。
所述生物降解性能够通过选择合适的本发明中所描述的聚合部分和/或附加的聚合物质的性质、和/或交联的程度来调整。一般来说，交联减少了生物降解性，且本发明中所描述的聚合部分和/或附加的聚合物质中的聚合物的生物降解性提高所述物质组合物和/或复合材料的生物降解性。
根据一些实施例，一医疗装置被使用于加强一组织，例如，通过防止一组织的扭曲和/或通过抑制由一脉管(例如，一血管)的体液(例如，一血液)的渗漏。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述装置被使用来，例如，通过加强一血管壁治疗一动脉瘤。
为了加强一组织，在一些实施例中，一植入式装置(例如，包含一薄膜形式的物质组合物和/或复合材料)被放在所述相关组织(例如，一动脉瘤上)的表面上(例如，一外表面)，且依附到所述组织，从而允许所述植入物去强化所述组织。
应当理解的是本发明的一些实施例的物质组合物和复合材料的相当大的弹性使得它们特别适合于强化移动材料，如许多类型的组织(例如，血管壁、韧带、肌腱、关节中的组织)。
根据一些实施例，所述植入式装置是为了骨头和/或关节的替换。在一些实施例中，所述装置在一韧带、肌腱、软骨、椎间盘或骨骼组织被植入。
因此，例如，在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述装置被放置于在如不愈合骨折；骨质疏松症；牙周疾病或缺陷；溶骨性骨疾病；后整形外科；后骨科植入；和涉及颅盖骨切除、牙槽骨增强程序中、脊柱融合术和脊柱骨折的后神经外科手术的这些症状的骨头中的所需位置上。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，其中所述植入物的给予是为了肌腱/韧带组织的生成，由于外伤或炎症症状，所述植入物被放置于组织拉伤后肌腱/韧带中所需的位置。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，其中所述植入物的给予是为了软骨的生成，由于像是但不限于类风湿关节炎、骨关节炎、外伤、肿瘤手术和美容外科的症状，所述植入物被放置于软骨中所需的位置，以治疗缺陷。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，其中所述植入物的给予是为了椎间盘组织(包含髓核和纤维环)的生成，一含有支架的装置被放置于髓核退化、纤维环拉伤或者髓核切除或椎间盘切除后的所需位置。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物和/或复合材料被配置用于保持一腔内制造品的位置(例如，通过抑制所述制造品的滑移)，例如，保持一体腔内植入式装置的位置。在一些实施例中，这样的作用是通过所述制造品的至少一部分(例如，外部部分)的弹性来促进的。例如，腔内的位置能够包含所述制造品的至少一部分的压缩，所述压缩力通过保持所述制造品的位置所促进的腔的壁而施加于所述制造品。
腔内能够保持位置的植入式装置的范例包含但不限于心血管植入物，例如起搏器、起搏器套管、起搏电极、除纤颤器、置换心脏瓣膜、静脉瓣；血管成形术塞子、主动脉瘤移植、房室分流器、留置动脉导管、留置静脉导管、人造血管接枝物、血管动脉瘤封堵器、血管假体过滤器、血管鞘、卵圆孔未闭间隔封堵装置和内部血管支架；导管，例如血液透析导管；血液透析移植；支架和支架移植，例如气管支架、食管支架、尿道支架和直肠支架；牙齿植入物；骨科植入物；骨折愈合装置；骨头替换装置；关节替换装置；诱导组织基片；组织再形成装置；肿瘤靶向和破坏装置；缝合锚；药物传输口；疝修补装置；和牙周装置。
所述装置可以是螺钉、栓、大头钉、杆、网格(例如缝合网格)、纤维、面料、薄膜、线圈、夹子、环、针、套筒、管、带、片、补丁和/或板的形状。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，
所述制造品被使用在一非医学应用中，例如，使用作为一柔性材料。应用的范例包含但不限于顶片(roofing sheet)、游泳池内衬、水库内衬、软管、浴室设备、工业管道、雨衣、靴子、像是食品和饮料覆盖物的覆盖材料和/或容器。
根据本发明的实施例的另一个方面，提供一种用于制备本发明中所描述的物质组合物的方法。
所述方法包含将一节枝弹性蛋白多肽(例如，如本发明中所描述的)共价交联到至少一个聚合物质(例如，一如本发明中所描述的聚合物)。在一些实施例中，在没有交联中，所述节枝弹性蛋白多肽和/或聚合物质本质上是相同于本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽部分和/或聚合部分。在一些实施例中，所述交联被选择而使得其不会产生一联苯部分，如本发明中所描述的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述聚合物质包含多个胺基(例如，如本发明中所描述的)。在一些实施例中，交联包含将具有所述节枝弹性蛋白多肽的羧基的胺基起反应，从而形成一酰胺键(例如，如本发明中所描述的)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法包含激活一羧基(例如，一节枝弹性蛋白多肽的羧基)，且将一含有所述激活的羧基(例如，一如本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽)的物质与一含有一胺基(例如，一如本发明中所描述的聚合物质)的物质进行接触，从而形成一酰胺键(例如，如本发明中所描述的)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一羧基的激活是通过与一碳化二亚胺反应来产生的。各种合适的碳化二亚胺试剂在本领域中是已知的。在示例性实施例中，所述碳化二亚胺包含EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亚胺)。
在示例性实施例中，具有的碳化二亚胺的反应还包含具有NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的反应或其取代的衍生物。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法包含在交联之前将一含有所述节枝弹性蛋白多肽及至少一个聚合物质的亲水性溶液(例如，一水溶液)与一亲水表面进行接触。通过将一溶液交联至一亲水表面上，一薄膜形式的物质组合物(例如，如本发明中所描述的)可以被形成。亲水表面的范例包含金属、玻璃和亲水性聚合物。在示例性实施例中，为了提高其亲水性，一玻璃表面以酸(如浓硫酸)来做处理。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述薄膜的厚度是通过控制所述表面的亲水性来控制的。一般来说，一表面越亲水，就越多的亲水性溶液散布在所述表面上，在交联上造成了一更薄的薄膜。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白多肽是处于一发泡体的形式(节枝弹性蛋白发泡体)。在示例性实施例中，在交联之前，所述节枝弹性蛋白发泡体与所述至少一个聚合物质(例如，被浸入一含有所述聚合物质的液体)接触，从而将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个所述聚合物质与所述聚合物质来接触。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法还包含在交联之前制备多个如本发明中所描述的含有所述节枝弹性蛋白多肽及所述聚合物质的颗粒。
各种本领域中已知的技术能够从节枝弹性蛋白多肽和聚合物质的混合物使用来制备颗粒，包含但不限于分散；超声波搅拌；一抗溶剂(例如，二氧化碳)至一溶液(例如，一水溶液)的添加；溶剂萃取和/或蒸发；和/或沉淀。此类技术的范例被描述于在此的范例部分。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述颗粒是从一分散体(例如，乳化液)的分散相(dispersed phase)来形成。在一些实施例中，所述颗粒包含一水溶液。在一些实施例中，所述水溶液被乳化成一油包水乳化液。
本文及本领域的术语"分散"指的是一系统，其中一物质的颗粒被分散在不同物质或状态的物质的连续相中。分散例如包含含有分散于一气体中的液体和/或固体颗粒(其被称为气溶胶)的系统、含有分散于一液体和/或固体中的气体颗粒(其被称为发泡体)的系统、含有分散于一液体中的液体颗粒(其被称为乳化液)的系统、含有分散于一液体中的固体颗粒(其被称为溶胶或悬浮物)的系统和含有分散于一固体中的液体颗粒(其被称为凝胶或海绵(具有吸收的液体)，取决于它们的兼容性)的系统。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一颗粒中的所述节枝弹性蛋白多肽和聚合物质的交联充分地导致液体和/或半固态颗粒凝固，从而形成固体颗粒。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述颗粒被相互的交联。在一些实施例中，颗粒彼此的交联是通过大体上如所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联的相同工序(例如，如本发明中所描述的)来完成的。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述节枝弹性蛋白多肽和聚合物质被交联(例如，如本发明中所描述的)以形成含有如本发明中描述的交联聚合物的颗粒，且随后所述颗粒被相互的交联。所述颗粒的交联能够通过任何本领域中已知的交联工序来完成，且能够是一个不同于或基本上相同于交联所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的工序的工序。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一颗粒中所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联和颗粒彼此的交联被伴随地进行。在一些实施例中，颗粒彼此的交联是通过实质上如所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联的相同工序来完成的(例如，如本发明中所描述的)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法是用于制备一如本发明中所描述的复合材料。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法包含在所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质的交联之前将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质与至少一个附加的聚合物质(例如，如本发明中所描述的)进行接触。在一些实施例中，所述交联是以所述节枝弹性蛋白多肽和/或聚合物质共价交联一附加的聚合物质。在一些实施例中，所述交联没有以所述节枝弹性蛋白多肽和/或聚合物质共价交联所述附加的聚合物质。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，在交联之前，混合所述至少一附加的聚合物质与所述节枝弹性蛋白多肽。在一些实施例中，在与和所述节枝弹性蛋白多肽所交联的所述聚合物质接触之前，混合所述至少一附加的聚合物质与所述节枝弹性蛋白多肽。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述至少一个附加的聚合物质是处于一发泡体的形式。这样的发泡体能够被使用来形成一如本发明中所描述的发泡体形式的复合材料。在一些实施例中，所述发泡体还包含所述节枝弹性蛋白多肽。在一些实施例中，所述发泡体不包含所述节枝弹性蛋白多肽。
在一些示例性实施例中，在交联之前，所述发泡体与所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质接触(例如，浸入于一含有所述节枝弹性蛋白多肽和聚合物质的液体)，从而将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质与所述附加的聚合物质进行接触。
在一些示例性实施例中，所述发泡体是从一所述附加的聚合物质和节枝弹性蛋白多肽的混合物来形成的，而后在交联之前，将所述发泡体与和节枝弹性蛋白多肽所交联的所述聚合物质进行接触(例如，浸入于一含有所述聚合物质的液体中)，从而将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质与所述附加的聚合物质进行接触。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一发泡体是通过冻干一含有从形成所述形式的物质的悬浮物来形成的。在一些实施例中，所述悬浮物是一水性悬浮物。冻干能够被使用于制备任何类型的本发明所描述的发泡体，其包含从本发明中所描述的物质组合物所形成的发泡体、本发明中所描述的复合材料、本发明中所描述的节枝弹性蛋白多肽和/或本发明中所描述的附加的聚合物质。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述方法还包含将含有所述物质组合物(如本发明中所制备的)的颗粒埋置于至少一个附加的聚合物质(如本发明中所描述的)中，从而产生一如本发明中所描述的含有埋置的颗粒的复合材料。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，在埋置之前所述颗粒被相互的共价交联(例如，如本发明中所描述的)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，在埋置之前所述颗粒没有被相互的共价交联，同时埋置和/或随后埋置所述颗粒被相互的共价交联(例如，如本发明中所描述的)。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，无论是埋置之前、埋置期间或埋置之后所述颗粒没有被相互的共价交联。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，颗粒彼此的交联是通过大体上如所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联(例如，如本发明中所描述的)的相同工序来进行。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，所述物质组合物(例如，颗粒形式的)与所述附加的聚合物质共价交联。这样的交联能够通过任何的本领域中已知的交联工序来进行，且能够是一个不同于或基本上相同于交联所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的工序(例如，如本发明中所描述的)的工序。
在本发明中所描述的任何实施例的一些中，一颗粒中所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联和物质组合物的颗粒至所述附加的聚合物质的交联被伴随地进行。在一些实施例中，颗粒至所述附加的聚合物质的交联是通过大体上如所述节枝弹性蛋白多肽与所述聚合物质的交联(例如，如本发明中所描述的)的相同工序来进行。
如本文所使用的术语"胺"描述一–NRxRy基团，其中Rx和Ry各自独立是氢、烷基、环烷基、杂脂环族、杂芳基或芳基，这些术语如上文所定义。当Rx或Ry是杂脂环族或杂芳基，所述相邻的(氮)原子被结合到所述杂脂环族或杂芳基中的一碳原子。
如本文所使用的术语"烷基"描述一含有直链和支链基团的饱和脂肪烃。优选地，所述烷基基团具有1至20个碳原子。每当一数值范围(例如“1-20”)被阐明，其意味着在这种情况下的所述烷基基团中，所述基团能够包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等等，最多包含20个碳原子。更优选地，所述烷基是一具有1至10个碳原子的中型烷基。最优选地，除非另有说明，所述烷基是一具有1至4个碳原子的较低级的烷基。所述烷基基团能够是取代的或未取代的。取代的烷基可以具有一或多个取代基，因此每个取代基团可以各自地是环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、胺类、卤化物、磺酸盐、亚砜、膦酸盐、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氰基、硝基、偶氮、磺酰胺、羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲素、氨基甲酸酯、酰胺、脒基、胍基和肼。
所述烷基基团可以是一末端基，如这个短语在本文中所定义的，其中其被连接到一单一相邻的原子或一连接基团，例如一亚烃基，如这个短语在本文中所定义的，其连接两个或更多的部分。
本文中遍布的短语"末端基"描述一经由一个其原子被连接到所述化合物中的一单一部份的基团(取代基)。
短语"连接基"描述一被连接到所述化合物中的两个或更多个部分的基团(取代基)。
术语"环烷基"描述一全碳单环的或稠环的(亦即，共享相邻的一对碳原子的环)基团，其中一或多个环不具有一完全共轭派电子(pi-electron)系统。所述环烷基基团能够是取代的或未取代的。取代的环烷基能够具有一或多个取代基，因此每个取代基团可以各自地是环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、胺类、卤化物、磺酸盐、亚砜、膦酸盐、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氰基、硝基、偶氮、磺酰胺、羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲素、氨基甲酸酯、酰胺、脒基、胍基和肼。所述环烷基基团可以是一末端基，如这个短语在本文中所定义的，其中其被连接到一单一相邻的原子或一连接基团，如这个短语在上文中所定义的，其连接两个或更多的部分。
术语"芳基"描述一具有一完全共轭派电子(pi-electron)系统的全碳单环的或稠环多环(亦即，共享相邻的一对碳原子的环)的基团。所述芳基基团能够是取代的或未取代的。取代的芳基能够具有一或多个取代基，因此每个取代基团可以各自地是环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、胺类、卤化物、磺酸盐、亚砜、膦酸盐、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氰基、硝基、偶氮、磺酰胺、羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲素、氨基甲酸酯、酰胺、脒基、胍基和肼。所述芳基基团可以是一末端基，如这个术语在本文中所定义的，其中其被连接到一单一相邻的原子或一连接基团，如这个术语在本文中所定义的，其连接两个或更多的部分。
术语"杂芳基"描述一具有在所述环中的一或多个原子(例如，氮、氧和硫)的单环或稠环的(亦即，共享相邻的一对原子的环)基团；此外，描述一具有一完全共轭派电子(pi-electron)系统的单环或稠环的基团。杂芳基基团的范例(但不限于此)包含吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。所述杂芳基基团能够是取代的或未取代的。取代的杂芳基能够具有一或多个取代基，因此每个取代基团可以各自地是环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、胺类、卤化物、磺酸盐、亚砜、膦酸盐、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氰基、硝基、偶氮、磺酰胺、羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲素、氨基甲酸酯、酰胺、脒基、胍基和肼。所述杂芳基基团可以是一末端基，如这个短语在上文中所定义的，其中其被连接到一单一相邻的原子或一连接基团，如这个短语在本文中所定义的，其连接两个或更多的部分。代表性的范例是吡啶、吡咯、恶唑、吲哚和嘌呤等。
术语"杂脂环族"描述一具有在所述环中的一或多个原子(如氮、氧和硫)的单环或稠环的基团。所述环还能够具有一或多个双键。然而，所述环不具有完全共轭派电子系统。所述杂脂环族能够是取代或未取代的。取代的杂脂环族能够具有一或多个取代基，因此每个取代基团可以各自地是环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环族、胺类、卤化物、磺酸盐、亚砜、膦酸盐、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、氰基、硝基、偶氮、磺酰胺、羰基、羧基、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲素、氨基甲酸酯、酰胺、脒基、胍基和肼。所述杂脂环族基团可以是一末端基，如这个短语在本文中所定义的，其中其被连接到一单一相邻的原子或一连接基团，如这个短语在上文中所定义的，其连接两个或更多的部分。代表性的范例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃和吗啉等。
术语"膦酸盐"指的是一-O-P(＝O)(ORx)-末端基或一–O-P(＝O)-O-，具有如上文中所定义的Rx。
术语"卤化物"和"卤代"描述氟、氯、溴或碘。
术语"亚砜"或"亚硫酰基"描述一–S(＝O)Rx末端基或一–S(＝O)–连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx是如上文中所定义的。
术语"磺酸盐"和"磺酰基"描述一–S(＝O)2-Rx末端基或一–S(＝O)2-连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx是如本文中所定义的。
本文中所使用的术语"磺酰胺"包含S-磺酰胺类和N-磺酰胺类两者。
术语"S-磺酰胺"描述一–S(＝O)2-NRxRy末端基或一–S(＝O)2-NRx–连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx和Ry。
术语"N-磺酰胺"描述一RxS(＝O)2–NRY–末端基或一S(＝O)2NRx–连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx和Ry是如本文中所定义的。
本文中所使用的术语"羰基"描述一-C(＝O)-Rx末端基或一-C(＝O)-连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx。
术语"羟基"描述–OH基团。
术语"氧代"描述＝O基团。
术语"烷氧基"描述-O-烷基基团和-O-环烷基基团两者，如本发明中所定义的。
术语"芳氧基"描述-O-芳基基团和-O-杂芳基基团，如本发明中所定义的。
术语"巯基"描述一-SH基团。
术语"硫代烷氧基"描述一-S-烷基基团和一-S-环烷基基团两者，如本发明中所定义的。
术语"硫代芳氧基"描述一-S-芳基和一-S-杂芳基基团两者，如本发明中所定义的。
术语"氰基"和"腈"描述一-C≡N基团。
术语"硝基"描述一-NO2基团。
术语"偶氮"描述一-N＝NR’末端基或一-N＝N连接基团，这些术语如上文所定义，具有如上文所定义的R’。
本文中所使用的术语"羧基"和"羧基"包含C-羧基和O-羧基基团两者。
术语"C羧基"描述一-C(＝O)-ORx末端基或一-C(＝O)-O连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx是如本文中所定义的。
术语"O羧基"描述一-OC(＝O)-Rx末端基或一-OC(＝O)连接基团，这些术语如上文所定义，其中R’是如本文中所定义的。
术语"尿素"描述一NRxC(＝O)-NRyRw末端基或一NRXC(＝O)-NRY连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx和Ry是如本文中所定义的，且Rw对于Rx和Ry是如本文中所定义的。
术语"硫脲素"描述一-NRx-C(＝S)-NRyRw末端基或一-NRx-C(＝S)-NRy连接基团，具有如本文中所定义的Rx、Ry和Ry。
本文中所使用的术语"酰胺"包含C-酰胺和N-酰胺两者。
术语"C-酰胺"描述一-C(＝O)-NRxRy末端基或一-C(＝O)-NRx连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx和Ry是如本文中所定义的。
术语"N-酰胺"描述一RxC(＝O)-NRy-末端基或一RxC(＝O)-N-连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx和Ry是如本文中所定义的。
本文中所使用的术语"氨甲酰基"或"氨基甲酸酯"包含N-氨基甲酸酯类和O-氨基甲酸酯类两者。
术语"N-氨基甲酸酯"描述一RyOC(＝O)-NRx-末端基或一OC(＝O)-NRx-连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx和Ry。
术语"O-氨基甲酸酯"描述一-OC(＝O)-NRxRy末端基或一-OC(＝O)-NRx连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx和Ry。
本文中所使用的术语"胺硫甲酰基"或"硫代氨基甲酸酯"包含O-硫代氨基甲酸酯类和N-硫代氨基甲酸酯类。
术语"O-硫代氨基甲酸酯"描述一OC(＝S)NRxRy末端基或一OC(＝S)NRx连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx和Ry。
术语"N-硫代氨基甲酸酯"描述一RyOC(＝S)NRx-末端基或一OC(＝S)NRx-连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx和Ry。
术语"脒基"描述一RxRyNC(＝N)-末端基或一–RxNC(＝N)-连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx和Ry是如本文中所定义的。
术语"胍基"描述一–RxNC(＝N)-NRyRw末端基或一–RxNC(＝N)NRy连接基团，这些术语如上文所定义，其中Rx、Ry和Rw是如本文中所定义的。
如本文所使用的术语"肼"描述一-NRx-NRyRw末端基或一-NRx-NRy连接基团，这些术语如上文所定义，具有如本文中所定义的Rx、Ry和Rw。
如本文所使用的术语"约"是指±10％。
术语"包含"、"包括"、"具有"及其同根词是指"包括但不限于"。
术语"由.......组成"是指"包括且限于"。
术语"主要由.......组成"及其同根词是指组成、方法或结构可包括附加成分、步骤和/或部件，但是仅在附加成分、步骤和/或部件在材料上不改变要求保护的组成、方法或结构的基本的和新颖的特性的情况下。
除非上下文另外清楚地规定，否则如本文中所用，单数形式"一个""一种"和"所述"包括复数个指示物。例如，术语"化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请通篇中，本发明的各实施方案可以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的说明仅为了方便和简要，而不应解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如，例如从1至6的范围的描述应视为已具体地公开了例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
每当在本文中指示数值范围时，意在将任何所体积的数字(分数或整数)包括在所述指示范围内。短语在第一指示数字和第二指示数字"之间取范围/之间的范围"以及从第一指示数字"至"第二指示数字"取范围/的范围"在本文中可互换使用，并且意在包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有的分数数字和整数数字。
如本文所使用的术语"方法"指的是用于实现一给定任务的方式、手段、技术和工序，但不限于，这些方式、手段、技术和工序，无论是已知的或者从通过化学、药理学、生物、生物化学和医学的领域的从业者已知的方式、手段、技术和工序快速开发的。
如本文所使用的术语"治疗"包含消除、基本上抑制、减缓或逆转一症状的进展；本质上改善一症状的临床或审美的病征；或基本上预防一症状的临床或审美的病征的出现。
应当理解，为了清楚起见，本发明的某些特征描述于多个单独实施方案的背景下，也可以组合的方式提供于单个实施方案中。相反，为了简要起见，描述于单个实施方案背景下的本发明的某些特征也可单独或以任何合适的分组合提供或者适当地提供在本发明的任何其它所述的实施方案中。在各个实施方案的背景下描述的一些特征不应视为那些实施方案的必要特征，除非在不具有所述要素的情况下所述实施方案不可操作。
如上文所述的和权利要求书章节所要求保护的本发明的各个实施例和方面可得到下文范例的支持。
范例
现参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式阐述本发明的一些实施方案。
材料和方法
材料：
8-臂端胺基聚(乙二醇)(PEG-胺；10,000Da)是从键凯科技美国(JenKemTechnology U.S.A.)(Allen,TX)来获得。
胶原(CollageTM人类重组胶原)是从CollPlant(以色列)来获得。
异丙醇和Span 80是从默克(Merck)来获得。
EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和乙醇是从西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)来获得。
微晶纤维素是从艾维素(Avicel)来获得。
节枝弹性蛋白产物：
重组节枝弹性蛋白被生产成一组胺酸标记的(6H)嵌合蛋白，所述组胺酸标记的(6H)嵌合蛋白是由融合至嗜纤维梭菌(C.cellulovorans)纤维素结合域(CBD)的黑腹果蝇(D.melanogaster)节枝弹性蛋白外显子1(17重复)所组成的。这个重组节枝弹性蛋白在大肠杆菌中被产生、提取和纯化，如Qin等人[Biomacromolecules 2009，10:3227-3234]、国际专利申请号PCT/IL2008/001542(公布号为WO2009/069123)和Qin等人[Biomaterials2011，32:9231-9243]中所描述的，造成了一产量约为100毫克/升的蛋白。
所述蛋白是通过免疫印迹(Western blot)来分析的，且对于纤维素的亲和力是通过纤维素结合试验(执行类似于甲壳素结合试验，如Qin等人[Biomacromolecules 2009，10:3227-3234]中所描述的)来确认的。所述纤维素结合是具体的发生在具有CBD的节枝弹性蛋白(而非发生在使用作为控制组的天然节枝弹性蛋白(缺乏CBD)中)中。
在一些实施例中，所述组胺酸标签的蛋白被使用。在其他实施例中，所述组胺酸标签在所述蛋白的使用之前利用重组组胺酸-标记的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，rTEV)蛋白酶(如Kapust等人[Protein Eng 2001，14:993-1000]所描述的)来裂解，接续于Ni-NTA管柱上再纯化，以去除所述蛋白酶和解的组胺酸标签(所述蛋白是从溢流道来收集的)。
图1中描绘了用于具有纤维素结合域(且具有组氨酸标签，其可以被任意地去除)的节枝弹性蛋白的基因和蛋白序列。
纳米晶纤维素产物：
纳米晶纤维素(NCC)是通过200微米的微晶纤维素的受控制的H2SO4水解作用来制备的，如Bondeso等人[Cellulose 2006，13:171]所描述的。所述NCC结构是在一0.2％NCC的样品被安装在一薄碳载体上且以乙酸双氧铀来染色后通过透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy)来观察的。
如图2A和2B所示，一蜂蜜般粘稠结晶的悬浮物被得到(图2A)，其包含以宽约10至20纳米且长约200至400纳米为特征的纳米棒(图2B)。
纳米晶纤维素发泡体的制备和特性：
2.5％纳米晶纤维素(NCC)的悬浮物被浇铸在使用作为模具的ELISA板井(platewell)中，且在-80℃的温度下结冻，随后冻干，造成了直径约为6毫米且高度约为7.6毫米的圆柱型发泡体。接续，所述NCC发泡体在从所述模具被释放之上是通过将所述发泡体样品胶合至金属支架来进行表征，再以金来涂覆，且通过一JEM S410LV扫描式电子显微镜(Jeol，日本)来观察。
如图3A和3B所示，冻干造成了一多孔发泡体(图3A)，且所述多孔发泡体显示出一以层压板片为特征的纳米结构(图3B)。所述板片的厚度大约为10纳米(nm)，这表明所述板片厚度代表一单一NCC晶体的尺寸。
这些结果表明，低温浓缩一旦发生冻结，会导致NCC的局部聚集，其造成了一多孔网状物而非所述薄膜，其通常通过NCC自组装形成[de Souza Lima和Borsali，MacromolRapid Comm 2004，25:771-787]。
机械试验：
发泡体的机械试验是使用一MultiTest 1-i计算器的拉伸测试仪(Mecmesin，英国)来进行的(具有一设置在测试仪模式上的ILC 10N称重传感器，在2毫米/分钟的压缩率下)。所述压缩板的底部是以磷酸盐缓冲液来浸没，其还不断地吸取到所述样品以确保完全饱和。在压缩期间，力(N)和位移(毫米)的曲线被记录。应力/应变曲线是通过区分通过样品的表面积的力以及通过区分通过样品的高度的位移而被产生的。所述弹性模量是通过所述曲线的线性区域的斜率来表示。
范例1
节枝弹性蛋白和与PEG-胺所交联的节枝弹性蛋白纳米晶纤维素(NCC)发泡体的制备
根据两个不同的技术来制备节枝弹性蛋白-纳米晶纤维素(NCC)复合发泡体。还制备了不具有NCC的节枝弹性蛋白发泡体。
所述节枝弹性蛋白被包含有一用于影响节枝弹性蛋白至NCC的结合的纤维素结合域(CBD)。在所述组胺酸标签的裂解后，使用节枝弹性蛋白，如材料和方法中所描述的。
一类型的节枝弹性蛋白-NCC复合体(在此简称为“浸入的复合体”)是通过将一NCC发泡体(其是如所述材料和方法部分所描述的来制备的)浸入于一200毫克/毫升节枝弹性蛋白在20mM磷酸钠(pH 7.5)的溶液中来制备的。所述节枝弹性蛋白溶液是以注射器而被添加至所述NCC发泡体，直到所述发泡体被完全饱和。接续，所述发泡体在-70℃的温度下结冻且冻干。
第二类型的节枝弹性蛋白-NCC复合体(在此简称为“混合的复合体”)在发泡体的形成之前是通过将节枝弹性蛋白溶解于一NCC悬浮物中来制备的。50毫克的冻干的节枝弹性蛋白粉末被溶解且混合至250微升的2.5％NCC悬浮物中，造成了一200毫克/毫升浓度的节枝弹性蛋白。接续，所述混合物在-70℃的温度下结冻且冻干。艾本德(Eppendorf)管帽被使用作为模具，造成了高约5毫米且直径约5毫米的圆盘。
为了制备一节枝弹性蛋白发泡体，冻干的重组节枝弹性蛋白粉末被悬浮于20mM磷酸钠(pH 7.5)(浓度为200mg/ml)中。接续，所述溶液的200微升(μl)样品被浇铸在一ELISA板(以硅化剂进行预处理以形成一疏水表面)的井(wells)(直径～6毫米)中。所述溶液在-70℃的温度下结冻且冻干，造成了一节枝弹性蛋白发泡体的形成(随著作为一模具的所述井)。
所有上述类型的发泡体受到了所述发泡体中的节枝弹性蛋白的交联。
在初步实验中，光诱导聚合被使用来影响节枝弹性蛋白交联，使用三(双吡啶)氯化钌(II)(根据如Elvin等人[Nature 2005，437:999-1002]中所描述的工序)或使用光诱导芬顿(Fenton)系统(如Qin等人[Biomaterials 2011，32:9231-9243]中所描述的)。然而，由于光穿透差，在所述发泡体的内部中，光诱导聚合没有始终如一地提供完全的交联，其造成了一不理想的蛋奶酥状(souffle-like)结构(图中未示出)。
因此，发展了交联节枝弹性蛋白的另一种方法，其是利用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和PEG-胺。应当理解的是，在所述PEG-胺的缺乏中，EDC没有显著地交联所述节枝弹性蛋白，因为所述节枝弹性蛋白(和NCC)具有很少的可用于交联的胺基或不具有可用于交联的胺基。在发泡体形成之前，NCC悬浮物是以1MNaOH来滴定至pH值为7，其对于EDC/PEG-胺交联而言是一合适的pH。
在一50mM EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐)和6mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)(其在一具有10％蒸馏的去离子水(distilled deionized water，DDW)的90％异丙醇的溶剂中)的溶液中，所述发泡体在室温下被逐渐发展3小时(在黑暗中)。次日，所述发泡体在具有100毫克/毫升8-臂PEG-胺的0.1M PBS中被逐渐发展(室温下1小时)，而后以DDW清洗两次。接续，所述发泡体在一50mM EDC和6mM NHS(在具有10％DDW的90％异丙醇中)的溶液中被再次逐渐发展(黑暗中室温下3小时)。接续，所述发泡体以DDW清洗，且使其在室温下干燥。
所述节枝弹性蛋白和节枝弹性蛋白-NCC发泡体的机械性能是通过压缩试验来评估的。纯NCC发泡体被用于比较测试。在测试之前，使所述发泡体在DDW或20mM磷酸钠(pH7.5)中饱和(至少一小时)，接着5分钟真空，以确保完全饱和。
如图4所示，节枝弹性蛋白-NCC复合发泡体的弹性模量是非常高于节枝弹性蛋白发泡体的弹性模量。所述节枝弹性蛋白发泡体的弹性模量是6.9±2.3kPa，然而节枝弹性蛋白-NCC发泡体的弹性模量是6.3±7.7kPa(混合的复合体)，是56.7±21.4kPa(浸入的复合体)。
所述节枝弹性蛋白和节枝弹性蛋白-NCC发泡体是有弹性的，在压缩后会恢复其原来的形状。相反地，所述NCC发泡体是塑性的，而没有恢复其原来的形状。
所述NCC发泡体的弹性模量是16±4.5kPa。
这些结果表明本发明中所描述的工序能够从节枝弹性蛋白或一含有节枝弹性蛋白的复合体来生产一弹性的交联发泡体。
这些结果进一步表明节枝弹性蛋白至一聚合物质(如NCC)的结合造成了附加强度.
不受任何具体理论约束，据信这样的效果是类似于通过与甲壳素的连接的天然存在的节枝弹性蛋白的加强，其造成了高达2MPa的弹性模量值[Gosline等人，Philos TransR Soc Lond B Biol Sci 2002，357:121-132；Burrows等人，BMC Biology 2008，6:41；Vincent和Wegst，Arthropod Struct Dev 2004，33:187-199]。
如图4和5A-5C所示，在3压缩循环的过程中节枝弹性蛋白发泡体和混合的复合体的弹性模量和应力/应变曲线没有显著地改变，然而浸入的复合体的弹性模量从56.7kPa降至约27kPa，一个值类似于混合的复合体的弹性模量。
这些结果表明节枝弹性蛋白中的预形成的、高度有序的NCC网状物的浸没造成了浸入的复合体中的一特别强大结构，而且当这个结构被压缩超出一定阈值，所述网状物部分失效且所述弹性模量下降，虽然所述节枝弹性蛋白复合体保持所述混合的复合体中所得到的所述相对随机的网状物的弹性和强度。
如图6所示，节枝弹性蛋白-NCC发泡体在相较于NCC发泡体的压缩之下显示出一较大的抗拒压力。这个结果是根据具有一相较于NCC发泡体较高弹性模量的节枝弹性蛋白-NCC发泡体，如图4所示。
不受任何具体理论约束，据信NCC至所述节枝弹性蛋白中的所述纤维素结合域的亲和性造成了所述节枝弹性蛋白-NCC复合体的附加强度，即使在一高有序网状物(orderednetwork)的缺乏中。
范例2
与PEG-胺所交联的节枝弹性蛋白薄膜的制备
鉴于用于交联发泡体中的节枝弹性蛋白的所述EDC/PEG-胺系统的功效，如范例1中例示的，EDC/PEG-胺交联是在含节枝弹性蛋白的薄膜中进行。重组节枝弹性蛋白是如材料和方法部分所描述的来制备，没有裂解所述组胺酸标签。
为了形成一节枝弹性蛋白薄膜，一玻璃表面以浓硫酸来做处理。这个治疗导致一亲水玻璃表面而适合于亲水性节枝弹性蛋白薄膜的制备。
重组节枝弹性蛋白(360毫克/毫升)在20mM Na2HPO4缓冲液(pH 8)中的储备溶液和8-臂PEG-胺(400毫克/毫升)以3:1比例被混合成一270毫克/毫升的节枝弹性蛋白和100毫克/毫升PEG-胺的最终浓度。在溶液均化作用之后，所述节枝弹性蛋白混合物被散布在所述处理的亲水性玻璃表面上。将从这个散布溶液所得到的产生的薄膜和纤维风干过夜。随后，将所述玻璃和所述节枝弹性蛋白纤维或薄膜被浸入于由80％异丙醇、20％蒸馏的去离子水(DDW)、50mM EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亚胺)和25mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)组成的混合物中，且在黑暗中室温下3小时以便实现交联。在交联之后，所述材料以DDW清洗且从所述玻璃移除。
所述产生的交联的节枝弹性蛋白-PEG材料的光学图像如图7所示。
所述薄膜的机械性能是通过如所述材料和方法部分中所描述的压缩试验和/或通过如Elvin等人[Nature 2005，437:999-1002]所描述的机械性能的拉伸试验来随意地测试。
范例3
与胶原所交联的节枝弹性蛋白的制备
EDC交联被使用来制备以胶原所交联的节枝弹性蛋白。当胶原包含可用于交联的胺基，PEG-胺不被包含。如所述材料和方法部分中描述的来制备重组节枝弹性蛋白，没有裂解所述组胺酸标签。
重组节枝弹性蛋白(3毫克/毫升)在20mM Na2HPO4缓冲液(pH 8)中的溶液与原纤维的胶原的溶液以2:1(节枝弹性蛋白溶液:胶原溶液)比例来混合。胶原原纤维形成是通过以10:1(胶原:原纤维生成缓冲液)比例来混合3毫克/毫升胶原储备溶液(3毫克/毫升在10mMHCl中)与原纤维生成缓冲液(200mM Na2HPO4，pH 11.2)且所述混合物在37℃下培育1小时而被诱发的。
在溶液均化作用之后，50mM EDC和25mM NHS被添加至55毫升的所述混合溶液。当在室温下搅拌3小时的时候，所述交联反应被随后进行。接续，离心所述交联的蛋白质溶液(22℃，9000g，10分钟)，且将得到的沉淀物浇铸在一模具中且在室温下风干过夜。接续，以DDW清洗所述节枝弹性蛋白胶原薄膜，且从所述模具取出。
所述生产的交联的节枝弹性蛋白胶原薄膜的光学图像如图8所示。
所述薄膜的机械性能是通过如所述材料和方法部分中所描述的压缩试验和/或通过如Elvin等人[Nature 2005，437:999-1002]所描述的机械性能的拉伸试验(例如，拉伸强度、弹性模量和/或回弹性)来随意地测试。
范例4
与PEG-胺所交联的节枝弹性蛋白球体的制备
与PEG-胺所交联的节枝弹性蛋白的小球体是使用描述于范例2中的EDC交联程序的修饰来制备。所述节枝弹性蛋白球体是有益于制备复合材料。如描述于所述材料和方法部分来制备重组节枝弹性蛋白，没有裂解所述组胺酸标签。
28微升的360毫克/毫升的节枝弹性蛋白储备溶液与12.5微升的400毫克/毫升的PEG-胺储备溶液混合，且DDW被添加至50微升的最终体积，从而得到与20mM Na2HPO4(pH 8)中的100毫克/毫升PEG-胺所混合的200毫克/毫升的重组节枝弹性蛋白。这个混合物被以注射器(搅拌)添加至一含有2.5毫升蓖麻油和1％Span 80(表面活性剂)的50毫升管子中，以便造成一非交联的节枝弹性蛋白球体的油包水乳化液。经由光学显微镜所得到的所述非交联的节枝弹性蛋白球体的图像如图9所示。
此后不久，2.5毫升的异丙醇水溶液(80％v/v)中的50mM EDC和25mM NHS被添加至所述乳化液。所得到的混合物在黑暗中室温下搅拌2.5小时，造成了由与PEG-胺所交联的节枝弹性蛋白组成的交联球体。接续，将所述得到的交联节枝弹性蛋白球体的混合物放置在乙醇中，而在室温下搅拌5分钟。接续，所述交联节枝弹性蛋白球体是通过离心(23℃，6000克，5分钟)来收集。
经由光学显微镜所得到的所述交联的节枝弹性蛋白球体的图像如图10所示。
所述节枝弹性蛋白球体被随意地使用于通过分散所述球体在一胶原凝胶来制备一复合材料，而后使用EDC和NHS(例如，使用如范例3中所描述的工序)或戊二醛来将所述球体交联至所述胶原。所述得到的复合材料被随意地冻干。
所述复合材料的机械性能是通过如所述材料和方法部分中所描述的压缩试验和/或通过如Elvin等人[Nature 2005，437:999-1002]所描述的机械性能的拉伸试验(例如，拉伸强度、弹性模量和/或回弹性)来随意地测试。
范例5
通过替代方法的交联的节枝弹性蛋白球体的制备
采用沉淀的非交联的节枝弹性蛋白球体的制备：节枝弹性蛋白球体是根据Ruckenstein等人[Polymer 1995，36:2857-2860]所描述的工序来制备的。一含有节枝弹性蛋白的单体水溶液是以一注射器被逐滴地引入一含有热石蜡油的立式玻璃柱。
采用超临界CO2中的分散的非交联的节枝弹性蛋白球体的制备：节枝弹性蛋白球体是根据Benedetti等人[Biotechnol Bioeng 1997，53:232-237]所描述的工序来制备的。一含有节枝弹性蛋白的溶液是以批处理模式并通过使用作为超临界反溶剂(SAS)的二氧化碳来胀接的。
采用溶剂萃取/蒸发的非交联的节枝弹性蛋白球体的制备：节枝弹性蛋白球体是根据Freitas等待[Journal of Controlled Release 2005，102:313–332]所描述的工序来制备的。一乳化液(例如，一水包油乳化液)是以溶解或分散于所述分散相的节枝弹性蛋白来制备。接续，所述分散相的溶剂是经由萃取和/或蒸发来移除，造成了节枝弹性蛋白球体。
采用高强度超声波的非交联的节枝弹性蛋白球体的制备：节枝弹性蛋白球体是根据Gedanken[Chem Eur J 2008，14:3840-3853]所描述的工序来制备的。
一含有节枝弹性蛋白(例如，约50毫克/毫升的节枝弹性蛋白)的溶液(例如，水溶液)经受高强度(例如，从20kHz到10MHz)超声波(例如约3分钟)，造成了节枝弹性蛋白微球体的形成，直径通常约为2.5微米。可选择地，空气填充的微球体是通过引导所述超声波至所述节枝弹性蛋白溶液的气水界面来制备的。可选择地，有机液体填充的微球体是通过引导所述超声波至所述节枝弹性蛋白溶液的有机溶液-水界面来制备的。
根据任何的上述方法所制备的节枝弹性蛋白球体是与EDC和PEG-胺来交联且被收集，其是使用范例4中所描述的工序。所述交联的节枝弹性蛋白球体被随意地使用于制备一复合材料，如范例4中所描述的。
所述复合材料的机械性能是通过如所述材料和方法部分中所描述的压缩试验和/或通过如Elvin等人[Nature 2005，437:999-1002]所描述的机械性能的拉伸试验(例如，拉伸强度、弹性模量和/或回弹性)来随意地测试。
尽管已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但显然许多改变、修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落在所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有此类改变、修改和变型。
在说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请的全部内容在本文中通过引用并入说明书，并入程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地且单独地表明通过引用并入本文中一样。此外，在本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认这些参考文献可用作本发明的现有技术。在使用分节标题的程度上，这些参考文献不应解释为必要的限制。

Claims (49)

1.一种物质组合物，包含一交联聚合物，所述交联聚合物包含多个节枝弹性蛋白多肽部分及至少一个聚合部分，所述至少一个聚合部分是经由至少一个交联部分而共价交联至所述多个节枝弹性蛋白多肽部分，所述交联部分是不包含联苯部分。
2.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述交联聚合物的至少10重量百分比是所述至少一个聚合部分。
3.根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述交联部分包含一酰胺键。
4.根据权利要求2所述的物质组合物，其中所述交联部分包含一酰胺键。
5.根据权利要求3所述的物质组合物，其中所述交联部分由一酰胺键组成。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的物质组合物，其中所述至少一个聚合部分包含多个胺基，且所述酰胺键是由所述聚合部分的至少一个胺基及所述节枝弹性蛋白多肽部分的至少一个羧基构成。
7.根据权利要求6所述的物质组合物，其中所述羧基构成所述节枝弹性蛋白多肽的氨基酸残基的侧链的一部分，所述节枝弹性蛋白多肽是选自于由谷氨酸残基及天冬氨酸残基所组成的群组。
8.根据权利要求6及7中任一项所述的物质组合物，其中所述至少一个聚合部分包含一支化端胺基聚合物。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的物质组合物，其中所述至少一个聚合部分包含一多肽。
10.根据权利要求9所述的物质组合物，其中所述多肽包含一胶原。
11.根据权利要求9及10中任一项所述的物质组合物，其中所述交联部分是由所述聚合部分的至少一个赖氨酸残基的一侧链生成的。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的物质组合物，其中所述至少一个聚合部分包含聚(乙二醇)(PEG)。
13.根据权利要求12所述的物质组合物，其中所述至少一个聚合部分包含一支化端胺基聚合物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的物质组合物，其中所述交联聚合物是处于多个颗粒的形式。
15.根据权利要求14所述的物质组合物，其中所述颗粒的直径范围是介于1微米至200微米之间。
16.根据权利要求14或15所述的物质组合物，其中所述颗粒实质上是球体。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的物质组合物，其中所述颗粒被相互的共价交联。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的物质组合物，其中所述物质组合物是处于一薄膜的形式。
19.一种复合材料，包含根据权利要求1至18中任一项所述的物质组合物以及至少一个附加的聚合物质，所述至少一个附加的聚合物质被结合至所述交联聚合物。
20.根据权利要求19所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质包含一多糖，且所述交联聚合物包含一多糖结合域，所述多糖结合域结合至所述多糖。
21.根据权利要求20所述的复合材料，其中所述节枝弹性蛋白多肽部分包含所述多糖结合域。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的复合材料，其中所述多糖包含纤维素。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的物质组合物或者根据权利要求19至22中任一项所述的复合材料，其中所述物质组合物或所述复合材料是处于一发泡体的形式。
24.根据权利要求23所述的物质组合物或所述的复合材料，其具有至少一个选自于由下列所组成的群组的特点：
至少2.5kPa的弹性模量；以及
至少50％的回弹性，在所述发泡体的压缩上。
25.根据权利要求19所述的复合材料，其中所述交联聚合物是处于多个颗粒的形式，所述颗粒被埋置于所述至少一个附加的聚合物质中。
26.根据权利要求19所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质包含胶原。
27.根据权利要求25所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质包含胶原。
28.根据权利要求19所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质被共价连接至所述交联聚合物。
29.根据权利要求25所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质被共价连接至所述交联聚合物。
30.根据权利要求28或29所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质包含胶原。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的复合材料，其中所述附加的聚合物质经由至少一酰胺键而被共价连接至所述交联聚合物。
32.一种制造品，包含根据权利要求1至18中任一项所述的物质组合物。
33.一种制造品，包含根据权利要求19至22中任一项所述的复合材料。
34.一种制造品，包含根据权利要求25至31中任一项所述的复合材料。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的制造品，其中所述制造品是一医疗装置。
36.根据权利要求35所述的制造品，其中所述医疗装置是一植入式医疗装置。
37.一种治疗有需要的受试者的组织损伤或缺损的方法，所述方法包含将根据权利要求36所述的制造品植入于所述受试者中，从而治疗所述组织损伤或缺损。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述制造品能够形成一支架在所述受试者体内，从而诱发一组织的形成。
39.一种制备根据权利要求1至18中任一项所述的物质组合物的方法，所述方法包含将一节枝弹性蛋白多肽共价交联到至少一个聚合物质，其中所述交联不会产生联苯部分。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一个聚合物质包含多个胺基，且所述交联包含将所述胺基与所述节枝弹性蛋白多肽的羧基起反应，以致形成一酰胺键。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述起反应包含激活所述节枝弹性蛋白多肽的所述羧基，且将所述节枝弹性蛋白多肽与所述至少一个聚合物质进行接触。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述激活是通过与一碳化二亚胺反应来产生的。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包含在所述交联之前将所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质与至少一个附加的聚合物质进行接触，从而产生一复合材料，所述复合材料包含结合至所述至少一个附加的聚合物质的所述交联聚合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一个附加的聚合物质是处于一发泡体的形式。
45.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包含在所述交联之前将一含有所述节枝弹性蛋白多肽及所述至少一个聚合物质的亲水性溶液与一亲水表面进行接触，以致产生薄膜形式的所述物质组合物。
46.根据权利要求39至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包含在所述交联之前制备多个含有所述节枝弹性蛋白多肽及所述至少一个聚合物质的颗粒，从而在所述交联之上产生含有所述交联聚合物的颗粒。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述颗粒被相互的共价交联。
48.根据权利要求46至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包含将所述颗粒埋置于所述至少一个附加的聚合物质中，从而产生一复合材料，所述复合材料包含埋置于所述至少一个附加的聚合物质中的所述颗粒。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述制备所述颗粒包含了所述节枝弹性蛋白多肽和所述至少一个聚合物质的混合物的分散和/或沉淀。
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