CN109957117B - 类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
一种类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶及其制备和应用方法,通过构建类节肢弹性蛋白基因(R4)x的表达载体,并将其导入表达宿主细胞中,经分离纯化和光化学处理后得到水凝胶。本发明以弹性效率最高的节肢弹性蛋白的基因重组蛋白为基质,提高了水凝胶的生物相容性和可降解性,通过修饰蛋白的石墨烯片层与类节肢弹性蛋白的高回复性(>97%)的紧密交联,制备得到适用于制作应变传感器的水凝胶材料。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物柔性电子材料领域的技术,具体是一种类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶及其制备和应用方法。
背景技术
柔性电子元件与传统的刚性电子元件相比,在使用中具有极大的灵活性与延展性,是一种新兴的电子技术。一般的以有机高分子材料作为基质的柔性电子元件(例如聚酰亚胺,聚醚醚酮或透明导电聚酯)具有高韧性以及可加工性,但是生产条件严苛,生物相容性以及可降解性差,而蛋白基的柔性电子元件则不存在以上问题。基于蛋白水凝胶的柔性电子元件,以生产过程绿色环保、生物相容性好、可降解以及与生物组织相似的理化特性等受到许多研究者的青睐。其中,自粘附性的导电蛋白水凝胶在可穿戴健康检测设备中具有不可忽视的应用前景。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足,提出一种类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶及其制备和应用方法,以弹性效率最高的节肢弹性蛋白的基因重组蛋白为基质,提高了水凝胶的生物相容性和可降解性,通过修饰蛋白的石墨烯片层与类节肢弹性蛋白的高回复性(>97%)的紧密交联,制备得到适用于制作应变传感器的水凝胶材料。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种类节肢弹性蛋白水凝胶的制备方法,通过构建类节肢弹性蛋白的表达载体,并将其导入表达宿主细胞中,经重组蛋白表达、分离纯化、石墨烯偶联和光化学处理后得到水凝胶。
所述的类节肢弹性蛋白是指:由类节肢弹性蛋白保守肽段(氨基酸序列如SeqIDNo.1所示,即GGRPSDSYGAPGGGN)串联体构成的蛋白质。
上述类节肢弹性蛋白保守肽段的氨基酸序列来源于文献Ardell D H,Andersen SO.Insect biochemistry and molecular biology,2001,31(10):965-970。
所述的表达载体是指:n个所述类节肢弹性蛋白保守肽段串联体的表达质粒载体,其中n为4-128中的任意整数。
所述的构建是指:将类节肢弹性蛋白保守肽段四联体重组表达质粒pET19b-R4分别进行限制性内切酶PvuI-NheI和PvuI-SpeI双酶切,所得到的两个含有类丝节肢弹性蛋白基因的片段,借助连接酶进行连接,得到长度括增至两倍的类节肢弹性蛋白保守肽段八联体重组表达质粒。以得到的八联体重组表达质粒作为供体质粒,分别用PvuI-NheI和PvuI-SpeI双酶切回收含有类丝节肢弹性蛋白基因片段,再借助连接酶进行连接,即可得到长度为十六联体重组表达质粒。同理,以表达m1和m2个类节肢弹性蛋白保守肽段四联体的重组表达质粒作为供体,分别用PvuI-NheI和PvuI-SpeI双酶切回收含有类丝节肢弹性蛋白基因片段,再借助连接酶进行连接,即可得到长度为m1+m2个类节肢弹性蛋白保守肽段四联体重组表达质粒,这里的m1和m2可以是1-16之间的任意一个正整数。
所述的类节肢弹性蛋白保守肽段四联体重组表达质粒pET19b-R4来自文献Huanget al.,ACS Biomaterials Science&Engineering,2017,3,1576-1585。
所述的连接酶为T4 DNA连接酶。
所述的重组蛋白表达是指:将编码若干个类节肢弹性蛋白保守肽段串联体的类节肢弹性蛋白表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)(购自天根生化科技有限公司),对重组菌进行培养,并用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导类节肢弹性蛋白的表达。
所述的分离纯化是指:利用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析分离纯化得到目标蛋白。
所述的石墨烯偶联是指:通过EDC/NHS反应活化氧化石墨烯的羧基基团,与类节肢弹性蛋白N端的氨基发生缩合反应形成肽键,将蛋白质修饰至石墨烯上,得到石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物。
所述的光化学处理是指:向含有石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物rGO-(R4)X、类节肢弹性蛋白(R4)x的混合溶液加入过硫酸铵、氯化三(2,2'(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物([Ru(bpy)3]2+)以及甘油、乙二醇或聚乙二醇200中的一种混合均匀后通过白光照射反应以形成水凝胶。
所述的类节肢弹性蛋白(R4)x在水凝胶中的浓度为50-400mg/mL。
所述的石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物rGO-(R4)X在水凝胶中的浓度为0.1-10mg/mL。
所述的甘油、乙二醇或聚乙二醇200中的一种在水凝胶中的浓度为1%-40%wt。
本发明通过上述方法制备得到的水凝胶,其孔径均匀,拉伸杨氏模量为7.5-140kPa,粘附强度范围为5-45kPa,电导率为0.1-2S m-1;在拉伸情况下的响应系数为1-10,压缩情况下,在小于10kPa的压强下的灵敏度达到0.05-2kPa-1,由于蛋白基质的超高的回复性,使得电学信号在施加力与撤除力后电流信号稳定。
本发明涉及上述方法制备得到的水凝胶的应用,将其用于制备应变传感器,优选制备粘附在人体皮肤表面的生物相容性可穿戴设备的应变传感器。
技术效果
与现有技术相比,本发明以弹性效率最高的节肢弹性蛋白的基因重组蛋白为基质,提高了水凝胶的可延展性、生物相容性和可降解性。同时,目前已知的载流电子迁移率最高的石墨烯作为导电活性物质可以很大程度上提高材料的导电性,利用EDC/NHS反应活化氧化石墨烯的羧基基团与聚合物的氨基发生缩合反应,此类方法可以实现节肢弹性蛋白的导电功能化,拓展了类节肢弹性蛋白水凝胶的应用。此外,类节肢弹性蛋白的高回复性(>97%)以及与修饰蛋白的石墨烯片层交联紧密,在高应变条件下依然具有稳定的可回复的电阻变化,并且在小应变条件下具有较高的灵敏度。
附图说明
图1为实施例中R8、R32和R64的SDS-PAGE图及其表征,箭头所指为目标条带;
图2为R64的甘油/聚乙二醇200/乙二醇水凝胶的搭接剪切实施例,表征粘附强度;
图3为R64不同浓度的甘油水凝胶的搭接剪切实施例,表征粘附强度;
图4为石墨烯甘油蛋白水凝胶(rGO-R64-20%Gly)的应力-应变曲线;
图5为rGO-R64-20%Gly水凝胶的回复性测试示意图,如图可见在低应变条件下有很好的回复性;
图6为搭接剪切实施例,测定石墨烯-蛋白甘油水凝胶的粘附强度;
图7为拉伸状态下的电阻变化率-应变曲线;
图中实心点为实施例测得数据,灰色直线为拟合直线,得到应变灵敏系数为3.415;
图8为应变为100%时,电流信号的疲劳性测试;
图中曲线的波峰为基线电流,波谷为拉伸后的电流;
图9为压缩状态下的电阻变化率-压强曲线;
图中实心点为实施例测得数据,灰色直线为拟合直线,得到在10kPa以下的压强作用下,水凝胶的应变灵敏度为0.114kPa-1;
图10为在9.8kPa压力作用下的水凝胶电流信号的疲劳性测试;
图中曲线的波谷为基线电流信号,波峰为利用50g的砝码施加压力后的电流信号;
图11为粘附在手指关节的水凝胶应变传感器随手指弯曲伸展过程的电流变化信号;
图中信号的波峰为手指伸展状态的电流,波谷为手指弯曲后的电流;
图12为粘附在喉咙处的水凝胶随吞咽行为的电流变化;
图中箭头所指的尖峰为吞咽动作的电流信号
图13为粘附在喉咙处的水凝胶随发音行为的电流变化;
图中的虚线框分别对应发音为“hu”和“xiao”的电流信号;
图14为甘油蛋白水凝胶与石墨烯甘油蛋白水凝胶的形貌示意及其放大图。
具体实施方式
实施例1
载体的构建:本实施例通过构建目标蛋白的表达载体,并将该表达载体导入大肠杆菌中实现表达生产,通过以下具体操作实现:利用限制性内切酶和连接酶,构建产生了编码1-32个GGRPSDSYGAPGGGN四联体(R4)x的表达载体,此处x表示1-32的任意一个正整数。然后,将不同载体分别转化进入表达宿主细胞中,将该菌株在含氨苄青霉素(0.1mg/mL)的4mLLB培养基中37℃培养12h至OD600为1.8~2.0时,以2%的接种量转入含氨苄青霉素的50mLR/2培养基中,37℃培养7-8h至OD600为2-3时,以10%的接种量转入体积为5L,含有氨苄青霉素的2L R/2培养基中,以溶氧控制补料,溶氧设置为40%,37℃培养至OD600为40-50时,降低温度至30℃。加入终浓度为1mM IPTG诱导6h后收菌,期间以pH联动补料,pH波动范围为上下0.05。
上述操作中涉及到的菌株、质粒、酶、抗生素、诱导剂和培养基分别为:克隆宿主大肠杆菌Escherichia coli DH5α,表达宿主大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3);表达质粒pET-19b;同尾酶NheI和SpeI,PvuI限制性内切酶,T4 DNA连接酶;氨苄青霉素;IPTG;LB培养基,R/2培养基。
所述的LB培养基的成分包括:10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
所述的R/2培养基的成分包括:组分A,2g/L(NH4)2HPO4、6.75g/L KH2PO4、0.93g/L一水合柠檬酸、0.5%(v/v)微量金属;组分B,10g/L葡萄糖、0.7g/L七水合硫酸镁。
所述的补料液成分包括:700g/L葡萄糖、20g/L七水合硫酸镁。
实施例2
目标蛋白的获取:本实施例中,按照1g的湿菌体对应10mL低浓度缓冲液的比例重悬实施例1中得到的菌体;高压破碎后12000rpm离心得到上清,上清经0.45μm的滤膜过滤,平衡缓冲液平衡Ni-Sepharose柱子后上样。用除杂缓冲液洗去非特异性结合的蛋白后,再用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。以截流量为3kDa和10kDa的浓缩管将目标蛋白浓缩到10-20mg/mL,将浓缩后的蛋白溶液放入-80℃的冰箱中冷冻12个小时,真空干燥机干燥48h。
将纯化出的洗脱液上样于还原条件下的SDS-PAGE,如图1所示。图中箭头所指的条带为目标蛋白(R4)x。
所述的平衡缓冲液是指:含有20mM Tris.HCl、150mM NaCl和5mM咪唑的水溶液。
所述的除杂缓冲液是指:含有20mM Tris.HCl、150mM NaCl和65mM咪唑的水溶液。
所述的洗脱缓冲液是指:含有20mM Tris.HCl、150mM NaCl和250mM咪唑的水溶液。
实施例3
目标蛋白与石墨烯的偶联:将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到100mM 2-[吗啉]乙磺酸缓冲液(pH6.0)中,终浓度为5mM,并加入氧化石墨烯,终浓度为2mg/mL;然后向混合物中加入N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulo-NHS),终浓度为10mM并在室温下反应30分钟。然后加入等体积的100mM磷酸盐(PBS)缓冲液,pH调节至7.5。将(R4)x蛋白(终浓度为10mg/mL)加入到氧化石墨烯溶液中,使反应在室温下进行2小时。随后,使用具有Ultracel-10K超滤膜的浓缩管将氧化石墨烯-(R4)X产物与过量的EDC,EDC副产物和Sulo-NHS分离。产物用去离子水洗涤5次,用5mM抗坏血酸在85℃下还原1h。然后用去离子水洗涤rGO-(R4)X产物,冻干2天,即得到石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物rGO-(R4)X。
实施例4
黏附水凝胶的制备:将目标蛋白(R4)x冻干样品分别溶解于相同浓度的多元醇类溶剂甘油/乙二醇/聚乙二醇200的50mM磷酸(pH7.2)缓冲液中,待蛋白完全溶解后,加入过硫酸铵和[Ru(bpy)3]2+混合均匀。随后,将溶液倒入矩形模具(30mm×6mm×1.5mm)中,照射3分钟。搭接剪切实施例得到的水凝胶粘附强度的结果表明,存在最适的溶剂种类,使得水凝胶的粘附强度达到最大,甘油/乙二醇/聚乙二醇200作为溶剂得到的水凝胶粘附强度分别为23.75±2.28kPa,5.64±0.92kPa,2.44±0.36kPa,如图2所示。
将目标蛋白(R4)x冻干样品分别溶解于不同浓度的甘油的50mM PB(pH7.2)水溶液中,待蛋白完全溶解后,加入过硫酸铵和[Ru(bpy)3]2+混合均匀。随后,将溶液倒入矩形模具(30mm×6mm×1.5mm)中,照射3分钟。搭接剪切实施例得到的水凝胶粘附强度可以在10~100kPa之间进行调控,如图3所示。
本实施例中所述的类节肢弹性蛋白(R4)x重复片段X>32;
所述的甘油的PB缓冲溶液为溶剂是指:10%(w/w),20%(w/w)和30%(w/w)甘油的50mM PB缓冲液,pH为7.2。
实施例5
黏附导电水凝胶的制备:将实施例2中得到的类节肢弹性蛋白(R4)x冻干样品溶解于50mM PB(pH7.2)中并加入实施例3中的石墨烯蛋白偶联物rGO-(R4)X,使石墨烯的浓度达到2mg/mL,甘油浓度为20%,蛋白质终浓度为200mg/mL。待蛋白完全溶解后,加入过硫酸铵和[Ru(bpy)3]2+混合均匀。随后,将溶液倒入矩形模具(30mm×6mm×1.5mm)中,照射3分钟。
所述的水凝胶中蛋白质、rGO-(R4)X、甘油、过硫酸铵和[Ru(bpy)3]2+的最终浓度分别为200mg/mL、2mg/mL、20%、20mM和0.2mM。
本实施例中,利用万能试验机对石墨烯蛋白甘油水凝胶进行力学性能测定,结果表明该种方法制得的水凝胶具有较好的韧性,可以承受人体皮肤运动扭曲等活动,并且具有适中的粘附性,可以很好地粘附在皮肤上,不会轻易脱落,如图4-6所示。
本实施例中,利用万用表与万能试验机联用,可以测得rGO-(R4)X-Gly导电粘附水凝胶的应变响应灵敏系数以及突出的耐疲劳性,如图7-10所示。
实施例6
本实施例是利用石墨烯蛋白甘油水凝胶作为柔性电子元件粘附在人体皮肤表面的制备方法。
本实施例将实施例5中得到的rGO-(R4)X-Gly导电粘附水凝胶连接到电化学工作站仪器中,形成一个闭合回路,将两端连接有电极的水凝胶粘附在皮肤表面,如手指关节,喉咙处,对大幅度的运动行为例如手指弯曲,以及小幅度的生理活动,例如吞咽与说话等行为进行检测。结果显示,对于大幅度甚至小幅度的动作都能通过使水凝胶发生形变而改变水凝胶的电阻变化,从而传递特征的电流信号,如图11-13所示。
所述的闭合回路电压为3V的恒定电压,连接方式为电极接口夹住两端包有铜箔的水凝胶。
本实施例中所述的水凝胶的SEM图,如图14所示。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整,本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限,在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶及其制备和应用方法
<130> fnb530e
<141> 2019-03-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 果蝇(melanogaster)
<400> 1
Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn
1 5 10 15
Claims (7)
1.一种类节肢弹性蛋白黏附导电水凝胶的制备用方法,其特征在于,通过构建类节肢弹性蛋白保守肽段串联体构成的蛋白编码基因的表达载体,并将其导入表达宿主细胞中,经重组蛋白表达、分离纯化、石墨烯偶联和光化学处理后得到水凝胶;
所述的类节肢弹性蛋白保守肽段的氨基酸序列如Seq ID No.1所示;
所述的表达载体是指:n个所述类节肢弹性蛋白保守肽段串联体的表达质粒载体,其中n为4-128中的任意整数;
所述的石墨烯偶联是指:通过EDC/NHS反应活化氧化石墨烯的羧基基团,与类节肢弹性蛋白N端的氨基发生缩合反应形成肽键,将蛋白质修饰至石墨烯上,得到石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物;
所述的光化学处理是指:向含有石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物rGO-(R4)X、类节肢弹性蛋白(R4)x的混合溶液加入过硫酸铵、氯化三(2,2'(2,2'-联吡啶)钌(II)六水合物([Ru(bpy)3]2+)以及甘油、乙二醇或聚乙二醇200中的一种混合均匀后通过白光照射反应以形成水凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的分离纯化是指:利用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析分离纯化得到目标蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的类节肢弹性蛋白(R4)x在水凝胶中的浓度为50-400mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的石墨烯类节肢弹性蛋白偶联物rGO-(R4)X在水凝胶中的浓度为0.1-10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的甘油、乙二醇或聚乙二醇200中的一种在水凝胶中的浓度为1%-40%wt。
6.一种根据权利要求1~5中任一所述方法制备得到的水凝胶,其特征在于,孔径均匀,拉伸杨氏模量为7.5-140kPa,粘附强度范围为5-45kPa,电导率为0.1-2S· m-1;在拉伸情况下的响应系数为1-10,压缩情况下,在小于10kPa的压强下的灵敏度达到0.05-2kPa-1。
7.一种根据权利要求1~5中任一所述方法制备得到的水凝胶的应用,其特征在于,将其用于制备粘附在人体皮肤表面的生物相容性可穿戴设备的应变传感器。
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Rational Design and Hierarchical Assembly of a Genetically Engineered Resilin Silk-Copolymer Results in Stiff Hydrogels;Huang Sheng-Chen, et al;《ACS BIOMATERIALS SCIENCE & ENGINEERING》;20170613;第3卷(第8期);第1576页右栏至1577页左栏第1段,第1579页左栏第2段,图1 * |
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