KR101952835B1 - 약물전달, 조직공학, 재생의학을 위한 자극 반응성 및 탄성을 지닌 엘라스틴 및 레질린에 기초한 블럭 폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 이의 제조 방법 및 응용 - Google Patents

약물전달, 조직공학, 재생의학을 위한 자극 반응성 및 탄성을 지닌 엘라스틴 및 레질린에 기초한 블럭 폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 이의 제조 방법 및 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물전달, 조직공학, 재생의학을 위한 자극 반응성 및 탄성을 지닌 엘라스틴 및 레질린에 기초한 블럭 폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 이의 제조 방법 및 응용에 관한 것이다. 상기 이중 블럭 폴리펩타이드는 온도 자극에 따라 가역적인 변화가 가능한 자가-조립된 미셀 구조를 형성하였고, 상기 삼중 블럭 폴리펩타이드을 이용하여 제조된 하이드로겔은 온도 자극에 따라 가역적인 졸-겔 또는 겔-졸 전이가 이루어지며, 타이로신 잔기간 화학적 가교 결합에 의해 기계적인 강도가 증진됨을 알 수 있었다. 이러한 우수한 특성을 지닌 본 발명은 약물 전달체, 조직공학용 지지체 그리고 조직 또는 기관 재생용 키트로 이용될 수 있을 것이다.

Description

약물전달, 조직공학, 재생의학을 위한 자극 반응성 및 탄성을 지닌 엘라스틴 및 레질린에 기초한 블럭 폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 이의 제조 방법 및 응용 {Self-assembled nanostructures of elastin and resilin-based block copolypeptides with stimuli responsiveness and resilience for drug delivery system, tissue engineering, and regenerative medicine and methods of preparing thereof}
본 발명은 약물전달, 조직공학, 재생의학을 위한 자극 반응성 및 탄성을 지닌 엘라스틴 및 레질린에 기초한 블럭 폴리펩타이드의 자가조립된 나노구조체 및 이의 제조 방법 및 응용에 관한 것이다.
온도, pH 및 이온 강도와 같은 환경 변화에 대한 반응성을 지닌 단백질 기반 공중합체 블럭의 미셀 또는 하이드로겔 구조로의 자가-조립은, 높은 생체 적합성 및 조절 가능한 분해능으로 인해 수십년 동안 연구되어 왔다. 코어-쉘 미셀로 자가조립되는 단백질 기반 폴리펩타이드 블럭은 약물 전달 시스템으로서 상당한 주목을 받아 왔으며, 특히, 삼중 블럭 폴리펩타이드는 물리적 또는 화학적 가교로 인한 졸-겔 전이가 일어나기 때문에 조직 공학 응용으로 연구되어 왔다. 이 밖에도 다양한 단백질 기반 물질들이 약물 전달 및 조직 공학 응용으로 개발되었다.
펜타펩타이드 반복 단위를 갖는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (EBPs), Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly (상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산)는 환경 변화에 대한 반응성을 조절할 수 있으므로 다수의 연구가 이루어지고 있다. 상기 EBP는 하한 임계 용액 온도 (LCST)에서 가역적인 상 전이를 거치며, 이를 전이 온도 (Tt)라 일컫는다. 이들은 Tt 이하에서는 가용화 상태이지만, Tt 이상으로 온도가 증가함에 따라 불수용성이 된다. 일반적으로 EBP의 물리화학적 특성은 펜타펩타이드 반복 단위, Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 조절된다. 구체적으로, 반복 단위 내 세번째 아미노산은 기계적 성질, 예를 들어, Gly에 의한 탄성, Ala에 의한 가소성을 나타내는 반면, 네번째 아미노산 Xaa 및 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화는 Tt에 영향을 미친다. 펜타펩타이드 반복 단위의 조합에 따라, 다양한 물리화학적 성질과 Tt를 갖는 EBP 및 블럭 펩타이드를 제조할 수 있고, 이를 통해 자극-유발성 미셀 구조 및 하이드로겔을 제조할 수 있다. EBP 블럭 공중합체는 약물 전달, 조직 공학 및 재생 의학 응용을 위한 자가-조립 미셀 및 주사가능한 하이드로겔로 광범위하게 연구되었다. 종전 설계된 EBP 이중블럭 공중합체는 낮은 LCST를 갖는 소수성 블럭 및 높은 LCST를 갖는 친수성 블럭으로 이루어지며, 이들은 소수성 블럭의 Tt 이상에서 미셀로 자가-조립되었다. 이러한 미셀의 자가 조립은 게스트 잔기, 친수성 및 소수성 블럭의 분자량 및 삽입되는 다른 화학 또는 물리적 도메인을 변화시킴으로써 조절되었다.
한편, 레질린은 곤충의 큐티클층에 존재하는 탄성 중합체 단백질이며, 에너지의 저장 및 반복 운동에 필요한 다양한 기능을 제공한다. 이에 대하여, 높은 탄성과 긴 피로 수명 시간을 포함하는 놀라운 기계적 특성이 알려져 있다. Elvin et al.은 대장균에서 Drosophila CG15920 유전자의 첫번째 엑손을 클로닝하여 발현시켰다. 결과적으로 레질린 기반 폴리펩타이드 (RBP)는 GGRPSDSYGAPGGGN로 추정되는 서열을 발견하였고, 이는 rec1-resilin으로 불리워 지고 있다. Kristi 그룹은 조직 공학 응용을 위하여, 레질린의 고유 속성을 손상시키지 않은 채로, 추정 레질인 반복 단위의 아미노산 서열을 변형시킨, 레질린-유사 폴리펩타이드 (RBPs) 기반의 탄성중합체 생체 재료를 개발하였으며, 세포-결합 RGD 서열, 기질 메탈로프로테이나제 (MMP)-민감성 분해 서열, 및 헤파린 결합 도메인을 포함하도록 제조되었다.
또한, PEG-비닐 설폰 가교제와의 마이클 반응을 통해 RLP-PEG로 이루어진 혼성 하이드로겔을 제조하였으며, 이들은 3D 매트릭스에서, 유용한 기계적 특성을 유지하면서, 인간 대동맥 외피 섬유아세포를 성공적으로 캡슐화하였다. 아울러, 인간 MSC를 지지할 수 있는 섬유로서, 자가-조립되는, 레질, 엘라스틱 및 콜라겐 (REC) 유래 서열로 이루어진 키메릭 단백질이 제조된 바 있으며, 최근 Li et al.은 온도의 증가에 따른 RBP의 상 분리 및 비가역적인 나노입자의 형성을 보고한 바 있으나, 이들은 RBPs의 UCST 거동에 대해서는 개시하고 있지 않다.
본 발명은 상 전이(phase transition) 거동을 가지는 레질린 기반 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및 상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 일측 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 신규한 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 이용하여 제조된 동적 나노 전달체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및 상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 양 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 신규한 삼중 블럭 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 삼중 블럭 폴리펩타이드를 이용하여 제조된 하이드로겔을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 약물 전달 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 조직 공학용 지지체를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로겔을 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 연구에서는, 미셀 및 하이드로젤 형성하기 위한, 레질린 기반 폴리펩타이드 (RBP) 및 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (EBP)의 자극 반응성 자가 조립을 개시한다. 일련의 EBPP-RBP 이중 블럭 및 EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 펩타이드는 유전 공학적 방법에 의해 합성되고, ITC (inverse transition cycling) 방법을 통해 정제하였다. EBPP-RBP 이중 블럭 폴리펩타이드는 블럭의 소수성 및 친수성 성질에 따라, 미셀 구조로 자가조립되었고, EBPP의 하한 임계 용액 온도 (LCST)와 RBP의 상한 임계 용액온도 (UCST)에 따라 상기 미셀 구조는 동적으로 변화하였다. 또한, EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드는 EBPP의 하한 임계 용액 온도 (LCST) 이상에서, 상기 EBP는 물리적으로 가교결합되어 하이드로겔 망 (네트워크)을 형성하여 가역적인 졸-겔 전이를 보여주었다. 이 뿐만 아니라 하이드로겔의 기계적 강도는 RBP 블럭 사이에 화학적 가교 결합, 및 EBP 블럭의 소수성 강화를 통해 향상될 수 있었다. 따라서, 엘라스틴-레질린 기반의 폴리펩타이드의 미셀 형태로의 자가-결합 및 기계적 특성이 향상된 동적 하이드로겔은 생체의학 분야 응용에 널리 이용될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 상 전이 거동 (phase transition)을 가지는 레질린 기반 폴리펩타이드 (RBP)을 제공한다.
본 발명에서, 레질린은 곤충의 큐티클층에 존재하는 탄성 중합체 단백질로서, 에너지의 저장 및 반복 운동에 필요한 다양한 기능을 제공하는 것으로 알려져 있으며, 높은 탄성과 긴 피로 수명 시간을 포함하는 놀라운 기계적 특성을 지니고 있다. Elvin et al.은 대장균에서 Drosophila CG15920 유전자의 첫번째 엑손을 클로닝하여 발현시켜, 레질린 폴리펩타이드로 추정되는 서열을 발견한 바 있다. 본 발명에서는 상기 서열의 일부를 변형시킴으로써, 우수한 기계적 특성을 유지함과 동시에 상 전이 거동을 갖는 레질린 기반 폴리펩타이드를 제조하였다. 상기 레질린 기반 폴리펩타이드의 유전자 서열은 바람직하게 서열번호 42일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은, 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및
상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 일측 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 1로 표시되는 자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다.
[식 1]
[소수성 EBP]m-[RBP]n
상기 식 1에서,
n 또는 m은 독립적으로 1 이상의 정수이고,
상기 [RBP]는 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭으로서, 서열번호 44로 표시되는 아미노산으로 이루어지고,
상기 [소수성 EBP]는 서열번호 1의 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 블럭, 서열번호 2의 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 블럭 또는 서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭임 (상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드 VPGXG, VPAXG, 또는 IPAXG가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되는 것임).
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연　아미노산　또는　인공　아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연　아미노산을 의미한다. 예컨대 상기　아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.
상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성 (음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 "소수성 아미노산"이란 소수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 페닐알라닌, 류신 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는　폴리펩타이드란　용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의　폴리펩타이드　유사체를 포함한다.　폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
용어 "상 전이(phase transition)"이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드는, 기본적으로, 자극 반응성 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)이다. 상기 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(elastin-like polypeptides: ELPs)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 명세서에서, 상기 X (또는 Xaa)는 "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG] 등의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly 는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다. 한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다.
본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성의 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다. 또한 EBP의 전이온도는 또한 아미노산 서열 및 이의 분자량에 달려 있다. Val-Pro-Gly-Val-Gly의 펜타펩타이드에서, 4번째 아미노산인 "게스트 잔기"를 Val 보다 더 친수성을 나타내는 잔기로 치환하는 경우, 원래 서열과 비교하여 Tt가 올라가고, 반대로 Val보다 소수성인 잔기로 게스트 잔기를 치환하면 원래 서열보다 Tt가 낮아진다. 즉, 친수성 EBP는 Tt가 높고 소수성 EBP는 상대적으로 Tt가 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 통해, EBP 서열의 게스트 잔기로 어떤 아미노산을 사용할지 결정하고, 게스트 잔기의 조성 비율에 변화를 줌으로써 특정 Tt를 가지는 EBP를 제조할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, Tt가 높으면 친수성을 나타내고 Tt가 낮으면 소수성을 나타낸다. 본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 Tt를 올리거나 낮출 수 있다. 그리하여 소수성 EBP 블럭의 제조가 가능하다.
참고로, 체온보다 낮은 Tt를 가지는 EBP는 소수성 블럭으로 사용될 수 있다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
본 발명의 EBP 서열을 예로 들면, Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 가소성 펜타펩타이드 가 반복되는 가소성 폴리펩타이드 블럭과 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 탄성 펜타펩타이드 반복되는 탄성 폴리펩타이드 블럭을 비교하였을 때, 3번째 아미노산인 Gly이 Ala보다 높은 친수성을 보인다. 따라서 가소성 폴리펩타이드 블럭 (Elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)이 탄성 폴리펩타이드 블럭 (Elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)보다 Tt가 낮게 나타난다.
일 구체예로서, 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 서열번호 1의 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 블럭에서,
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23];
K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25];
D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 27];
E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 31].
구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 4(서열번호 23에 대응하는 서열), 서열번호 6(서열번호 25에 대응하는 서열), 서열번호 8(서열번호 27에 대응하는 서열), 서열번호 10(서열번호 29에 대응하는 서열), 또는 서열번호 12(서열번호 31에 대응하는 서열)로 이루어질 수 있다.
다른 구체예로서, 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 서열번호 2의 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 블럭에서,
상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32];
K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33];
D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34];
K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 35];
D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 36];
H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 37];
H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나[서열번호 38]; 또는
G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 39].
구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 13(서열번호 32에 대응), 서열번호 14(서열번호 33에 대응), 서열번호 15(서열번호 34에 대응), 서열번호 16(서열번호 35에 대응), 서열번호 17(서열번호 36에 대응), 서열번호 18(서열번호 37에 대응), 서열번호 19(서열번호 38에 대응) 또는 서열번호 20(서열번호 39에 대응)으로 이루어질 수 있다.
다른 구체예로서, 본 발명은 하기의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
상기 서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭에서,
반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 40]; 또는
G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어진다 [서열번호 41].
구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 유전자 서열은 서열번호 21 (서열번호 40에 대응) 또는 서열번호 22 (서열번호 41에 대응)로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [식 1]의 이중 블럭 폴리펩타이드의 동적 변화는 5B에 모식적으로 나타내었다.
상기 이중 블럭 폴리펩타이드를 구성하는, 상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 (RBP) 및 상전이 거동을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 블럭 (EBP) 각각은 친수성 및 소수성 성질을 갖는 블럭으로서, 미셀 구조를 형성함에 크게 기여한다. 우선, 상기 EBP의 LCST 이하의 조건에서, 응집된 상태인 RBP 블럭으로 이루어진 코어, 가용화 상태인 EBP 블럭으로 이루어진 쉘로 구성되는, 자가-조립된 미셀 구조를 형성한다. 이후, EBP의 LCST 이상의 조건에서는, EBP 블럭 역시 응집된 상태로 변화되어, 전체적으로 응집체를 형성하게 된다. 끝으로, RBP의 UCST 이상의 고온 조건에서는, RBP가 가용화 상태로 변화되어, 응집된 상태인 EBP 블럭으로 이루어진 코어, 가용화 상태인 RBP 블럭으로 이루어진 쉘로 구성되는 미셀 구조를 재형성한다. 특히, RBP의 UCST는 이중 블럭 폴리펩타이드의 길이 또는 분자량의 변화에 따라 조절할 수 있었으며, 이러한 미셀 구조의 변화는 가역적임을 알 수 있었다.
본 발명에서 사용되는 용어, "자가조립"은 자체적으로 조립되어 특정 구조를 형성하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 상기 자가조립은 특정 온도 조건에서의 가용화의 차이에 따라, 소수성 도메인 또는 코어를 형성하고, 친수성 도메인 또는 쉘을 형성함으로써, 미셀 형태의 나노 구조체를 형성하는 것을 의미한다.
즉, 상기 RBP-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드 기반 미셀 형태의 나노구조체는 온도 자극에 반응하여 가역적인 동적 특성을 나타냈으며, 이러한 특성은 이중 블럭 폴리펩타이드 또는 각 블럭의 길이 변화에 따라 조절 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 자극 유발 약물 방출 역동학을 지닌, 자극 반응성 RBP-EBP 이중 블럭 폴리펩타이드는 동적 약물 전달 시스템에 유용할 것이다.
본 발명은, 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및
상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 양 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 2로 표시되는 자극 반응성을 가지는 삼중 블럭 폴리펩타이드를 제공한다.
[식 2]
[소수성 EBP]m-[RBP]n-[소수성 EBP]m,
상기 식 2에서,
n 또는 m은 독립적으로 1 이상의 정수이고,
상기 [RBP]는 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭으로서, 서열번호 44로 표시되는 아미노산으로 이루어지고,
상기 [소수성 EBP]는 서열번호 1의 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 블럭, 서열번호 2의 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 블럭 또는 서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭임 (상기 X 는 프롤린을 제외한 아미노산으로, 상기 펜타펩타이드 VPGXG, VPAXG, 또는 IPAXG가 반복될 때 임의의 천연 또는 인공 아미노산에서 선택되는 것임).
본 발명의 삼중 블럭 폴리펩타이드는 상술한 이중 블럭 폴리펩타이드에서 기술한 바 있는 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭 등을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 측면에서,
본 발명의 삼중 블럭 폴리펩타이드에 열 자극을 가하는 단계; 및
상기 온도 자극에 의하여 사이 삼중 블럭 펩타이드간 가교 결합을 형성하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는, 하이드로겔을 제공한다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤(hydrogel)이란,　일반적으로 다량의 수분을 함유할 수 있는 삼차원의 친수성 고분자 망상구조를 가진 물질을 의미하며, 수용액상에서 팽윤된 후에 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 물리화학적 특성을 지닌다.　
본 발명에 따른 상기 [식 2]의 삼중 블럭 폴리펩타이드를 이용한 하이드로겔의 동적 변화는 5C에 모식적으로 나타내었다.
우선, EBPP의 하한 임계 용액 온도 이하에서, EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드는 가용화 상태로 존재한다. 이후, EBPP의 하한 임계 용액 온도 이상에서, 물리적인 가교를 통한 가역적인 겔화가 진행되어 동적 하이드로젤을 형성한다. 또한 이러한 과정에서, RBP 블럭은 탄성 블럭으로의 역할뿐만 아니라, 화학적 가교 결합이 중앙 블럭 상의 타이로신 잔기 사이에 형성되어 하이드로겔 전체의 기계적 특성을 강화시키는 역할을 수행한다.
이 뿐만 아니라, 상기 [소수성 EBP] 블럭에서, 반복되는 펜타펩타이드의 첫번째 위치의 "Val"을 "Ile"로 치환시킨, 서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭은 소수성 성질이 강화되어, 상기 블럭을 이용한 하이드로겔은 기계적 특성이 향상됨을 확인할 수 있었다.
상기 "동적 하이드로젤(dynamic hydrogel)"이란 다음과 같은 의미를 가진다. 환경(온도, pH, 이온 세기, 리간드 등) 상태에 반응하여 하이드로젤을 이루는 물질(예를 들면, 단백질)의 입체구조의 3차원적 변화 (Conformational change)를 겪을 수 있는데, 이를 "동적 하이드로젤"이라고 한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달 조성물을 제공한다. 상기 하이드로젤은 온도 자극에 반응하므로, 약물을 주입하여 체내에 안정적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조직공학용　지지체(scaffold)는 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 신체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 조직 공학(tissue engineering) 분야에서 사용될 수 있는 모든 지지체를 포함한다.　
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직 또는 기관 재생용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 조직 또는 기관재생용 키트는 상기 조직공항용 지지체에 더하여, 상기 지지체의 형상 유지를 위한 보강층이 추가될 수 있다. 상기 보강층은 PCL, PLA, PLGA, PGA 등의 생분해성 고분자 물질에서 선택될 수 있다.
본 발명은 레질린-기반 폴리펩타이드 및 상 전이 거동 폴리펩타이드로 이루어지는, 자극 반응성을 가지는 이중/삼중 블럭 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 이중 블럭 폴리펩타이드는 온도 자극에 따라 가역적인 변화가 가능한 자가-조립된 미셀 구조를 형성하였고, 상기 삼중 블럭 폴리펩타이드을 이용하여 제조된 하이드로겔은 온도 자극에 따라 가역적인 졸-겔 또는 겔-졸 전이가 이루어지며, 타이로신 잔기간 화학적 가교 결합에 의해 기계적인 강도가 증진됨을 알 수 있었다. 이러한 우수한 특성을 지닌 본 발명은 약물 전달체, 조직공학용 지지체 그리고 조직 또는 기관 재생용 키트로 이용될 수 있을 것이다.
도 1은, RBP, 단일, 이중, 및 삼중 블럭 폴리펩타이드 유전자의 클로닝에 대한 개략도이다. (A) RDL를 위하여 AcuI 및 BseRI 제한 효소 사이트를 포함하는 어뎁터 서열이 pET-21(a)에 삽입되도록 개질시켰다. RBP 뉴클레오타이드 카세트 (Acul 및 BseRI 점착성 말단을 갖음)는 BseRI로 제한되어 있는 개질된 pET-21(a)에 삽입되었다. (B) RDL에 의한 RBP 유전자의 다중화이다. 벡터는 XbaI 및 BseRI에 의해 선형화되었고, 삽입을 위한 인서트는 XbaI 및 AcuI에 의해 제한되었다. 연결 후, 목적하는 유전자 길이를 얻을 때까지 동일한 단계를 반복하였다. (C) RBP를 포함하는 플라스미드 (XbaI 및 BseRI에 의해 선형화됨)에 EBPP 유전자를 삽입시켜 이중 블럭 폴리펩타이드의 클로닝을 합성하였다. (D) 이음매가 없는 삼중 블럭 폴리펩타이드이다. 첫번째 단계로, RBP 플라스미드에 EBPP 유전자를 삽입하여 이중 블럭을 합성하였으며, 두번째 단계로, 이중 블럭을 함유하는 플러스미드에 EBPP 유전자 (XbaI 및 AcuI에 의해 제한됨)를 삽입하여 삼중 블럭 폴리펩타이드, EBPP-RBP-EBPP를 합성하였다.
도 2는, 본 발명에 따른 RBP 유전자 라이브러리의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. (A) RBP[m-Dros]n 및 (B) RBP[Dros]n. 좌측 레인은 사이즈 마커, 우측면은 각 RBP[m-Dros]n 유전자의 예상되는 사이즈 마커를 나타낸다. 각 유전자에 의해 인코딩되는 반복 단위의 개수는 상단에 표시하였다.
도 3은, 본 발명에 따른 RBP의 SDS-PAGE 결과이다. (A) RBP[m-Dros]24, (B) RBP[m-Dros]30 및 (C) RBP[Dros]8. 레인 (M)은 kDa의 단위로 표시한 사이즈 마커, 우측면은 예상되는 분자량을 나타낸다. (D) PBS에서 25, 50, 100 uM의 RBP[Dros]16 에 대한 열적 프로파일이다. 열적 프로파일 결과는 1℃/분의 가열 속도로 10℃에서 90℃까지 단백질 용액을 가열한 것이다.
도 4는, RBP[m-Dros]n의 특성을 분석한 결과이다. (A) RBP[m-Dros]24, (B) RBP[m-Dros]30의 열적 프로파일이다. 열적 프로파일 결과는 PBS에서 1℃/분의 냉각 속도로 50℃에서 10℃까지 각 블럭의 25μM 용액을 냉각하여 측정한 것이다. (C) RBP[m-Dros]24, (D) RBP[m-Dros]30의 DLS 측정 결과이다. 각 블럭 (15μM)의 유체역학적 반경 (Rh)은 30℃에서 0℃까지의 온도함수로서, 90°의 산란각에서 측정되었다.
도 5는, 전이 거동을 갖는 RBP[m-Dros]n 및 EBPP-RBP[m-Dros]n 폴리펩타이드의 개략도이다. (A) RBP[m-Dros]n 단일 블럭은 가역적인 열적 전이를 나타낸다. UCST 이상에서, RBP는 완전히 가용화되고, UCST 이하로 냉각시 응집된다. (B) RBP 및 소수성 EBPP를 갖는 이중 블럭 폴리펩타이드 EBPP-RBP[m-Dros]n는 미셀 구조로 자가 조립된다. EBPP의 Tt 보다 낮으면, RBP는 UCST로 인해 응집되어 미셀의 코어를 형성하는 반면, 가용화 상태인 EBP는 쉘을 형성한다. EBPP의 Tt 이상에서, EBPP의 열적 전이로 인해 전체적으로 응집된다. 한편, 매우 높은 온도 ~80℃에서, RBP는 UCST로 인해 가용화되고, 다시 미셀을 형성한다. 이러한 이중 블럭 펩타이드의 열적 반응성은 가역적이다. (C) EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드는 중앙에 타이로신 잔기를 갖는 RBP 블럭과 상기 블럭의 양 측면에 소수성 EBPP 블럭이 위치한다. EBPP의 Tt 보다 낮으면, EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드는 가용화 상태이고, EBPP의 Tt 이상에서, 열적으로 유발된 가역적인 겔화를 통해 물리적으로 가교된 단백질 하이드로겔을 생성한다. 화학적 가교 결합이 중앙 블럭 상의 타이로신 잔기 사이에 형성되어 하이드로겔의 기계적 특성이 강화될 수 있다.
도 6은, (A) 및 (C)는 EBPP[G1A3F2]6를 갖는 이중 블럭 폴리펩타이드의 아가로스겔 및 SDS-PAGE 이미지이다. 레인 1: RBP[m-Dros]3-EBPP[G1A3F2]6, 레인 2: RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]6, 레인 3: RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]6, 레인 4: RBP[m-Dros]24-EBPP[G1A3F2]6이다. (B) 및 (D)는 삼중 블럭 폴리펩타이드의 아가로스겔 및 SDS-PAGE 이미지이다. 레인 1: EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]12, 레인 2: EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]12, 레인 3: EBPP[G1A3F2]24-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]24, 레인 4: EBPP[G1A3F2]24-RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]24이고, 레인 (M)은 사이즈 마커, 우측면은 예상되는 분자량을 나타낸다.
도 7은, PBS (10 mM, pH 7.4)에서 RBP[m-Dros]를 갖는 EBPP[G1A3F2]6 이중 블럭 폴리펩타이드의 특성을 분석한 것이다. 1℃/분의 가열 속도로 10℃에서 90℃까지의 열적 프로파일로, EBPP[G1A3F2]6 의 LCST 이하에서, RBP[m-Dros]를 코어로 갖는 미셀 구조가 형성되고, EBPP[G1A3F2]6의 LCST 이상에서, 전체적으로 응집된다. ~80 ℃에서 EBPP[G1A3F2]6-RBP[m-Dros]3을 제외한 모든 이중 블럭 폴리펩타이드은, UCST 이상에서의 RBP[m-Dros] 가용화로 인해 가역적으로 미셀을 형성하였다. (B) DLS에 의해 25℃ 및 85℃에서 EBPP[G1A3F2]6-RBP[m-Dros]24의 크기를 측정한 결과이다.
도 8은, (A) EBPP[G1A3F2]12를 갖는 RBP[m-Dros]n 이중 블럭 폴리펩타이드 및 (B) 삼중 블럭 폴리펩타이드의 열적 프로파일이다. 열적 전이의 패턴은 두 플롯 모두 동일하였다. 낮은 온도에서, 폴리펩타이드들은 가용화 상태였고, 온도가 증가함에 따라 응집되었다.
도 9는, EBPPI[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPPI[G1A3F2]12 삼중 블럭 폴리펩타이드의 (A) 구리 염색된 SDS-PAGE 겔 (15%), 및 (B) 열적 프로파일이다. 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 삼중 블럭 폴리펩타이드이다. 열적 프로파일은 25 uM 샘플 농도를 갖는 PBS (10 mM, pH 7.4)에서 1℃/분의 가열 속도로 5℃에서 80℃까지 온도 함수로서 측정되었다.
도 10은, (A) 4℃, (B, C) 37℃ 및 (D) 4℃에서 순차적으로 배양된 경우, pH 7.4의 10mM PBS 완충제에서 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]12의 사진이다. 37℃에서 4℃로 온도가 감소할 때의 가역적인 겔-졸 거동은 물리적으로 가교된 겔의 가역성을 나타낸다.
도 11은, pH 7.4의 10mM PBS 완충제에서 35 wt%의 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]12에 대한 점탄성 레올로지를 측정한 것이다. 1℃/분의 가열 속도에서 (A) 온도에 대한 함수 (스트레인 2%, 1 rad/s) 및 (B) 주파수에 대한 함수 (스트레인 2 %, 10 ℃)로 나타낸 결과이다.
도 12는, PBS (10mM, pH 7.4)에서, 25 wt%의 EBPPI[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPPI[G1A3F2]12에 대한 점탄성 레올로지를 측정한 것이다. (A) 진폭 스위프 (1 rad/s의 주파수에서의 0.2-20%), (B) 주파수 스위프 (2% 스트레인에서의 0.1-10 rad/s). (C) 및 (D)는 1℃/분의 가열 및 냉각 속도에서 온도에 대한 함수 (스트레인 2%, 1 rad/s)로서 레올로지를 측정한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험 재료
Novagen Inc.(Madison, WI, U.S.)로부터 pET-21a 벡터 및 BL21(DE3) E. coli 세포들을 구입하였다. Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)로부터 Top 10의 수용세포들(competent cells)을 구입하였다. Cosmo Gene Tech(Seoul, South Korea)에서 올리고뉴클레오티드들을 화학적으로 합성하였다. Fermentas (Ontario, Canada)로부터 감열성 알칼리 포스포타제인 FastAP, 및 BamHI와 XbaI를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 구매하였다. New England Biolabs (Ipswich, MA, U.S.)로부터 BseRI, AcuI, 및 기타 제한 효소를 포함하는 다른 제한 엔도뉴클레아제를 얻었다. Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)에서 DNA 미니-제조, 겔 추출, 및 PCR 정제를 위한 모든 키트들을 얻었다. DYNE BIO (Seongnam, South Korea)로부터 Dyne Agarose High를 얻었다. 모든 Top10 세포들을 TB DRY 배양액 (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, U.S.)에서 성장시켰고, 모든 BL21(DE3) 세포들을 MP Biomedicals (Solon, OH, U.S.)로부터 얻은 CircleGrow 배양액에서 성장시켰다. 프리캐스트 겔인 Ready Gel (Tris-HCI, 2-20%)을 Bio-Rad(Hercules, CA, U.S.)로부터 얻었다. 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4), 암피실린, 폴리에틸렌이민(PEI)은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)로부터 구입하였다.
실시예 2. 서로 다른 EBP 블럭들과 이들의 블럭 폴리펩타이드에 대한 표기
펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는 서로 다른 EBP들은 다음과 같이 명명한다. 상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 첫째, 가소성이 있는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly(VPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)라고 정의한다. 한편 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)의 펜타펩타이드 반복은 탄성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)라 칭한다. 또한, Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly(IPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 첫번째 위치가 Ile로 대체된 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(EBPPI)라고 정의한다. [XiYjZk]n에서, 괄호 내의 대문자들은 게스트 잔기의 단글자 아미노산 코드, 즉, EBP 펜타펩타이드의 4번째 위치(Xaa 또는 X)에서의 아미노산이고, 이들의 해당하는 아래 첨자는 반복 단위로서 EBP 모노머 유전자의 게스트 잔기의 비율(ratio)을 나타낸다. [XiYjZk]n의 아래 첨자 수 n은 본 발명의 서열번호 1 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG], 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG], 또는 서열번호 3 은 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 의 EBP의 반복 횟수의 총 수를 나타낸다. 예를 들어, EBPP[G1A3F2]12는 서열번호 2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 의 단위가 12번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(Xaa)에서의 Gly, Ala, 및 Phe의 비는 1:3:2이다.
두 개의 다른 서열을 갖는 RBP들은 RBP[Dros]n 및 RBP[m-Dros]n와 같이 명명한다. 상기 n은 반복 단위의 수를 나타낸다. RBP들의 서열은 Drosophila 엑손 1으로부터 유래하며, 상기 RBP 반복 단위는 레질린의 2개의 반복 서열을 포함한다. RBP[Dros]n의 반복 서열은 종전 연구에서 보고된 바 있는 서열과 동일하다. 한편, RBP[m-Dros]n에 대해서는, 온도-반응성 및 높은 탄성과 같이 추가적인 특성을 얻기 위하여 두 개의 반복 서열을 조합하였다. 상기 EBPP-RBP 이중 블럭 및 삼중 블럭 폴리펩타이드는 이중 블럭 EBPP[G1A3F2]n-RBP[Dros/m-Dros]n 및 삼중 블럭 EBPP[G1A3F2]n-RBP[Dros/m-Dros]n-EBPP[G1A3F2]n와 같이 블럭들 사이 하이픈과 함께 꺽쇠 괄호들에서, 각각의 블럭의 구성에 따라 명명된다.
실시예 3. 이음매가 없는 (seamless) 유전자 클로닝을 위한 변형된 pET -21a 벡터의 제조
도 1A에 나타낸 바와 같이, EBP 및 RBP의 RDL를 위하여, 2 개의 고유한 제한 효소 BseRI 및 AcuI가 도입되도록 pET-21a (+)를 변형시켰다. 37℃에서 20분 동안 FastDigest 완충제에서 50U의 XbaI, 50U의 BamHI와 함께 4μg의 pET-21a 벡터를 소화 (digestion)시켰다. 5' 말단은 37℃에서 1시간 동안 NEB 3 완충제 에서 10U의 CIP로 탈인산화시켰다. 제한된 플라스미드 DNA를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. XbaI와 BamHI 호환 가능한 점착 말단을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드, 즉, (5'-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag-3') 및 (5'-gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3')를 설계하였다. 상기 올리고머 DNA는 단백질의 분광 광도적 검출을 위한 Tyr 및 개시 (Met) 및 종결 코돈을 포함한다. 2분 동안 95℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2μM 올리고뉴클레오티드 농도의 50μL를 가열함으로써 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링한 후 그 용액을 3 시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 16℃에서 30분 동안 20pmol의 어닐링된 dsDNA와 0.1pmol의 선형화된 벡터를 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에 배양함으로써, XbaI 및 BamHI 점착 말단을 갖는 변형된 클로닝 DNA 인서트를 선형화된 pET-21a (+) 벡터에 삽입하였다. 상기와 같이 연결된 벡터를 화학적으로 형질 전환된 Top 10 수용세포들에 도입하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 플레이트 상에 도포하였으며, DNA 시퀀싱을 통해 삽입된 서열을 확인하였다.
실시예 4. RBP 및 EBP의 유전자 단위체 합성 및 올리고머화
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. EBP 라이브러리에 대하여, 다양한 펜타펩타이드 반복 단위들을 갖는 EBP들의 DNA와 아미노산 서열은 각각 표 1과 표 2에 나타내었다.
[표 1] EBP 라이브러리의 유전자 서열
Figure 112017028861298-pat00001
[표 2] EBP 라이브러리의 아미노산 서열
Figure 112017028861298-pat00002
상기 표 1에서 서열번호 4-11은 친수성 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있고, 서열번호 12-22번은, Phe, His이 들어간 소수성 EBP 블럭을 위한 유전자 서열로 분류될 수 있다. 상기 표 2에서 아미노산 서열번호 23-30는 친수성으로 분류될 수 있고, Phe, His이 들어간 아미노산 서열번호 31-41은 소수성 EBP 블럭으로 분류될 수 있다. 즉, EBP의 LCST가 체온보다 낮은 경우 소수성을 띠고, EBP의 LCST가 체온보다 높은 경우 친수성을 띤다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
온도와 pH를 포함한 고유한 자극 반응성을 갖도록 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly [여기서 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음] 를 갖는 서로 다른 EBP들을 DNA 레벨에서 설계하였다. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 가소성이 있는 EBPP(EBP with plasticity: EBPP)와, Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 펜타펩타이드 반복을 갖는 탄성이 있는 EBPE(EBP with elasticity: EBPE), 모두를, 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 갖도록 복제하였다. 상기 표 1과 표 2는, 각각 펜타펩타이드 반복 단위를 갖는 서로 다른 EBP들의 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, EBPE[G1A3F2]12와 EBPP[G1A3F2]12는 거의 동일한 몰 질량(molar mass)뿐만 아니라, EBP 펜타펩타이드 반복 단위의 4번째 잔기가 동일한 조합을 나타낸다. 그리고 펜타펩타이드 반복 단위의 서로 다른 3번째 아미노산 잔기(Ala 또는 Gly)로 인해 서로 다른 기계적 특성들을 갖는다. Lys, Asp, Glu, His 등의 대전된 아미노산을 게스트 잔기로 도입함으로써 양으로 및 음으로 대전된 EBP들을 구축하였다. 또한, 첫번째 위치 아미노산 ("Val" 또는 "Ile")의 온도 반응성 및 삼중 블럭 폴리펩타이드의 물리적 가교 효과를 확인하기 위하여, 펜타펩타이드 단위인 내 첫번째 위치의 "Val"을 "Ile"로 치환시킨, Ile-Pro-Ala-X-Gly로서, 두 종류의 EBPP 라이브러리를 설계하였다.
2분 동안 95℃에서 T4 DNA 리가아제 완충제에서 2μM의 올리고뉴클레오티드 농도의 50μL를 가열함으로써 다양한 EBP들을 인코딩하기 위한 올리고뉴클레오티드의 각 쌍을 어닐링(annealing)한 후 3시간에 걸쳐 실온까지 천천히 냉각하였다. 생성된 dsDNA 산물은 비회문적(nonpalindromic) 2bp와 3'의 돌출부 (overhangs)를 갖는다. 30분 동안 37℃에서 15U의 BseRI와 10U의 FastAP 감열 알칼리 포스파타제로 총 4μg의 변형된 mpET-21a 복제 벡터를 소화시켰다. 5' 말단은 37℃에서 1시간 동안 NEB 3 완충제에서 10U의 CIP로 탈인산화시켰다. 제한된 벡터를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 40μL의 증류된 탈이온수에서 용리하였다. 16℃에서 30분 동안 90pmol의 dsDNA와 30pmol의 벡터를 T4 DNA 리가아제를 갖는 T4 DNA 리가아제 완충제에 배양함으로써, 상기 dsDNA를 선형화 및 변형된 pET-21a (+) 벡터에 삽입하였다. 상기와 같이 연결된 벡터를 화학적으로 형질 전환된 Top10의 수용세포들에 도입하였으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 플레이트 상에 도포하였으며, DNA 시퀀싱을 통해 삽입된 서열을 확인하였다.
또한, 두 개의 RBPs, RBP[Dros]n 및 RBP[m-Dros]n 은 Drosophila 엑손 1으로부터 유래하였다. 상기 RBP[Dros]n 서열은 기존의 연구에 보고된 바 있는 GGRPSDTYGAPGGGN 반복 서열이며, 본 연구에서는 RBP[m-Dros]n과 동일한 분자량을 갖는 반복단위로 2 개의 서열을 결합시켰다. RBP[m-Dros]n은 GGRPSDSYGAPGGGN 및 GGRPSSSYGAPGQGN의 2개 반복 단위로 변형된 RBP[Dros]n이다. RBP [Dros]n 및 RBP [m-Dros]n 에 대한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 표 3 및 4에 각각 나타내었다.
[표 3] RBP 라이브러리의 유전자 서열
Figure 112017028861298-pat00003
[표 4] RBP 라이브러리의 아미노산 서열
Figure 112017028861298-pat00004
도 1B에 나타낸 바와 같이, RBP 유전자는 RDL에 의해 30 반복 단위까지 다중화 (multimerization)시켰다. 벡터는, 37℃에서 30분 동안, 총 4μg의 모노머 유전자들을 Cutsmart 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 소화하였다. 벡터는 15U의 BseRI 및 10U의 Xbal에 의한 이중 소화(double digestion) 및 10U의 CIP에 의한 탈인산화에 의해 제조되었다. 삽입을 위하여, 총 4μg의 모노머 유전자들을 Cutsmart 완충제에서 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 37℃에서 20분 동안 소화시켰다. 소화 후에, 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16℃에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터와 함께 30pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 상기 산물을 이용하여 수용 대장균 Top10 세포들을 형질전환시켰으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도포하였다. 상기 형질전환체는 진단 제한 엔도뉴클레아제 다이제스트 (XbaI 및 BamHI 에 의한 제한)에 의해 초기에 스크리닝되었고, DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다.
실시예 5. RBP의 발현/정제 및 특성 분석
E. Coli BL21(DE3) 세포를 RBP[Dros]n 및 RBP[m-Dros]n 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 단일 박테리아 콜로니를 50μg/ml의 암피실린을 포함하는 10ml의 TB 배지 (1차 초대 배양물)에 접종하고, 37℃, 150rpm으로 밤새도록 배양하였다. 50μg/ml의 암피실린이 첨가된 400ml의 TB 배지에 1차 배양물을 접종하고, 37℃, 200rmp으로 4시간 동안 배양하였다. 2차 초대 배양물을, 2L 플라스크 내의 미량의 성분을 포함하는 500ml의 CircleGrow에 접종하고 37℃, 200rpm으로 밤새도록 배양하였다 원심분리를 통해 박테리아 세포를 수득하고 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시텼다. 상기 재현탁시킨 샘플을 얼음 수조 상에서 50%의 전력으로 5분 동안 (20초 간격으로 10초 동안) 초음파 분해하여 세포 용해물을 수득하였다.
RBP[Dros]n은 기존에 보고된 바 있는 암모니아 설페이트 침전 및 가열법에 약간의 변형을 가하여 정제하였다. 초음파 처리된 샘플은 4℃에서 30분동안 16000rpm으로 원심분리하여 불용성 세포 잔해을 제거하고, 상청액에 PEI 용액 (0.5%)을 첨가하였다. 4℃에서 15분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 핵산 오염물을 분리시켰다. 투명한 수용성 용해물은 RBP[Dros]의 정제를 위하여 사용되었다. 30%의 최종 포화 상태인 암모니아 설페이트염을 4℃에서 교반시키면서 PEI가 처리된 샘플에 첨가하였고, 완전히 혼합시킨 뒤, 20분 동안 유지하였다. 4℃에서 20분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 응집된 단백질을 분리시켰다. RBP[Dros]n는 20%의 암모니아 설페이트 및 상기와 동일한 조건의 원심분리를 통해 분리시켰다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 과량의 PBS를 이용하여 상기 샘플을 투석하였고, 암모니움 설페이트 염을 제거하였다. RBP[Dros]n의 열적 안정성을 이용하여 추가적인 고순도의 정제물을 얻었다. 상기 샘플을 90℃에서 5분 동안 교반 및 가열시켜 오염된 단백질을 변성시켰으며, 상기의 고온 조건에서도 RBP[Dros]n은 가용화 상태를 유지하고 있었다. 실온에서 20분 동안 13000rpm으로 원심분리하여 변성된 단백질은 제거하였다. 상기 세포 펠렛은 버린 후, 상청액 내 존재하는 RBP[Dros]n을 추후 사용을 위해 보관하였다.
RBP[m-Dros]n의 정제를 위하여, 초음파 분해된 샘플을 4℃에서 30분 동안 16000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 3-5ml의 PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 20분 동안 65℃로 가열시켜 완전 용해시키고, 가열된 샘플을 실온에서 15분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 오염된 단백질을 제거하였다. 이때, RBP[m-Dros]n은 고온 조건에서도 가용화 상태를 유지하고 있었으므로 상청액 내 잔존하였다. 상청액을 4℃에서 30분 동안 냉각시킨 뒤, 다시 -20℃에서 5분 동안 냉각시킴으로써, RBP[m-Dros]n의 상 전이를 유발시켰고, 이는 탁도의 증가로 가시화되었다. 4℃에서 10분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 응집된 단백질을 분리시켰고, 세포 펠렛은 실온에서 PBS로 현탁되었다. 고온에서의 가용화 및 저온에서의 응집되는 일련의 사이클은 3회 더 진행되었고, 이를 통해 정제된 단백질을 수득하였다.
한편, 순도 및 분자량은 쿠마시 염색된 RBP[Dros]n 및 구리 염색된 RBP[m-Dros]n에 대한 SDS-PAGE를 통해 분석되었다. RBP[m-Dros]n의 상전이 거동은 자외선 가시선 분광광도계 및 동적 광산란 (DLS)으로 특성화하였다. 하한 임계 용액 온도의 경우, 25μM 샘플 용액을 50℃로 가열하고, 이후, 350nm에서의 광학 밀도(OD350)를 1℃/분의 가열 속도로 50℃에서 10C까지의 온도 함수로 측정하였다.
아가로스 겔 전기영동 분석을 통하여 336bp에서 2766까지로 다양한 반복 단위를 갖는 RBP[Dros]n 및 RBP[m-Dros]n 유전자 라이브러리를 확인할 수 있었고 (도 2A 및 도 2B), 도 3A 내지 3C은 쿠마시 염색된 RBP[m-Dros]24, RBP[m-Dros]30 RBP[Dros]8 각각의 분자량을 확인하였으며, 이를 기초로, RDL로 다중화시킨 RBP[m-Dros]n 및 RBP[Dros]n의 예상 분자를 표 5에 나타내었다.
[표 5] RDL로 다중화시킨 RBP[m-Dros] n 및 RBP[Dros] n 의 예상 분자량
Figure 112017028861298-pat00005
한편, 도 3D는 RBP[Dros]16의 열적 프로파일을 나타낸 것이다. 각각의 다른 농도 (PBS 내 25, 50, 100 uM)에서 RBP[Dros]16의 열적 프로파일은, 1℃/분 가열 속도로 10℃에서 85℃까지에서, 어떠한 전이도 보이지 않았다. 한편, 도 4A 및 4B에서는, 1/분 냉각 속도로 50℃에서 10℃까지에서, 350nm에서의 광학 흡광도(Absorbance350)의 변화를 통해 RBP[m-Dros]24 및 RBP[m-Dros]30의 열적 전이 거동을 확인할 수 있었다. 도 4 C 및 도 4 D에서는 상기 용액을 1℃/분 냉각 속도로 30℃에서 0℃까지 냉각시켜 형성된 RBP[m-Dros]24 및 RBP[m-Dros]30의 응집 형태를 확인하였다. 즉, RBP[m-Dros]n의 블럭 길이가 변화함에 따라 RBP[m-Dros]24 및 RBP[m-Dros]30는 다양한 UCST와 운점 (cloud point)을 나타내었다. 즉, 완전히 가용화되었던 RBP[m-Dros]n은 UCST 이하로 냉각시킴으로써 샘플의 혼탁도가 증가하게 되고, 이는 응집되었음을 의미한다. 이전 보고와 같이, 블럭의 길이가 길어질수록 UCST는 높아졌다.
실시예 6. EBPP - RBPP 이중 블럭 폴리펩타이드 유전자의 합성 및 발현
도 1C에 나타낸 바와 같이, EBPP-RBP 이중 블럭 유전자는 EBPP 유전자를 RBP 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입하여 합성하였다. 2개의 EBPP 유전자, EBPP[G1A3F2]6 및 EBPP[G1A3F2]12는 [Dros] 및 [m-Dros]의 서로 다른 블럭 길이로 융합되었다. 벡터의 제조를 위하여, 37℃에서 30분 동안 15U의 BseRI와 10U의 XbaI로 FastDigest 완충제에서 4μg의 플라스미드를 소화시켰다. 5' 말단은 37℃에서 1시간 동안 NEB 3 완충제 에서 10U의 CIP로 탈인산화시켰다. 제한된 벡터를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 삽입을 위하여, 플라스미드는 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 37℃에서 30분 동안 이중 소화되었다. 소화 후에, 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16℃에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터와 함께 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 상기 산물을 이용하여 화학적으로 수용 대장균 Top 10 세포들을 형질전환시켰으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도포하였다. 모든 블럭의 길이는 XbaI 및 AcuI에 의한 제한을 실시한 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였고, DNA 시퀀싱을 통해 추가로 확인되었다.
상기 융합 단백질의 발현을 위하여, EBPP-RBP 폴리펩타이드를 포함하는 pET-21a(+) 벡터로 대장균 BL21 (DE3) 세포를 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 250ml 플라스크 내 50 μg/mL의 암피실린을 포함하는 50ml의 CircleGrow 배지에 접종하였고, 이어서, 이를 2L 플라스크 내 500ml CircleGrow 배지 배양물에 접종하였다. 상기 플라스크는 200rpm의 잔탄 배양기에서 배양되었고, 광학 밀도(OD600)가 1.0에 도달했을 때, 최종 농도 1mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 상기 배양물은 배양 18 시간 후, 수득되었고, 융합 단백질은 ITC에 의해 정제되었다. 상기 세포 펠렛은 PBS에 재현탁되었고, 상기 재현탁된 샘플을 얼음 수조 상에서 초음파 분해 (VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT)하여 세포 용해물을 수득하였다. 4℃에서 15분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 세포 잔류물을 분리하였고, 가용화 상태의 용해물을 다른 튜브로 옮기고, PEI 용액을 첨가하여 혼합하여 최종농도 0.5% w/v에 이르게 하였다. 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 핵산 오염물을 분리하였다. 3 내지 4M의 최종 농도의 염화나트륨을 PEI 처리된 샘플에 첨가하여, 융합 단백질의 상 전이를 촉진시켰다. 40℃에서 30분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 응집된 융합 단백질을 분리하였다. 상기 응집 단백질을 냉각된 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 15분 동안 16000rpm으로 원심분리하여 잔존하는 불수용성 물질을 제거하였다. 상기 응집 및 재현탁 과정을 4-5회 반복실시하여 적절한 순도의 융합 단백질을 수득하였다.
실시예 7. EBPP - RBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 물리화학적 특성
도 5B는 소수성 EBP와 RBP[m-Dros]가 융합되어 자극 반응성을 지닌, 전환 가능한 미셀 구조를 형성하는 EBPP-RBP 이중 블럭 폴리펩타이드의 개략적인 모식도이다. 저온에서, 이중 블럭의 소수성 차이로 인해 코어-쉘 미셀 구조가 형성되고, EBPP는 이들의 LCST의 이하에서 가용화되는 반면, RBP[m-Dros]는 LCST의 이하의 온도에서 응집된다. 상기 RBP[m-Dros]는 EBPP의 LCST 이상의 온도에서도 응집된 채로 존재하며, 결국 블럭 전체가 응집체를 이룬다. 이러한 RBP[m-Dros] 코어와 EBPP 쉘로 이루어진 응집체는, UCST에서 RBP[m-Dros]이 가용화되어 고온인 ~ 80 ℃에서 미셀 구조를 다시 형성한다. EBPP-RBP[m-Dros] 이중 블럭에서 일반 미셀로의 자가 조립은 온도 감소에 의해 가역적으로 변화한다. 또한, EBPP [G1A3F2]6, 또는 EBPP[G1A3F2]12를 다양한 길이의 RBP[Dros]n 또는 RBP[m-Dros]n과 융합시켰을 때, 소수성 블럭 및 RBP[m-Dros]n의 길이 변화에 따른 예상 분자량 및 전이 온도(Tt)를 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6] 다른 블럭 길이를 갖는 EBPP - RBP 이중 블럭 펩타이드의 예상 분자량 및 전이 온도
Figure 112017028861298-pat00006
상기 이중 블럭 폴리펩타이드의 분자량은 23.55 내지 95.03 kDa였고, 도 6A 및 6C는 [G1A3F2]6을 포함하는 이중 블럭의 유전자 길이와 단백질 정제를 보여준다 (레인 1: RBP[m-Dros]3-EBPP[G1A3F2]6, 레인 2: RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]6, 레인 3: RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]6, 레인 4: RBP[m-Dros]24-EBPP[G1A3F2]6). 도 7A는 [G1A3F2]6을 포함하는 이중 블럭 폴리펩타이드의 열적 프로파일로서, EBPP[G1A3F2]6-RBP[m-Dros]3를 제외한 이중 블럭 폴리펩타이드는 미셀 형성, 응집체 형성, 미셀 구조의 재형성과 같은 3 단계 열적 전이 단계를 보여준다. 첫 번째 단계에서 소수성 RBP[m-Dros]3는 저온 조건에서 응집되어 코어를 형성하는 반면, EBPP는 가용성 상태로, 쉘의 역할을 수행한다. EBPP의 LCST 이상으로 온도가 상승함에 따라, EBPP 블럭의 열적 전이가 전체적으로 응집체를 형성하게 하는 두번째 단계가 시작된다. 세번째 단계에서는 70℃ 이상으로 증가하면서 급격한 흡광도의 감소가 관찰되고, 이는 RBP[m-Dros]의 가용화로 인한 가역적인 미셀 구조를 나타낸다.
상기 온도에서, EBPP[G1A3F2]6은 코어, RBP[m-Dros]24 등은 쉘의 역할을 수행한다. 단일 블럭의 UCST는 ~18℃였던 반면, 일례로서, EBPP[G1A3F2]6과 RBP[m-Dros]24의 융합은 EBPP[G1A3F2]6의 열적 전이까지 응집된 상태로 잔존하게 하기 때문에 이들의 UCST를 증가시켰다. EBPP[G1A3F2]6-RBP[m-Dros]3의 경우, 이들의 작은 분자량으로 인해 모든 온도에 걸쳐 EBPP[G1A3F2]6의 효과가 지배적이므로 미셀이 형성되지 않았다. 도 7B는 저온 및 고온에서 EBPP[G1A3F2]6-RBP[m-Dros]24의 크기를 측정한 결과를 보여준다. Rh는 25℃에서 68mm였던 반면, 85℃에서 34mm였다. 즉 이러한 온도 조절을 통해 이중 블럭 폴리펩타이드의 미셀 구조와 크기를 가역적으로 변화시킬 수 있었다.
도 8A는 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]n 이중 블럭에 대한 열적 프로파일을 보여준다. EBPP[G1A3F2]12를 포함하는 모든 이중 블럭 폴리펩타이드는 EBPP의 LCST 이하에서 가용화 상태였고, 그 이상에서는 응집되었으며, 모든 온도 범위에 걸쳐 응집된 상태로 잔존하였다. EBPP의 길이가 더 짧은 경우와는 달리, 저온 및 고온에서 미셀의 형성은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 RBP[m-Dros]는 저온 및 고온에서 소수성 블럭의 영향을 크게 받는다는 것을 나타낸다. 모든 온도 범위에서, EBPP[G1A3F2]12 블럭의 영향이 지배적이었는바, RBP[m-Dros]의 UCST는 관찰되지 않았다.
실시예 8. EBPP - RBP - EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드 유전자의 합성 및 발현
EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 펩타이드는 2 단계로 합성되었다; 첫 단계로서, RBP 유전자를 EBPP를 포함하는 플라스미드에 삽입하여 RBP-EBPP 블럭 공중합체를 형성하고, 두 번째 단계로서, EBPP 유전자를 RBP-EBPP를 포함하는 플라스미드에 삽입하였다. 벡터의 제조를 위하여, 37℃에서 30분 동안 15U의 BseRI와 10U의 XbaI로 FastDigest 완충제에서 4μg의 플라스미드를 소화시켰다. 5' 말단은 37℃에서 1시간 동안 NEB 3 완충제에서 10U의 CIP로 탈인산화시켰다. 제한된 벡터를 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 삽입을 위하여, 플라스미드는 10U의 XbaI와 15U의 AcuI로 37℃에서 30분 동안 이중 소화되었다. 소화 후에, 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 의해 반응 산물들을 분리하였고, 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 완충제에서 30분 동안 16℃에서 1U의 T4 DNA 리가아제를 갖는 30pmol의 선형화된 벡터와 함께 90pmol의 정제된 인서트를 배양함으로써 연결 반응을 실시하였다. 상기 산물을 이용하여 화학적으로 수용 대장균 Top 10 세포들을 형질전환시켰으며, 이어서, 이들을 50μg/ml의 암피실린이 보충된 SOC 플레이트 상에 도포하였다. EBP의 길이 및 RBP 유전자가 각기 다른 삼중 블럭 폴리펩타이드가 합성되었고, 모든 블럭의 길이는 XbaI 및 AcuI에 의한 제한을 실시한 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였으며, DNA 시퀀싱을 통해 추가로 확인되었다. 이후, 상기 융합 단백질의 발현은 실시예 6과 동일한 과정을 통해 진행되었다.
실시예 9. EBPP - RBP - EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드의 물리화학적 특성
도 5C는 EBPP-RBP-EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드로 구성되는 하이드로겔의 개략적인 모식도이다. 중간 블럭은 RBP [m-Dros]과 말단의 EBPP 블럭들로 구성된다. 저온에서 삼중 블럭 폴리펩타이드는 완전히 용해되며, 이는 EBPP의 LCST 이상에서 물리적으로 가교된 네트워크로 전환된다. 이러한 삼중 블럭 폴리펩타이드의 자가 조립은 온도 변화에 따라 가역적으로 상 전이(phase transition)가 일어날 수 있다.
생리적 조건 및 Tt 이상에서, 소수성 EBPP 블럭은 타이로신 잔기를 포함하는 중간의 친수성 RBP 블럭과 자가 조립되어 물리적으로 가교된 하이드로겔을 형성하였다. 상기 물리적으로 가교된 하이드로겔의 기계적 특성은 RBP 블럭 상의 타이로산 잔기의 화학적 가교 결합에 의해 향상되었다. 한편, EBPP [G1A3F2]12, 또는 EBPP[G1A3F2]24를 다양한 길이의 RBP[m-Dros]n과 융합시켰을 때, 소수성 블럭 및 RBP[m-Dros]n의 길이 변화에 따른 예상 분자량 및 전이 온도 (Tt)를 하기 표 7에 나타내었다. 또한, 물리적 가교에서의 효과를 확인하기 위해서, 펜타폴리펩타이드 반복 단위 내 첫 번째 아미노산 잔기만이 상이한 EBPP 또는 EBPPI 라이브러리 ("Val" 또는 "Ile")는 동일한 RBP[m-Dros] 블럭과 융합되었다.
[표 7] 다른 블럭 길이를 갖는 EBPP (I)- RBP - EBPP (I) 삼중 블럭 펩타이드의 예상 분자량 및 전이 온도
Figure 112017028861298-pat00007
EBPP[G1A3F2] 블럭 길이가 증가함에 따라 전이 온도는 더 낮아졌다. 특히, EBPPI 라이브러리를 갖는 삼중 블럭 폴리펩타이드는 동일한 블럭 길이를 갖지만, EBPP 라이브러리를 갖는 다른 삼중 블럭 폴리펩타이드에 비해 가장 낮은 전이 온도(Tt)를 나타내었다. 즉, EBPPI[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPPI[G1A3F2]12의 LCST는 동일한 길이를 갖지만 EBPP 라이브러리를 갖는 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]12 삼중 블럭 폴리펩타이드에 비해 훨씬 낮았다. 이러한 Tt의 현저한 감소는 펜타펩타이드 반복체의 첫 번째 위치에서 “Val"이 상대적으로 소수성 성격이 강한 “Ile"으로 대체되었음에 기인하는 결과이다.
도 6B 및 6D는 [G1A3F2]6을 포함하는 삼중 블럭의 유전자 길이와 단백질 정제를 보여준다 (레인 1: EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]12, 레인 2: EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]12, 레인 3: EBPP[G1A3F2]24-RBP[m-Dros]6-EBPP[G1A3F2]24, 레인 4: EBPP[G1A3F2]24-RBP[m-Dros]12-EBPP[G1A3F2]24). 또한, 도 8B는 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]n-EBPP[G1A3F2]12 삼중 블럭 폴리펩타이드에 대한 열적 프로파일을 보여준다. 상기 삼중 블럭 폴리펩타이드의 열적 프로파일 패턴은, 모든 온도 범위에서, EBPP[G1A3F2]12 블럭의 영향이 지배적이었던 이중 블럭 폴리펩타이드의 결과와 유사하였다.
도 9는 하이드로겔의 물리적 가교와 관련하여, 펜타폴리펩타이드 반복체의 첫번째 위치의 "Val"을 "Ile"로 대체하였을 때의 효과를 확인하기 위한, EBPPI 라이브러리 (Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly)를 갖는 삼중 블럭 폴리펩타이드의 순도 및 특성을 보여준다. 도 9A는 EBPPI[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6-EBPPI[G1A3F2]12의 SDS-PAGE 겔로서 단일의 정제된 밴드를 보여준다. 도 9B는 PBS 내 25uM 농도에서의 열적 프로파일로서, Tt 이하에서의 완전 용해 및 LCST 이상에서의 급격한 응집을 보여준다.
도 10은 pH 7.4의 10 mM PBS 완충액에서 EBPP[G1A3F2]12-RBP[m-Dros]6- EBPP[G1A3F2]12의 가역적인 졸-겔 전이 거동에 대한 사진 이미지이다. EBPP의 Tt 이하에서, 삼중 블럭 폴리펩타이드는 용해 상태였고, 온도가 증가함에 따라 응집체로 전환되고 물리적으로 가교된 네트워크를 형성하였다. 이러한 응집은 온도를 낮춤에 따라 다시 용해되었고, 이러한 결과는 물리적 가교된 하이드로겔의 가역성을 나타내는 것이다.
실시예 10. EBPP - RBP - EBPP 삼중 블럭 폴리펩타이드의 레올로지 측정
다양한 농도의 EBPP-RBP-EBPP 폴리펩타이드 용액을 인산 완충 용액 (PBS, pH 7.4)을 이용하여 제조하였고, 동적-전단 레올로지 테스트(dynamic-shear rheological test)로 상기 용액을 연구하여 탄성율(G′), 손실 탄성율(G″), 복소 전단 탄성계수(G*), 복소 점도(η*), 및 손실 각(δ)을 온도와 주파수의 함수로서 정량화하였다. G′은 재료의 탄성 거동을 특징화하는 한편, G″은 그 재료의 점성 거동을 특징화한다. G*와 η*는, 점탄성 액체 또는 고체의, 주파수 의존 강성도 및 주파수 의존 점성 드래그를 각각 나타낸다. 손실 각(δ)은 탄성에 대한 점성의 상대 측정값이다(뉴턴 점성 유체:δ = 90°; 탄성 고체:δ = 0°). 완전 가용화 상태 하에서의 금속 용제 트랩을 사용하여 10℃ 내지 40℃의 온도 범위에 걸쳐 용제 증발을 방지하였다. 독립적 스트레인 스위프 테스트 (스트레인 스위프 범위: 0.2-20%, 각 주파수: 0.1, 1.0 10rad/s)에 의해 확인된 바와 같이, 서로 다른 온도에서 선형 점탄성 영역에서 동적 주파수 스위프 측정을 수행하였다. 각 주파수 범위는 주파수 스위치 테스트에 대하여 10℃ (Tt미만) 및 40℃ (Tt 초과)에서 0.1 내지 10rad/s이었다. 순방향 가열과 역방향 냉각 측정을 위해 도당 1분의 지속 기간으로 10℃ 내지 45℃의 온도 범위에 걸쳐 1rad/s와 2% 스트레인으로 온도 스위프 테스트를 실시하여 이들의 레올로지 성질 및 기계적 성질의 가역성을 조사하였다. 각 진동 전단 측정으로부터 저장 탄성율(G′), 손실 탄성율(G″), 복소 전단 탄성계수(G*), 복소 점도(η*), 및 손실 각(δ)을 얻었다. 재현성을 보장하도록 각 실험을 3회 반복 수행하였다.
도 11은 pH 7.4의 10 mM PBS 완충액에서 35 wt%의 EBPP[G1A3F2]12-[m-RBP]12- EBPP[G1A3F2]12의 레올로지 측정값을 나타낸다. 레올로지 특성 및 열적 가역성은 도 11A에 나타낸 바와 같이 10℃에서 40℃까지의 분당 1℃의 가열로부터 측정되었다. 37℃에서 손실 각(δ)은 57이었고, G' 및 G" 값은 약 76Pa 및 118Pa였다. G'와 G"간 교차점의 부재로 인해 Tt 이상에서는 물리적인 가교가 관찰되지 않았다. 도 11B는 교차점이 없는 G'와 G"에 의존적인 주파수 의존적 레올로지 거동을 보여준다.
도 12는 pH 7.4의 10 mM PBS 완충액에서 25wt%의 EBPPI[G1A3F2]12-[m-RBP]6-EBPP[G1A3F2]12에 대한 레올로지 측정값을 나타낸다. 도 12A는 저온 및 고온에서의 진폭 스위프 (1 rad/s 주파수)로서, 37℃에서 보다 높은 G'을 보여준다. 도 12B는 고온에서, 1rad/s에서 교차점을 갖는 주파수 의존적인 G' 및 G"를 보여주었으며, 이는 EBPPI의 Tt 이상에서 점탄성 고체임을 나타낸다. 도 12C 및 12D는 1℃/분의 가열 및 냉각 속도로 1에서 40까지의 온도 함수에 따른 레올로지 측정결과이다. 펜타펩타이드 반복단위 첫번째 위치의“Val"을 "Ile"로 대체시킨, EBPPI 라이브러리를 갖는 삼중 블럭 폴리펩타이드는 23℃에서 모둘러스 교차점을 지니며, 이는 열 전이 상에서의 겔 형성을 명확히 보여주었다. 이러한 겔화는 온도가 감소함에 따라 완전히 가역적으로 변화하였다. 상기 교차점 이하 및 이상에서 폴리펩타이드의 G' 및 G" 값은 EBPPI[G1A3F2]12-[m-RBP]6-EBPPI[G1A3F2]12가 EBPP[G1A3F2]12-[m-RBP]12-EBPP[G1A3F2]12에 비해 훨씬 높았고, 이는 펜타펩타이드 반복 단위 내 "Ile"은 소수성을 강화시켜 물리적 가교를 향상시킴을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Self-assembled nanostructures of elastin and resilin-based block copolypeptides with stimuli responsiveness and resilience for drug delivery system, tissue engineering, and regenerative medicine and methods of preparing thereof <130> P20161137KR_P16U22C2225 <150> KR 10-2016-0034372 <151> 2016-03-23 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or non-natural <400> 1 Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly Val Pro Gly Xaa Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or non-natural <400> 2 Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly Val Pro Ala Xaa Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin-based peptide, Xaa can be any amino acid, natural or non-natural <400> 3 Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly Ile Pro Ala Xaa Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 4 gtcccaggtg gaggtgtacc cggcgcgggt gtcccaggtg gaggtgtacc tgggggtggg 60 gtccctggta ttggcgtacc tggaggcggc 90 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 5 gttccagctg gcggtgtacc tgctgctgct gttccggccg gtggtgttcc ggcgggcggc 60 gtgcctgcaa taggagttcc cgctggtggc 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 6 gttccgggtg gtggtgttcc gggtaaaggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60 ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 7 gttccggcgg gtggtgttcc ggcgaaaggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60 gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 24 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 25 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 26 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 27 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 28 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 29 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 30 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 31 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 32 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 33 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 34 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 35 Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 36 Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 37 Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 38 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly 20 25 30 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 39 Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Cys Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 40 Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBP <400> 41 Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 42 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP[m-Dros]1 <400> 42 ggcggccgtc cgtcagattc ttatggcgca ccgggtgggg gtaatggcgg ccgtccatct 60 tcgagctatg gcgcaccggg ccaaggtaat 90 <210> 43 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP[Dros]1 <400> 43 ggggcgccgg gtggtggcaa cggtggtcgt ccgagcgata cctacggggc gccgggtggt 60 ggcaacggtg gtcgtccgag cgatacctac 90 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP[m-Dros]1 <400> 44 Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Asn 20 25 30 <210> 45 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP[Dros]1 <400> 45 Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn 20 25 30

Claims (20)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및
    상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 일측 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 1로 표시되는 자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드:

    [식 1]
    [소수성 EBP]m-[RBP]n
    상기 식 1에서,
    n 또는 m은 독립적으로 1 이상의 정수이고,
    상기 [RBP]는 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭으로서, 서열번호 44로 표시되는 아미노산으로 이루어지고,

    상기 [소수성 EBP]는,
    서열번호 1의 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23]; K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25]; D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 27]; E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29]; 또는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 31] 이거나; 또는
    서열번호 2의 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32]; K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33]; D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34]; K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 35]; D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 36]; H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 37]; H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 38]; 또는 G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 39]이거나; 또는
    서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 40]; 또는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 41] 것인, 자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서,
    상기 이중 블럭 폴리펩타이드는,
    상기 [소수성 EBP]의 하한 임계 용액 온도 이하에서, 자가-조립 (self-assembly)되어 [RBP] 블럭으로 이루어진 코어-[소수성 EBP] 블럭으로 이루어진 쉘로 구성되는 미셀 구조를 형성하고,
    상기 [소수성 EBP]의 하한 임계 용액 온도 이상에서, 응집체를 형성하고,
    상기 [RBP]의 상한 임계 용액 온도 이상에서, [소수성 EBP] 블럭으로 이루어진 코어-[RBP] 블럭으로 이루어진 쉘로 구성되는 미셀 구조를 형성하는, 동적 변화가 진행되는 것인 자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 동적 변화는 온도 자극에 따라 가역적인 것인, 자극 반응성을 가지는 이중 블럭 폴리펩타이드.
  9. 제3, 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항의 이중 블럭 폴리펩타이드를 포함하는, 약물 전달 조성물.
  10. 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭; 및
    상기 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 양 말단에 연결되는 상전이 거동을 가지는 폴리펩타이드 블럭을 포함하는, 하기 식 2로 표시되는 자극 반응성을 가지는 삼중 블럭 폴리펩타이드:

    [식 2]
    [소수성 EBP]m-[RBP]n-[소수성 EBP]m,

    상기 식 2에서,
    n 또는 m은 독립적으로 1 이상의 정수이고,
    상기 [RBP]는 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭으로서, 서열번호 44로 표시되는 아미노산으로 이루어지고,

    상기 [소수성 EBP]는,
    상기 [소수성 EBP]는 서열번호 1의 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 A(Ala), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 23]; K(Lys), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 25]; D(Asp), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 27]; E(Glu), G(Gly), I(Ile)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 29]; 또는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 31] 이거나; 또는

    서열번호 2의 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 32]; K(Lys), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 33]; D(Asp), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지거나 [서열번호 34]; K(Lys), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 35]; D(Asp), F(Phe)가 3:3의 비율로 이루어지거나 [서열번호 36]; H(His), A(Ala), I(Ile)가 3:2:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 37]; H(His), G(Gly)가 5:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 38]; 또는 G(Gly), C(Cys), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 39]이거나; 또는

    서열번호 3의 [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG] 블럭이고,
    상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:4:1의 비율로 이루어지거나 [서열번호 40]; 또는 G(Gly), A(Ala), F(Phe)가 1:3:2의 비율로 이루어지는 [서열번호 41] 것인, 자극 반응성을 가지는 삼중 블럭 폴리펩타이드.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제10항에 따른 삼중 블럭 폴리펩타이드에 열 자극을 가하는 단계; 및
    상기 온도 자극에 의하여 삼중 블럭 폴리펩타이드간 가교 결합을 형성하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는, 하이드로겔.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 가교 결합은 [소수성 EBP]의 하한 임계 용액 온도 이상에서 형성되는 [소수성 EBP]블럭 사이의 물리적 가교 결합인 것인, 하이드로겔.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 온도 자극에 의해 가역적인 졸-겔 또는 겔-졸 전이가 이루어지는 것인, 하이드로겔.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 레질린 기반 폴리펩타이드 블럭 사이의 타이로신 잔기간 화학적 가교 결합에 의해, 기계적 강도가 증진되어 있는 것인, 하이드로겔.
  18. 제14항의 하이드로겔을 포함하는, 약물 전달용 조성물.
  19. 제14항의 하이드로겔을 포함하는, 조직공학용 지지체.
  20. 제14항의 하이드로겔을 포함하는, 조직 또는 기관 재생용 키트.

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