JP2020503882A - エラストマータンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、エラストマータンパク質およびエラストマータンパク質作製に関する。詳細には、本発明は、エラストマータンパク質配列に指向されており、発現構築物などのエラストマータンパク質配列の作製のための方法および組成物、ならび宿主細胞を含み、また該エラストマータンパク質配列から生成された組成物も含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、開示全体が全ての目的のため全体として参照によって本明細書に組み入れられる、2017年1月13日に出願された米国特許仮出願第62/446,230号の恩典を主張する。

技術分野
本開示は、一般に、エラストマータンパク質およびエラストマータンパク質作製に関する。具体的には、本開示は、エラストマータンパク質配列、発現構築物、宿主細胞、および固体に関する。

背景
エラストマータンパク質は、粘弾性の機械特性を示すポリペプチドであり、かつ、エラスチン、レジリン、アブダクチン（abductin）、およびタコ動脈エラストマーを含む。レジリンは、負荷中および除荷中にほとんどエネルギーが散逸しないため、特に興味深いエラストマータンパク質である。レジリンは、多くの昆虫に見出され、その低いエネルギー散逸が、多くの昆虫種の、極めて効率的に跳ぶかまたは羽ばたく並外れた能力を可能にしている。レジリンは、その独特の特性のため、多くの産業的適用を有し得る興味深いエラストマー材料である。しかしながら、レジリンは、天然には極めて少量にしか存在せず、従って、昆虫の飼育によって、高い費用効果では入手することはできない。

天然レジリンおよびレジリン様タンパク質（レジリン配列に基づく）の変種は、多数のグループによって、大腸菌（E.coli）培養物中で組換え作製されており、組換え発現されたタンパク質を抽出するために細胞を溶解し、精製するためにアフィニティクロマトグラフィー技術を使用することによって単離されている（Elvin et al.,2005；Charati et al.;2009、McGann et al.,2013）。組換え作製されたレジリンおよびレジリン様タンパク質は、天然レジリンにおいても架橋を形成するチロシン残基を標的として架橋された（例えば、Elvin et al.,2005；Qin et al.,2011を参照すること）。組換え作製されたレジリンは、リジン残基（Li et al.,2011）またはシステイン残基（McGann et al.,2013）を標的としても架橋されている。架橋された組換え作製されたレジリンおよびレジリン様タンパク質は、天然レジリンと類似した機械特性を示し、90％より高い弾性エネルギー値を有していた（Elvin et al.,2005、Qin et al.,2011、Li et al.,2011）。

ある研究において、大腸菌培養物1リットル当たり70〜80mgの組換えレジリン様タンパク質が産生され、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィーによってレジリン様タンパク質が精製された（Charati et al.,2009）。より効率的な発現システムが開発され、それは、大腸菌宿主細胞から300〜450mg/Lの組換えレジリン様タンパク質を産生した（Lyons,et al.,2009）。塩沈殿後の加熱に基づき、溶解された大腸菌宿主細胞からレジリン様タンパク質を精製する、より効率的な方法も開発されている（Qin et al.,2011；Lyons et al.,2009）。しかしながら、より大きい産生量を有する、エラストマータンパク質（例えば、レジリンおよびレジリン様タンパク質）を発現させ精製するための改善されたシステムが、より大規模でより効率的なタンパク質作製を提供することが望まれている。

細胞溶解後の単純な沈殿に基づく精製技術によって、発現されたタンパク質を回収することの少なくとも一つの欠点は、溶解された細胞に由来する細胞タンパク質の標的タンパク質への混入のため、得られるタンパク質が低い純度を有する傾向があるという点である。低い純度は、低い弾性エネルギーを含む多様な生成物の欠陥をもたらし得る。さらに、タンパク質の細胞内蓄積は、毒性をもたらし、従って、組換えエラストマータンパク質の産生の効率の減少をもたらし得る。従って、必要とされているのは、細胞外部分からエラストマータンパク質を回収するための方法を含む、組換えエラストマータンパク質の発現および精製のための改善された方法である。また、より大きい産生効率を有する、組換えエラストマータンパク質（例えば、レジリンおよびレジリン様タンパク質）の発現および精製のための改善された方法も、必要とされている。

いくつかの態様によると、組換えレジリンタンパク質を含む組成物を作製するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、発酵物中で組換え宿主細胞の集団を培養する工程であって、組換え宿主細胞が、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを含み、かつ組換え宿主細胞が、分泌型レジリンコード配列によってコードされた組換えレジリンタンパク質を分泌する、工程；および発酵物から組換えレジリンタンパク質を精製する工程を含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、全長または短縮型のネイティブレジリンである。いくつかの態様において、ネイティブレジリンは、セイシェルショウジョウバエ（Drosophila sechellia）、パナマハキリアリ（Acromyrmex echinatior）、ヤンマ（Aeshna）、ノサシバエ（Haematobia irritans）、ネコノミ（Ctenocephalides felis）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）、ミツバチ（Apis mellifera）、キョウソヤドリコバチ（Nasonia vitripennis）、コロモジラミ（Pediculus humanus corporis）、ガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）、グロッシーナ・モーシタンス（Glossina morsitans）、アッタ・セファロテス（Atta cephalotes）、アノフェレス・ダーリンジ（Anopheles darlingi）、エンドウヒゲナガアブラムシ（Acyrthosiphon pisum）、クロショウジョウバエ（Drosophila virilis）、キリシマキノコショウジョウバエ（Drosophila erecta）、スナバエ（Lutzomyia longipalpis）、オオサシガメ（Rhodnius prolixus）、ヒアリ（Solenopsis invicta）、ネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus）、ウリミバエ（Bactrocera cucurbitae）、およびトリコグラムマ・プレチオスム（Trichogramma pretiosum）からなる群より選択される生物に由来する。いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、SEQ ID NO:1を含む。いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、SEQ ID NO:4を含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、α接合因子分泌シグナルを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、FLAGタグを含む。いくつかの態様において、ベクターは、複数の分泌型レジリンコード配列を含む。

いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの態様において、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ピキア（コマガテラ）パストリス（Pichia （Komagataella） pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア（シェフェルソミセス）スチピチス（Pichia （Scheffersomyces） stipitis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）からなる群より選択される種である。

いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で組換えレジリンを産生する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は組換えレジリンの分泌型画分を産生し、該分泌型画分は、組換え宿主細胞によって発現された組換えレジリン全タンパク質と比較して50％超である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で組換えレジリンを分泌する。いくつかの態様において、80％超の組換えレジリンは、発酵物中の組換え宿主細胞の外部に存在する。いくつかの態様において、発酵物は1L当たり少なくとも2gの組換えレジリンを含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質を精製する工程は、発酵物を遠心分離することによって、第1のペレット画分および第1の上清画分を生成すること；ならびに第1のペレット画分から組換えレジリンタンパク質を単離することを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質を精製する工程は、組換えレジリンタンパク質が可溶である溶液を生成するために、第1のペレット画分にカオトロープを添加すること；カオトロープを含む第1のペレット画分を遠心分離することによって、第2の上清画分および第2のペレット画分を生成すること；ならびに第2の上清画分から可溶性全長レジリンを単離することをさらに含む。

いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列を含むベクターが、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、全長または短縮型のネイティブレジリンをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、改変された全長または短縮型のネイティブレジリンをコードする。いくつかの態様において、改変されたレジリンは、アミノ酸残基の付加を含むか、アミノ酸残基の削除を含むか、アミノ酸残基の置換を含むか、またはアミノ酸残基の位置の変更を含み、このアミノ酸残基は別のレジリンと架橋することができる。

いくつかの態様において、全長または短縮型のネイティブレジリンは、セイシェルショウジョウバエ、パナマハキリアリ、ヤンマ、ノサシバエ、ネコノミ、セイヨウオオマルハナバチ、コクヌストモドキ、ミツバチ、キョウソヤドリコバチ、コロモジラミ、ガンビアハマダラカ、グロッシーナ・モーシタンス、アッタ・セファロテス、アノフェレス・ダーリンジ、エンドウヒゲナガアブラムシ、クロショウジョウバエ、キリシマキノコショウジョウバエ、スナバエ、オオサシガメ、ヒアリ、ネッタイイエカ、ウリミバエ、およびトリコグラムマ・プレチオスムからなる群より選択される生物に由来する。

いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、SEQ ID NO:1を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、SEQ ID NO:4を含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、1つまたは複数のAリピートまたは準Aリピートを含む組換えレジリンをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、1つまたは複数のBリピートまたは準Bリピートを含む組換えレジリンをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は組換えレジリンをコードし、該組換えレジリンは、1つもしくは複数のAリピートもしくは準Aリピート、または1つもしくは複数のBリピートもしくは準Bリピートのいずれか一方のみを含む。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、1つまたは複数のAリピートまたは準Aリピートと1つまたは複数のBリピートまたは準Bリピートとを含む組換えレジリンをコードする。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、キチン結合ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、α接合因子分泌シグナルを含むポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、FLAGタグを含む。

いくつかの態様において、ベクターは、複数の分泌型レジリンコード配列を含む。いくつかの態様において、ベクターは、3つの分泌型レジリンコード配列を含む。いくつかの態様において、分泌型レジリンコード配列は、構成性または誘導性のプロモーターに機能的に連結されている。

いくつかの態様によると、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを1つまたは複数含む組換え宿主細胞も、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの態様において、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、ピキア（コマガテラ）パストリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、アークスラ・アデニニボランス、ヤロウイア・リポリチカ、ピキア（シェフェルソミセス）スチピチス、ピキア・メタノリカ、サッカロミセス・セレビシエ、およびクルイベロミセス・ラクチスからなる群より選択される種である。

いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを3つ含む。

いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で組換えレジリンを産生する。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は組換えレジリンの分泌型画分を有し、該分泌型画分は50％超である。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度でレジリンを分泌する。

いくつかの態様によると、分泌型レジリンコード配列を含む1つまたは複数のベクターを含む組換え宿主細胞と、組換え宿主細胞を増殖させるのに適した培養用培地とを含む、発酵物も、本明細書中に提供される。

いくつかの態様において、発酵物は、1L当たり少なくとも2gの組換えレジリンを含む。

発酵物のいくつかの態様において、80％超の組換えレジリンが、組換え宿主細胞の外部に存在する。

発酵物のいくつかの態様において、組換えレジリンは、全長組換えレジリンである。

いくつかの態様によると、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを1つまたは複数含む組換え宿主細胞を含む発酵物から得られた組換えレジリンと、組換え宿主細胞を増殖させるのに適した培養用培地とを含む、組成物も、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも60重量％の組換えレジリンを含む。

いくつかの態様において、組成物は、ほぼ同じ量のネイティブレジリンを含む組成物と比較して類似した特性を有する。いくつかの態様において、組成物は、ほぼ同じ量のネイティブレジリンを含む組成物と比較して異なる特性を有する。

いくつかの態様において、組成物は、50％超の弾性エネルギーを含む。いくつかの態様において、組成物は、10MPa未満の圧縮弾性率を有する。いくつかの態様において、組成物は、10MPa未満の引張弾性率を有する。いくつかの態様において、組成物は、1MPa未満の剪断弾性率を有する。いくつかの態様において、組成物は、1％超の破断伸び（extension to break）を有する。いくつかの態様において、組成物は、0.1kPa超の最大引張強さを有する。いくつかの態様において、組成物は、90未満のショア00硬度を有する。いくつかの態様において、組成物は、全長レジリンを含む。

いくつかの態様によると、組換えレジリンを含む組成物を作製するための方法も、本明細書中に提供され、本方法は、組換え宿主細胞からの組換えレジリンの分泌を促進する条件下で発酵物を作製するために、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを1つまたは複数含む組換え宿主細胞を培養する工程を含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンを含む組成物を作製するための方法は、全長ネイティブレジリンを作製するために組換えレジリンを精製する工程をさらに含む。いくつかの態様において、全長ネイティブレジリンを作製するために組換えレジリンを精製する工程は、発酵物を遠心分離することによって、第1のペレット画分および第1の上清画分を生成すること；ならびに第1のペレット画分から組換えレジリンタンパク質を単離することを含む。いくつかの態様において、第1のペレット画分から組換えレジリンタンパク質を単離することは、組換えレジリンタンパク質が可溶である溶液を生成するために、第1のペレット画分にカオトロープを添加すること；カオトロープを含む第1のペレット画分を遠心分離することによって、第2の上清画分および第2のペレット画分を生成すること；ならびに第2の上清画分から組換えレジリンタンパク質を単離することを含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンを含む組成物を作製するための方法は、複数の組換えレジリンを架橋する工程をさらに含む。いくつかの態様において、架橋は、酵素的架橋である。いくつかの態様において、架橋は、光化学的架橋である。いくつかの態様において、組換えレジリンタンパク質は、全長レジリンタンパク質を含む。

いくつかの態様によると、培養用培地と組換え宿主細胞とを含む発酵物も本明細書中に提供され、組換え宿主細胞はベクターを含み、ベクターは分泌型レジリンコード配列を含み、かつ組換え宿主細胞は少なくとも2mg/g乾燥細胞重量/時間の速度で組換えレジリンを分泌する。

例示的なレジリンの構造を概略的に例示する。 組換えレジリンを含む組成物の作製の方法のフローチャートである。 3つの分泌型レジリンコード配列を含むベクターの例示的なマップである。 ELISAによってアッセイされた、ピキア・パストリス（コマガテラ・ファフィー（Komagataella phaffii））組換え宿主細胞における3×FLAGタグ付き組換えレジリンの発現および分泌を示す。 ウエスタンブロット（上；3×FLAGタグ付き組換えレジリン）およびクーマシー（下；非タグ付き組換えレジリン）によってアッセイされた、ピキア・パストリス（コマガテラ・ファフィー）組換え宿主細胞における組換えレジリンの発現を示す。 リッチ培地における組換えレジリンを産生する組換え宿主細胞の産生量を示す。 最少培地における組換えレジリンを産生する組換え宿主細胞の産生量を示す。 500mL BMGYフラスコ増殖からの2種類の分泌型組換えレジリンの精製を示す。各試料について、レーン1は、最初の上清であり；レーン2は、沈殿後の上清であり；レーン3は、透析された沈殿物であり；レーン4は、熱変性タンパク質であり；レーン5は、最終的に精製された組換えレジリンである。 様々な形および形態の、架橋された精製された組換えレジリンを含むタンパク質性ブロックコポリマーの写真を示す。 架橋された組換えレジリンを含むタンパク質性ブロックコポリマーの圧縮の写真を示す。 本明細書中に記載された選択された方法によって精製された組換えレジリン組成物から得られたバンドを示すゲルの画像である。 本発明のいくつかの態様による、後に切断されるシグナル配列と共に発現する全長セイシェルショウジョウバエレジリン配列（Ds_ACB）である。

図面は、例示の目的のためにのみ、本開示の様々な態様を示す。当業者は、本明細書中に記載された原理から逸脱することなく、本明細書中に例示された構造および方法の代替的な態様が用いられ得ることを、以下の考察から容易に認識するであろう。

定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、全て、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

「1つの（a）」および「1つの（an）」および「その（the）」という用語ならびに類似の指示対象は、本明細書中で使用されるように、本明細書中に他に示されるかまたは前後関係によって明白に否定されない限り、単数および複数の両方をさす。

「約」、「およそ」、または「と類似した/ほぼ同じ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差の範囲内を意味し、それは、その値が測定されるかもしくは決定される方法、または測定システムの限界に、一部分、依存し得る。下記の範囲および量は、全て、近似値であり、本発明を限定するためのものではないことが理解されるべきである。範囲および数が使用される場合、これらは、統計的な範囲または測定の誤差もしくは変動を含む近似的なものであり得る。いくつかの態様において、例えば、測定は、±10％であり得る。

アミノ酸は、1文字コードまたは3文字コードによって言及され得る。1文字コード、アミノ酸名、および3文字コードは、以下の通りである：G - グリシン（Gly）、P - プロリン（Pro）、A - アラニン（Ala）、V - バリン（Val）、L - ロイシン（Leu）、I - イソロイシン（Ile）、M - メチオニン（Met）、C - システイン（Cys）、F - フェニルアラニン（Phe）、Y - チロシン（Tyr）、W - トリプトファン（Trp）、H - ヒスチジン（His）、K - リジン（Lys）、R - アルギニン（Arg）、Q - グルタミン（Gln）、N - アスパラギン（Asn）、E - グルタミン酸（Glu）、D - アスパラギン酸（Asp）、S - セリン（Ser）、T - トレオニン（Thr）。

「を含む（including）」、「を含む（includes）」、「を有する（having）」、「を有する（has）」、「を有する（with）」という用語、またはそれらの変化形は、「を含む（comprising）」という用語と同様に、包括的であるものとする。

「微生物」という用語は、本明細書中で使用されるように、微生物をさし、単細胞生物をさす。本明細書中で使用されるように、その用語には、全ての細菌、全ての古細菌、単細胞原生生物、単細胞動物、単細胞植物、単細胞真菌、単細胞藻類、全ての原虫、および全てのクロミスタが含まれる。

「ネイティブ」という用語は、本明細書中で使用されるように、天然の改変されていない状態で天然に見出される組成物をさす。

「任意の」または「任意で」という用語は、特色もしくは構造が存在してもよいもしくは存在しなくてもよいこと、またはイベントもしくは状況が起こってもよいもしくは起こらなくてもよいことを意味し、その記載が、詳細な特色もしくは構造が存在する場合および特色もしくは構造が存在しない場合、またはイベントもしくは状況が起こる場合およびイベントもしくは状況が起こらない場合を含むことを意味する。

「分泌型画分」という用語は、本明細書中で使用されるように、細胞によって産生される全レジリンと比較した、細胞から分泌される組換えレジリンの画分をさす。

「分泌シグナル」という用語は、本明細書中で使用されるように、ポリペプチドと融合した時に、そのポリペプチドの細胞からの分泌を媒介する短いペプチドをさす。

「分泌型レジリンコード配列」という用語は、本明細書中で使用されるように、N末端で分泌シグナルと融合しておりかつ任意でC末端でタグペプチドまたはタグポリペプチドと融合している本明細書中に提供されるレジリンをコードするヌクレオチド配列をさす。

「組換え」という用語は、ポリペプチド（例えば、レジリン）に関して、本明細書中で使用されるように、組換え宿主細胞において産生されるポリペプチド、または組換え核酸から合成されるポリペプチドをさす。

「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中で使用されるように、組換え核酸を含む宿主細胞をさす。

「組換え核酸」という用語は、本明細書中で使用されるように、その天然に存在する環境から取り出された核酸、または天然に見出された場合にその核酸に隣接しているかもしくは近位にある核酸の全部もしくは一部と会合していない核酸、または天然には連結されていない核酸と機能的に連結された核酸、または天然には存在しない核酸、または天然にはその核酸に見出されない改変（例えば、人為的に、例えば、ヒトの介入によって導入された挿入、欠失、もしくは点変異）を含有している核酸、または異種の部位において染色体に組み込まれた核酸をさす。その用語には、クローニングされたDNA単離物、および化学合成されたヌクレオチド類似体を含む核酸が含まれる。

「ベクター」という用語は、本明細書中で使用されるように、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。ベクターの一つの型は、「プラスミド」であり、それは、一般に、付加的なDNAセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖DNAループをさすが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅または制限酵素による環状プラスミドの処理によって得られるもののような直鎖状二本鎖分子も含む。他のベクターには、バクテリオファージ、コスミド、細菌人工染色体（BAC）、および酵母人工染色体（YAC）が含まれる。ベクターの別の型は、付加的なDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入された細胞において自律複製することができる（例えば、細胞において機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、細胞への導入時に細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって、細胞ゲノムと共に複製される。

「リピート」という用語は、アミノ酸または核酸の配列に関して、本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、連鎖状の配列）内に2回以上存在する部分配列をさす。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、介在配列を含まないリピート配列の直接反復を有していてもよいか、または介在配列を含むリピート配列の不連続反復を有していてもよい。「準リピート」という用語は、アミノ酸または核酸の配列に関して、本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて不正確に繰り返される（即ち、準リピート部分配列のいくつかの部分が準リピート間で可変性である）部分配列である。繰り返されるポリペプチドおよびDNA分子（またはポリペプチドまたはDNA分子の一部分）は、リピート部分配列（即ち、正確なリピート）または準リピート部分配列（即ち、不正確なリピート）のいずれかから構成されていてよい。

「ネイティブレジリン」という用語は、本明細書中で使用されるように、昆虫によって産生されたエラストマーのポリペプチドまたはタンパク質をさす。ネイティブレジリンの非限定的な例のGenBankアクセッション番号には、以下のNCBI配列番号が含まれる：NP 995860（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、NP 611157（キイロショウジョウバエ）、Q9V7U0（キイロショウジョウバエ）、AAS64829、AAF57953（キイロショウジョウバエ）、XP 001817028（コクヌストモドキ）、およびXP001947408（エンドウヒゲナガアブラムシ）。

「改変された」という用語は、本明細書中で使用されるように、機能的特性がネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドの特性の10％以内に保存されている、ネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドの配列と組成が異なるタンパク質またはポリペプチドの配列をさす。いくつかの態様において、改変されたタンパク質または改変されたポリペプチドと、ネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドとの間の違いは、一次配列（例えば、1つもしくは複数のアミノ酸が除去されているか、挿入されているか、もしくは置換されている）または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）にあり得る。アミノ酸欠失とは、タンパク質からの1つまたは複数のアミノ酸の除去をさす。アミノ酸挿入とは、1つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質またはポリペプチドに導入されることをさす。アミノ酸挿入には、単一または複数のアミノ酸の、N末端および/またはC末端における融合、ならびに配列内挿入が含まれ得る。アミノ酸置換には、非保守的または保存的な置換が含まれ、保存的アミノ酸置換の表は、当技術分野において周知である（例えば、Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)を参照すること）。いくつかの態様において、改変されたタンパク質または改変されたポリペプチドとネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドとのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性は、アミノ酸またはヌクレオチド塩基の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％である。

「短縮型」という用語は、本明細書中で使用されるように、ネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドより長さが短いタンパク質またはポリペプチドの配列をさす。いくつかの態様において、短縮型タンパク質または短縮型ポリペプチドは、ネイティブタンパク質またはネイティブポリペプチドの長さの10％超または20％超または30％超または40％超または50％超または60％超または70％超または80％超または90％超であり得る。

「相同体」または「実質的類似性」という用語は、ポリペプチド、核酸、またはそれらの断片をさす時、本明細書中で使用されるように、適切なアミノ酸またはヌクレオチドの挿入または欠失によって、別のアミノ酸もしくは核酸（またはその相補鎖）と最適に整列化された時、前述のようなFASTA、BLAST、またはGapのような配列同一性の周知のアルゴリズムによって測定されるように、アミノ酸またはヌクレオチド塩基の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％において、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。

「レジリン」という用語は、本明細書中で使用されるように、架橋されてエラストマーを形成することができるタンパク質またはポリペプチドをさし、ここで、タンパク質またはポリペプチドは、ネイティブレジリン、改変されているネイティブレジリン、または短縮させられたネイティブレジリンである。本発明のレジリンは、好ましくは、組換えレジリンである。いくつかの態様において、組換えレジリンには、宿主細胞から異種性に発現され分泌された、（例えば、昆虫から単離された）レジリンまたはレジリン断片をコードする天然のまたは改変された（例えば、短縮型もしくは連鎖状）ヌクレオチド配列が含まれる。好ましい態様において、分泌型組換えレジリンタンパク質は、宿主細胞の細胞外の溶液から収集される。

本明細書中で使用されるように、「エラストマー」という用語は、粘弾性および（存在する場合、共有結合性の分子間架橋を除けば）典型的には弱い分子間力を有するポリマーをさす。粘弾性とは、変形を受けた時に粘性特徴および弾性特徴の両方を示し、従って、時間依存的なひずみを示す材料の特性である。弾性は、秩序正しい固体における結晶面に沿った結合伸縮に関連しており、粘性は、非結晶材料内の原子または分子の拡散の結果である。従って、粘弾性であるエラストマーは、一般に、他の材料と比較して低いヤング率および高い破壊ひずみを有する。材料の粘性成分のため、負荷が適用され、次いで除去された場合、粘弾性材料のエネルギーは散逸する。この現象は、粘弾性材料の応力ひずみ曲線においてヒステリシスとして観察される。負荷が適用される時、特定の応力ひずみ曲線が存在し、負荷が除去される時、除荷時の応力ひずみ曲線は、負荷中の曲線とは異なる。散逸するエネルギーは、負荷曲線と除荷曲線との間の面積である。

本明細書中での値の範囲の列挙は、本明細書中に他に示されない限り、その範囲内に包括的に含まれる別々の各値を個々にさすための略記法として役立つものに過ぎず、別々の各値は、本明細書中に個々に列挙されたかのごとく、本明細書中に組み入れられる。

詳細な説明
組換えレジリンを含む組成物およびその作製の方法が、本明細書中に提供される。

レジリンは、石油に基づくエラストマーと比較して、多くの独特の特性を有する。最も顕著には、レジリンは、極めて高い弾性効率を有し、変形のために入力されたエネルギーが、ほとんど熱として失われない。レジリンの他の望ましい特性には、例えば、望ましい弾性エネルギー、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、破断伸び、最大引張強さ、硬度、反発、および圧縮永久ひずみが含まれる。さらに、レジリンは、タンパク質であり、従って、生分解され得、そのため、石油に基づくポリマーより環境にやさしい。また、レジリンは、生体適合性であり、従って、ヒトまたは動物との接触を含む適用において使用され得る。最後に、具体的な適用の分野のために設計されたエラストマーを作製するために、タンパク質配列、タンパク質構造、分子間架橋の量、および作業変数を変動させることによって、組換えレジリンの機械特性を調整することが可能である。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法および組成物は、大量の組換えレジリンを作製するための効率的な手段を提供する。いくつかの態様において、大量のレジリンおよびレジリン様ポリペプチドは、分泌経路を介して組換えレジリンを分泌する組換え宿主細胞を使用して得られる。組換えレジリンのそのような分泌は、（a）組換えレジリンの細胞内蓄積からの毒性を回避し、（b）細胞破壊またはタンパク質再折り畳みの過程を排除することによって精製を単純化し、（c）組換えレジリンの特性をモジュレートし得る翻訳後イベント（例えば、タンパク質分解による成熟、グリコシル化、ジスルフィド結合形成）の機会を提供する。

組換えレジリンを含む組成物
いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、組換えレジリンを含む。

図1は、Xが任意のアミノ酸であるコンセンサスアミノ酸配列YGXPを含むリピート単位（「Aリピート」）を複数含むN末端Aドメインと；キチン結合型RR-2（C）ドメイン（PfamリファレンスPF00379；Rebers JE & Willis,JH.A conserved domain in anthropod cuticular proteins binds chitin.Insect Biochem Mol Biol 31:1083-1093）と；Uがグリシンまたはセリンであり；Zがセリン、グリシン、アルギニン、またはプロリンであり；かつXが任意のアミノ酸であるコンセンサスアミノ酸配列UYZXZを含むリピート単位（「Bリピート」）を複数含むC末端Bドメインとを含有する、ネイティブレジリンの一例を例示する。全ての天然に存在するレジリンが、Aドメイン、Cドメイン、およびBドメインを有するとは限らない。様々な昆虫によって産生されるネイティブレジリンは、典型的には、準リピート間のいくつかのアミノ酸変動を有する不正確なリピート（即ち、準リピート）をAドメイン内および/またはBドメイン内に有する。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換えレジリンは、1つまたは複数のAリピートを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンは、コンセンサス配列SXXYGXPを各々が有するAリピートおよび/または準Aリピートのアミノ酸部分配列のブロックを複数含む、N末端Aドメインを含み、Sはセリンであり、Xはアミノ酸であり、Yはチロシンであり、Gはグリシンであり、かつPはプロリンである。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換えレジリンは、1つまたは複数のBリピートを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンは、コンセンサス配列GYZXZZXおよび/またはSYZXZZXを各々が有するBリピートおよび/または準Bリピートのアミノ酸部分配列のブロックを複数含む、C末端Bドメインを含み、Gはグリシンであり；Yはチロシンであり；Zはセリン、グリシン、プロリン、またはアルギニンであり；Sはセリンであり；かつXは任意のアミノ酸である。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換えレジリンは、1つまたは複数のAリピートを含む。いくつかのそのような態様において、組換えレジリンは、1〜100個のAリピートまたは2〜50個のAリピートまたは5〜50個のAリピートまたは5〜20個のAリピートを含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、式：
(X₁-X₂-X₃-X₄)_n （1）
によって記載されるコンセンサス配列を1つまたは複数含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートの境界を示し；
nはAリピートまたは準Aリピートの数を記載し、1〜100または2〜50または5〜50または5〜20であり；
X₁は4アミノ酸長のモチーフであり、X₁の最初のアミノ酸はYであり、X₁の残りのアミノ酸はGAP、GLP、GPP、GTP、またはGVPであり；
X₂は3〜20アミノ酸長のモチーフであり；
X₂はGGG、GGGG、N、NG、NN、NGN、NGNG、GQGG、GQGN、GQGQ、GQGQG、もしくは3つもしくはそれ以上のグリシン残基を含むか、またはX₂の残基の50％もしくはそれ以上がグリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはX₂の残基の60％もしくはそれ以上がグリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはX₂の残基の70％もしくはそれ以上がグリシンもしくはアスパラギンのいずれかであるか、またはX₂の残基の80％もしくはそれ以上がグリシンもしくはアスパラギンのいずれかであり；
X₃は2〜6アミノ酸長のモチーフであり、X₃はGG、LS、APS、GAG、GGG、KPS、RPS、またはGGGGであり；かつ
X₄は1〜2アミノ酸長のモチーフであり、X₄はS、D、T、N、L、DS、DT、LS、SS、ST、TN、またはTSである。

いくつかのそのような態様において、組換えレジリンは、モチーフX₁、X₂、X₃、およびX₄を含み、他の態様において、組換えレジリンは、モチーフX₁、X₂、X₃、もしくはX₄、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換えレジリンは、1つまたは複数のBリピートを含む。いくつかのそのような態様において、組換えレジリンは、1〜100個のBリピートまたは2〜50個のAリピートまたは5〜50個のAリピートまたは5〜20個のAリピートを含む。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、式：
(X₁₁-X₁₂-X₁₃)_m （2）
によって記載されたコンセンサス配列を1つまたは複数含み、
式中、括弧はコンセンサス配列のリピートまたは準リピートの境界を示し；
mはBリピートまたは準Bリピートの数を記載し、1〜100であり；
X₁₁は1〜5アミノ酸長のモチーフであり、最初のアミノ酸はYであり、残りのアミノ酸はGAP、GPP、SSG、またはSGGを含んでいてよく；
X₁₂は2〜5アミノ酸長のモチーフであり、GQ、GN、RPG、RPGGQ、RPGGN、SSS、SKG、またはSNを含み；かつ
X₁₃は4〜30アミノ酸長のモチーフであり、GG、DLG、GFG、GGG、RDG、SGG、SSS、GGSF、GNGG、GGAGG、または3つもしくはそれ以上のグリシン残基を含むか、または残基の30％もしくはそれ以上がグリシンであるか、または残基の40％もしくはそれ以上がグリシンであるか、または残基の50％もしくはそれ以上がグリシンであるか、または残基の60％もしくはそれ以上がグリシンである。

いくつかのそのような態様において、組換えレジリンは、モチーフX₁₁、X₁₂、およびX₁₃を含み、他のそのような態様において、組換えレジリンは、モチーフX₁₁、X₁₂、もしくはX₁₃、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換えレジリンは、1つまたは複数のAリピート、1つまたは複数のBリピート、および/または1つまたは複数のCドメインを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンは、1つもしくは複数のAリピート、または1つもしくは複数のBリピートの一方のみを含む。いくつかの態様において、組換えレジリンは、1つまたは複数のAリピートを含み、BリピートもCドメインも含まない。いくつかの態様において、組換えレジリンは、1つまたは複数のBリピートを含み、AリピートもCドメインも含まない。組換えレジリンがCドメインを含む態様において、Cドメインは、AリピートもしくはBリピートのN末端側もしくはC末端側に置かれていてもよいか、またはAリピートとBリピートとの間に置かれていてもよい。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、Xが任意のアミノ酸である配列XXEPPVSYLPPSをさらに含む。いくつかのそのような態様において、配列は、AリピートまたはBリピートのN末端側に位置する。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、非ネイティブ環境において発現した全長ネイティブレジリンである。いくつかの態様において、組換えレジリンは、ネイティブレジリンの短縮バージョンを含む。いくつかの態様において、短縮型ネイティブレジリンは、少なくとも1つのAリピートを含む。いくつかの態様において、短縮型ネイティブレジリンは、少なくとも1つのBリピートを含む。全長ネイティブレジリンおよび短縮型ネイティブレジリンの非限定的な例は、SEQ ID NO:1〜44として提供される。いくつかの態様において、組換えレジリンは、全長セイシェルショウジョウバエレジリン（SEQ ID NO:1）である。いくつかの態様において、組換えレジリンは、短縮型パナマハキリアリレジリン（SEQ ID NO:4）である。いくつかの態様において、組換えレジリンは、非ネイティブの様式（例えば、より少ないかまたはより多い架橋、異なるアミノ酸残基を介した架橋）で架橋された全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンである。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、改変された全長または短縮型のネイティブレジリンである。いくつかの態様において、組換えレジリンは、全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％同一である。いくつかの態様において、組換えレジリンは、全長セイシェルショウジョウバエレジリン（SEQ ID NO:1）と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％同一である。いくつかの態様において、組換えレジリンは、短縮型パナマハキリアリレジリン（SEQ ID NO:4）と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％同一である。

ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の同一性を測定するために使用され得る多数の異なるアルゴリズムが、当技術分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0（Genetics Computer Group（GCG）,Madison,Wis）内のプログラムであるFASTA、Gap、またはBestfitを使用して比較され得る。FASTAは、クエリー配列とサーチ配列との間の最適なオーバーラップの領域のアライメントおよびパーセント配列同一性を提供する。例えば、（参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）Pearson,Methods Enzymol.183:63-98,1990を参照すること。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、そのデフォルトパラメータ（6のワードサイズおよびスコアリングマトリックスのためのNOPAMファクター）でFASTAを使用するか、または参照によって本明細書中に組み入れられるGCGバージョン6.1に提供されるデフォルトパラメータでGapを使用して、決定され得る。あるいは、配列は、コンピュータプログラムBLAST（Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Gish and States,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden et al.,Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Zhang and Madden,Genome Res.7:649-656,1997）、特に、blastpまたはtblastn（Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997）を使用して比較されてもよい。

いくつかの態様において、改変されたレジリンは、全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと異なる位置および/または異なる量および/または異なる型の翻訳後修飾を1つまたは複数有するよう、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化）を受けたアミノ酸残基において全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと異なる。いくつかの態様において、改変されたレジリンは、全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと異なる位置および/または異なる量および/または異なる型の、架橋に関与するアミノ酸を1つまたは複数有するよう、架橋に関与するアミノ酸残基において全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと異なる。いくつかのそのような態様において、改変されたレジリンは、1つまたは複数の付加的なまたはより少ないチロシン残基、1つまたは複数の付加的なまたはより少ないリジン残基、および/または1つまたは複数の付加的なまたはより少ないシステイン残基を含むという点で、全長ネイティブレジリンまたは短縮型ネイティブレジリンと異なる。

いくつかの態様において、組換えレジリンは、連鎖状のネイティブレジリンもしくは短縮型ネイティブレジリンまたは連鎖状の改変されたレジリンを含む。いくつかの態様において、連鎖状のネイティブレジリンもしくは短縮型ネイティブレジリンまたは連鎖状の改変されたレジリンは、少なくとも2個（例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上）のAリピートを含む。いくつかの態様において、連鎖状の短縮型ネイティブレジリンまたは連鎖状の改変されたレジリンは、少なくとも2個（例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれ以上）のBリピートを含む。

本明細書中に提供される組成物は、重量で少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％；10％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、もしくは20％；20％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、もしくは30％；30％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、もしくは40％；40％〜100％、90％、80％、70％、60％、もしくは50％；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；80％〜100％もしくは90％；または90％〜100％の組換えレジリンを含む。組換えレジリンは、同一の組換えレジリンであってもよいか、または少なくとも2種類の異なるアミノ酸配列を有する組換えレジリンの混合物であってもよい。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、ネイティブレジリンを含む組成物と比較して類似した特性を有する。他の態様において、本明細書中に提供される組成物は、ネイティブレジリンを含む組成物と比較して異なる特性を有する。そのような特性の非限定的な例には、弾性エネルギー、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、破断伸び、最大引張強さ、硬度、反発、および圧縮永久ひずみが含まれる。特定の機械特性を有する組成物を得るために改変され得るパラメータには、例えば、組換えレジリンの長さおよび/もしくは配列、組換えレジリンの翻訳後修飾の程度および/もしくは型、ならびに/または組換えレジリンの架橋の程度および/もしくは型が含まれる。

いくつかの態様において、最大引張強さ、圧縮弾性率、引張弾性率、剪断弾性率、破断伸び、および弾性エネルギーのような機械特性は、エラストマー試料に対して応力ひずみ測定を実施する様々な型の引張システムおよび圧縮システムを使用して測定され得る。ヒステリシスを有する曲線を含む得られた応力ひずみ曲線は、引張または圧縮において測定され得る。いくつかの態様において、引張試験システムおよび圧縮試験システムは、試料にひずみを適用し、得られた力をロードセルを使用して測定することができる。いくつかの態様において、機械特性は、（例えば、巨視的圧縮試験機を使用して）巨視的スケールで測定されてもよいか、微視的スケールで測定されてもよいか、または（例えば、原子間力顕微鏡法（AFM）もしくはナノインデンテーション測定を使用して）ナノスケールで測定されてもよい。いくつかの態様において、エラストマーの圧縮機械特性は、標準的なASTM D575-91（2012）圧縮におけるゴム特性の標準試験方法（Standard Test Methods for Rubber Properties in Compression）によって測定され得る。引張におけるエラストマーの機械的測定は、ASTM D412-15a 加硫ゴムおよび熱可塑性エラストマーの引張における標準試験方法（Standard Test Methods for Vulcanized Rubber and Thermoplastic Elastomers-Tension）を使用して実施され得る。いくつかの態様において、エラストマーの引裂強さは、ASTM D624-00 通常の加硫ゴムおよび熱可塑性エラストマーの引裂強さの標準試験方法（Standard Test Method for Tear Strength of Conventional Vulcanized Rubber and Thermoplastic Elastomers）を使用して実施され得る。いくつかの態様において、スラブエラストマー、接合されたエラストマー、および成型されたエラストマーの機械特性は、ASTM D3574-11 柔軟性のある細胞材料−スラブウレタンフォーム、接合されたウレタンフォーム、および成型されたウレタンフォームの標準試験方法（Standard Test Methods for Flexible Cellular Materials-Slab,Bonded,and Molded Urethane Foams）を使用して実施され得る。いくつかの態様において、エラストマーの機械特性は、ASTM D5992-96（2011）振動法を使用した加硫ゴムおよびゴム様材料の動的試験のための標準ガイド（Standard Guide for Dynamic Testing of Vulcanized Rubber and Rubber-Like Materials Using Vibratory Methods）を使用して測定され得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、もしくは95％超；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；80％〜100％もしくは90％；90％〜100％；95％〜100％、90％〜99％、または95％〜99％の弾性エネルギーを有する。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、10MPa未満、7MPa未満、5MPa未満、2MPa未満、1MPa未満、0.5MPa未満、もしくは0.1MPa未満；0.01MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa、0.5MPa、もしくは0.1MPa；0.1MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa、もしくは0.5MPa；0.5MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、もしくは1MPa；1MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、もしくは2MPa；2MPa〜10MPa、7MPa、もしくは5MPa；5MPa〜10MPaもしくは7MPa；または7MPa〜10MPaの圧縮弾性率を有する。いくつかの態様において、組成物の圧縮弾性率は、ASTM D575-91（2012）圧縮におけるゴム特性の標準試験方法によって定義されるように測定され得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、10MPa未満、7MPa未満、5MPa未満、2MPa未満、1MPa未満、0.5MPa未満、もしくは0.1MPa未満；0.01MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、1MPa、もしくは0.5MPa；0.5MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、2MPa、もしくは1MPa；1MPa〜10MPa、7MPa、5MPa、もしくは2MPa；2MPa〜10MPa、7MPa、もしくは5MPa；5MPa〜10MPaもしくは7MPa；または7MPa〜10MPaの引張弾性率を有する。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、1MPa未満、100kPa未満、50kPa未満、20kPa未満、10kPa未満、もしくは1kPa未満；0.1kPa〜1MPa、100kPa、50kPa、20kPa、10kPa、もしくは1kPa；1kPa〜1MPa、100kPa、50kPa、20kPa、もしくは10kPa；10kPa〜1MPa、100kPa、50kPa、もしくは20kPa；20kPa〜1MPa、100kPa、もしくは50kPa；50kPa〜1MPaもしくは100kPa；または100kPa〜1MPaの剪断弾性率を有する。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、1％超、10％超、50％超、100％超、300％超、もしくは500％超；1％〜500％、300％、100％、50％、もしくは10％；10％〜500％、300％、100％、もしくは50％；50％〜500％、300％、もしくは100％；100％〜500％もしくは300％；または300％〜500％の、破断伸びを有する。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、0.1kPa超、1kPa超、2kPa超、5kPa超、もしくは10kPa超；0.1kPa〜100kPa、10kPa、5kPa、2kPa、もしくは1kPa；1kPa〜100kPa、10kPa、5kPa、もしくは2kPa；2kPa〜100kPa、10kPa、もしくは5kPa；5kPa〜100kPaもしくは10kPa；または10kPa〜100kPaの最大引張強さを有する。

いくつかの態様において、硬度および圧縮弾性率のような機械特性は、インデンテーション測定システムおよびナノインデンテーション測定システムを使用して測定され得る。いくつかの態様において、所定の量のひずみまで試料に押し込むために圧子を用いるインデンテーション測定が、レジリンの硬度および圧縮弾性率を測定するために使用され、得られた力が、ロードセルを使用して測定される。いくつかの態様において、ビッカース形圧子およびバーコビッチ形圧子を含む種々の圧子形が使用され得る。いくつかの態様において、インデンテーション技術によって測定された硬度は、硬度＝(ピークフォース)/(接触面積)という関係を特徴とする。

いくつかの態様において、ポリマー、エラストマー、およびゴムの硬度は、デュロメータを使用して測定され得る。いくつかの態様において、エラストマーの硬度は、特定のスプリングの力およびインデンターの形状の組み合わせを使用した12種類の異なるデュロメータスケールを認識する標準的なASTM D2240を使用して測定され得る。最も一般的なスケールは、ショアOO、A、およびD硬度スケールである。硬度スケールは0〜100の範囲であり、0がより柔軟な材料であり、100がより硬い材料である。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、90未満、80未満、70未満、60未満、50未満、40未満、30未満、もしくは20未満；10〜90、80、70、60、50、40、30、もしくは20；20〜90、80、70、60、50、40、もしくは30；30〜90、80、70、60、50、もしくは40；40〜90、80、70、60、もしくは50；50〜90、80、70、もしくは60；60〜90、80、もしくは70；70〜90もしくは80；または80〜90のショア00硬度を有する。いくつかの態様において、レジリンの硬度測定は、ASTM D2240によって実施される。

本明細書中で使用されるように、「反発」という用語は、弾性エネルギーの詳細な尺度をさす。いくつかの態様において、反発は、ペンデュラムツールおよびドロップボール（dropped ball）を含む多数の異なるツールによって測定され得る。ペンデュラム型測定においては、反発率と一般的に呼ばれるRBが、式：

から求められる。反発弾性エネルギーは、

として算出され得、ここで、h＝反発の頂点高さ、およびH＝初期高さである。反発弾性エネルギーは、反発の角度の測定によっても決定され得る。エラストマーの反発を決定する試験方法のいくつかの例は、ASTM D2632-15およびASTM D7121-05（2012）である。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、もしくは95％超；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；80％〜100％もしく90％；90％〜100％；95％〜100％、90％〜99％、または95％〜99％の反発を有する。いくつかの態様において、レジリンの反発測定は、ASTM D2632-15、またはASTM D7121-05（2012）によって実施される。

本明細書中で使用されるように、「圧縮永久ひずみ」という用語は、応力が除去された後に残存する永久変形の尺度をさす。いくつかの態様において、圧縮永久ひずみは、（圧縮永久ひずみAと呼ばれる）空気中での一定の力による圧縮永久ひずみ、（圧縮永久ひずみBと呼ばれる）空気中での一定のたわみによる圧縮永久ひずみ、および（圧縮永久ひずみCと呼ばれる）材料の硬さを考慮した空気中での一定のたわみによる圧縮永久ひずみを含む異なる方式で測定され得る。圧縮永久ひずみA（C_A）は、以下の式：C_A＝[(t₀-t_i)/t₀]×100によって算出され、ここで、t₀は最初の標本の厚さであり、かつt_iは試験後の標本の厚さである。圧縮永久ひずみB（C_B）は、C_B＝[(t₀-t_i)/(t₀-t_n)]×100によって与えられ、ここで、t₀は最初の標本の厚さであり、t_iは試験後の標本の厚さであり、かつt_nは試験中のスペーサーの厚さまたは標本の厚さである。エラストマーの圧縮永久ひずみを決定する試験方法のいくつかの例は、ASTM D3574-11およびASTM D395-16である。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、50％超、60％超、70％超、80％超、90％超、もしくは95％超；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；80％〜100％もしくは90％；90％〜100％；95％〜100％、90％〜99％、または95％〜99％の圧縮永久ひずみAまたは圧縮永久ひずみBを有する。いくつかの態様において、レジリンの圧縮永久ひずみ測定は、ASTM D3574-11およびASTM D395-16によって実施される。

レジリンの製品への加工および成形は、種々の適用のための多くの形態をとることができる。従って、本明細書中に提供される組成物は、ゲル、多孔性スポンジ、フィルム、可削性固体、鋳造された形態、成型された形態、および合成物を含むが、これらに限定されるわけではない、任意の形および形態を有し得る。

本明細書中に提供される組成物は、とりわけ、航空宇宙、自動車、スポーツ用品、振動絶縁、フットウェア、および衣類における適用を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の使用を有する。これらのカテゴリーからのいくつかの適用が、非限定的な例としてリストされる。望ましい弾性効率のため、レジリンは、力学的エネルギーの貯蔵および回収のためのエネルギー貯蔵装置（例えば、ゴムバンド）として使用され得る。高速で隆起および陥没を越えた場合のタイヤの道路との接触をより多く維持するための、レジリンブッシングの適用によって、自動車サスペンションシステムを改善することができる。さらに、ゴルフボールのコア、テニスラケットグリップ、ゴルフクラブグリップ、および卓球ラケットを含む、異なって調整された機械特性を有するレジリンの多数のスポーツ用品適用が存在する。

本明細書中に提供されるレジリン組成物の独特の特性のため、特に関心対象の適用は、フットウェアである。インソールまたはミッドソールとして、レジリンは、接地を緩和し、接地からのエネルギーをより多く前方への推進力として回収することによって、靴の履き心地および生物学的効率を改善することができる。ミッドソールとして、レジリンは、ミッドソール全体を構成していてもよいか、またはその特性を補完するための別の材料（例えば、摩損もしくは摩耗に対して抵抗性の材料、もしくはトラクションのために調整された材料）の内部に埋め込まれていてもよい。レジリンミッドソールは、増強された性能（例えば、より柔軟な踵接地エリアおよびより堅いアーチサポート）を提供するために協調的に作用する、異なって調整された機械特性を有する複数のレジリン材料を含有していてもよい。

本明細書中で使用されるように、「密度」という用語は、試料の質量を体積で割ったものをさす。いくつかの態様において、エラストマーの密度は、気泡を排除するために水の代わりにアルコールを含む比重瓶を使用して決定され得る。いくつかの態様において、エラストマーの密度は、静水学的方法を使用して決定され得る。本明細書中で使用されるように、「圧縮体積密度」とは、試料の圧縮体積に対する試料の質量の比をさし、ここで、「圧縮体積」という用語は、ピストンシリンダテストチャンバーエンクロージャーの周囲の形に完全に一致するまで流動するよう十分な圧縮力に供された時、エラストマー試料が到達した最終平衡体積として定義される。いくつかの態様において、エラストマーの圧縮体積密度は、圧縮体積密度計を使用して決定され得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組成物は、0.5mg/cm³〜2.0mg/cm³または1.0mg/cm³〜1.5mg/cm³または1.1mg/cm³〜1.4mg/cm³または1.2mg/cm³〜1.35mg/cm³の密度または圧縮体積密度を有する。いくつかの態様において、エラストマーの密度または圧縮体積密度の決定は、ASTM D297-15 ゴム製品の化学分析のための標準試験方法（Standard Test Methods for Rubber Products-Chemical Analysis）を使用して実施され得る。

組換えレジリンベクター、組換え宿主細胞、および発酵物
組換えレジリンをコードするベクター、そのようなベクターを含む組換え宿主細胞、およびそのような組換え宿主細胞および組換えレジリンを含む発酵物が、本明細書中にさらに提供される。

いくつかの態様において、本明細書中に提供されるベクターは、N末端で分泌シグナルと融合しており、任意で、C末端でタグペプチドまたはタグポリペプチドと融合しているレジリンポリペプチドをコードする分泌型レジリンコード配列を含む。いくつかの態様において、ベクターは、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化された分泌型レジリンコード配列を含む。

適切な分泌シグナルは、本明細書中に提供される組換え宿主細胞におけるポリペプチドの分泌を媒介する分泌シグナルである。適切な分泌シグナルの非限定的な例は、サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（αMF）、ピキア・パストリスの酸性ホスファターゼ（PHO1）、および一般的なマメであるインゲンマメ（Phaseolus vulgaris）に由来するフィトヘマグルチニン（PHA-E）の分泌シグナルである。付加的な分泌シグナルは、当技術分野において公知であるか、または宿主細胞によって分泌されたタンパク質の同定、その後の分泌型タンパク質のゲノム分析および非翻訳N末端配列の同定によって同定されてもよい（例えば、Huang et al.A proteomic analysis of the Pichia pastoris secretome in methanol-induced cultures.Appl Microbiol Biotechnol.2011 Apr;90(1):235-47を参照すること）。

分泌型レジリンコード配列によってコードされたレジリンは、タグペプチドまたはタグポリペプチドとさらに融合していてもよい。タグペプチドまたはタグポリペプチドの非限定的な例には、アフィニティタグ（即ち、ある種の剤もしくはマトリックスに結合するペプチドもしくはポリペプチド）、可溶化タグ（即ち、タンパク質の適切な折り畳みを支援し、沈殿を防止するペプチドもしくはポリペプチド）、クロマトグラフィータグ（即ち、特定の分離技術の間で異なる分割を与えるためにタンパク質のクロマトグラフィー特性を変化させるペプチドもしくはポリペプチド）、エピトープタグ（即ち、抗体が結合するペプチドもしくはポリペプチド）、蛍光タグ（即ち、短波長の光によって励起された時、高波長の光を放射するペプチドもしくはポリペプチド）、発色タグ（即ち、可視光スペクトルの特定のセグメントを吸収するペプチドもしくはポリペプチド）、酵素基質タグ（即ち、特定の酵素反応の基質であるペプチドもしくはポリペプチド）、化学的基質タグ（即ち、特定の化学修飾の基質であるペプチドもしくはポリペプチド）、またはそれらの組み合わせが含まれる。適切なアフィニティタグの非限定的な例には、マルトース結合タンパク質（MBP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ポリ(His)タグ、SBPタグ、Strepタグ、およびカルモジュリンタグが含まれる。適切な可溶性タグの非限定的な例には、チオレドキシン（TRX）、ポリ(NANP)、MBP、およびGSTが含まれる。クロマトグラフィータグの非限定的な例には、ポリ陰イオン性アミノ酸（例えば、

）およびポリグルタミン酸タグが含まれる。エピトープタグの非限定的な例には、V5タグ、VSVタグ、Mycタグ、HAタグ、Eタグ、NEタグ、およびFLAGタグが含まれる。蛍光タグの非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（GFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、オレンジ色蛍光タンパク質（OFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、およびそれらの誘導体が含まれる。発色タグの非限定的な例には、GFP様タンパク質ファミリーの非蛍光メンバー（例えば、BlitzenBlue、DonnerMagenta；DNA2.0,Neward,CA）が含まれる。酵素基質タグの非限定的な例には、ビオチン化に適したリジンを配列内に含むペプチドまたはポリペプチド（例えば、AviTag、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質［BCCP］）が含まれる。化学的基質タグの非限定的な例には、FIAsH-EDT2との反応に適した基質が含まれる。C末端のペプチドまたはポリペプチドのレジリンとの融合は、（例えば、TEVプロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子、もしくはエンテロペプチダーゼによって）切断可能であってもよいか、または非切断可能であってもよい。

いくつかの態様において、ベクターは、1つの分泌型レジリンコード配列を含む。他の態様において、ベクターは、2つまたはそれ以上（例えば、3つ、4つ、または5つ）の分泌型レジリンコード配列を含む。いくつかのそのような態様において、分泌型レジリンコード配列は、同一である。他のそのような態様において、分泌型レジリンコード配列のうちの少なくとも2つは、同一でない。分泌型レジリンコード配列のうちの少なくとも2つが同一でない態様において、少なくとも2つの分泌型レジリンコード配列は、それらがコードするレジリンおよび/または分泌シグナルおよび/または任意のタグペプチドもしくはタグポリペプチドにおいて相互に異なっていてよい。

いくつかの態様において、ベクターは、分泌型レジリンコード配列の発現を駆動するよう、分泌型レジリンコード配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。いくつかの態様において、誘導性プロモーターの誘導は、グルコース抑制、ガラクトース誘導、ショ糖誘導、リン酸抑制、チアミン抑制、またはメタノール誘導を介して起こる。適切なプロモーターには、本明細書中に提供される組換え宿主細胞においてタンパク質の発現を媒介するプロモーターが含まれる。適切なプロモーターの非限定的な例には、AOX1プロモーター、GAPプロモーター、LAC4-PBIプロモーター、T7プロモーター、TACプロモーター、GCW14プロモーター、GAL1プロモーター、λPLプロモーター、λPRプロモーター、βラクタマーゼプロモーター、spaプロモーター、CYC1プロモーター、TDH3プロモーター、GPDプロモーター、TEF1プロモーター、ENO2プロモーター、PGL1プロモーター、SUC2プロモーター、ADH1プロモーター、ADH2プロモーター、HXT7プロモーター、PHO5プロモーター、およびCLB1プロモーターが含まれる。分泌型レジリンコード配列の発現を容易にするために使用され得る付加的なプロモーターは、当技術分野において公知である。

いくつかの態様において、ベクターは、分泌型レジリンコード配列の転写の終結をもたらすよう、分泌型レジリンコード配列に機能的に連結されたターミネーターを含む。適切なターミネーターには、本明細書中に提供される組換え宿主細胞において転写を終結させるターミネーターが含まれる。適切なターミネーターの非限定的な例には、AOX1ターミネーター、PGK1ターミネーター、およびTPS1ターミネーターが含まれる。分泌型レジリンコード配列の転写の終結をもたらす付加的なターミネーターは、当技術分野において公知である。

ベクターが2つもしくはそれ以上のレジリンコード配列を含む態様において、2つもしくはそれ以上のレジリンコード配列は、同一のプロモーターおよび/もしくはターミネーターに機能的に連結されていてもよいか、または2種類もしくはそれ以上の異なるプロモーターおよび/もしくはターミネーターに機能的に連結されていてもよい。

本明細書中に提供されるベクターは、組換え宿主細胞におけるベクターの繁殖に適した要素をさらに含んでいてよい。そのような要素の非限定的な例には、細菌複製開始点および選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー）が含まれる。細菌複製開始点および選択マーカーは、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、選択マーカーは、薬物耐性マーカーである。薬物耐性マーカーは、そうでなければ細胞を死滅させるであろう外因的に添加された薬物を細胞が解毒することを可能にする。薬物耐性マーカーの例示的な例には、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Zeocin（商標）等のような抗生物質に対する耐性に関するものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、選択マーカーは、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーは、必須成分を欠く培地において増殖させられる間、細胞がその必須成分（一般的には、アミノ酸）を合成することを可能にする。選択可能な栄養要求性遺伝子配列には、例えば、ヒスチジノールの存在下でヒスチジンを含まない培地における増殖を可能にするhisDが含まれる。本発明のベクターに適した他の選択マーカーには、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子、AURI遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。

本発明のベクターは、宿主細胞のゲノム内の特定の位置への分泌型レジリンコード配列の組み込みを指示するターゲティング配列をさらに含んでいてよい。そのようなターゲティング配列の非限定的な例には、宿主細胞のゲノムに存在するヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの態様において、ターゲティング配列は、宿主細胞のゲノム内の反復要素と同一である。いくつかの態様において、ターゲティング配列は、宿主細胞のゲノム内の転位要素と同一である。

いくつかの態様において、本明細書中に記載されたベクターを含む組換え宿主細胞が、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、例えば、相同組換えまたは標的組込みを介して、組換え宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に安定的に組み込まれる。ゲノム組み込みのために適した部位の非限定的な例には、サッカロミセス・セレビシエゲノム内のTy1遺伝子座、ピキア・パストリスゲノム内のrDNA遺伝子座およびHSP82遺伝子座、ならびに組換え宿主細胞のゲノム全体に散在するコピーを有する転位要素が含まれる。他の態様において、ベクターは、組換え宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込まれず、染色体外に存在する。

組換え宿主細胞は、哺乳類、植物、藻類、真菌、または微生物を起源とするものであり得る。適切な真菌の非限定的な例には、メチロトローフ酵母、糸状酵母、アークスラ・アデニニボランス、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、アワモリコウジカビ（Aspergillus niger var.awamori）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、カンジダ・エチェルシー（Candida etchellsii）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、カンジダ・フミリス（Candida humilis）、カンジダ・リポリチカ、カンジダ・プソイドトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、トルラ酵母（Candida utilis）、カンジダ・バーサティリス（Candida versatilis）、デバリオミセス・ハンゼニー（Debaryomyces hansenii）、クリ胴枯病菌（Endothia parasitica）、エレモテシウム・アシュビー（Eremothecium ashbyii）、フザリウム・モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）、モルテイレラ・ビナソー・ラフィノセウチライザー変種（Morteirella vinaceae var.raffinoseutilizer）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ムコール・ミエヘイ・クーニー・エト・エマーソン変種（Mucor miehei var. Cooney et Emerson）、ムコール・プシルス・リンツ（Mucor pusillus Lindt）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roquefortii）、ピキア・メタノリカ、ピキア・パストリス（コマガテラ・ファフィー）、ピキア（シェフェルソミセス）スチピチス、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロミセス・ベティカス（Saccharomyces beticus）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ケバリエリ（Saccharomyces chevalieri）、サッカロミセス・ジアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Saccharomyces ellipsoideus）、サッカロミセス・エクシグース（Saccharomyces exiguus）、サッカロミセス・フロレンティヌス（Saccharomyces florentinus）、サッカロミセス・フラギリス（Saccharomyces fragilis）、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、サッカロミセス・サケ（Saccharomyces sake）、サッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、スポリジオボラス・ジョンソニー（Sporidiobolus johnsonii）、スポリジオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus salmonicolor）、スポロボロミセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesi）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、ヤロウイア・リポリチカ、ザイゴサッカロミセス・ロウキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、ならびにそれらの誘導体および交雑種が含まれる。

適切な微生物の非限定的な例には、アセトバクター・スボキシダンス（Acetobacter suboxydans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Actinoplane missouriensis）、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アースロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクチス・ランセフィールド（Lactococcus lactis Lancefield）N群、ロイコノストック・シトロボルム（Leuconostoc citrovorum）、ロイコノストック・デキストラニカム（Leuconostoc dextranicum）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）NRRL B-512(F)株、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Micrococcus lysodeikticus）、スピルリナ（Spirulina）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・ラクチス（Streptococcus lactis）、ストレプトコッカス・ラクチス亜種ジアセチラクチス（Streptococcus lactis subspecies diacetylactis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトマイセス・チャッタノオゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・ナタレンシス（Streptomyces natalensis）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）、ストレプトマイセス・ルビギノサス（Streptomyces rubiginosus）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ならびにそれらの誘導体および交雑種が含まれる。組換え宿主細胞として使用され得る追加の株は、当技術分野において公知である。「組換え宿主細胞」という用語は、特定の主細胞のみならず、そのような細胞の子孫もさすものであることが理解されるべきである。変異または環境影響のいずれかのため、ある種の改変が後続世代において起こり得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない可能性があるが、それでも本明細書中で使用されるように「組換え宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、本明細書中に提供される組換えレジリンの産生を改善する遺伝子改変を含む。そのような遺伝子改変の非限定的な例には、変化したプロモーター、変化したキナーゼ活性、変化したタンパク質折り畳み活性、変化したタンパク質分泌活性、変化した遺伝子発現誘導経路、および変化したプロテアーゼ活性が含まれる。

本明細書中に提供される組換え宿主細胞は、本明細書中に提供されるベクターを用いて適切な起源の細胞を形質転換することによって生成される。そのような形質転換のためのベクターは、環状であってもよいかまたは直鎖状であってもよい。ベクターを含む組換え宿主細胞形質転換体は、例えば、細胞の増殖の可否による選択を可能にする、ベクターによってコードされた薬物耐性マーカーもしくは栄養要求性マーカーを発現させることによって、またはその他の手段（例えば、ベクターに含まれる発光ペプチドの検出、例えば、制限酵素マッピング、PCR増幅、もしくは単離された染色体外ベクターもしくは染色体組み込み部位の配列分析による個々の組換え宿主細胞コロニーの分子的分析）によって容易に同定され得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換え宿主細胞は、高力価の本明細書中に提供される組換えレジリンを産生することができる。いくつかのそのような態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、4mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、6mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、8mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、12mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、14mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、16mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、18mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、25mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回るか；2〜40、30、20、10、もしくは5mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；5〜40、30、20、もしくは10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；10〜40、30、もしくは20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；20〜40もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；または30〜40mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間の速度で組換えレジリンを産生する。他のそのような態様において、組換え宿主細胞は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、4mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、6mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、8mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、12mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、14mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、16mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、18mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、25mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回るか；2〜40、30、20、10、もしくは5mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；5〜40、30、20、もしくは10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；10〜40、30、もしくは20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；20〜40もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；または30〜40mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間の速度で組換えレジリンを分泌する。産生された組換えレジリンの同一性は、HPLC定量化、ウエスタンブロット分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、二次元質量分析（2D-MS/MS）配列同定によって確認され得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される組換え宿主細胞は、本明細書中に提供される組換えレジリンの高い分泌型画分を有する。いくつかのそのような態様において、組換え宿主細胞は、組換えレジリンの分泌画分を有し、該分泌画分が、50％超、60％超、70％超、80％超、もしくは90％超であるか；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；90％〜100％もしくは90％；または90％〜100％である。

組換えレジリンの産生および分泌は、組換え宿主細胞に含まれる分泌型レジリンコード配列のコピーの数および/または組換え宿主細胞に含まれる分泌型レジリンコード配列の転写の速度によって影響され得る。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、1つの分泌型レジリンコード配列を含む。他の態様において、組換え宿主細胞は、2つまたはそれ以上（例えば、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上）の分泌型レジリンコード配列を含む。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、強力なプロモーターに機能的に連結された分泌型レジリンコード配列を含む。強力なプロモーターの非限定的な例には、ピキア・パストリスのpGCW14プロモーターが含まれる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、中程度のプロモーターに機能的に連結された分泌型レジリンコード配列を含む。そのような中程度のプロモーターの非限定的な例には、ピキア・パストリスのpGAPプロモーターが含まれる。いくつかの態様において、組換え宿主細胞は、弱いプロモーターの調節下でレジリンをコードするコード配列を含む。

本明細書中に提供される発酵物は、本明細書中に記載された組換え宿主細胞と、組換え宿主細胞を増殖させるのに適した培養用培地とを含む。

前記発酵物は、細胞の生存および/または増殖ならびに組換えレジリンの分泌のために組換え宿主細胞が必要とする栄養素を提供する培養用培地において、組換え宿主細胞を培養することによって得られる。そのような培養用培地は、典型的には、過剰の炭素源を含有している。適切な炭素源の非限定的な例には、単糖、二糖、多糖、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な単糖の非限定的な例には、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リボース、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な二糖の非限定的な例には、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な多糖の非限定的な例には、ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、グリカン、セルロース、キチン、およびそれらの組み合わせが含まれる。

いくつかの態様において、発酵物は、重量で全発酵物の少なくとも1％、5％、10％、20％、もしくは30％；1％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、もしくは10％；10％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、もしくは20％；20％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、もしくは30％；30％〜100％、90％、80％、70％、60％、50％、もしくは40％；40％〜100％、90％、80％、70％、60％、もしくは50％；50％〜100％、90％、80％、70％、もしくは60％；60％〜100％、90％、80％、もしくは70％；70％〜100％、90％、もしくは80％；80％〜100％もしくは90％；または90％〜100％の量の組換えレジリンを含む。

いくつかの態様において、発酵物は、少なくとも2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、もしくは30g/L；2g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、30g/L、20g/L、もしくは10g/L；10g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、30g/L、もしくは20g/L；20g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、もしくは30g/L；30g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、もしくは40g/L；40g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、もしくは50g/L；50g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、70g/L、もしくは60g/L；60g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、80g/L、もしくは70g/L；70g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、90g/L、もしくは80g/L；80g/L〜300g/L、200g/L、100g/L、もしくは90g/L；90g/L〜300g/L、200g/L、もしくは100g/L；100g/L〜300g/Lもしくは200g/L；または200g/L〜300g/Lの量の組換えレジリンを含む。

方法
本明細書中に記載された組換えレジリンの作製の方法が、さらに本明細書中に提供される。

前記方法は、一般に、他に示されない限り、当技術分野において周知の従来の方法によって、本明細書全体に引用され記述される様々な一般的な参照およびより具体的な参照に記載されたように実施される。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992,and Supplements to 2002）；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1990；Taylor and Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press,2003；Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I,CRC Press,1976；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol II,CRC Press,1976；Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999を参照すること。

いくつかの態様において、宿主細胞から細胞外にレジリンを分泌するために新規の方法が用いられる。いくつかの態様において、方法は、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを構築する工程（図2の工程1001）、ベクターを宿主細胞中で形質転換する工程（図2の工程1002）、および、次いで、レジリンを細胞外に分泌するよう組換え宿主細胞を培養する工程（図2の工程1003）を含む。いくつかの態様において、方法は、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、4mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、6mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、8mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、12mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、14mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、16mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、18mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、25mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間、もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回るか；2〜40、30、20、10、もしくは5mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；5〜40、30、20、もしくは10mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；10〜40、30、もしくは20mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；20〜40もしくは30mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間；または30〜40mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間の速度でレジリンを細胞外に分泌させることを含む。いくつかの態様において、次いで、分泌型レジリンが精製され（図2の工程1004）、精製されたレジリンがエラストマーを形成するよう架橋される（図2の工程1005）。いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法は、本明細書中に提供される組換え宿主細胞を得るために、本明細書中に提供されるベクターを用いて細胞を形質転換する工程（図2の工程1002）を含む。ベクターを用いて細胞を形質転換するための方法は、当技術分野において周知である。そのような方法の非限定的な例には、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、リポソームトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション）、カチオン性ポリマートランスフェクション、電気穿孔、セルスクイージング（cell squeezing）、ソノポレーション（sonoporation）、光学（optical）トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（impalefection）、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション（magnetofection）、およびウイルス形質導入が含まれる。当業者は、ベクターを導入するためのある種の技術が、ある種の型の細胞のためによりよく機能するという当技術分野における知識に基づき、本明細書中に提供されるベクターを用いて細胞を形質転換するために適した1種類または複数種類の方法を選択することができる。

いくつかの態様において、方法は、本明細書中に提供される発酵物を得るのに適した条件下で、本明細書中に提供される組換え宿主細胞を培養用培地中で培養する工程（図2の工程1003）をさらに含む。いくつかの態様において、条件および培養用培地は、組換え宿主細胞からの組換えタンパク質の培養用培地中への分泌を容易にするのに適したものである。これらの方法における使用に適した培養用培地は、当技術分野において公知であり、適切な培養条件も同様である。酵母宿主細胞の培養の例示的な詳細は、Idiris et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.86:403-417,2010；Zhang et al.,Biotechnol.Bioprocess.Eng.5:275-287,2000；Zhu,Biotechnol.Adv.30:1158-1170,2012；Li et al.,MAbs 2:466-477,2010に記載されている。

いくつかの態様において、方法は、本明細書中に提供される組換えレジリンを得るために、本明細書中に提供される発酵物から、分泌型組換えレジリンを精製する工程（図2の工程1004）をさらに含む。精製は、発酵物から分泌型タンパク質を精製するための当技術分野において公知の多様な方法によって行われ得る。そのような方法における一般的な工程には、（細胞を除去するための）遠心分離、その後の沈殿剤またはその他の適切なコスモトロープ（cosmotropes）（例えば、硫酸アンモニウム）を使用したタンパク質の沈殿が含まれる。次いで、沈殿したタンパク質を、遠心分離によって上清から分離し、溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水［PBS］）に再懸濁させることができる。溶解した塩を除去するために、懸濁したタンパク質を透析することができる。さらに、透析されたタンパク質を、他のタンパク質を変性させるために加熱することができ、変性タンパク質を遠心分離によって除去することができる。任意で、精製された組換えレジリンをコアセルベート（coacervated）することができる。

様々な態様において、発酵物から分泌型組換えタンパク質を精製する方法は、尿素またはチオシアン酸グアニジンのような公知のカオトロープによって、細胞ブロス全体または細胞ペレットにおいてタンパク質を可溶化する工程と共に、様々な遠心分離工程を含み得る。

いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法は、本明細書中に提供される組換えレジリン組成物を得るために組換えレジリンを架橋する工程（図2の工程1005）をさらに含む。タンパク質を架橋するための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、架橋は、（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを使用した）酵素的架橋を介して達成される。他の態様において、架橋は、光化学的架橋を介して達成される（例えば、Elvin CM,Carr AG,Huson MG,Maxwell JM,Pearson RD,Vuocolo T,Liyou NE,Wong DCC,Merritt DJ,Dixon NE.Nature 2005,437,999-1002；Whittaker JL,Dutta NK,Elvin CM,Choudhury NR.Journal of Materials Chemistry B 2015,3,6576-79；Degtyar E,Mlynarczyk B,Fratzl P,Harrington MJ.Polymer 2015,69,255-63を参照すること）。いくつかの態様において、架橋は、化学的架橋を介して達成される（例えば、Renner JN,Cherry KM,Su RSC,Liu JC.Biomacromolecules 2012,13,3678-85；Charanti,MB,Ifkovits,JL,Burdick,JA,Linhardt JG,Kiick,KL.Soft Matter 2009,5,3412-16；Li LQ,Tong ZX,Jia XQ,Kiick KL.Soft Matter 2013,9,665-73；Li L,Mahara A,Tong Z,Levenson EA,McGann CL,Jia X,Yamaoka T,Kiick KL.Advanced Healthcare Materials 2016,5,266-75を参照すること）。いくつかの態様において、架橋は、チロシン残基を介して達成される。他の態様において、架橋は、リジン残基を介して達成される。いくつかの態様において、架橋は、システイン残基を介して達成される。いくつかの態様において、架橋は、トランスグルタミナーゼを用いる（例えば、Kim Y,Gill EE,Liu JC.Enzymatic Cross-Linking of Resilin-Based Proteins for Vascular Tissue Engineering Applications.Biomacromolecules.17(8):2530-9を参照すること）。いくつかの態様において、架橋は、ポリ(エチレングリコール)（PEG）を用いる（McGann CL,Levenson EA,Kiick KL.Macromol.Chem.Phys.2013,214,203-13；McGann CL,Akins RE,Kiick KL.Resilin-PEG Hybrid Hydrogels Yield Degradable Elastomeric Scaffolds with Heterogeneous Microstructure.Biomacromolecules.2016;17(1):128-40）。いくつかの態様において、架橋は、得られた組換えレジリン組成物が特定の形または形態を有するよう、容器または金型において行われる。

実施例1:組換えレジリンを分泌するピキア・パストリス組換え宿主細胞の生成
分泌型レジリンコード配列を含むベクターを用いてGS115（NRRL Y15851）ピキア・パストリス（コマガテラ・ファフィー）のHIS+誘導体を形質転換することによって、組換えレジリンを分泌するピキア・パストリス組換え宿主細胞を生成した。

前記ベクターは各々、N末端分泌シグナル（α接合因子リーダー配列およびプロ配列）とインフレームで融合している3つのレジリンコード配列を含み、いくつかの場合において、C末端3×FLAGタグ（SEQ ID NO:45）を含んでいた（図3を参照すること）。分泌型レジリンコード配列の各々には、プロモーター（pGCW14）およびターミネーター（tAOX1 pAシグナル）が隣接していた。ベクターは、ピキア・パストリスゲノムのHSP82遺伝子座への3つの分泌型レジリンコード配列の組み込みを指示することができるターゲティング領域、細菌および酵母の形質転換体の選択のための優性耐性マーカー、ならびに細菌複製開始点をさらに含んでいた。

レジリンコード配列は、科学文献および公の配列データベースの検索から得られた。ヌクレオチド配列をアミノ酸配列へ翻訳し、次いで、コドン最適化した。全長レジリン配列および短縮型レジリン配列の両方を選択した。選択された分泌型レジリンコード配列は、表1にリストされる。

（表１）例示的な全長および短縮型のレジリンのアミノ酸配列ならびに組換え宿主株

組み込まれた各分泌型レジリンコード配列の3コピーを含む宿主株を生成するために、電気穿孔を使用してベクターをピキア・パストリス中で形質転換した。形質転換体を、抗生物質が補足されたYPD寒天プレートに播種し、30℃で48時間インキュベートした。

各最終形質転換由来のクローンを96穴ブロックにおいて400μLの緩衝グリセロール複合培地（BMGY）に接種し、1,000rpmで撹拌しながら30℃で24時間インキュベートした。試料を取り出し、遠心分離を介して組換え宿主細胞をペレット化し、上清を回収し、クーマシーゲルを介したレジリン含量の分析および（3×FLAGタグを含むポリペプチドについての）ウエスタンブロット分析のため、SDS-PAGEゲル上で実行した。FLAGタグ付きタンパク質については、残りの培養物を、ELISA測定のため、デュプリケートで最少培地培養物に接種するために使用した。1デュプリケートをペレット化し、上清を直接測定した。第2のデュプリケートをチオシアン酸グアニジンによって抽出し、細胞内画分および細胞外画分の両方を測定した。

図4Bおよび図4Cに示されるように、多数の種に由来する組換えレジリンが、ピキア・パストリス組換え宿主細胞において成功裡に発現された（注：いくつかのタンパク質は塩基性残基をほとんど有しておらず、従って、クーマシーによって検出するのは困難であるが、ウエスタンにおいてはシグナルを有する）。図4Aに示されるように、組換え宿主細胞は、産生された組換えレジリンを90％も分泌した。

実施例2：組換えレジリンを発現および分泌するピキア・パストリス組換え宿主細胞の産生量の測定
産生量を測定するために、各組換え宿主細胞の3つのクローンを、96穴スクエアウェルブロックにおいて400μLのBMGYに接種し、1,000rpmで撹拌しながら30℃で48時間インキュベートした。48時間のインキュベーションの後、4μLの各培養物を、96穴スクエアウェルブロックにおいて400μLの最少培地に接種するために使用し、次いで、それを1,000rpmで撹拌しながら30℃で48時間インキュベートした。400uLの5Mチオシアン酸グアニジンを培養物に添加し、混合物を遠心分離によってペレット化した。上清を保存し、ペレットを800μLの2.5Mチオシアン酸グアニジンに再懸濁させた。再懸濁した細胞をビーズを使用して物理的に溶解し、溶解された細胞混合物を、遠心分離によってペレット化し、上清を保存した。各画分のレジリンの濃度を、3×FLAGエピトープを定量化する直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）分析によって決定した（図5Aおよび図5B）。

実施例3：組換えレジリンの精製
非FLAGタグ付きのDs_ACBポリペプチドおよびAe_Aポリペプチドを、精製および架橋のために選択した。（Ds_ACBを発現する）RMs1221株および（Ae_Aを発現する）RMs1224株を、300rpmで撹拌しながら、30℃で48時間、フラスコにおいて500mLのBMGYにおいて増殖させた。

精製のためのプロトコールは、Lyons et al.(2007)から改作された。遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を収集した。硫酸アンモニウムの添加によって、タンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を、少量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁させ、再懸濁した試料をPBSに対して透析して塩を除去した。次いで、透析された試料を、ネイティブタンパク質を変性させるために加熱し、変性タンパク質を遠心分離によって除去した。保持された上清は、精製されたレジリンポリペプチドを含有していた。任意で、保持された上清を冷却して、濃縮された下相および希薄な上相をもたらすコアセルベーションを引き起こした。

図6に示されるように、Ae_Aは、比較的純粋な形態で得られ、Ds_ACBは、70kDa、50kDa、および25kDaの3本のバンドを生じた。

実施例4：精製され分泌された組換えレジリンの架橋
濃縮されたDs_ACBレジリンを、2種類の方法：（Elvin et al.2005から改作された）光架橋および（Qin et al.2009から改作された）酵素的架橋のうちの1種類を介して架橋した。

光架橋のため、レジリンタンパク質を、過硫酸アンモニウムおよびトリス(ビピリジン）ルテニウム(II)（[Ru(bpy)3]2+）と混合した。混合物を明るい白色光に曝すと、その後、混合物はゴム状固体を形成した。

酵素的架橋のため、レジリンタンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）および過酸化水素と混合した。混合物を37℃でインキュベートすると、その後、混合物はゴム状固体を形成した。

実施例5：組換えレジリンのブロックの作製
（Ds_ACBレジリンを発現する）RMs1221株を、より大量のタンパク質を作製するために、2つの2L発酵槽において実行した。

1VVMの気流および700rpmの最小撹拌で、30℃に調節された撹拌発酵容器において、出発供給材料としての15g/Lのグルコースおよび1g/L L81消泡剤を含む最少基礎塩培地において、株を増殖させた。水酸化アンモニウムのオンデマンドの添加によって、発酵物のpHを5に調節した。バッチグルコースが枯渇すると、酸素取り込み速度120mモル/L/時間を維持するために設計されたプログラムされた供給レシピを介して、グルコースを添加し、温度を25℃に減少させ、溶存酸素を20％に維持した。約700〜800 ODの細胞密度で、70時間後、発酵物を採集した。

前記タンパク質を、実施例3に記載されたように精製し、実施例4に記載されたように酵素的架橋のための試薬と組み合わせた。架橋混合物を、小型の円筒形、長方形、球状、および靴形の金型に充填し、37℃で最終的にインキュベートした。得られた組換えレジリン固体は、図7に示される。

実施例6：レジリン固体の材料試験
実施例5に記載されたようにして作製されたレジリンシリンダを、レオメータを使用した圧縮試験に供した。組換えレジリンシリンダは、破壊されることなく、7.3mmの初期高さ（平均幅5.4mm）から0.66mm未満に圧縮され得た。図8に示されるように、シリンダは、圧縮加重の開放によって、6.7mmの高さ（平均幅5.6mm）に復帰した。

実施例7：細胞ブロス全体から全長組換えレジリンを回収するための方法
前記の実施例1に従って、3×FLAGタグを有する株（RMs1209）および3×FLAGタグを有さない株（RMs1221）において作製されたDs_ACB（SEQ ID NO:1）を精製するために、様々な回収および分離の技術を使用した。

第1の試料のセットは、第1の細胞のペレットおよび第1の上清を作製するために、細胞ブロス全体を遠心分離し、透明な細胞ブロスを作製するために、第1の上清を抽出することによって調製された。次いで、第1の上清を、硫酸アンモニウムを使用して沈殿させ、第2のペレットおよび第2の上清を作製するために、遠心分離し、第2の上清を廃棄した。次いで、第2のペレットを、透析のため、PBSに再懸濁させた。次いで、高温で安定しているDs_ACB以外のタンパク質を変性させるために、透析された溶液を高温に供した。透析された変性した溶液を遠心分離することによって、変性タンパク質を除去し、第3のペレットおよび第3の上清を作製した。変性した溶液からの第3の上清を保持し、次いで、Ds_ACBを含有している密な下層および上層への相分離を誘導するために、第3の上清を冷却することによってコアセルベートした。これらの試料は、下記表2および本明細書中で「CCB」試料と呼ばれる。いくつかのCCB試料においては、下層を保持し、さらなる相分離を誘導するために、下層を低温でインキュベートすることによって、複数回のコアセルベーションを実施した。これらのCCB試料は、それぞれ、下記表2および本明細書中で「第1のコアセルベーション」試料および「第2のコアセルベーション」試料と呼ばれる。

第2の試料のセットは、細胞および細胞に近位の（例えば、細胞に接着している、細胞の表面上にある）タンパク質および/または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集物）の第1のペレットと、第1の上清とを作製するために、細胞ブロス全体を遠心分離し、次いで、第1のペレットを得るために、第1の上清を廃棄することによって調製された。第1のペレットを、Ds_ACBを可溶化するために、チオシアン酸グアニジンに再懸濁させた。再懸濁物を再び遠心分離して、第2のペレットおよび第2の上清を作製した。次いで、第2の上清をPBSに対して透析し、Ds_ACB以外のタンパク質を変性させるために、高温に供し、第3のペレットおよび第3の上清を作製するために、遠心分離した。第3の上清を、Ds_ACBを含有している密な下層および上層への相分離を与えるための冷却によるコアセルベーションに供した。これらの試料は、下記表2および本明細書中で「ゲル層」試料と呼ばれる。いくつかのゲル層試料においては、下層を保持し、さらなる相分離を誘導するために、より低い温度で下層をインキュベートすることによって、複数回のコアセルベーションを実施した。これらのゲル層試料は、下記表2および本明細書中で「第1のコアセルベーション」試料および「第2のコアセルベーション」試料と呼ばれる。

第3の試料のセットは、ペレットおよび上清を作製するために細胞ブロス全体を遠心分離し、次いで、細胞および細胞に近位の（例えば、細胞に接着している、細胞の表面上にある）タンパク質および/または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集物）のペレットを得るために、上清を廃棄することによって調製された。細胞に近位のタンパク質を可溶化するために、細胞のペレットを、チオシアン酸グアニジンに再懸濁させた。再懸濁物を再び遠心分離して、第2の細胞のペレットおよび第2の上清を作製した。次いで、第2の上清を硫酸アンモニウムによって沈殿させ、第3のペレットおよび第3の上清を作製するために、遠心分離した。第3のペレットをチオシアン酸グアニジンに懸濁させ、次いで、PBSに対して透析し、Ds_ACB以外のタンパク質を変性させるために、高温に供し、第4の上清および第4のペレットを作製するために、遠心分離した。次いで、第4の上清を、相分離を与えるための冷却によるコアセルベーションに供した。これらの試料は、下記表2および本明細書中で「沈殿ゲル層」試料と呼ばれる。

単一の試料は、タンパク質を可溶化するために、細胞ブロス全体に尿素を添加し、次いで、第1のペレットおよび第1の上清を作製するために、細胞ブロス全体を遠心分離することによって作製された。次いで、第1の上清を、硫酸アンモニウムを使用して沈殿させ、第2のペレットおよび第2の上清を作製するために、遠心分離した。第2の上清を廃棄し、次いで、第2のペレットをチオシアン酸グアニジンに再懸濁させ、PBSに対して透析し、次いで、Ds_ACB以外のタンパク質を変性させるために、高温に供し、第3のペレットおよび第3の上清を作製するために、再び遠心分離した。次いで、Ds_ACBを含有している密な下層および上層への相分離を誘導するために、第3の上清を冷却することによって、第3の上清をコアセルベートした。この試料は、下記表2および本明細書中で「尿素WCBE」試料と呼ばれる。

別の単一の試料は、第1のペレットおよび第1の上清を作製するために、細胞ブロス全体を遠心分離し、次いで、細胞および細胞に近位の（例えば、細胞に接着している、細胞の表面上にある）タンパク質および/または不溶性タンパク質（例えば、タンパク質凝集物）の第1のペレットを得るために、第1の上清を廃棄することによって調製された。細胞の第1のペレットを、タンパク質を可溶化するために、チオシアン酸グアニジンに再懸濁させた。再懸濁物を、第2の細胞のペレットおよび第2の上清を作製するために、再び遠心分離した。次いで、第2の上清をPBSに対して透析し、次いで、タンパク質の重い相、上清の軽い相、および軽い相から重い相を分離するフィルムを作製するために、遠心分離した。次いで、軽い相およびフィルムを廃棄することによって、タンパク質の重い相を単離した。この試料は、下記表2および本明細書中で「高密度層」試料と呼ばれる。

表2（下記）は、図9に示されたゲルにおいて見られた分解の相対量と共に、株および回収技術の様々な組み合わせをリストする。図9に示されるように、試料E、F、G、K、およびLは、およそ110kDaにバンドを示し、より低い分子量に最小のまたは弱いバンドを示した（表2中で「最小」と表記された）。試料A、B、C、D、G、I、およびJは、およそ90kDa、30kDa、22kDa、17kDa、および12kDaのバンドに対応する分解生成物を有していた（表2中で「実質的」と表記された）。これらのうち、試料AおよびIは、全長レジリンの存在を示す、およそ110kDaのバンドも示した。従って、「ゲル層」試料は、全長レジリンを作製したが、CCB試料は、時には、全長レジリンに加えて（例えば、試料A）または全長レジリンなしで（例えば、試料CおよびD）、分解生成物を作製した。尿素WCBE試料は、分解生成物のみを作製した。CCB/沈殿ゲル層は、CCB精製方法およびゲル層精製方法の両方からの単離された材料の組み合わせを示す。

（表２）全長レジリンおよび分解生成物をもたらす回収方法からの試料

試料A、I、E、F、G、K、およびLにおいて示された110kDaバンドが全長レジリン（SEQ ID NO:1）に相当することを確証するために、（図9中で矢印によって示された）試料Hの110kDaバンドを切り出し、エドマン分解によるN末端配列決定に送った。エドマン分解は、アミノ酸残基が1つずつ切断され、クロマトグラフィーによって同定される、周期的な手法である。周期的な手法の中に、三つの工程が存在する。工程1において、アルカリ性条件下で、PITC試薬がN末端アミノ基にカップリングされる。工程2において、N末端残基が酸性媒体において切断される。工程3において、PITCとカップリングした残基が、フラスコに移され、PTH残基に変換され、HPLCクロマトグラフィーによって同定される。次いで、次のN末端残基の同定のため、次のサイクルが開始される。エドマン分解分析は、Shimadazu PPSQ-33配列決定機およびPVDF膜において実施された。

図10は、後に切断されるシグナル配列と共に発現する全長セイシェルショウジョウバエレジリン配列（Ds_ACB）を示す。最初の配列（イタリック体）は、シグナルペプチターゼによって転写後に2回切断され、その後、Kex2によって切断されるα接合因子前駆体タンパク質シグナル配列（SEQ ID NO:46）である。2番目の配列（太字）は、Ste13によって切断されるEAEAリピート（SEQ ID NO:47）である。3番目の配列（小文字）は、セイシェルショウジョウバエ全長レジリン（SEQ ID NO:1）に相当する。4番目の配列（太字イタリック体）は、リンカー配列（SEQ ID NO:46）に相当する。5番目の配列（下線）は、3×FLAGタグ（SEQ ID NO:45）に相当する。

エドマン配列決定は、およそ110kDaのバンドのタンパク質配列のN末端が、全長セイシェルショウジョウバエレジリン配列に相当することを確認した。具体的には、N末端配列決定は、N末端が、EAEAリピートを含む全長セイシェルショウジョウバエレジリン配列「EAEA」またはEAEAリピートを含まない全長セイシェルショウジョウバエレジリン配列「GRPE」のいずれかに相当することを示した。

実施例8：架橋したレジリンの安定性の定量化
変動するレベルの分解生成物および全長レジリンを含む、実施例7に記載された方法によって生成されたレジリン試料を、前記の実施例4に関して記載されたような酵素的架橋に供した。毎日の観察を通して、各架橋した試料が固体であり続ける持続期間を決定することによって、架橋した試料の安定性を経時的に査定した。表3は、各架橋した試料についての固体としての期間を示す。表3に示されるように、全長レジリンを含む試料は、全長レジリンを含まない試料より長い安定性持続時間を有していた。

（表３）架橋したレジリンの安定性

追加の考察
本開示の態様の上記の説明は、例示の目的のために提示されており；網羅的なものではなく、開示された正確な形態に特許請求の範囲を限定するためのものでもない。関連技術分野の当業者は、前記の開示を考慮すれば多くの改変および変動が可能であることを理解することができる。

本明細書中で使用された言語は、読みやすさおよび教示の目的のために主に選択されており、本発明の主題の境界を示すかまたは制限するために選択されていない。従って、本開示の範囲は、この詳細な説明によってではなく、本開示に基づく適用に関して発行される特許請求の範囲によって限定されるものとする。従って、態様の開示は、例示的であり、特許請求の範囲において示される本発明の範囲を限定するためのものではない。

配列一覧

Claims (68)

1. 発酵物中で組換え宿主細胞の集団を培養する工程であって、該組換え宿主細胞が、分泌型レジリンコード配列を含むベクターを含み、かつ該組換え宿主細胞が、該分泌型レジリンコード配列によってコードされた組換えレジリンタンパク質を分泌する、該工程；および
   該発酵物から該組換えレジリンタンパク質を精製する工程
   を含む、組換えレジリンタンパク質を含む組成物を作製するための方法。
2. 前記組換えレジリンタンパク質が、全長または短縮型のネイティブレジリンである、請求項1に記載の方法。
3. 前記ネイティブレジリンが、セイシェルショウジョウバエ（Drosophila sechellia）、パナマハキリアリ（Acromyrmex echinatior）、ヤンマ（Aeshna）、ノサシバエ（Haematobia irritans）、ネコノミ（Ctenocephalides felis）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）、ミツバチ（Apis mellifera）、キョウソヤドリコバチ（Nasonia vitripennis）、コロモジラミ（Pediculus humanus corporis）、ガンビアハマダラカ（Anopheles gambiae）、グロッシーナ・モーシタンス（Glossina morsitans）、アッタ・セファロテス（Atta cephalotes）、アノフェレス・ダーリンジ（Anopheles darlingi）、エンドウヒゲナガアブラムシ（Acyrthosiphon pisum）、クロショウジョウバエ（Drosophila virilis）、キリシマキノコショウジョウバエ（Drosophila erecta）、スナバエ（Lutzomyia longipalpis）、オオサシガメ（Rhodnius prolixus）、ヒアリ（Solenopsis invicta）、ネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus）、ウリミバエ（Bactrocera cucurbitae）、およびトリコグラムマ・プレチオスム（Trichogramma pretiosum）からなる群より選択される生物に由来する、請求項1に記載の方法。
4. 前記組換えレジリンタンパク質がSEQ ID NO:1を含む、請求項1に記載の方法。
5. 前記組換えレジリンタンパク質がSEQ ID NO:4を含む、請求項1に記載の方法。
6. 前記組換えレジリンタンパク質がα接合因子分泌シグナルを含む、請求項1に記載の方法。
7. 前記組換えレジリンタンパク質がFLAGタグを含む、請求項1に記載の方法。
8. 前記ベクターが、複数の分泌型レジリンコード配列を含む、請求項1に記載の方法。
9. 前記組換え宿主細胞が酵母細胞である、請求項1に記載の方法。
10. 前記酵母細胞がメチロトローフ酵母細胞である、請求項9に記載の方法。
11. 前記組換え宿主細胞が、ピキア（コマガテラ）パストリス（Pichia （Komagataella） pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、ヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア（シェフェルソミセス）スチピチス（Pichia （Scheffersomyces） stipitis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）からなる群より選択される種である、請求項1に記載の方法。
12. 前記組換え宿主細胞が、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で前記組換えレジリンを産生する、請求項1に記載の方法。
13. 前記組換え宿主細胞が前記組換えレジリンの分泌型画分を産生し、該分泌型画分が、該組換え宿主細胞によって発現された組換えレジリン全タンパク質と比較して50％超である、請求項1に記載の方法。
14. 前記組換え宿主細胞が、2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で前記組換えレジリンを分泌する、請求項1に記載の方法。
15. 80％超の前記組換えレジリンが、前記発酵物中の前記組換え宿主細胞の外部に存在する、請求項1に記載の方法。
16. 前記発酵物が、1L当たり少なくとも2gの組換えレジリンを含む、請求項1に記載の方法。
17. 前記組換えレジリンタンパク質を精製する工程が、
    前記発酵物を遠心分離することによって、第1のペレット画分および第1の上清画分を生成すること；ならびに
    該第1のペレット画分から該組換えレジリンタンパク質を単離すること
    を含む、請求項1に記載の方法。
18. 前記組換えレジリンタンパク質を精製する工程が、
    該組換えレジリンタンパク質が可溶である溶液を生成するために、前記第1のペレット画分にカオトロープを添加すること；
    該カオトロープを含む該第1のペレット画分を遠心分離することによって、第2の上清画分および第2のペレット画分を生成すること；ならびに
    該第2の上清画分から可溶性全長レジリンを単離すること
    をさらに含む、請求項17に記載の方法。
19. 分泌型レジリンコード配列を含むベクター。
20. 前記分泌型レジリンコード配列が、全長または短縮型のネイティブレジリンをコードする、請求項19に記載のベクター。
21. 前記分泌型レジリンコード配列が、改変された全長または短縮型のネイティブレジリンをコードする、請求項19に記載のベクター。
22. 前記改変されたレジリンが、アミノ酸残基の付加を含むか、アミノ酸残基の削除を含むか、アミノ酸残基の置換を含むか、またはアミノ酸残基の位置の変更を含み、該アミノ酸残基が別のレジリンと架橋することができる、請求項21に記載のベクター。
23. 前記全長または短縮型のネイティブレジリンが、セイシェルショウジョウバエ、パナマハキリアリ、ヤンマ、ノサシバエ、ネコノミ、セイヨウオオマルハナバチ、コクヌストモドキ、ミツバチ、キョウソヤドリコバチ、コロモジラミ、ガンビアハマダラカ、グロッシーナ・モーシタンス、アッタ・セファロテス、アノフェレス・ダーリンジ、エンドウヒゲナガアブラムシ、クロショウジョウバエ、キリシマキノコショウジョウバエ、スナバエ、オオサシガメ、ヒアリ、ネッタイイエカ、ウリミバエ、およびトリコグラムマ・プレチオスムからなる群より選択される生物に由来する、請求項20〜22のいずれか一項に記載のベクター。
24. 前記分泌型レジリンコード配列が、SEQ ID NO:1を含むポリペプチドをコードする、請求項23に記載のベクター。
25. 前記分泌型レジリンコード配列が、SEQ ID NO:4を含むポリペプチドをコードする、請求項23に記載のベクター。
26. 前記分泌型レジリンコード配列が、1つまたは複数のAリピートまたは準Aリピートを含む組換えレジリンをコードする、請求項19に記載のベクター。
27. 前記分泌型レジリンコード配列が、1つまたは複数のBリピートまたは準Bリピートを含む組換えレジリンをコードする、請求項19に記載のベクター。
28. 前記分泌型レジリンコード配列が組換えレジリンをコードし、該組換えレジリンが、1つもしくは複数のAリピートもしくは準Aリピート、または1つもしくは複数のBリピートもしくは準Bリピートのいずれか一方のみを含む、請求項19に記載のベクター。
29. 前記分泌型レジリンコード配列が、1つまたは複数のAリピートまたは準Aリピートと1つまたは複数のBリピートまたは準Bリピートとを含む組換えレジリンをコードする、請求項19に記載のベクター。
30. 前記組換えレジリンがキチン結合ドメインをさらに含む、請求項26〜29のいずれか一項に記載のベクター。
31. 前記分泌型レジリンコード配列が、α接合因子分泌シグナルを含むポリペプチドをコードする、請求項19〜30のいずれか一項に記載のベクター。
32. 前記分泌型レジリンコード配列がFLAGタグを含む、請求項19〜30のいずれか一項に記載のベクター。
33. 複数の分泌型レジリンコード配列を含む、請求項19〜32のいずれか一項に記載のベクター。
34. 3つの分泌型レジリンコード配列を含む、請求項33に記載のベクター。
35. 前記分泌型レジリンコード配列が、構成性または誘導性のプロモーターに機能的に連結されている、請求項19〜34のいずれか一項に記載のベクター。
36. 請求項19〜35のいずれか一項に記載のベクターを1つまたは複数含む、組換え宿主細胞。
37. 酵母細胞である、請求項36に記載の組換え宿主細胞。
38. 前記酵母細胞がメチロトローフ酵母細胞である、請求項37に記載の組換え宿主細胞。
39. ピキア（コマガテラ）パストリス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、アークスラ・アデニニボランス、ヤロウイア・リポリチカ、ピキア（シェフェルソミセス）スチピチス、ピキア・メタノリカ、サッカロミセス・セレビシエ、およびクルイベロミセス・ラクチスからなる群より選択される種である、請求項38に記載の組換え宿主細胞。
40. 請求項19〜35のいずれか一項に記載のベクターを3つ含む、請求項36に記載の組換え宿主細胞。
41. 2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度で組換えレジリンを産生する、請求項36〜40のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
42. 前記組換え宿主細胞が組換えレジリンの分泌型画分を有し、該分泌型画分が50％超である、請求項36〜41のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
43. 2mg レジリン/g乾燥細胞重量/時間を上回る速度でレジリンを分泌する、請求項36〜42のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
44. 請求項36〜43のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞と該組換え宿主細胞を増殖させるのに適した培養用培地とを含む、発酵物。
45. 1L当たり少なくとも2gの組換えレジリンを含む、請求項44に記載の発酵物。
46. 80％超の組換えレジリンが、前記組換え宿主細胞の外部に存在する、請求項44に記載の発酵物。
47. 前記組換えレジリンが全長組換えレジリンである、請求項44〜46のいずれか一項に記載の発酵物。
48. 請求項44〜47のいずれか一項に記載の発酵物から得られた組換えレジリンを含む、組成物。
49. 少なくとも60重量％の組換えレジリンを含む、請求項48に記載の組成物。
50. ほぼ同じ量のネイティブレジリンを含む組成物と比較して類似した特性を有する、請求項48に記載の組成物。
51. ほぼ同じ量のネイティブレジリンを含む組成物と比較して異なる特性を有する、請求項48に記載の組成物。
52. 50％超の弾性エネルギーを有する、請求項48に記載の組成物。
53. 10MPa未満の圧縮弾性率を有する、請求項48に記載の組成物。
54. 10MPa未満の引張弾性率を有する、請求項48に記載の組成物。
55. 1MPa未満の剪断弾性率を有する、請求項48に記載の組成物。
56. 1％超の破断伸び（extension to break）を有する、請求項48に記載の組成物。
57. 0.1kPa超の最大引張強さを有する、請求項48に記載の組成物。
58. 90未満のショア00硬度を有する、請求項48に記載の組成物。
59. 全長レジリンを含む、請求項48に記載の組成物。
60. 組換えレジリンの分泌を促進する条件下で発酵物を作製するために請求項36〜42のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、請求項48〜59のいずれか一項に記載の組成物を作製するための方法。
61. 全長ネイティブレジリンを作製するために前記組換えレジリンを精製する工程をさらに含む、請求項60に記載の方法。
62. 全長ネイティブレジリンを作製するために前記組換えレジリンを精製する工程が、
    前記発酵物を遠心分離することによって、第1のペレット画分および第1の上清画分を生成すること；ならびに
    該第1のペレット画分から組換えレジリンタンパク質を単離すること
    を含む、請求項61に記載の方法。
63. 前記第1のペレット画分から前記組換えレジリンタンパク質を単離することが、
    該組換えレジリンタンパク質が可溶である溶液を生成するために、該第1のペレット画分にカオトロープを添加すること；
    該カオトロープを含む該第1のペレット画分を遠心分離することによって、第2の上清画分および第2のペレット画分を生成すること；ならびに
    該第2の上清画分から該組換えレジリンタンパク質を単離すること
    を含む、請求項62に記載の方法。
64. 複数の前記組換えレジリンを架橋する工程をさらに含む、請求項60〜63のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記架橋が酵素的架橋である、請求項64に記載の方法。
66. 前記架橋が光化学的架橋である、請求項64に記載の方法。
67. 前記組換えレジリンタンパク質が全長レジリンタンパク質を含む、請求項60〜66のいずれか一項に記載の方法。
68. 培養用培地と組換え宿主細胞とを含む発酵物であって、
    該組換え宿主細胞がベクターを含み、該ベクターが分泌型レジリンコード配列を含み、かつ該組換え宿主細胞が、少なくとも2mg/g乾燥細胞重量/時間の速度で組換えレジリンを分泌する、該発酵物。

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