JP2007531506A

JP2007531506A - 合成バイオエラストマー

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Publication number: JP2007531506A
Application number: JP2006529446A
Authority: JP
Inventors: クリストファー・マルコム・エルビン
Original assignee: コモンウェルスサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチオーガナイゼイション
Priority date: 2003-05-21
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2007-11-08
Also published as: EP1625161A4; US20070275408A1; WO2004104043A1; AU2003902483A0; EP1625161A1

Abstract

複数の繰り返し単位を含むポリペプチドであるバイオエラストマーであって、共通配列 SSXXYGXP、ここでSはセリン、Xは不特定のアミノ酸、Yはチロシン、GはグリシンそしてPはプロリンが存在し、ジチロシン結合形成を介して架橋されているが、ただし、バイオエラストマーはレシリンではない。

Description

本発明は合成バイオエラストマーに関し、より具体的には、そのアミノ酸配列がレシリン（resilin）の繰返し配列に由来するポリペプチドバイオエラストマーに関する。本発明はまた、ナノマシン、バイオセンサーなどの装置にも関し、特に、該ポリペプチドが、例えば、スプリング機構、即ち「ナノスプリング」の部分であるものに関する。本発明はまた、巨視的な用途におけるバイオエラストマーの使用も提供する。その他のポリペプチドとの融合タンパク質も本発明の一部を形成し、別の手段で形成されたハイブリッド分子と同様に、様々な用途に適用できる。

レシリンは、昆虫のクチクラの特定の領域に存在するゴム様タンパク質であり、公知の弾性材料のなかでもっとも有効なものである。該物質の弾性能は97%であるとされている;貯蔵エネルギーの3％しか熱として損失しない。それはクチクラに幅の広い弾性を与え、昆虫の飛行システムにおいてエネルギー貯蔵として、また、振動を吸収するものとして機能する。それはノミおよびバッタの跳躍システムにおいても利用されている。

レシリンについて最初に記載したのはWeis-Fogh (1960)であった。これはバッタの羽および、トンボの飛行筋肉組織における弾性の腱と結合する弾性の靱帯であった。レシリンは並はずれた弾性を示す(Weis-Fogh、1960)。トンボからの弾性の腱は、切れることなくその元の伸ばしていない長さの３倍以上に伸びることが出来、引っ張り力を緩和するとすぐに元の長さに戻る。サンプルを１週間引っ張った条件に維持した後でさえ、持続性の歪みはみられない(Weis-Fogh、1961a、1961b)。

レシリンはノミの跳躍機構 (Bennet-Clark and Lucey、1967) および多数のその他の昆虫の構造およびいくらかの甲殻類にみられる(Andersen and Weis-Fogh、1964)。それはすべての調べた昆虫および甲殻類 (ザリガニ)にみられたが、クモ形類には存在しないようである。

レシリンの２つのもっとも顕著な特性はその弾性と不溶性である。それは140℃より低温の水には不溶性である。多くの溶媒中で、特に、タンパク質溶媒、例えば、フェノール、ホルムアミド、ギ酸にはレシリンはかなり膨潤する。レシリンはまたチオシアン酸リチウムおよびエチレンジアミン銅といった、絹フィブロインおよびセルロースを溶解することが出来る溶媒の濃い溶液中であっても膨潤するが溶液とはならない。レシリンをメタノール、エタノールまたはアセトンに入れると、風乾した場合のように縮んで硬いガラス状物質となる。水中にもどすと、それはその弾性の特性にめだった変化をともなわずに元の大きさへと膨潤する(Weis-Fogh、1960)。

レシリンの弾性の特性はポリマー弾性の要求条件と合致する:架橋された分子は柔軟で配座が自由でなければならない。物質の弾性挙動を説明する２つの理論がある。第一はいわゆる「ゴム理論」であり、ゴム様の特性の原因は、動力学的に自由なランダムなポリマー分子のネットワークを変形させる際の配座イントロピーの減少にあるとする。第二はUrryおよびその同僚の理論であり(Urry、1988; Urry et al. 1995)、それは弾性機構はβらせん構造から生ずると提案する。レシリンおよびアブダクチン（abductin）はエントロピー性（entropic）エラストマーとして挙動し、変形において貯蔵されたエネルギーのほとんどすべてが回復する。しかし、アブダクチンはプロリン含量が低く、推定βターンを有さず、したがってβらせんも有さない。レシリンのアミノ酸組成はエラスチンとよりよくにており、プロリン、グリシンおよびアラニン含量が高い。にもかかわらず、これらの配列はアラインメントにおいて類似性を示さず、進化の基礎においても関連していないようである。

レシリンの重要な性質は不溶性レシリンの架橋された性質である。これはチロシン架橋によると示されており、その結果、ジチロシン部分が形成される (Andersen、1964; 1966)。レシリンの前駆体はおそらく可溶性の非-架橋ペプチド鎖であり、上皮細胞の頂端膜側から表皮下空間へと分泌され、そこでそれらは迅速に架橋して三次元の容易に変形可能なタンパク質ネットワークを形成する。

「Molluscan ligament polypeptides and genes encoding them」という標題の米国特許第6127166号には、アブダクチンにおける繰り返し配列に基づく軟体動物タンパク質が記載されており、それは新規な生物材料として利用することが出来る。アブダクチンをコードする遺伝子はレシリン遺伝子と関連しておらず(<30％同一性)、βターンの形成は推定されていない。アブダクチンについて同定されている繰返し配列はGGFGGMGGGXであり、これはチロシンを含まず、したがってレシリンのごとくジチロシン結合の形成を介して架橋することはできない。

少なくとも３つのβターン構造を含むポリペプチドが国際特許出願公開WO 98/05685号に記載されている。開示された繰返し配列はヒトのエラスチンに基づく。エラスチンは典型的にリジン側鎖の酸化と縮合を介して架橋して、デスモシンとイソデスモシンを含む加水分解産物を生ずる。ジチロシン架橋形成がβターンを結合させているという示唆はない。

国際特許出願公開WO 02/00686号はβターンの間に散在する動的架橋セグメントによって分離された一連の該βターンを形成する繰り返しペプチド単量体単位を有するバイオエラストマーを含むナノマシンを記載する。記載されたバイオエラストマーはチロシン含量が少なく、βターンを含む鎖の間のチロシン架橋の示唆はない。一方、ナノスケール規模における基礎的な機能単位はねじれたフィラメントであり、これは多数の個々の鎖の多機能性キャップとのカップリングを介して形成され、二本鎖フィラメントについてはアジピン酸であり、三本鎖フィラメントについてはKempトリ酸であり、四本鎖フィラメントについてはEDTAである。

発明の概要
本発明は、キイロショウジョウバエ（Drosophilia melanogaster）からのレシリン遺伝子のエキソン 1 から発現される組換えポリペプチドが、620 アミノ酸ポリペプチドのアミノ酸19-322しか存在しないのに、ジチロシン形成によって架橋され得、そしてバイオエラストマーを形成することが出来るという発見に基づく。共通配列は、この、およびその他の種の観察から得られ、同配列に基づく繰返し配列を有するポリペプチドを調製した。いかなる理論にも拘束されるつもりはないが、本発明によるアミノ酸配列を有するポリペプチドは一連のβターンを含み、それらはともにβらせんを形成し、それはナノマシンにおける容易に変形されるスプリング (「ナノスプリング」)として作用すること、および/またはジチロシン結合形成により架橋されて新規なバイオエラストマーを形成すること、ができる。

本発明の第一の態様によると、共通配列 SXXYGXPを有する複数の繰り返し単位を含むポリペプチドであるバイオエラストマーが提供され、ここで、Sはセリン、Xはアミノ酸、Y はチロシン、GはグリシンおよびP はプロリンであり、ジチロシン結合形成を介して架橋されているが、ただし、バイオエラストマーはレシリンではない。

本発明の一つの態様において、繰り返し単位は以下の共通配列を含む:
X₁X₂X₃X₄SX₅X₆YGX₇PX₈X₉X₁₀X₁₁
ここで:
X₁ は不在または任意のアミノ酸;
X₂ は不在または任意のアミノ酸;
X₃ は不在または任意のアミノ酸;
X₄ はPまたはS;
X₅ は荷電または極性アミノ酸;
X₆ は荷電または極性アミノ酸;
X₇ は AまたはP;
X₈ は GまたはA;
X₉ は不在、G または極性アミノ酸;
X₁₀ は不在、G または極性アミノ酸;そして、
X₁₁ は不在または任意のアミノ酸である。

ある態様において、X₁は存在する場合、G、Y、A またはNであり、もっとも好ましくはGである。

ある態様において、X₂は存在する場合、塩基性アミノ酸またはGであり、より好ましくは、G、LまたはQであり、もっとも好ましくは Gである。

ある態様において、X₃は存在する場合、塩基性アミノ酸 TまたはPであり、より好ましくは R、K、T または Pである。

X₄ は典型的には Pである。

X₅ は好ましくは D、TまたはSである。

X₆ は好ましくは S、QまたはTである。

X₇ は典型的には Aである。

X₈ は典型的には Gである。

X₉は存在する場合は好ましくは G、Qまたは Sであり、もっとも好ましくは Gである。

X₁₀は存在する場合は好ましくは G、S またはNであり、もっとも好ましくは Gである。

X₁₁は存在する場合は好ましくは G、Q、P、SまたはNである。

ある態様において、X₈、X₉ およびX₁₀ の少なくとも１つはGであり、もっとも好ましくは X₈である。

繰返し配列は同じであっても異なっていてもよく、少なくともいくらかは上記配列からの変異を含んでいてもよい。

繰返し配列はリンカー配列によって連結していてもよく、それは典型的には1〜20 アミノ酸、より典型的には1〜10 アミノ酸そして一般的には1〜4 アミノ酸を含む。リンカー配列は存在せずに繰り返しが隣接していてもよく、あるいは上記配列にしたがった繰り返し単位のオーバーラップがあってもよい。

繰返し配列の長さは種々であり、その結果チロシン残基間の距離が異なることが理解されよう。それゆえ、ジチロシン架橋間により大きいまたはより小さい空間があり得、いかなる理論にも拘束される意図はないが、ナノスプリング材料における巻きの「緊張の程度」がこれによって影響をうけると考えられる。繰返し配列とリンカー配列の長さが通常となる限り、典型的にはチロシン残基は8〜34 アミノ酸残基、より頻繁には9〜24、そしてもっとも頻繁には10 〜14 残基によって分離される。

繰返し配列内、リンカー配列内またはその他の架橋されたポリペプチドの領域内にさらなるチロシン残基が存在してもよい。

繰り返しの数はいくつでもよいが、好ましくは1〜50の繰り返し、より好ましくは6〜40、より好ましくは8〜30、より好ましくは10〜 25そして一般的には 12 〜 20の繰り返しである。

本発明の一つの態様において、ポリペプチドは配列 GGRPSDSYGAPGGGNまたはGGRPSDTYGAPGGGNを有する繰り返し単位を含み、例えば、ポリペプチド RPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGである。ポリペプチドは図6に斜体で示すアミノ酸を含んでいてもよく、それはレシリン遺伝子のエキソン 1(配列番号1)からのものである。この態様で増幅される領域は完全なエキソン 1ではない。エキソン 1は塩基 54752-55771にわたるが、この態様において発現される領域は塩基 54805-55714を含む。この領域には推定シグナル配列は含まれず、開始メチオニンおよび６つのヒスチジン残基、次いで、配列PEPPVNS SDSYGPPASG および18の繰り返し単位が含まれる。ポリペプチドは配列番号1の断片であってもよく、あるいは配列番号3、配列番号7、配列番号14または配列番号27に示すアミノ酸配列を含んでいたとしてもかまわない。ポリペプチドは、例えば、配列番号2の一部、配列番号26 または該ポリペプチドをコードするあらゆる配列によってコードされているものでもよく、化学合成によって調製したものでもよい。

さらなる態様において、ポリペプチドは配列 PSSQYGAPAQTを有する繰り返し単位を含む。このより短い繰返し配列は該繰り返し単位を含む配列番号4からの断片を含むものでもよく、または配列番号15、17、25、29 または31のいずれかでもよく、あるいは配列番号17-24に示すDNA 配列によってコードされるポリペプチドでもよい。

さらなる態様において、ポリペプチドは配列 SSSYGAPまたはSSTYGAPまたはSTTYGAPを有する繰り返し単位を含む。

本明細書において用いる、「共通配列」との語は、配列の各部分においてもっともよくみられるアミノ酸を含むアミノ酸 (またはヌクレオチド) 配列であるが、いくつかのアミノ酸の性質または実体が未特定であってもよく、その場合、「X」という記号が常套の1文字アミノ酸コードの代わりに用いられる。常套の1文字アミノ酸コードが本明細書に渡って用いられており、当業者によく理解されているものである。すべての繰り返し単位がそっくりそのまま共通配列と一致しているわけではなく、それでも本発明のポリペプチドのβらせん構造は破壊されないが、ほとんどまたはすべての繰り返し単位は上記特定の配列を有することが理解されよう。

本発明の第二の態様によると、共通配列 SXXYGXPを有する複数の繰り返し単位を含む単離ポリペプチドが提供され、ここでSはセリン、Xはアミノ酸、Yはチロシン、GはグリシンそしてPはプロリンであり、ただし、ポリペプチドはプロ-レシリンではない。

単離ポリペプチドの態様は上記の通りである。

ある態様においてポリペプチドは配列番号25、27、29 または31に示すアミノ酸配列を有する。

本発明の第三の態様によると、第二の態様によるポリペプチドをコードする単離核酸が提供される。

ある態様において核酸は配列番号17-24、26、28または30の何れかに示すヌクレオチド配列を有する。

本発明の第四の態様によると、以下の工程を含むバイオエラストマーの調製方法が提供される:
(1) 第二の態様によるポリペプチドを提供する工程;
(2)架橋反応を開始させる工程;および
(3)バイオエラストマーを単離する工程。

本発明の第五の態様によると、第二の態様によるポリペプチドと第二のポリマー分子を含むハイブリッド分子が提供される。

単離ポリペプチドの好ましい形態は上記の通りである。

コア組換えタンパク質配列に以下の配列を加えて、ハイブリッド分子を作ってもよい:
A.イガイ足糸（Mussel byssus）タンパク質配列
B. クモ絹（Spider silk）タンパク質
C.コラーゲン
D.エラスチン
E.フィブロネクチン
F.グルテニン。

これらハイブリッドポリマーは新規な特性を示し、特性としては例えば、高い引っ張り強度に対する抵抗性、接着特性および細胞相互作用および細胞接着が挙げられる。

クモ網絹（spider dragline silk）タンパク質の組換え形態は、培養中の形質転換哺乳類細胞における発現が成功している(Lazaris et al. 2002)。

グルテニンタンパク質、特にHMW-GS (高分子量グルテニンサブユニット)はドウの弾性の特性の原因である (Parchment et al.、2001)。

イガイ（mussel）接着タンパク質である Mefp-1,2 および 3は大腸菌での発現がなされており、また化学的にも合成されている(Deming、1999)。

エラスチンは組換え形態で産生されている(Meyer and Chilkoti (2002)）。

単離ポリペプチドはヒスチジンタグ付加されたポリペプチドであるのが有利である。

本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて化学的に合成することが出来る。それは修飾レシリンの発現によっても調製することが出来る。特定の配列、鎖長および構造を有する反復性のタンパク質に基づくポリマーをコードする遺伝子の合成戦略は Meyer and Chilkoti (2002)に記載されている。

例えば、レシリン繰り返しの鎖状体を含むが、チロシン残基の数と配置が改変されたハイブリッドレシリン遺伝子を合成することが出来る。レシリン遺伝子繰り返しに付加されたハイブリッド配列を有する遺伝子を合成することも出来る。これらのさらなる遺伝子は足糸プラークタンパク質 (Mefp) 配列またはエラスチン配列またはフィブロネクチン細胞接着配列モチーフ (Arg-Gly-Asp-Ser/Val)またはクモ網絹タンパク質配列またはコラーゲン配列のいずれをコードするものでもよい。

これらハイブリッド遺伝子を次いで本発明に記載のものなどの新規な組換えタンパク質の生産用細菌発現ベクターにクローニングすればよい。

別の改変としては、水溶性合成ポリマーおよびよく規定されたタンパク質折り畳みモチーフ、この場合、レシリンポリペプチド単位、から編成されるハイブリッドヒドロゲル系の生産も含まれる。これらのヒドロゲルはコイルドコイルタンパク質ドメインの共同構造遷移により温度誘導性崩壊を経る。この系は、よく特徴づけられた水溶性合成ポリマーがタンパク質のよく規定された折り畳みモチーフと、操作された体積変化特性を有するヒドロゲル中で組み合わせることが出来ることを示す。この技術はWang et al (1999)によって記載されている。

ある態様において、上記の第一のポリペプチドと、第一のポリペプチドに融合した第二のポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。

融合タンパク質はジチロシン架橋によって架橋してもよいが、必ずしも架橋する必要はない。例えば、βらせんを形成するのに十分な数の一連のβターンを含む第一のポリペプチド（第一のポリペプチドは架橋されていてもよい）を、架橋していない第二のペプチドに融合させてナノマシンにおけるスプリング機構を形成することが出来る。あるいは第二のポリペプチドは、酵素（バイオエラストマーに機能を導入することが出来る）、免疫グロブリン、構造タンパク質、例えば、絹フィブロイン（編むことにより非常に軽い、弾力のある耐久性の糸またはフィラメントが得られる）またはその他のポリペプチドであってもよい。

本発明の第六の態様によると、スプリング機構として作用する第二の態様によるポリペプチドおよび該スプリング機構が作用する装置を含むナノマシンが提供される。

本発明の第七の態様によると、第二の態様によるポリペプチド、または第一の態様によるバイオエラストマーまたは第三の態様によるハイブリッド分子を含むバイオセンサーが提供される。

本発明の第八の態様によると、第一の態様によるバイオエラストマーまたは第四の態様によるハイブリッド分子からなる、またはそれらを含む製品が提供される。

図面の簡単な説明
図1は、エラストマーポリペプチドがどのように機能するかを示す略図である;

図2は、UDP-N-アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼにおけるβらせん構造を示す;

図3は、空間充てん模型を用いたβらせん弾性タンパク質構造の別の表示である;

図4は、タンパク質におけるジチロシン架橋の性質を示す;

図5は、例えば、チロシン架橋の形成によってつくられるバイオエラストマーにおける架橋の略図である;

図6は、キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子のアミノ酸配列を示す;

図7は、キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子のコード領域からのDNA 配列を示す;

図8は、プライマーRESF3およびRESPEPR1を用いたPCR 反応産物を示し、これによって、大腸菌における可溶性ショウジョウバエプロ-レシリンの発現と精製が達成されたことが示される;

図9は、レシリンクローンの部分的NdeI/EcoR1 消化を示す;

図10は、大腸菌における可溶性ショウジョウバエプロ-レシリンの発現と精製を示すゲルである;

図11は、ペルオキシダーゼ酵素により可溶性プロ-レシリンの架橋が起こったことを示すゲルである;

図12は、試験管Aにおける架橋されていないプロ-レシリンおよび試験管 Bにおける架橋されたレシリンのサンプルの写真である;

図13は、架橋されたレシリンの蛍光スペクトルをグラフで示す;

図14は、本発明によってクローニングされた組換えレシリンのアミノ酸配列を示す; そして、

図15は、レシリンの沈降平衡分析を示し、これによって可溶性レシリンの分子量評価が得られる;

図16は、実施例4の方法におけるレシリン産生を示すゲルである;

図17は、様々な誘導条件下のプロ-レシリン産生を示すゲルである;

図18は、ニッケルカラムから現れたフラクションを示すゲルであり、組換えプロ-レシリンの精製が示される;

図19は、自己誘導方法におけるレシリン産生を示すゲルである;

図20は、自己誘導方法における様々な培養条件下でのレシリン産生を示すゲルである;

図21は、γ線によるレシリン溶液の照射の１時間後におこる架橋を示すゲルである;

図22は、UVB 照射に曝した後に起こるレシリン溶液の架橋を示すゲルである;

図23は、リボフラビンの存在下でのUV 照射によるレシリンの架橋を示すゲルである;

図24は、白色光によるレシリンのフルオレセイン架橋を示すゲルである;

図25は、フルオレセイン架橋によるさらなる実験の結果を示す;

図26は、実施例14に記載の紫外線水銀ランプによるクマリン架橋の結果を示す;

図27は、フルオレセインをレシリンに加えた場合の白色光に対する曝露時間(分)に対して、レシリンにおけるチロシン残基からのジチロシン架橋形成のパーセンテージをプロットする;

図28は、実施例16に記載のレシリンエキソン1組換えタンパク質の光誘導架橋を示すゲルである。照射は10秒であった。レーン 1: 分子量標準; レーン 2: レシリンのみ; レーン 3: レシリン＋ S₂0₈; レーン 4: レシリン＋ ((Ru)II)(pby₃)²⁺; レーン 5: レシリン＋ S₂0₈; ＋ ((Ru)II)(PBY₃)²⁺;そして、

図29は、可溶性レシリン (PBS 中1mg/ml)架橋の程度に対する((Ru(II)(bpy)³)²⁺希釈の効果を示す。レーン 1: レシリン + S₂O₈ + ((Ru(II)(bpy)³)²⁺ (光無し); レーン 2: レシリン + S₂O₈; レーン 4: レシリン + ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 5: レシリン + S₂O₈ + 200μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 6: レシリン + S₂O₈ + 100μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 7: レシリン + S₂O₈ + 50μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 8: レシリン + S₂O₈ + 25μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 9: レシリン + S₂O₈ + 12.5μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 10: レシリン + S₂O₈ + 6.25μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 11: レシリン + S₂O₈ + 3.125μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺; レーン 12: レシリン + S₂O₈ + 1.56μM ((Ru(II)(bpy)³)²⁺;

図30は、様々な昆虫からのレシリン配列間の相同性を示す;

図31は、本発明によるペプチドの質量スペクトルである;そして、

図32は、様々なペルオキシダーゼによって生じるジチロシン蛍光を比較するグラフである。

発明の詳細な説明
レシリン遺伝子 (CG15920)は、キイロショウジョウバエのゲノム配列からショウジョウバエゲノムデータベースの分析によって暫定的に同定された(Ardell、DH and Andersen、SO (2001)）。該タンパク質はその他の弾性タンパク質、例えば、それぞれVPGVG およびGPGGX単位が顕著であるエラスチンおよびクモ鞭毛状絹（spider flagelliform silk）、に特徴的な短い繰返し配列を含む。これらの配列についてはそれらがβターンを形成しその結果得られる一連のβターンがβらせんを形成し(Ardell and Andersen、2001)、それが容易に変形されるスプリング (「ナノスプリング」)として機能している可能性があることが示唆された。

図1は、本発明におけるようなβらせん構造がどのようにして伸長した位置から静止位置に戻るかことができるのかを模式的に示す。これは、エラストマーポリペプチドのゴム状の性質にしばしば起因しているエントロピーによって駆動される工程である。図2および3は典型的なβらせん構造 (この場合、UDP-N-アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼからのもの)を示し、これは、図1に示すようにして伸長し、静止位置に戻ることが出来る。図2においてβ鎖は矢印で示す構造によって表される。これらはβターンモチーフによって連結しており、PGまたは GGの2アミノ酸配列によって一般的に開始する。複数のβターンモチーフがあることにより、β鎖が図2に示すタイプのβらせんを形成することが可能となり、これは図3にHMW タンパク質からのペプチドの空間充てん模型によって示す(出典: Parchment et al. (2001)）。チロシンは図4に示すようなフリーラジカル機構を介してジチロシンを形成することが出来る。本発明者らは、単量体単位の間のジチロシン架橋の形成を介してレシリンからバイオエラストマーを調製することに成功した。架橋されていない単量体単位も特定の用途、例えば、ナノマシンでの用途には有用である。

本発明の特に好ましい態様において、ポリペプチドは架橋されて溶液から不溶性ゲルを形成し、好ましくは溶液はタンパク質濃度が比較的高く、より好ましくはタンパク質濃度が10％ w/vを超える。当業者であればタンパク質の溶液が高濃度の方が有効に架橋されるが、経済的観点から非常に高濃度のタンパク質は用いられないことおよび、溶液に残ってしまうであろうタンパク質濃度には限界があることを理解するであろう。同様に、タンパク質濃度がより低い溶液も架橋されうるが、その結果得られるゲルの有効性はより低くなる。

あらゆる架橋手段が利用可能であるが、ただし、ジチロシン結合が形成されるものに限られる。かかる方法は当業者に周知であり、Malencik and Anderson (1996)に記載されており、その内容は引用により本出願に含める。

ある態様において酵素に媒介される架橋が行われうる。ペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼはタンパク質の間にジチロシン架橋を形成することが出来るが、チロシン残基に対するその特異的活性は、アルスロマイセス（Arthromyces）ペルオキシダーゼによって示される活性の約 1％にすぎない。この真菌の酵素の特有の性質はMalencik and Anderson (1996)によって同定され、カルモジュリン(２つの Tyr 残基しか含まない)の非常に大きいMW ポリマーへの架橋に用いられた。

その他の系もジチロシン架橋を介するタンパク質分子の架橋に用いることが出来る。例えば以下が含まれる:

その他のペルオキシダーゼも、可溶性レシリンを架橋してポリマーとするのに用いることが出来る。例えば以下が含まれる:
A. 線虫からのDuox ペルオキシダーゼ、これはクチクラにおけるチロシン残基の架橋の原因である。この酵素は、虫のクチクラタンパク質におけるジチロシンの形成をもたらすことが示されている (Edens et al. 2001)。
B.ウニオボペルオキシダーゼは、授精の直後の卵膜の硬化において重要な役割を果たしている。これら酵素をコードする遺伝子は２種のウニからクローニングされている(LaFleur、et al. 1998)。

ネッタイシマカという蚊の成熟卵からの絨毛膜ペルオキシダーゼ(Nelson et al. 1994)。この絨毛膜ペルオキシダーゼはチロシンに対してセイヨウワサビペルオキシダーゼの100倍をこえる特異的活性を有する。この酵素はインビトロでジチロシン形成を介するポリペプチドと絨毛膜タンパク質との架橋を触媒することが示された。この酵素は絨毛膜形成と硬化に必要である。さらなる態様において、非常に迅速に誘導される、トリス-ビピリジル Ru(I)錯体の電子受容体(electroniceptor)の存在下での可視光光分解であるPICUP (非修飾タンパク質の光誘導-架橋) 反応も架橋の誘導に用いることが出来る(Fancy and Kodadek、1999)。

照射の後、Ru(III)イオンが形成され、それが電子除去剤として働いて、ポリペプチド内、特にチロシン残基において炭素ラジカルが生じ、それによってジチロシン結合の形成が可能となる。この誘導方法により、可溶性レシリンまたはプロ-レシリン断片の非常に高分子量の凝集体への定量的変換が可能となる。さらにこの方法により、組換えレシリンを所望の形状の試験管に導入し、そこに含まれる組換えレシリンに照射することによってバイオエラストマーを便宜な形状にすることが可能となる。

さらなる態様において、γ線をレシリン単量体の架橋に用いることが出来るが、この照射への曝露の際にタンパク質に損傷を与えないように注意する必要がある。UVB 照射架橋もリボフラビンの存在下または非存在下で行うことが出来る。リボフラビンの非存在下では、かなりの量の架橋が１時間の照射により行われるが、リボフラビンが存在するとその時間をかなり短縮することが出来る。さらに、架橋は、クマリンの存在下で紫外光により、あるいはフルオレセインの存在下で白色光により行うことが出来る。ジチロシン架橋形成の程度を確認するためのジチロシンの分析は常套方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー測定によって行うことが出来る。

架橋の効果および単量体単位当たりの架橋の最適数を調べるには、架橋されたポリマーの弾性を当該技術分野において公知の方法で測定すればよい。架橋のレベルは結果として得られるレシリン繰り返しポリマーが必要な弾性を示す限りにおいて変動させうる。例えば、架橋がγ線による場合、架橋の程度は、照射の時間とエネルギーの関数となる。所望のレベルの架橋を達成するために必要な時間は架橋されていないポリマーを照射源に様々な時間間隔で曝して、結果として得られた架橋された材料の各時間間隔での弾性 (弾性係数)の程度を測定することにより容易に計算できる。この実験により、特定の用途に適当な弾性のレベルを生じるのに必要な照射時間を決定することが出来る (例えば、米国特許第4474851号参照、その内容を引用により本出願に含める)。

レシリン繰り返しポリマーは好ましくは軽度に架橋されたものである。好ましくは、架橋の程度は、5または10から100単量体単位当たり少なくとも約１の架橋であり、例えば、20〜50単量体単位当たり１つの架橋である。実際、本発明者らは、プロ-レシリン単量体における利用可能なチロシンのうち約 18％がプロレシリンの酵素的酸化の後に、ジチロシンに変換されていることを見いだした。

架橋の程度は反応中にモニターしてもよいし、反応体の測定量を用いてあらかじめ決定してもよい。例えば、ジチロシン架橋は蛍光性であるので、反応混合物の蛍光スペクトルを反応の経過中にモニターして、特定の時間での架橋の程度を決定すればよい。これは図14に示されており、反応および得られるバイオエラストマーの性質の制御を可能とする。所望のレベルの架橋が達成されると(あらかじめ決定した蛍光強度に達成することにより示される)、ペルオキシダーゼに触媒される反応を当業者に公知の方法でクエンチすればよい。

例えば、グルタチオンを添加してもよいし、 Malencik and Anderson (1996)に記載のようにグルタチオンおよびグルタチオンペルオキシダーゼ溶液にゲルを浸漬してもよい。

融合タンパク質は当業者に公知のクローニング技術によって産生することが出来る。あるいは、分子を連結するその他の手段を用いてもよく、例えば、共有結合、イオン結合および水素結合または静電相互作用、例えば、イオン・双極子相互作用、双極子間相互作用等が挙げられる。結合は、例えば、弾性成分の架橋について上記した方法によって形成することが出来る。第一の弾性成分との架橋を可能とするためには第二の成分において適当な化学部分を提供するのが必要であろう。かかる部分は当業者に周知であり、例えば、アミノ、およびカルボキシル基が挙げられる。第二の成分がタンパク質である場合、成分間の結合は組換え核酸技術によって行うことが出来る。

ハイブリッドレシリン分子は両方の成分を様々な数で含みうる。例えば(a)各成分を１分子含むものであってもよいし、 (b) 第一の成分を１分子と、第二の成分を複数分子(例えば、2〜500または10〜100）含むものであってもよいし、(c)第一の成分を複数分子と、第二の成分を１分子含むものであってもよいし、あるいは(d) 両方の成分を複数分子含むものであってもよい。挿入される配列の最適数と位置は当業者により決定できる。２成分の間の結合の程度と最終的なハイブリッドレシリン分子における各成分の相対数を変動させて両成分の機能を所望のレベルにて提供することができる。ハイブリッドレシリン分子には、第二の成分の断片が、レシリンポリペプチド配列内に挿入されているものも含まれる。あるいは、レシリン繰返し配列が第二の成分の分子内に挿入されているものでもよい。挿入される配列はタンデムに挿入しても交互に挿入してもよい。

例えば、強度と弾性をともに要求する生物材料を作るためには、第一の成分を荷重に耐えうる第二の成分と組み合わせればよい。荷重に耐えうる天然のポリマーの例としては、コラーゲンおよび絹または絹様タンパク質、例えば、昆虫 (またはクモ)-由来絹タンパク質が挙げられる。強度を与える第２の成分として使用できるその他の好適な型のポリマーとしては、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリエーテル、およびポリイミドが挙げられる。かかるポリマーを含むハイブリッドレシリン分子は様々な用途を有し、用途としては例えば、弾性が上昇した人工関節靱帯が挙げられ、ここで第二の成分はコラーゲンまたはその機能的断片である。コラーゲンの機能的断片としては以下の配列を含むものが挙げられる: Gly-Pro-Hyp、ここで Hypはヒドロキシプロリンである。

あるいは、カイコ、昆虫またはクモ絹タンパク質（silk protein) (フィブロイン等)あるいはその機能的断片を第二の成分として使用することにより、非常に軽量の、弾性および耐久力のある糸またはフィラメントを作ることが出来、それを織ることによって織物が得られる。かかる織物は、例えば、軍服の製造に有用である。フィブロインの断片は以下の配列を有するものを含む: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser、Ala-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala、Ser-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala、およびAla-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala。

本発明の材料、即ちレシリン繰り返しポリマーまたはハイブリッドレシリン分子は、様々な有用な物理形態で製造することが出来、例えば、織布または不織布、ゲル、フォーム、粉、または溶液が挙げられる。さらに、所望により、該材料は、例えば、医療用補綴、例えば、人工血管または人工関節の場合、製造時に、適当な形状に成形することができる。

インビボで用いる場合、特に対象、例えばヒト患者の体内で用いる場合、該材料は生体適合性であることが重要である。「生体適合性」材料は、変異原性、抗原性、炎症誘導性、発熱性または溶血性を実質的に示さない。さらに、それは実質的な細胞障害性、急性全身毒性、または皮内毒性のいずれも示してはならず、凝固時間を実質的に低下させるものであってはならない。これら望ましくない生理活性のインビボおよびインビトロ試験は当該技術分野で周知である;かかるアッセイの例としては、例えば、米国特許第5527610号に記載されており、その内容を引用により本出願に含める。また、インビボで用いる場合、該材料は生分解性である方がよい。

その高いグリシン含量、不溶性、化学的不活性性および生分解性に鑑みると、インビボ用途(例えば、補綴および組織接着-防止障壁)に用いられるレシリンポリペプチドおよびハイブリッド分子はおそらく実質的に生体適合性である。毒性または免疫原性が、例えば、問題の材料において起こる場合、かかる望ましくない効果を改良する方法は当該技術分野で公知である。例えば、それを化学物質、例えば、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)またはメタ過ヨウ化酸（metaperiodate）で処理することによる材料の「なめし」により毒性と免疫原性はともにかなり低下する。好ましくは、インビボ用途の装置を作るために用いられる材料は滅菌可能なものである。

レシリンを用いてナノマシンおよびバイオセンサーを作ることが可能である。

レシリンのエントロピーに駆動される伸長および弾性は以下を含む多くのナノマシン用途に利用できる:
(A) ナノマシンのMEMSへの適用。微小電気機械装置機能におけるかなりの改良。かかる装置の応答時間はミリ秒ほどの短さとなりうる。
(B)バイオセンサーへの適用。例えば、薬剤、生体異物および毒性化学物質の結合の感知。想定されるナノマシンは、連続して疎水的に折りたたまれた球状受容体タンパク質に結合したエラストマー、例えば、レシリンを含む。例えば、エラストマーであるタイチンにおける繰返し配列の300 残基当たり１つのリン酸残基の(キナーゼ認識配列、例えば、 RGYSLGへの)結合により、完全に疎水性のタイチンβバレルの折り畳み構造がほどけることが示された(Urry、2001)。これは測定されうる輪郭の長さを上昇させるであろう。
(C)ナノマシンエラストマーである sasのβバレルの吸音特性がUrry (2001)によって記載されている。

例えば、レシリン遺伝子の第一エキソン由来であって、その配列を図15に示す本発明のポリペプチドは、いずれの好適な方法でも製造しうる。かかるポリペプチドの化学合成が想定されるが、ポリペプチドを発現する発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換するのが好ましい。宿主-発現ベクター系の設計は完全に当業者の能力範囲内である。

本発明の目的に使用しうる発現系としては、これらに限定されないが、微生物、例えば、該ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージ DNA、プラスミド DNA、またはコスミド DNA 発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌、これらに限定されないが、大腸菌株 BL21 (DE3) plysS、BL21 (DE3)RP および BL21* そして枯草菌);組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母;組換えウイルス発現ベクター(バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV)で感染されたか、あるいは組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された植物細胞系; または哺乳類細胞ゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む組換え発現コンストラクトを担持する哺乳類細胞 (例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられる。

細菌系においては、多数の発現ベクターが発現させる遺伝子産物に意図される用途に応じて便宜に選択できる。例えば、かかるタンパク質を大量に産生したい場合は、容易に精製できる高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい。かかるベクターとしては、これらに限定されないが、大腸菌発現ベクター pETMCS1 (Miles et al、1997)、pUR278 (Ruther et al.、EMBO J.、2:1791、1983)、これらでは、コード配列がlacZ コード領域とインフレームにベクターに個々に連結されて融合タンパク質が生じる; pIN ベクター (Inouye & Inouye、Nucleic Acids Res.、13:3101、1985; Van Heeke & Schuster、J. Biol. Chem.、264:5503、1989);等が挙げられる。pGEX ベクターもまた、外来ポリペプチドをグルタチオン S-トランスフェラーゼ (GST)との融合タンパク質として発現させるのに用いることができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下での溶出によって容易に精製することが出来る。pGEX ベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むよう設計されており、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から遊離させることが出来る。

哺乳類宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系を利用することが出来る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のヌクレオチド配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三分裂リーダー配列、に連結させるとよい。このキメラ遺伝子を次いで、アデノウイルスゲノムにインビトロまたはインビボ組換えによって挿入すればよい。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域 E1または E3)における挿入の結果、感染した宿主中で生存でき、遺伝子産物を発現することが出来る組換えウイルスが生じる(例えば、Logan & Shenk、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:3655、1984参照)。挿入されたヌクレオチド配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナルも要求されうる。かかるシグナルとしては、 ATG 開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。その独自の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子またはcDNA 全体が適当な発現ベクターに挿入された場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要ではない。しかし、コード配列の部分のみが挿入された場合、外因性翻訳制御シグナル、例えばおそらく、ATG 開始コドンを提供する必要がある。さらに、開始コドンは、完全なインサートの翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠とインフレームでなければならない。これら外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源であり得、天然および合成のものがある。発現効率は適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含めることにより増強できる (Bittner et al.、Methods in Enzymol.、153:516、1987)。

さらに挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を特定の所望の様式で修飾およびプロセシングするよう宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のかかる修飾(例えば、グリコシル化およびHypおよびDOPA 残基の作成)およびプロセシング (例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。適当な細胞株または宿主系を、発現させる外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確保するように選択するとよい。哺乳類宿主細胞には、これらに限定されないが CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、および WI38が含まれる。

組換えタンパク質の長期の高収率の産生には、安定な発現が好ましい。例えば、上記の配列を安定に発現する細胞株を操作するのがよい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞を適当な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)および選択可能なマーカーによって制御されるDNAで形質転換するのがよい。外来DNAの導入後、操作された細胞を強化培地で１−２日間培養し、次いで選択培地に変更する。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組込み、増殖して病巣(foci)を形成するのを可能にし、それによって結局クローニングすることができ、拡張されて細胞株が得られる。この方法は遺伝子産物を発現する細胞株の操作に有利に用いることが出来る。かかる操作された細胞株は遺伝子産物の内因的活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。

融合タンパク質は、発現する融合タンパク質に特異的に結合する抗体またはリガンドの利用によって容易に精製することが出来る。例えば、Janknecht et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:8972、1991に記載の系によって、ヒト細胞株において発現した非変性融合タンパク質の容易な精製が可能である。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングされ、遺伝子のオープンリーディングフレームは６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳により融合する。組換えワクシニアウイルスで感染された細胞からの抽出物をNi²⁺ ニトリロ酢酸-アガロースカラムにローディングし、ヒスチジン-タグ付加されたタンパク質をイミダゾール含有バッファーにより選択的に溶出する。所望により、ヒスチジンタグは適当な酵素によって選択的に切断することもできる。

さらに、大量の組換えポリペプチドは遺伝子改変生物 (例えば植物または哺乳類)を用いて有利に得ることが出来、ここで該生物は、目的のポリペプチドをコードする外因性導入遺伝子を担持する (Wright et al.、Bio/technology、5:830、1991; Ebert et al.、Bio/technology、9:835、1991; Velander et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:12003、1993; Paleyanda et al.、Nature Biotechnology、15:971、1997; Hennighausen、Nature Biotechnology、15:945、1997; Gibbs、Scientific American、277:44、1997)。目的のポリペプチドは体の組織内で発現し、そして適当な生物の関連する組織または体液から精製される。例えば、導入遺伝子を乳腺で発現させることにより、タンパク質が哺乳類の乳汁に大量に分泌され、それからタンパク質を適宜精製すればよい (例えば、Wright et al.、前掲、Paleyanda et al.、前掲; Hennighausen、前掲)。

実施例 1
キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子のクローニング
レシリン遺伝子の第一エキソン(図6)をショウジョウバエ遺伝子の公知のDNA 配列から設計した２つのプライマーを用いたPCRによってキイロショウジョウバエゲノムDNAから増幅した。フォワードプライマーは(His)₆ コード配列およびNdeI 部位を含んでおり、リバースプライマーはEcoRI 部位を含むものであった。これらの制限部位は、PCR産物の大腸菌発現ベクター pETMCS1 (Miles et al. 1997)の NdeI/EcoRI 部位へのクローニングを容易にするために含めた。図8、レーン 3に示すPCR産物をアガロースゲルから市販のキット(MN)を用いて精製し、クローニングベクター pCR-Blunt (Invitrogen)にクローニングした。インサートの配列は、色素-ターミネーターヌクレオチドミックス(Big Dye - ABI)を用いて決定した。配列はショウジョウバエからのCG15920 配列について報告されていたものと同一であることが判明した。最初のNdeI 部位は塩基 55596 にみられた(図 7の下線部)。

PCR プライマーは、(フォワード) ResF3 および (リバース) RespepR1であった。プライマーの配列を以下に示す:
ResF3:
5' CCCATATGCACCATCACCATCACCATCCGGAGCCACCAGTTAACTCGTATCTACC 3'
RespepR1:
5' CCGAATTCCTATCCAGAAGCTGGGGGTCCGTAGGAGTCGGAGGG 3'

実施例 2
キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子の第一エキソンの発現および精製
上記で得た配列はレシリン/pCRBlunt クローンのEcoRI/NdeIによる部分的消化によって得た。上方のバンド(図9参照)をゲルから切り出し、市販のキット(Machery-Nagel)を用いて精製し、発現ベクター pETMCS1のEcoI/NdeI 部位に、T4 DNA リガーゼによる標準的ライゲーション条件を用いてライゲーションした。約 200ngのインサートを50ngのベクターに、１２℃で一晩ライゲーションさせた。ライゲーションした組換えプラスミド混合物を用いて大腸菌株 Top10 (Invitrogen)のコンピテントセルを形質転換し、Luria 培地 (LB)寒天プレート上でアンピシリン (100μg/ml)耐性に基づいて選択した。コロニーを選択し、含まれていた組換えプラスミドを市販のキット(Machery-Nagel)を用いて調製した。推定される組換えプラスミドインサートの配列をDNA 配列分析によって確認したところ、CG15920の公表配列と一致した。

発現ベクター pETMCS1のNdeI/EcoR1 部位にクローニングされたキイロショウジョウバエレシリンエキソン I 配列を含む正しい組換えプラスミドを、このプラスミドを担持する大腸菌 Top10 株の2mlの一晩培養物から単離した。この精製プラスミドを用いて次いで大腸菌株BL21(DE3)plysS または大腸菌 rne (BL21*) 株を形質転換し、アンピシリン (100μg/ml)とクロラムフェニコール (34μg/ml)との両方の耐性について選択した。

組換えタンパク質の小規模誘導を２つの株を一晩LB 培地で培養することにより行って、レシリン組換えタンパク質産生のレベルをベクター pETMCS1のみで形質転換した大腸菌 BL21(DE3)plysS から発現した大腸菌およびベクタータンパク質と比較した。結果は、大腸菌リボヌクレアーゼ E 突然変異株、BL21 Star （商標）、(DE3)pLysS: F - ompT hsdS B (rB - mB - ) gal dcm rne131 (DE3) pLysS (Cam R ) は、BL21(DE3)plysS 株よりもより可溶性の組換えレシリンを含むことを示した(データ示さず)。

組換え BL21 Star（商標）株 (レシリン5/BL21Star)をそれゆえレシリン組換えタンパク質の大規模発現のために選択した。

実施例 3
レシリン産生のスケールアップ
3 リットルのLB 培地 (3個の2-リットルバッフル三角フラスコのそれぞれに1 リットルの培地)に(レシリン5/BL21Star)の一晩培養物を播き、A600を0.1とした。細胞は回転振盪機で激しく振盪しながら (200サイクル/分) 37℃でA600が 0.8となるまで培養した。その時点で、IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を終濃度1mMとなるように添加し、培養物をさらに 4.5時間37℃で激しく振盪しながら培養した。細胞を遠心分離 (10,000xg 20分、4℃)で回収した。細胞ペレットを4℃で80mlの50mM NaH₂PO₄/ Na₂HPO₄ バッファー（150mM NaClおよび1X プロテアーゼインヒビターカクテル (EDTA-無含有) (Roche - カタログ番号1 873 580)を含有）に再懸濁した。細胞を超音波破砕機 (4X15秒バースト)で破壊し、次いでTriton X-100 (終濃度0.5％)を添加した。

膜と可溶性画分とを、破壊した細胞を 100,000xgで1時間4℃で遠心分離することにより分離した。可溶性画分を10mlの Ni-NTA 親和性樹脂 (Qiagen - Ni-NTA Superflow (25 ml) 25 ml ニッケルチャージ樹脂 (最大圧力: 140 psi) (カタログ番号 30410)）を充てんされたカラムに1.5時間4℃で結合させた。樹脂はカラムに充てんし、それをローディングバッファー (50mM NaH₂PO₄/ Na₂HPO₄ バッファー、150mM NaCl含有)で A₂₈₀がほぼベースラインとなり安定するまで(1ml/分)洗浄した。樹脂に非特異的に結合した大腸菌タンパク質を除去するために、10mM イミダゾール含有バッファーをカラムに通したところ多くの大腸菌タンパク質が溶出した。A₂₈₀がほぼベースラインになると、ローディングバッファー中のイミダゾールの10mM - 150mMグラジエントを2.0ml/分でカラムに通した。フラクション(2ml)を回収し、各フラクションの10μlのアリコートをSDS-PAGEで分析した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、脱染し(10％酢酸、30％エタノール)、可溶性組換えレシリンタンパク質のアフィニティーカラムクロマトグラフィー精製を確認した。精製レシリンを含むフラクション(フラクション12-48)をプールし、約 20ml体積となるまで濃縮し、50mM Tris/HCl 100mM NaCl pH 8.0を含むバッファーに対して透析した。透析されたタンパク質溶液を次いでCentricon（商標）ろ過装置 (MW カットオフ = 10,000 Da)を用いて濃縮し、タンパク質濃度を80mg/ml、150mg.mlまたは 250mg/ml (A₂₈₀測定による)とした。可溶性レシリンのこのアフィニティーカラム精製の結果を図10に示す。

可溶性組換えレシリンの分子量はSDS-PAGEによって約46,000 Daであると示され、これにより、組換えタンパク質が大腸菌において二量体として産生されていることが示唆された。というのは303アミノ酸タンパク質の計算MWは28,466 Daであるからである。しかし、TBS に対して透析したサンプル(A280 = 0.4)を平衡密度勾配超遠心分離によって分析すると、結果は明らかに、可溶性組換えタンパク質の計算熱力学的分子量は23,605 Daであることを示した (図15)。本発明者らはキイロショウジョウバエからのCG15902遺伝子の第一エキソンから発現した組換えレシリンは単量体であると結論づけることが出来る。

実施例 4
LB 培地での大腸菌の培養: 組換えレシリン産生
6 リットルのLB 培地を蒸留水によって 2 x LB EZMix (Sigma)を用いて調製した。pHは1M NaOHによって7.5に調整した。微量元素を培地に0.25ml / リットルとなるよう添加し、リン酸バッファーを10 ml/リットル培地で添加した。培地を6x 2L バッフルフラスコに入れ、オートクレーブにかけた。
微量元素混合物:
FeCl₃.6H₂O；2.713g
CuCl₂；0.101g
CoCl₂.6H₂O；0.204g
H₃BO₄；0.051g
Na₂MoO₄.2H₂O；0.202g
CaCl₂.2H₂O；0.0977g
ZnSO₄.7H₂O；0.300g
濃HCl 10mlをH₂Oで100mlとし、100ml の培地当たり25μL用いた。

無菌条件を確実にするために層流棚中で、組換え大腸菌株のシングルコロニーを0.4ml アンピシリン (100 mg/ml)および 0.4 ml クロラムフェニコール (34 mg/ml)を含む400 ml 培地に添加した。培地を 220rpmで一晩37℃で培養した。

翌朝、一晩培養物のOD₆₀₀ を測定した。一晩培養物のアリコートを6 リットルの培地に終OD₆₀₀が0.15となるように添加した。培地1 リットル当たり1 ml のアンピシリンとクロラムフェニコールの両方(上記と同じ濃度)を添加し、Antifoam 289 (Sigma)を 1滴(約50μl)添加した。培地を220rpmで2時間、OD₆₀₀が約1.0になるまで振盪した。この時点で、培地１リットル当たり0.5 mlの 1M IPTGを添加し、さらに3時間振盪した。

培養からの細胞を6000 rpm、 4℃、20分の遠心分離によって回収した。上清を捨て、ペレットを取り出し、-80℃の冷凍庫で保存し、すぐ処理できるようにした。40 mlのサンプルを遠心し、小さいペレットを-80℃の冷凍庫で保存しすぐ処理できるようにした。小さいペレットは細胞のレシリン含量の確認に用いた。40ml培養物からのこのペレットを細胞溶解および Ni-NTA 樹脂(Qiagen)でのアフィニティークロマトグラフィーで処理した。典型的な結果を図16に示す。

誘導条件の変更
誘導条件を4時間の誘導、そして培養物のOD₆₀₀ が 2に達してからの誘導に変更し、レシリン収量に対する効果を測定した。

３つの40 ml 培地を常套方法にしたがってオートクレーブにかけた。以下の条件による OD₆₀₀値となる、それぞれ異なる時点で誘導をかけた:
1: OD₆₀₀= 1で誘導3時間(通常条件)
2: OD₆₀₀ = 1で誘導4時間
3: OD₆₀₀ = 2で誘導3時間。

培養は20 μlの1M IPTGで誘導をかけた。

その他すべての条件および方法などは通常の方法のままとした。培養物を遠心し、ペレットを1 mlのリン酸バッファー（0.1％ Triton-X100 (TX-100)およびプロテアーゼ阻害剤含有）に再懸濁し、最終的な OD₆₀₀ 比は同じに維持した。超音波処理および遠心の後、結果として得られた上清をニッケルカラムに通した。結果として得られた溶出液をSDS-PAGEゲルで泳動した。結果を以下に示す。

図17に示す結果は、異なる条件の間でレシリン収量にわずかな差しかないことを示す。差があるとしても、OD₆₀₀ = 1から3時間誘導する通常の条件がその他よりも良好であるようである。ゲルは定量的結果を与えるものではないが、誘導条件の変化によって有意な利益は達成されないことを示している。

実施例 5
大腸菌の代替株
本発明者らはレシリンの産生を向上させることが出来るかを調べるために大腸菌 BL21 (DE3)plysS 株を大腸菌BL21 (DE3) RP 株と比較した。この株は、tRNA遺伝子のプラスミドにコードされるコピーを含み、Argおよび Proコドンがまれであることを克服できる。

レシリン発現クローン (レシリン 5) DNAを大腸菌のもう一つの株であるBL21 (DE3) RP 株 (Stratagene)に形質転換した。この株はまれなコドンを生じる能力により、より良好な産生をもたらすことが予測された。レシリン産生特性を調べるために、３つの40 ml LB 培地をオートクレーブにかけた。１つの培地はレシリン 5 株、１つはレシリン RP 株そしてもう１つはベクターのみを含むものであった。ベクターはレシリンを産生しないため、結果の妥当性を確認するために含めた。

３つの培養物をOD₆₀₀ = 0.15から培養を開始し、OD₆₀₀がおよそ0.8となったときに0.5mM IPTGで誘導をかけた。37℃の３時間の振盪の後、各培養物の最終OD₆₀₀ を測定した。遠心分離後、結果として得られたペレットを再懸濁して、最終OD₆₀₀の読みと、リン酸バッファー + 0.1％ TX-100 + プロテアーゼ阻害剤中の相対OD₆₀₀が同じであることを確認した。100 mlの 25 mg/ml リゾチームを超音波処理の前にレシリン RPに添加した。

遠心分離後、上清をニッケル樹脂で処理し、溶出液をSDS-PAGEゲルで泳動した。

レシリンバンドはレシリン 5において強いが、レシリン RPにおいてはいくらか弱いようであり、レシリン 5 株がレシリンタンパク質をより効率的に産生することが示唆された。このことから、本発明者らは、BL21 Star 株と比較してRP 株におけるレシリンの産生には利点がないことを結論づけることが出来る。

実施例 6
大腸菌における組換えレシリン産生の代替手順
組換えレシリン遺伝子の自己誘導に用いた培地は、Overnight Express Autoinduction System（商標）(Novagen)であった。

手順 1
1 mlの一晩培養物 (OD₆₀₀ およそ 6.0)を培地に添加し、4 時間37℃、220rpmで振盪した。室温でさらに26 時間振盪した。遠心分離は常套方法で行った。

この方法を用いると、最終OD₆₀₀はLB 培地で通常得られるのは4.0であるのに対して、およそ 12.0であった。40 ml サンプルを遠心分離し、LB 培地から産生されるレシリンと比較するために処理した。結果を図19に示す。40 ml遠心分離からのペレットは通常のレシリンペレットと比べて重量にして3.6倍大きかったので、それを通常40 ml ペレットの再懸濁に用いる1 mlではなく、3.6 mlに再懸濁した。再懸濁したペレットを超音波処理し、遠心分離した。1 mlの結果として得られた上清をニッケルカラムに通し、溶出液をゲルで泳動した。ゲルはレシリンの産生はLB 培地方法からのものと同等であることを示した。培地１リットル当たりおよそ４倍の細胞数が達成されたので、本発明者らは、生産能力を4倍上昇させることに成功した。

手順 2
手順 1と同様に、ただしおよそ 3.30pmに一晩培養物を培地に添加し、一晩37℃で振盪した。細胞を遠心分離によって翌朝培養の18 時間後に回収した。

培養条件の変動
いくらかの代替的な方法および手順を50 mL 培地に対して試験してレシリン産生の最適方法を決定した:
A: 標準的試験条件、変動無し
B: 100 mLの開始培養物
C: 500 mLの開始培養物
D: 100 mLの開始培養物および培地濃度の倍加
E: 培養物を37℃で一晩(18 時間)培養
G: 第二温度23℃
H: 培養物を37℃で一晩(4.00pmから翌日の2.00pm) 培養

これらの結果は、培地に最大多数の細胞を播いた際に細胞密度が最大になることを示す。しかし、細胞密度の差異は小さい。培地中の溶液濃度を倍加して細胞を培養した結果、細胞密度は最少となり、これはおそらく培地中の高塩濃度に起因する。

第二温度の低下によっては細胞密度に大きな差は得られなかった。

低密度は細胞を37℃で一晩培養した際に達成された。

この培養物を遠心分離し、Ni-NTAスピンカラムにかけた。溶出液を1M イミダゾールとともに、SDS PAGEゲルにローディングした。結果は図20に示す。

すべてのペレットを同じ体積の溶解バッファーで溶解し、同じ時間超音波処理した。それらを30分14,000 rpmで遠心分離し、1 mL の上清をNi-NTAカラムにローディングした。レシリンを100 mL 1 M イミダゾールで溶出した。5 mlの各溶出液をゲルにローディングした。

結果はレシリンの最大収量は37℃で一晩培養した培養物からのようであることを示す。これらのサンプルはまた吸光度も最低であり、細胞の量が少ないにも拘わらず、より多くのレシリンタンパク質を含むことが示唆された。

最低収量はバリエーションCからのものであるようであり、それはもっとも多数の細胞を播き、最高の吸光度に達したものである。これから、細胞はそのエネルギーをレシリンタンパク質産生よりも生育に使ったことが示唆される。

実施例 7
組換え (大腸菌)ヘキサヒスチジン(his)レシリンの精製
手順を以下に要約する:
1.細胞を溶解する
2.遠心分離する
3.上清をQ-セファロースカラムにかけ、ブレークスルーを回収する
4.ブレークスルーをNi NTAカラムにかける
5.レシリンをイミダゾールで溶出する
6.レシリンを濃縮する
7.透析する
8. Amicon Ultra-15 (15kDa カットオフ) 限外ろ過膜で濃縮する。

1.細胞の溶解
〜100gの細胞ペレットを解凍し、400mlの溶解バッファーに再懸濁した。この物質を12 x 50ml チューブに入れ、チューブを残りの溶解バッファーでいっぱいに満たした。これによって細胞ペーストの50ml チューブでのより均一な分布が得られる。各チューブは約 40mlの細胞懸濁液を含むものであった。

超音波処理
10mm 超音波プローブを備えたUltrasonics (Melbourne、Aust) A180 (180W最大出力) 超音波破砕機を用いて細胞を破壊した。約 40mlの細胞懸濁液を含む50ml チューブを湿った氷のスラリーを含むビーカーに入れた。超音波処理をかけた(30秒間)。12 チューブ中の物質の残りに順に超音波処理をかけ、この手順をさらに２回繰り返した。各超音波処理の後、チューブを氷中に保存し、超音波処理の間の物質の冷却を可能とした。完了すると、チューブを-80℃に少なくとも4 時間 (または好ましくは一晩)おいた。もっとも簡単には、チューブをラックに入れ、ラックをポリスチレンボックスにいれ、そしてこれを冷凍庫に入れた。

ポリスチレンボックスに温水を満たすことにより物質を解凍した。さらに3 x 1分バーストで、前記のように超音波処理した。細胞懸濁液は淡い黄色の溶液となり、明白な粘性はなかった(アリコートをパスツールピペットで分注して判定した)。

2.遠心分離
溶解した細胞懸濁液をBeckman 薄壁ポリカーボネートチューブに入れ、100,000g、4℃で30 分間遠心分離した。

上清は非常に清澄となりろ過は必要ではなかった(各 Beckman チューブの底の最後の数滴は除く)。ペレットを回収して標識した容器にいれ-80℃の冷凍庫で保存した。

3.Q-セファロースカラム (陰イオン交換) フロースルークロマトグラフィー)
Q-セファロースカラム (~ 200 ml 溶解バッファーで、50mm直径x 100mm 樹脂カラムベッド)を平衡化した。液体は50 mm 直径カラムを流速 10ml/分で通ることが出来る。

カラムを平衡化したら、上清をカラムに同じ流速でローディングした。ブレークスルーはレシリン (pI = 9.0)を含むので、ブレークスルーを回収した。上清の~ 80mlがローディングされた後に回収を始め、すべてのレシリンの回収を確実にした。

ローディングすると、少量の溶解バッファーを用いて上清容器の底をすすぎ、これをカラムにローディングした。溶解バッファーでの洗浄をすべての非結合タンパク質がカラムを通過し、 A280 がベースラインに戻るまで続けた(~ 280 ml必要であった)。

プールされたブレークスルー液にNaClを500mM、イミダゾールを10mMとなるよう添加し、pHを8.0に調整した。その結果生じる沈殿はろ過または遠心分離で除くべきである。

Q-セファロースカラムに結合したタンパク質を取り出すために1M NaClを含有する溶解バッファーで溶出した。すべてのタンパク質が取り出されたら、カラムを~ 200 mlの溶解バッファーで再び平衡化し、次のランですぐに使用できるようにした。溶出したタンパク質は廃棄してもよい。

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー (Ni-NTA 樹脂)
ドラフト中でニッケルカラムを組立て、洗浄バッファー 1、(50mm直径x 60mm カラムに対して~200 ml)で平衡化した。流速は~ 10m/分間であった。

カラムを平衡化すると、Q-セファロースブレークスルーを同じ流速でカラムにローディングした。ブレークスルーを回収し、これはレシリンを含んでいないことが確認されると、後で廃棄した。~40mlの上清がローディングされたら回収を始めた。

ローディングが完了すると、少量の洗浄バッファー 1を用いて Q-セファロースブレークスルー容器の底をすすぎ、これをカラムにローディングした。洗浄バッファー 1でA280がベースラインに戻るまでカラムを洗浄し続けた(~100ml)。この時点で、すべてのレシリンがニッケルカラムに結合しているはずであり、その他のほとんどすべてのタンパク質は洗い流され、ニッケルカラムブレークスルーとして回収された。

結合したレシリンの溶出:
カラムを FPLCにつなげ、50mM イミダゾール溶液 (8.1％溶出バッファー、91.9％洗浄バッファー 2)で洗浄した。OD ベースラインが安定になるまで洗浄を続けた。8.1％洗浄バッファー 2 (50mM イミダゾール)から 40％洗浄バッファー 2 (200mM イミダゾール)のグラジエントで１時間流速5 ml/ 分でランを行った。10 mlのフラクションを回収した。40％洗浄バッファー 2 でさらに50 分間溶出を続け、フラクションを回収した。これによってすべてのレシリンおよびその他のあらゆるタンパク質がニッケルカラムから除かれたことが確実となるはずである。フラクションにラベルをつけ(図18)、4℃の冷蔵庫で保存した。

ニッケルカラムを ~ 200 ml 洗浄バッファー 1で再び平衡化して次のランに使えるようにした。

レシリンの濃縮
レシリンを含有するフラクションを Millipore/Amicon 限外ろ過チューブ(カットオフ10 kDa )で終体積~ 20mlとなるよう濃縮した。フロースルーをとっておき、 SDS PAGE泳動によりレシリンを全く含まないことを確認した。

透析および濃縮
10kDa カットオフ膜を用いて一晩、5 リットルの50 mM Tris pH 7.5および50 mM NaClに対してレシリンを透析した。

さらにレシリンを少なくとも 200mg/mLまで濃縮した。この時点で粘性のある黄色液体が濃縮チューブの底にあらわれるはずである。レシリンはこの時点で次の実験にすぐに用いることが出来る。

バッファー
溶解バッファー:
50mM TRIS
1mM ベンズアミジン HCl
0.5％ Triton X-100 (TX-100)
10mM μ-ME (750μl/リットル溶液)
蒸留水で1 リットルにし、pHを(濃HClで)7.2にする。2MEを使用の直前に添加し、再びpHを調整する。
洗浄バッファー 1:
100mM NaH₂PO₄
10mM TRIS
500mM NaCl
1mM ベンズアミジン HCl
10mM イミダゾール
0.1％ Tx-100
10mM 2ME (使用直前に750μlを1 リットルの溶液に添加する)
蒸留水で1 リットルにし、pHを 8.0にする。
洗浄バッファー 2 (溶液 A)
100mM NaH₂PO₄
10mM TRIS
500mM NaCl
1mM ベンズアミジン HCl
10mM イミダゾール
蒸留水で1 リットルにし、pHを7.2にする。
溶出バッファー (溶液 B)
100mM NaH₂PO₄
10mM TRIS
500mM NaCl
1mM ベンズアミジン HCl
500mM イミダゾール
蒸留水で1 リットルにし、pHを7.2にする。

実施例 8
レシリンホモログの同定および単離
キイロショウジョウバエ、ハマダラカおよびミツバチからの完全ゲノムを含むgenbank 昆虫ゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Genome/Insects.html)の検索をショウジョウバエからの推定レシリン遺伝子 (CG15920) (Ardell and Andersen、2001)をクエリー配列として用いデフォールト設定を用いるTBLASTN検索を行ったところ、高いスコア(低いE 値)の多数の遺伝子ホモログが見いだされ、それらはすべて「YGAP」アミノ酸モチーフを含んでいた。この繰り返しモチーフは間隔が様々であり、これら遺伝子においては繰り返し単位が様々な数存在した。ハマダラカにおいては、ゲノムの中で１つの配列のみが複数のYGAP 繰り返しモチーフ(配列番号4)を含んでいたが、ショウジョウバエとミツバチとでは共に、２つのホモログ形態があった(それぞれ配列番号5および6ならびに配列番号6および7)。これらはCG15920型およびCG7709 型配列と類似性を有していた。

さらに、レシリンホモログをその設計がショウジョウバエ (CG15920)およびハマダラカ (EAA07479.1)からの一次アミノ酸配列のアラインメントに基づくディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーを用いた実験において昆虫 cDNAから単離した。このアラインメントを以下に示す。これらディジェネレートオリゴをノミおよびブユの蛹の段階から単離したcDNAを用いたPCR 反応に使用した。プライマー配列を以下の表に示す。

この実験で設計し、用いたディジェネレートプライマー

1. PCR 実験 (PCR 条件およびMgCl₂ 濃度の最適化)
設計したプライマー対からの特異的産物の増幅のための最適条件を調べるためにPCR を行った(上のプライマー対の表を参照)。標準的 PCR は以下に挙げるすべての成分を微小遠心 PCR チューブに全体積 50μlとなるように添加することにより設定した: (注：QIAGEN Taq ポリメラーゼキットを用いた）。
10x QIAGEN 反応バッファー 5μl、5 x Q バッファー 10μl、25mM MgCl₂ (0.2μl - 2μlの範囲の可変成分)、dNTP 混合物(各0.5μM) 0.5μl、プライマー F' 0.5μl、プライマー R' 0.5μl、Taq ポリメラーゼ 0.5μl、滅菌水)(可変、31.8-30μl)、テンプレート DNA 1μl。
PCRに用いた条件も同様に可変であった (用いた機械はBIORAD 「Gene Cycler」):
94℃30秒
37℃30秒 (可変工程)
72℃1分
35サイクル(可変工程)
サイクル試験は40サイクル含み、試験したアニーリング温度は40℃、 47℃を含んだ。
その他の試験条件には２段階 PCRを含めた:
94℃30秒
37℃30秒
72℃1分
5 サイクル
94 ℃30秒
66℃30秒
72℃1 分
40 サイクル

2. pGEM-Teasy（商標）におけるPCR産物のクローニング
PCR産物を最小サイズのアガロースゲル (120ml + 1.2μl EtBr)で泳動し、新しいスクレーパーの刃で泳動後にバンドを切り出した。切り出したアガロースを2ml 微小遠心管に入れた。1キットにおける Macherey-Nagel Nucleospin extract 2を用いて精製した(プロトコール 4.1:アガロースゲルからのDNA 抽出用プロトコール):
各 100mgのアガロースゲルについて、300μlのバッファー NT1を添加した。サンプルを50℃で5-10 分間インキュベートし、3 分間ごとに軽くボルテックスにかけ完全に溶解した。次に NucleoSpin Extract カラムを2mlの回収チューブに入れ、サンプルをローディングし、1 分間8,000 x g (10,000 rpm)で遠心分離した。次にフロースルーをすてカラムを回収チューブに戻し、500μl バッファー NT2を添加する工程を任意で行ってもよい。 1 分間最速で遠心分離した。フロースルーをすて回収チューブに戻した。600μl のバッファー NT3を添加し、1 分間最速で遠心分離した。フロースルーをすて回収チューブに戻した。次いで 200μlのバッファー NT3を添加した。2 分間最速で遠心分離し、NT3を定量的に除いた。最後にカラムを清潔な1.5ml微小遠心管に入れ、25-50μlの溶出バッファー NEを添加し、室温で1 分間放置した。1 分間最速で遠心分離した。

以下を一緒に入れることによってpGEM-Teasy (Promega)に切り出したPCR 断片をライゲーションした:
PCR 断片 3.7μl、pGEM-Teasy 0.5μl、ライゲーションバッファー 5μlおよびT4 DNA リガーゼ 0.8μl。

次いで一晩4℃で最多の形質転換体が得られるようインキュベートし(室温で30分でもよい)、形質転換プロトコールを進めた。

3. 形質転換プロトコール
top10 細胞を氷の上で解凍し、解凍したら0.5μlのres5 プラスミドまたは1μlのライゲーション反応物を添加した。指で穏やかに混合し、1時間氷上で維持した。チューブに42℃で30 秒熱ショックを与え、すぐに氷上に10 分間おいた。250μlのSOCを添加し、1時間 37℃でインキュベートした。25、50 および100μlを3.5 mlの 1M IPTG と16μlの50ng/ml X Galを含む LB/amp プレートに播いた。一晩37℃で培養した。翌日白色コロニーを取り出し、LB/amp 培地に播いた。10mlのLB を含む15mlの青いキャップのファルコンチュブを用いた(10mlのLB に対し、10 μlのアンピシリン)。ミニプレッププロトコール (QIAGEN)を行った。

4. ミニプレッププロトコール (QIAGEN)
15mlの青いキャップのファルコンチューブからの2mlの培地を2ml微小遠心管に移し、10 分間最高速度で遠心した。上清をデカントして250μl バッファー P1中にボルテックスによって漂白および再懸濁した細菌ペレットを含むガラスビーカーに移した。250μl バッファー P2を再懸濁した細胞に添加し、チューブを穏やかに4〜 6回反転させて混合した。その後350μl バッファー N3を添加し、チューブをすぐに4〜 6回反転させた。チューブを10 分間最速で遠心分離した。密な白いペレットが形成した。ピペットを用いて、上清をQIAprep カラムに移し、30 〜60 秒遠心分離した。フロースルーを捨てた。この後の任意の工程は0.5ml バッファー PBのカラムへの添加および30〜60 秒の遠心分離による洗浄であった。これからフロースルーを捨て、カラムを0.75ml バッファー PE を添加し30〜 60 秒遠心分離することによって洗浄した。これからフロースルーをすて、さらに1 分間遠心分離し、残りの洗浄バッファーを除いた。カラムを清潔な1.5ml微小遠心管に入れた。DNAを溶出するため、50μl バッファー EBをカラムの中央に添加し、1 分間静置した。次いで1 分間遠心分離した。

5. 配列決定プロトコール
微小遠心管に２回蒸留水 1μl、DNA (プラスミド) 5μl、プライマー (M13 F'、M13 R'または T7) 1μl、Big Dye 3.1 2μl、配列決定バッファー 3μl (全体積 12μl)を共にいれ、プログラム 4 35 サイクルを用いた。完了すると、1.3μl 3M NaOAc pH5.2 および30μl 無水エタノールを添加した。-20℃で15 分間インキュベートした。15 分間4℃で遠心し、注意深くピペッティングにより溶液を除いた。次いで100μl 80％エタノールで洗浄し、最速で5 分間4℃で遠心した。次いで溶液を注意深く除き、3 分間の減圧遠心分離で加熱せずに乾燥させた。配列決定クリーンアップを1.5ml微小遠心管で確認した。DNAの出発量を5μlから6μlに増やした場合より良好な配列決定が得られた。

6.「動物組織からの全RNAの単離のためのRneasy ミニプロトコール」に記載のプロトコールにしたがったQIAGEN Rneasy ミニキットによるRNA 抽出
組織およびサンプルを最初に破壊する必要があった。これを行うためにサンプルをまず滅菌RNase無含有2ml スクリューキャップ微小遠心管に 3〜4の滅菌ガラスビーズと共に入れた。これを次いでBIO-101 (Savant) FastPrep FP120破壊機で行った。速度5.0および時間 3 x 6 秒を用いた。15 秒2000rpmの迅速な遠心を行い、破砕物を沈降させた。上清を次いで2ml 回収チューブ中のQIA shredder カラムに移し、15 秒10,000rpmで遠心分離した。きれいになった溶解液を新しい 1.5ml微小遠心管に移し、さらに3 分間最速で遠心分離した。これを別の新しい微小遠心管に移した。次いで1 体積 (およそ 350-600μl)の70％エタノールをきれいになった溶解液に添加し、ピペッティングにより(遠心分離ではなく)迅速に混合した。700μlまでのサンプルを2ml 回収チューブ中のRneasy カラムに添加することが出来た。15 秒8000 x g (10,000rpm)で遠心分離した。フロースルーを捨てピペッティングにより350μl バッファー RW1をカラムに入れ、 15 秒8000 x g (10,000rpm)で遠心分離した。フロースルーを捨て、 10μl Dnase 1 ストック溶液を70μl バッファー RDDに添加した。これを穏やかな反転により混合した。ピペッティングにより Dnase 1 インキュベーション混合物 (80μl)を直接Rneasy シリカゲル膜に入れ、卓上で(20-30℃)15 分間静置した。ピペッティングにより350μl バッファー RW1をカラムに入れ、 15 秒8000 x gで遠心分離し、フロースルーを捨て、700μl バッファー RW1をカラムに添加し、15 秒8000 x gで遠心分離した。フロースルーを捨てチューブを回収した。次いで Rneasy カラムを新しい2ml 回収チューブに入れ、ピペッティングにより500μl バッファー RPEをカラムに入れた。15 秒 8000 x gで遠心分離し、フロースルーを捨てた。さらに500μl バッファー RPEをカラムに添加し、2 分間8000 x gで遠心分離して膜を乾燥させた。Rneasy カラムを新しい2ml 回収チューブに入れ、遠心分離を最速で1 分間行った。溶出のために、カラムを新しい1.5ml微小遠心管に入れ、ピペッティングにより30-50μl Rnase-無含水を直接カラムに入れ、1 分間8000 x gで遠心分離した。

7. Superscript 二本鎖 cDNA 合成キット (Invitrogen)
第一鎖合成
RNase無含有 1.5 微小遠心管に、プライマー (100 pmol/μl) 1μl、DEPC-処理水中RNA 11μlを入れ、70℃で10 分間加熱混合し、すばやく氷上で冷却した。チューブの底にある内容物を簡単な遠心分離により回収し、5x 第一鎖反応バッファー 4μl、0.1M DTT 2μl、10mM dNTP混合物 1μlを添加した。

穏やかにボルテックスをかけ簡単な遠心分離により回収した。チューブを45℃で2 分間静置し、superscript II RT 1μlを添加した。

穏やかに混合し、45℃で1時間インキュベートした。全体積は 20mlとなった。次いでチューブを氷上におき反応を停止した。

第二鎖 cDNA合成
氷上で以下の成分を第一鎖反応チューブに添加した: DEPC-処理水 91μl、5x 第二鎖反応バッファー 30μl、10mM dNTP 混合物 3μl、大腸菌 DNA リガーゼ (10U/μl) 1μl、大腸菌 DNA ポリメラーゼ I (10U/μl) 4μl、大腸菌 Rnase H (2U/μl) 1μl。
穏やかにボルテックスをかけ混合し2 時間16℃(温度は16℃を超えてはならない)でインキュベートした。次いで2μl (10 ユニット)の T4 DNA ポリメラーゼを添加し、16℃で 5 分間インキュベートを続けた。チューブを氷上に置き、 10μlの0.5M EDTAを添加し、160mlのフェノール: クロロホルム: イソアミルアルコール (25:24:1)を添加し、激しくボルテックスし、室温で5 分間14,000 x gで遠心分離した。注意深く140μlの上層である水層を取り出し、新しい1.5-ml チューブに移した。70μlの7.5M NH₄Oac、次いで0.5mlの氷冷無水エタノールを添加した。混合物を激しくボルテックスし、すぐに室温で20 分間14,000 x gで遠心分離した。上清を注意深く取り出して捨てた。ペレットの上に0.5 ml 氷冷 70％エタノールの層を加えた。2 分間14,000 x gで遠心分離し、上清を取り出して捨てた。最後にペレットを37℃で10 分間乾燥させ、残りのエタノールを蒸発させ、そしてペレットを少体積のDEPC-処理水に溶解した(25μgの開始全RNA当たり3μlまたは開始mRNA1mg当たり1μg)。

ディジェネレート PCRの結果
最初の最適化実験はres5 プラスミドおよびプライマー対、 1+5、2+5、1+4および 3+4を用いて行った。用いた条件は1.PCR 実験 (PCR 条件とMgCl₂ 濃度の最適化)に記載したものであった。試験したすべての条件のうち、最適条件は37℃で35 サイクルであることが判明した。PCRはBIORAD 「gene cycler」 PCR機によりQIAGEN試薬を用いて行った。最適MgCl₂ 濃度は0.5μlであることが判明した。それより高い MgCl₂ 濃度では、スメアになってしまう。最適化実験により、Q バッファーの使用が反応効率を改善する結果、より強く鋭いバンドが得られることが示された。

次の段階はノミおよびブユからのRNAの抽出およびds cDNAの作成を含み、これを次にディジェネレート PCRに用いた。この段階ではまた、２つの新しいディジェネレートプライマー、プライマー6および7を設計した。このプライマーは先のプライマーとともに用いた。次いでPCRをすべてのプライマー対、1+7、2+7、3+7 および先のプライマーセットの 1+5、2+5、1+4 および 3+4を用いてノミおよびブユ cDNAに対して行った。これらのバンドの中でブユについて得られたのは、プライマー対 1+7 (およそ500bp)、2+7 (300、500bp および1kb)、3+7 (1kb)、1+4 (およそ1kb)および3+4 (およそ1kb)(図36参照)であった。ノミにおいて得られたバンドはプライマー対 2+5 （300および500bp) (図37)であった。

部分ヌクレオチド配列を、ノミ (配列番号8、9および12)およびブユ (配列番号10、11 および13)からのこれらのバンドのクローニングによって得た。翻訳されると、これら配列は図30に示すように繰り返しモチーフ YGAPを示した。図30はまた、繰り返しモチーフを含む配列間の類似性（および相違）を示す。

実施例 9
合成レシリン産生
構造モチーフの鎖状体（contamers）を形成するようライゲーションできるように、プライマーをハマダラカおよびショウジョウバエレシリン遺伝子(またはホモログ)の推定構造ドメイン配列に基づいて設計した。

アニーリングおよびライゲーション
10 ul 10x ライゲーションバッファー (New England Biolabs)
10 ul 100uM AnSyn1またはDroSyn1
10 ul 100uM AnSyn2またはDroSyn2
69 ul dH20
100 ul 最終体積

アニーリングをMJ Research PTC-200 Peltier Thermal cyclerで数分間にわたって温度を徐々に50 〜 10℃ (0.5℃/分)に下げることによって行った。

アニーリングに次いで 400 UのT4 リガーゼ (New England Biolabs)を各チューブに添加し、ライゲーションを16℃で1-18時間行った。サンプルを65℃で10 分間加熱してリガーゼを不活化し、サンプルを Qiaquick DNA精製カラム(Qiagen)を用いて精製した。

エンドフィリング（End-Filling）反応
5 ul 10 x ExoPol バッファー (New England Biolabs)
5 ul 10mM dNTP
39 ul テンプレート (アニーリングおよびライゲーションしたDroSynまたはAnSyn プライマー鎖状体)
1 ul (5U) Klenowフラグメント(New England Biolabs)
50 ul 最終体積
を氷上で調製した。反応を25℃で 15 分間インキュベートし、次いで1 ul 0.5 M EDTAの添加により停止し、75 ℃で 20 分間加熱した。

最初のクローニングをZeroBlunt TOPO クローニングベクター (Invitrogen)を用いて行い、スーパーコンピテントSURE2 細胞(Stratagene)に形質転換した。組換え体の選択はカナマイシン 25 ug/mlを含むLB 寒天プレートでの培養に基づいて行った。次いで選択されたコロニーをM13for および M1rev プライマーを用いてPCR スクリーニングして、プラスミド内のインサートを増幅した。発現産物の毒性によって、特にDroSyn 反応において配列突然変異を有さないクローンを得ることは難しかったため、Stbl2、Stbl3およびM15[pREP4]を含む様々な細胞株を用いた。

AnSyn クローン単離:
最初に、200-500bpのサイズ範囲のAnSyn 産物を含む12の組換え体を配列決定のために選択した。配列決定はBigDye 3.1 chemistry (Applied Biosystems) と、M13forまたは M13rev プライマーのいずれかを用いて行った。すべてが突然変異(挿入または欠失)を含んでいることが判明した。6つは配列内に挿入または欠失を含んでおり、除いた。残りの6つはすべて5'配列が切断型であり、所望のオープンリーディングフレーム (ORF)が破壊されていた。しかしこの切断にもかかわらず、それ以外の点ではそれらは完全な鎖状体であり、7-13 繰り返しの長さの範囲であった。以下に得られた配列の例を示し、添付の配列表において配列番号17-24と称する。配列番号24によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列 (配列番号25)も以下に示す。

クローン 1は配列番号17を含み、5'末端が欠けていることを除いては良好に発現し、それゆえ10のみ繰り返しを有する:
AACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCaCCGGCGC

クローン 9 は配列番号18を含み、開始点の近くに挿入されたCを含みこれは好ましくない:
GCGCCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGC AAAaCCCGTctAGCCAgTATGGTGCACCGGCG

クローン 10は配列番号19を含み、5'末端が欠けていることを除いては良好に発現し、それゆえ12のみ繰り返しを有する:
GCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGC

クローン 15は配列番号20を含み、5'末端が欠けていることを除いては良好に発現し、それゆえ10のみ繰り返しを有する:
AACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCG

クローン 16は配列番号21を含み、5'末端が欠けていることを除いては良好に発現し、それゆえ13のみ繰り返しを有する:
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGC

クローン 18は配列番号22を含み、5'末端が欠けていることを除いては良好に発現し、それゆえ7のみ繰り返しを有する:
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGC

クローン 22は配列番号23を含み、挿入されたAを有し、好ましくない:
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCAGTATGGTGCACCGG
CGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGG
CGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGG
CGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGG
CGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGG
CGCAAACCCCSTCWAGCCAGWATGGTGCACCGGCGC

アニーリングおよびライゲーションを上記のように繰り返し、その後、エンドフィリング反応をプルーフリーディング DNA ポリメラーゼ PfuUltra（商標）(Stratagene)を用いて以下のように行った:
5 ul 10 x PfuUltra HF 反応バッファー (Stratagene)
4 ul 10mM dNTP
40 ul テンプレート (アニーリングおよびライゲーションしたAnSyn プライマー鎖状体)
1 ul (2.5U) PfuUltra DNA ポリメラーゼ (Stratagene)
50 ul 最終体積

この反応を72℃で30 分間インキュベートした。

インキュベーションの後、全反応を1％アガロースゲルで泳動した。鎖状体をサイズ範囲400-500 bp、800-1200bpおよび1650bp +に含むゲルの領域を切り出し、ゲルからDNAを QIAquick ゲル抽出キット(QIAGEN)を用いて精製した。大きな断片(1650 bp +)をpCR-Bluntにライゲーションし、Stbl3 細胞に形質転換した。96のコロニーをスクリーニングし、3つの可能性のあるクローンが得られた。これらを配列決定した。1つ(AnL 7H)は19 繰り返しの鎖状体に対応する配列に含まれていた。
An-L 7H クローン (配列番号24および25)
CAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCMGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGYAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCG
GCGCAAACCCCGTCTAGCYAGTATGGTGCACC

QTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP
AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP
AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGAP AQTPSSQYGA

これらのクローンを特異的プライマーを用いて再増幅し、以下に記載のように発現ベクターにクローニングした。

DroSyn クローン単離
最初にスクリーニングした6つの DroSyn 組換え体は所望のORFが破壊されるような配列内の突然変異の存在により許容できないものと考えられた。この高いエラー率はコンストラクトは低レベルで発現させても宿主細菌に対して毒性であることの証拠であると考えられ、突然変異したクローンのみが選択されることとなる。この問題を克服するための試みにおいて、発現の制御がより厳密な異なる宿主細胞型をさらなるクローニング実験に選択した。

Stbl2 細胞 (Invitrogen)に形質転換されたDroSyn エンドフィリング化産物のライゲーションからの96 コロニーのスクリーニングも、成功しないことが判明した。6つの組換え体を選択し配列決定したがすべてはインデルにより不適当であった。次いで以下のライゲーションおよびStbl3 細胞 (Invitrogen)の形質転換から得た19 のさらなるクローンを、単離および特徴付けした。17は導入された配列エラーのために不適当であったが4つの繰り返しを含む1つのクローンが得られた。小さくはあるが、これらを特異的プライマーで再増幅し、以下に記載のように発現ベクターにクローニングした。

K3F (配列番号26および27)
GTCCGAGCGATACCTATGGTGCGCCGGGTGGTGGCAACGGTGGT
CGTCCGAGCGATACCTATGGTGCGCCGGGTGGTGGCAACGGTGGT
CGTCCGAGCGATACCTATGGTGCGCCGGGTGGTGGCAACGGTGGT
CGTCCGAGCGATACCTATGGTGCGCCGGGTGGTGGCAACGGTGG
AA = RPSDTYGAPGGGNGG RPSDTYGAPGGGNGG RPSDTYGAPGGGNGG RPSDTYGAPGGGNG

このクローンは特異的プライマーで再増幅し、以下に記載する発現ベクターにクローニングした。

発現ベクター pETにクローニングするための再増幅
Nde I 制限酵素部位および6-HIS 発現タグが鎖状体の5'末端に付加され、一連の停止コドンおよびEcoR1 制限酵素部位が 3'末端に付加されるように、選択されたインサートの再増幅のためのプライマーを設計した。それらプライマーは増幅産物がEcoR1およびNde I 制限酵素を用いて発現ベクター pETにクローニングされ、発現した産物がN-末端6-ヒスチジンタグを発現タンパク質の簡単な精製のために含むように設計した。

プライマーの5’末端におけるAnSyn またはDroSyn特異的配列の8 塩基の付加により小さい5' 欠失を含む先に記載したコンストラクトへのORFの再導入が可能となった。組換えクローンのEcoR1 および Nde1による正確な切断を容易にするために、プライマー内のpCR-BLUNT-特異的配列を AをTと置換することにより修飾して(下側に示す) これらの部位に通常存在するEcoR1 部位を除いた。
pET-Eco (プラスミドにおける修飾EcoR1)

最初に上記で得たクローン10および16を上記プライマーを用いる増幅の最適化に用いた。

Expand High Fidelity PCR System (Roche) を用い以下のプロトコールにしたがってクローンを増幅した。
反応当たり、
4 ul 10mM dNTPs
1 ul 10uM pET-NdeAn プライマー
1 ul 10 uM pET-Eco プライマー
17 ul dH2O
2 ul 1/10 希釈液 An16またはAn10 プラスミド

各チューブに25 ulの以下を含むマスター混合物を添加した:
2 ul 10 x Expand High Fidelity 反応バッファー 2
0.75 ul HF酵素混合物
22.25 ul dH20
PCRを以下の条件で行った:
変性95℃2分
サイクル1
95℃30 秒
50℃30 秒
72℃2分
繰り返しサイクル4回
サイクル2
95℃30 秒
64℃30 秒
72℃2分
繰り返しサイクル 19回
72℃ 10分

PCR 反応を 1％アガロースゲルで泳動し、産物をゲルからQIA quickゲル抽出キット (QIAGEN)を用いて精製した。

産物をpCR-Blunt クローニングベクター (Invitrogen)にクローニングし、化学的コンピテントStbl3 細胞(Invitrogen)に形質転換した。組換え体の選択は、カナマイシン50 ug/mlを含むLB 寒天プレートでの培養、次いで選択したコロニーのM13forおよびM1rev プライマーを用いるプラスミド内のインサートを増幅するためのPCR スクリーニングに基づいて行った。

選択された組換え体を配列決定し正しい配列がクローニングされているか、また Nde1 およびEcoR1 制限酵素消化部位、6-His タグおよび停止コドンが含まれているかを確認した。

結果: 多数の正しいクローンが単離され、そのなかの２つをさらなる研究に選択した。それらの配列 (配列番号28および 30)および推定タンパク質配列(配列番号29および 31)を以下に示す。

T2A 7つの繰り返し
GCCATATGCATCACCATCACCATCACGCCAGTGTGCTGGTATTCAGGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAgCCAGTATGGTGCACCGGCGCCCTGAATACTGCAGATATTTAGGTGAGAATTCGC
H Met H H H H H H A S V L V F R
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P A P Stop I L Q I F R Stop E F
R5E 10の繰り返し
GCCATATGCATCAccAtCAcCATCACgCCAGTGTGCtgGTATTCAGGGCGCAAACCCCGTcTAGCCAGTATGGTGCaCCGGCGCAAACCCcGTcTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGTACCGGCGCAAACCCCGTCTAgCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCAAACCCCGTCTAGCCAGTATGGTGCACCGGCGCCCTGAATACTGCAGATATTTAGGTGAGAATTCGC
H Met H H H H H H A S V L V F R
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G V P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P
A Q T P S S Q Y G A P A P Stop I L Q I F R Stop E F

T2AおよびR5E インサートをpCR-Blunt ベクターから以下のようにして切り出した。
5 ul プラスミド
1 ul (20U)Nde I 酵素 (New England Biolabs)
1 ul 10x バッファー 4 (New England Biolabs)
3 ul dH2O
20 ul

反応を37℃で2 時間インキュベートし、次いで 1 ul (10U) EcoR1 酵素 (New England Biolabs)を添加した。反応をさらに2 時間インキュベートした。

反応は 1％アガロースゲルで泳動し、消化したT2Aおよび R5E 産物をQIA quick ゲル抽出キット (QIAGEN)を用いてゲルから精製した。

500 bp DHFR インサート (RSC722+DHFR)を含むpET 発現ベクターをDr Nick Dixon (RSC、ANU; Neylon et al. 2000)から譲り受けた。これをコンピテント DH5α細胞にクローニングした。コロニーを選択し、 37℃で一晩培養し、その後プラスミドをプラスミド精製キット (QIAGEN)を用いて単離した。インサートは以下のプロトコールによって切り出した。
5 ul プラスミド
1 ul (20U)Nde I 酵素 (New England Biolabs)
1 ul 10x バッファー 4 (New England Biolabs)
3 ul dH2O
20 ul

反応を37℃で2 時間インキュベートし、1 ul (10U) EcoR1 酵素 (New England Biolabs)を添加した。反応を一晩インキュベートした。

反応を1％アガロースゲルで泳動し、消化したプラスミドをQIA quick ゲル抽出キット (QIAGEN)を用いてゲルから精製した。

発現ベクターへのライゲーション：
ライゲーションは以下のように行った:
10 ul プラスミド
7 ul インサート
2 ul 10x ライゲーションバッファー (New England Biolabs)
1 ul (400 U) T4 リガーゼ (New England Biolabs)
7 ul dH2O
20 ul
一晩4℃でインキュベートした。

化学的コンピテント M15[pREP4] 細胞に形質転換し、100ug/ml アンピシリンおよび25 ug/ml カナマイシンを含む寒天プレート上で選択した。

配列の完全性を配列分析により確認し、その後それらプラスミドを発現用の適当な細胞に形質転換した。

実施例 10
ペプチドを標準的 FMOC 合成技術を用いて合成した。ペプチドは以下のアミノ酸配列 (配列番号32)を有していた:
RPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGG (26マー)

ペプチドは15-残基繰返し配列を含み、２つのチロシン残基を含んでいた。

ペプチドの代替合成方法が２つある。
ストラテジー 1:
1. Wang-Gly 樹脂の使用: tBu保護および Pbf (Arg)およびTrt (Asn)
2. C→N 構築、FMOC ストラテジー
3. MS 分析での鍵となる位置での単一カップリング(3eq)
ストラテジー 2:
1.収束固相ペプチド合成(CSPPS)の使用および繰り返しセクションおよびGly-Gly切断の利用。

完全な26-マーのペプチドの質量スペクトルを図32に示す。

実施例 11
ペルオキシダーゼを用いる可溶性レシリンの架橋
プロ-レシリンを上記のように大腸菌細胞から精製し、実施例9および10の合成レシリンに適用しうる工程において不溶性ポリマーとなるよう架橋した。不溶性ゲルの形成は、レシリンタンパク質溶液の濃度に依存した。ゲル形成のため、可溶性レシリン単量体を0.25M ホウ酸バッファー pH 8.2中80mg/ml、150mg/mlおよび 250mg/mlに上記のように濃縮した。

3つの市販のペルオキシダーゼ酵素の有効性を試験するために、以下のスモールスケールの実験を行った。レシリンは 5mg/mlで用いた。セイヨウワサビペルオキシダーゼ (Boehringer #814407)、ラクトペルオキシダーゼ (Sigma #L8257) およびアルスロマイセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）ペルオキシダーゼ (Sigma # P4794)をバッファーに1mg/mlで溶解した。過酸化水素を新鮮な30％溶液から調製し、(100mM) ストック溶液として用いた。

精製レシリン (20μl)の溶液に酵素(2μl)を添加し、反応を過酸化水素の添加により開始した。終濃度はそれゆえ:レシリン (5nmole/40μl)、H₂O₂ (5mM)および酵素(40pmol/40μl)であった。反応をホウ酸バッファー (0.25M)pH 8.2中で37℃で4時間行った。反応は10μlの溶解バッファーの添加により停止させ、10μlの混合物を10％ゲル(Invitrogen i-Gel)でのSDS-PAGEによって分析した。この実験の結果を図11に示す。

レーン 1は架橋の前の精製可溶性レシリンを示す。レーン2、3 および 4は実験に用いたペルオキシダーゼ酵素を示し、レーン5、6 および 7はそれぞれ可溶性レシリンに対するラクトペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルスロマイセスペルオキシダーゼの効果を示す。ラクトペルオキシダーゼが可溶性レシリンの架橋においてもっとも有効性の低いペルオキシダーゼであり、単量体の数％のみが二量体に変換した。セイヨウワサビペルオキシダーゼは高分子量オリゴマーのラダーがゲルのクーマシーブルー染色により明らかであるように、より有効であった。一方、アルスロマイセスペルオキシダーゼはすべての単量体を非常に大きいタンパク質ポリマーに変換し、10％ポリアクリルアミド分離ゲルにかろうじて入る程度であった。

不溶性レシリンポリマーを作るために、タンパク質濃度を、可溶性レシリンをCentricon（商標）(10kDa) ろ過装置を通すことによって上昇させた。タンパク質濃度は 5mg/mlから、80mg/ml、170mg/ml および 150mg/mlに上昇した(それぞれ8％、17％および25％タンパク質溶液)。反応条件: 0.25M ホウ酸バッファー pH 8.2中、可溶性レシリン (40μl)、H₂O₂ (10mM)、ペルオキシダーゼ (10mg/mlを5μl)。反応は過酸化水素の添加により開始した。瞬時のゲル形成がすべての３つの反応で観察され、25％タンパク質溶液からもっとも硬いゲルが生じ、8％レシリン溶液からは非常に低密度のゲルが生じ、後者は完全には固体ではなかった。

形成されたゲルは長波長 (300nm) UV 光での照射によって強く蛍光性であり(チューブ B)、架橋前の可溶性レシリンと同等の量であるが(チューブ B)、図12に示すようにバッファーや水には不溶性であった。

これらの結果は可溶性タンパク質カルモジュリンの非常に大きなポリマーへの架橋を引き起こすアルスロマイセスペルオキシダーゼの匹敵する有効性と一致した(Malencik and Anderson、1996; Malencik et al、1996)。これらの著者らはまた真菌ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼよりも有効であることを示した。

レーン 7、図4の架橋された物質の蛍光スペクトルは、3mlの0.25M ホウ酸バッファー pH 8.2中、Perkin-Elmer 蛍光光度計を用いて、励起を300nmで行って発光スペクトルを生じさせ、400nmで発光をモニターして励起スペクトルを生じさせて得た。これらのスペクトルを非架橋可溶性レシリンの匹敵する量を生じたスペクトルと比較した。これらの結果を図13に示す。スペクトルは、励起および発光極大がジチロシン標準および架橋されたカルモジュリン（Malencik and Anderson (1996)）について報告されたスペクトルと非常に似ていることを示す。これらの値は: (ホウ酸バッファー pH 8.4中) 励起極大 = 315nm; 発光極大 = 377nmであった。標準のジチロシンは、301nmの励起および377nmの発光でホウ酸バッファー中で最大の感度を示す。これらの波長は、様々な量のホウ酸-ホウ酸ナトリウムバッファーの存在下でのジチロシンの吸光および蛍光発光スペクトルにおいてみられる等吸収点およびイソ放射点（isoemissive point）を表す(Malencik et al. 1996)。

図32は様々なペルオキシダーゼによって生じ、マイクロタイター蛍光リーダー(BMG Polarstar)を用いて励起300nm、発光420nmで測定したジチロシン蛍光の比較を示す。ペルオキシダーゼは PBS中1mg/mlとなるよう調製した。レシリン濃度は5mg/mlであった。過酸化物濃度は5mMであった。反応は100mM ホウ酸バッファー pH 8.2中で行った。反応は37℃で行い酵素の添加により開始した。これらのデータは、L-チロシンからのジチロシン形成およびカルモジュリンのアルスロマイセス・ラモサスペルオキシダーゼによる架橋を示す結果によって支持される(Malencik et al. 1996、Malencik and Anderson)。

実施例 12
精製可溶性組換えレシリンは、100mM ホウ酸バッファー pH 8.5中のレシリンタンパク質の20％溶液の調製およびアルスロマイセス・ラモサスペルオキシダーゼによる10mM H₂O₂ の存在下で室温での処理により架橋された。ゴム形成の条件:
40μL レシリン溶液 (200mg/ml)
5μL H₂O₂ (100mM ストック溶液)
5μL アルスロマイセスペルオキシダーゼ (10mg/ml)

固体ゴム物質の瞬時の形成が酵素の添加によって起こった。

可溶性タンパク質は高度に蛍光性 (励起λ=320nm)の不溶性物質に5 秒以内で変換した。この物質を0.1M トリスバッファー pH 8.0で洗浄し、Atomic Force Microscopy (AFM)を用いて弾性率について試験した。サンプルを乾燥させ、水に再懸濁するか、または70％相対湿度で AFM試験のために維持した。湿度制御が必要な場合、それはサンプルとSPM スキャナーチューブの低部の両方を小さい風防硝子チャンバに閉じこめ、系に逆浸透水にガスを通気することによって得た所望の湿度の窒素ガスを通すことにより達成した。Honeywellモノリシック集積（monolithic integrated）湿度センサーおよび「K」型熱電対センサーをチャンバの端壁の小孔から挿入し、湿度と温度をモニターした。ブタジエンおよびブチルゴムをシートとしてEmpire Rubber、Australiaから供給した。サンプルは標準的硬化系を用いて加硫してあり、充填剤は含んでいなかった。

Digital Instruments Dimension 3000 Scanning Probe Microscope (SPM)を用いて力距離曲線（Force-Distance curve）を捕捉し、それから弾性を判定することができた。空気中で行った測定はTappingMode（商標）において作動するSPMにより、シリコン「ポイントプローブ」を用いて行い、水中で行った測定はContactMode（商標）において作動するSPM により「ナノプローブ」窒化ケイ素プローブを用いて行った。20-100 nm の相対トリガー（Relative triggers）のふれ(deflection)を用いてカンチレバーふれを制限し、力距離測定の際にサンプルに与えられる全力を制限した。サンプルの弾性は接近曲線（approach curve）の接触領域の下面積のパーセンテージとして表した退縮曲線（retract curve）の接触領域の下面積として定義した。それは曲線の接近および退縮部分の間のヒステリシスと反比例する。チップとサンプルの間に接着が起こると、それは退縮曲線下面積の測定の際に考慮した。サンプルに対する力距離測定の前に、位置感受性検出器を硬い物質(ガラス)に対して力距離測定を行うことにより較正した。

実施例 13
レシリンを架橋するためのγ線照射
濃縮レシリン (230mg/ml)の50 μlのアリコットを 7本のガラスチューブに入れた。それらをコバルト-60ソースを用いてγ線に曝した。曝露時間は1、2、4、8、16、32および 64 時間とした。曝露をすべてのサンプルについて継続した(照射ソース = 4.5kG/h)。

曝露されたレシリンを40:1に10mM リン酸バッファー pH 8.0で希釈した。1 μlのこの溶液を14 μlのローディング色素と混合し、各ゲルのウェルにローディングした。曝露の32および64 時間後に、レシリンはピペッティングできず、したがって少量をチップの末端でピックアップし、ローディング色素と機械的に混合したこと注意されたい。タンパク質標準はレーン 1に用いた。ゲルを 160Vで泳動し、泳動が終わると、クーマシーブルーで染色した。その結果得られたゲルを図21に示す。

レシリン単量体はSDS-PAGEゲル上で約50kDaに泳動し、レーン2-6において明らかに顕著なバンドとして観察することが出来る。２つのレシリン単量体の二量体作成のための架橋はタンパク質のサイズを倍加させ、したがって約100kDaに泳動されるであろう。三量体は約150kDaに泳動され、以下同様であろう。完全に架橋されたレシリンはウェルの底に残り、即ち、レーンの最上端に残る。

ゲルは、架橋が1時間照射後に起こり、約100kDaの弱いバンドを生じることを示す。しかし、単量体と二量体との相対濃度の比較は、この時点では架橋は多くは起こっていなかったことを示す。

さらなる曝露により、架橋の程度、即ち二量体の割合は増加し、16 時間照射後には、非架橋レシリンの割合は架橋されたレシリンと同程度になった。32および64 時間後、レシリンはゲル中を泳動するのが困難であり、単量体は殆ど残っておらず、レシリンは多くの架橋を含むことが示される。単量体の弱いバンドが32時間サンプルにおいてみることが出来る。

それゆえ、γ線を用いてレシリンを完全に架橋するには、少なくとも 32 時間の曝露が必要である。この量の曝露はタンパク質を損傷する可能性があり、それゆえこの方法は好ましくない。

実施例 14
レシリンのUVB 照射架橋
100 μlの濃縮レシリン (230mg/ml)を900 μl PBS (リン酸バッファー溶液)に希釈して終濃度23mg/mlとした。これを内径5mmの石英硝子カップの7 x 100 μl サンプルのアリコットにした。レシリン溶液の UVB 照射への曝露を阻害しないように、カップを粘着ラベルで密封した。

サンプルをQUV ウェザロメーター用に設計したUVB チューブを用いてUVB 照射に曝露した。サンプルはUVB チューブの端から10 mmのところに位置させた。これは周囲大気温度で1、2、4、8、16、32および64 時間行った。すべての曝露は連続性とし、16 時間 (連日2 x 8 時間曝露)および64 時間 (56 時間の後、２日後に8 時間曝露) 曝露は例外とした。曝露の後、サンプルをエッペンドルフチューブに移し、蒸発による水のロスを最少にした。

1 μlの各レシリン溶液を14 μlのローディング色素と混合し、95℃で2 分間加熱し、ゲルにローディングした。結果を図22に示す。ゲルは、１時間の曝露の間にかなりの量の架橋が起こっていることを示す。単量体の体積は架橋されたタンパク質の体積よりも大きいのに、多くの二量体、三量体およびより高レベルの架橋が起こっていた。UVBへの曝露を多くすると、架橋の量は増加し、単量体の体積は減少する。8 時間の曝露後、多くの架橋されたタンパク質はレーンの最上部に残っており、多数の架橋が形成されたことを示唆する。二量体の証拠はいくらかあったが、より高次の架橋は明らかではなかった。これは多くの物質が複数の架橋を形成していることを示唆する。16 時間の曝露後、単量体は少量のみ残っており、ほとんどの物質はウェルの上部に残り、したがって本発明者らは高度に架橋されたタンパク質を得た。

実施例 15
UVB 照射によるレシリンのリボフラビン架橋
50mM TRISおよび50mM NaCl中の10mg/ml レシリンの50 μl アリコットを、石英硝子カップに入れ、25 μM リボフラビンを添加し混合した。リボフラビンは蒸留水に溶解した。サンプルを UVB 照射に先の UVB 照射実験と同様に曝露し、30、60、120 および240 分間曝露を続けた。

曝露後、1 μlの各溶液をローディング色素に混合し、95℃に加熱し、SDS-PAGEゲルにローディングした。結果を図23に示す。結果はかなりの量のレシリンが30 分間後には架橋されており、すべてのレシリン単量体が4 時間曝露後には架橋されていたことを示す。リボフラビン無しでUVB に曝露したレシリンと比較して、架橋時間が大きく改善されたことが示される。少量のレシリン二量体および三量体が4 時間曝露後に存在した。

実施例 16
白色光によるレシリンのフルオレセイン架橋
100mM フルオレセイン溶液を水中の0.1mM NaOHを用いて作った。1 μlのフルオレセイン溶液を1 mlの10mg/ml レシリンと混合した。190 μlのレシリンを5ウェル中に分配し氷上で維持した。レシリンをウェルの上端から10cm に位置する2 x 300W 電球（globe）に30、60、90、120および150 秒曝露した。1 μlの結果として得られた溶液を14 μlのローディング色素と混合し、SDS-PAGEゲルで泳動した。結果 (ここでは示さず)は架橋の完了にはさらなる時間が必要であることを示した。それゆえ、さらなる曝露を150、300、600、900 秒行った。これらの時間枠で、電球は過剰に熱くなるため、曝露は150 秒ずつ、60 秒の停止間隔を開けて行い、電球が冷める機会を確保した。結果を図24に示す。たった30 秒後に、かなりの架橋が起こったことが示された。単量体体積は10 分間の曝露後にはかなり減少した。15 分間曝露の後、ほとんどのレシリン単量体が架橋された。

架橋後に、大部分のレシリンがウェルに残っていると予測されたが、ウェル中にこの物質はほとんどないようであった。この理由は溶液中の架橋されたレシリンの凝集による。溶液は翌日までゲル用に調製せず、レシリンの凝集を可能にした。凝集体はピペットで取り扱えず、したがってゲルにはローディングされなかった。

これを改善するために、実験を繰り返した。曝露したレシリンをすばやくローディング色素にピペットで入れ、最後の曝露が完了したらすぐにゲルで泳動した。結果は図25に示す。

実施例 17
紫外線水銀ランプ (380nm)によるクマリン架橋
濃縮したレシリンを50 mM TRISおよび50 mM NaCl で10 mg/mlに希釈した。溶液を３部に分けた。第一の部分を100 μM 7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸と混合し、90μl アリコートを黒キャップの小さいチューブに入れた。第二の部分を10 μM 7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸と混合し、90μl アリコートを青キャップの小さいチューブに入れた。第三の部分は7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸を含まず、チューブは赤キャップのものであった。

各アリコートを水銀光 (380nm波長)下で下表に記載のように様々な時間曝露した。各溶液は複数回の10 秒の照射に曝露した。

* は曝露を示す。

黒および青サンプルについての各曝露条件は二連で行った。曝露後、5 μlの各溶液をローディングバッファーと混合し、SDS-PAGEにローディングした。結果を図26に示す。

結果は、すべてのレシリンが水銀蒸気光への300 秒の曝露の後に架橋されたことを示す。かなりの架橋が60 秒後におこっていた。60および300 秒の間の時間間隔がないため、完全な架橋に必要な正確な時間を判定することはできなかった。

クマリンは架橋に対して程度の低い影響を及ぼすようである。100 および10 μMのクマリンを含むレシリンについての30 秒の曝露を比較するとこのことはよくわかる。高濃度のクマリンを含むサンプルはウェルに対してより多くの「不鮮明さ（smudging）」を示し、より多くの架橋が形成されたことを示す。

実施例 18
レシリンサンプルのHPLC ジチロシン分析
実施例 16に記載の第二の実験からのフルオレセインサンプルおよび固体の架橋されたレシリンからのいくらかのサンプルをジチロシン含量について HPLCで分析した。

75 μlの各フルオレセインサンプル、および重量がわかっている架橋されたレシリンを0.1％フェノールを含有する1 mlの6M HClで消化した。サンプルを145℃に4 時間加熱した。およそ 1 mlの水を各サンプルに添加して2 mlとした。各サンプルの400uL アリコートを蒸発させた後、400 μl のバッファーを添加した。20uL のこの体積の溶液をHPLCにかけた。

結果を下表に示し、左列における時間の項目によって同定されるサンプルは実施例 16の図25を参照して記載されるサンプルである (分で示す時間は、サンプルの光への曝露の長さを示す)。10および15 分間のサンプルは、エッペンドルフチューブの底における架橋されたレシリンの塊により、予測されるより低い結果を生じうることに注意されたい。この結果、有意に結果が変化した可能性がある不均一なサンプルが選択された。固体Bは酵素で架橋されたレシリンであるが、架橋反応は均一な物質を生じなかった。固体Cは酵素で架橋されたレシリンであって、酵素をよりよく混合することにより、より均一なゴムを生じた。可溶性レシリンは架橋が存在しない標準としても試験した。

表：可溶性および架橋されたレシリンのジチロシン分析

ジチロシンは次式を用いて測定した: (体積 * HPLC /重量)。タンパク質重量あたりのジチロシンの量についての数値が得られる。

架橋されてジチロシンを形成したチロシンのパーセンテージを測定するために、チロシンおよびジチロシンの曲線下面積を記録し、パーセンテージは次式を用いて計算した: ジチロシン面積 / (ジチロシン面積+ チロシン面積)。

結果 (図27)は、フルオレセインをレシリンに添加した場合、白色光に対する曝露が大きいほどジチロシン量は安定に増加することを示す。これはより多くの架橋が形成されたことを示し、SDS PAGEゲルの結果と一致する。

チロシン架橋の量はフルオレセインを添加して白色光に15 分間曝露するよりも酵素触媒反応の方が多かった。実際、少なくとも 3倍の架橋が形成した。

実施例 19
トリス(2,2'-ビピリジル) ルテニウム(II) ジクロリドを用いる可溶性レシリンの架橋
PICUP (非修飾タンパク質の光誘導架橋) 反応を非常に迅速な、トリス-ビピリジル Ru(II) 錯体の電子受容体の存在下での可視光分解により誘導した。照射に続いて、Ru(III)イオンが形成され、それが電子除去剤として作用してポリペプチド(骨格または側鎖)内に、炭素ラジカルが生じる。これは超共役または共鳴によるラジカルの安定化が起こりやすい位置チロシンおよびトリプトファン残基で優先的に起こる。ラジカルは非常に迅速にその近傍の感受性の基と反応し、新しいC-C結合を形成する(Fancy and Kodadek、1999 and Fancy、2000)。

実質的には、Fancy and Kodadek (1999)に記載の方法を用いた。これは水中のトリス(2,2'-ビピリジル) ルテニウムジクロリドストック溶液 (0.1M)の調製を伴う。新鮮な過硫酸アンモニウム (0.5M)を使用直前に調製した。組換えレシリンを50mM Tris/HCl + 50mM リン酸ナトリウム pH 8.0に対して透析し実施例 4に記載のように約200mg/mlに濃縮した。

ランプは600W 石英タングステンハロゲン (2 x 300W) (GE #38476 300W)であった。スペクトル出力は 300nm 〜1200nmのブロードなピークを示す。

トリス(2,2'-ビピリジル)ルテニウム (II) ジクロリド ((Ru(II)(bpy)³)²⁺、過硫酸アンモニウム (APS)および可視光によって媒介されるタンパク質の酸化的架橋はFancy and Kodadek (1999)に元々記載されている。この方法は短い光分解の後に結合または自己アセンブルしたタンパク質を優先的に架橋する。反応はAPSによる金属中心の光によって開始する酸化によって形成されるRu(III)中間体を介して進行すると考えられている。Ru(III) 錯体は強力な一電子酸化剤でありチロシン (またはトリプトファンレシリン5配列にはtrp 残基は存在しないが)側鎖を酸化することができ、様々な経路で適当な近傍残基に結合することが出来るラジカルを生じさせる。１つの起こりうる可能性のある架橋反応はアレーンカップリング反応の形成である。近傍のアミノ酸がチロシンであれば、ジチロシン結合が形成する(Fancy and Kodadek、1999)。

レシリンエキソン 1 可溶性組換えタンパク質の架橋
本発明者らの実験はFancy and Kodadek (1999)の((Ru(II)(bpy)³)²⁺、過硫酸アンモニウム (APS) および可視光に基づく方法の有用性を調べるために行った。まず、PBS (リン酸緩衝食塩水)中の1mg/mlレシリン溶液を用い反応は室温で行った。APS 濃度は5mMであり、 ((Ru(II)(bpy)³)²⁺ 濃度は200μMであった。照射は600Wランプを15cmの距離で用いて10 秒間行った。

この実験の結果 (図28)は、可溶性レシリンのSDS-PAGEゲルの上部に残る非常に高分子量凝集体への定量的変換が起こったことを示した。この結果はレシリンエキソン 1 組換えタンパク質がジチロシン結合形成に利用可能な近接するよう配置されたチロシン残基により自己結合することを示唆する。

架橋反応に対する((Ru(II)(bpy)³)²⁺ 濃度の効果を調べるために、実験を行い、ここで2-倍段階希釈の((Ru(II)(bpy)³)²⁺を 1mg/ml の5mM APS含有PBS中の可溶性レシリン溶液に添加した。照射は室温で10 秒間15cmの距離で行った。

結果(図29)はこれらの条件下での架橋により、非常に高分子量の産物が生じることを示した。さらに、この実験によりRu(II)Bpy金属塩が光照射の際に酸化される反応の化学量論が明らかとなった。これらのデータは1mM レシリン (40μM タンパク質) にはおよそ 4μM Ru(II)Bpyが完全な架橋を触媒するのに必要であることを示す。

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図1は、エラストマーポリペプチドがどのように機能するかを示す略図である; 図2は、UDP-N-アセチルグルコサミンアシルトランスフェラーゼにおけるβらせん構造を示す; 図3は、空間充てん模型を用いたβらせん弾性タンパク質構造の別の表示である; 図4は、タンパク質におけるジチロシン架橋の性質を示す; 図5は、例えば、チロシン架橋の形成によってつくられるバイオエラストマーにおける架橋の略図である; 図6は、キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子のアミノ酸配列を示す; 図7は、キイロショウジョウバエからのレシリン遺伝子のコード領域からのDNA 配列を示す; 図8は、プライマーRESF3およびRESPEPR1を用いたPCR 反応産物を示し、これによって、大腸菌における可溶性ショウジョウバエプロ-レシリンの発現と精製が達成されたことが示される; 図9は、レシリンクローンの部分的NdeI/EcoR1 消化を示す; 図10は、大腸菌における可溶性ショウジョウバエプロ-レシリンの発現と精製を示すゲルである; 図11は、ペルオキシダーゼ酵素により可溶性プロ-レシリンの架橋が起こったことを示すゲルである; 図12は、試験管Aにおける架橋されていないプロ-レシリンおよび試験管 Bにおける架橋されたレシリンのサンプルの写真である; 図13は、架橋されたレシリンの蛍光スペクトルをグラフで示す; 図14は、本発明によってクローニングされた組換えレシリンのアミノ酸配列を示す; 図15は、レシリンの沈降平衡分析を示し、これによって可溶性レシリンの分子量評価が得られる; 図16は、実施例4の方法におけるレシリン産生を示すゲルである; 図17は、様々な誘導条件下のプロ-レシリン産生を示すゲルである; 図18は、ニッケルカラムから現れたフラクションを示すゲルであり、組換えプロ-レシリンの精製が示される; 図19は、自己誘導方法におけるレシリン産生を示すゲルである; 図20は、自己誘導方法における様々な培養条件下でのレシリン産生を示すゲルである; 図21は、γ線によるレシリン溶液の照射の１時間後におこる架橋を示すゲルである; 図22は、UVB 照射に曝した後に起こるレシリン溶液の架橋を示すゲルである; 図23は、リボフラビンの存在下でのUV 照射によるレシリンの架橋を示すゲルである; 図24は、白色光によるレシリンのフルオレセイン架橋を示すゲルである; 図25は、フルオレセイン架橋によるさらなる実験の結果を示す; 図26は、実施例14に記載の紫外線水銀ランプによるクマリン架橋の結果を示す; 図27は、フルオレセインをレシリンに加えた場合の白色光に対する曝露時間(分)に対して、レシリンにおけるチロシン残基からのジチロシン架橋形成のパーセンテージをプロットする; 図28は、実施例16に記載のレシリンエキソン1組換えタンパク質の光誘導架橋を示すゲルである。照射は10秒であった。図29は、可溶性レシリン (PBS 中1mg/ml)架橋の程度に対する((Ru(II)(bpy)³)²⁺希釈の効果を示す。図30は、様々な昆虫からのレシリン配列間の相同性を示す; 図31は、本発明によるペプチドの質量スペクトルである;そして、図32は、様々なペルオキシダーゼによって生じるジチロシン蛍光を比較するグラフである。

Claims

共通配列 SXXYGXP（ここで、Sはセリン、Xはアミノ酸、Yはチロシン、GはグリシンおよびPはプロリン）を有する複数の繰り返し単位を含み、ジチロシン結合形成を介して架橋されているポリペプチドであるバイオエラストマー、ただし、該バイオエラストマーはレシリンではない。
以下の共通配列を有する複数の繰り返し単位を含む請求項1のバイオエラストマー:
X₁X₂X₃X₄SX₅X₆YGX₇PX₈X₉X₁₀X₁₁
［配列中:
X₁ は不在または任意のアミノ酸;
X₂ は不在または任意のアミノ酸;
X₃ は不在または任意のアミノ酸;
X₄ はPまたはS;
X₅ は荷電または極性アミノ酸;
X₆ は荷電または極性アミノ酸;
X₇ はAまたはP;
X₈ はGまたはA;
X₉ は不在、Gまたは極性アミノ酸;
X₁₀ は不在、Gまたは極性アミノ酸;および、
X₁₁ は不在または任意のアミノ酸］。
X₁が存在する場合、G、Y、AまたはNである請求項2のバイオエラストマー。
X₂が存在する場合、塩基性アミノ酸またはGである請求項2のバイオエラストマー。
X₃が存在する場合、塩基性アミノ酸、TまたはPである請求項2のバイオエラストマー。
X₄がPである請求項2のバイオエラストマー。
X₅がD、TまたはSである請求項2のバイオエラストマー。
X₆がS、QまたはTである請求項2のバイオエラストマー。
X₇がAである請求項2のバイオエラストマー。
X₈がGである請求項2のバイオエラストマー。
X₉が存在する場合、G、QまたはSである請求項2のバイオエラストマー。
X₁₀が存在する場合、G、SまたはNである請求項2のバイオエラストマー。
X₁₁が存在する場合、G、Q、P、SまたはNである請求項2のバイオエラストマー。
X₈、X₉および X₁₀の少なくとも１つがGである請求項2のバイオエラストマー。
アミノ酸配列GGRPSDSYGAPGGGNまたはGGRPSDTYGAPGGGNを有する繰り返し単位を含む請求項2のバイオエラストマー。
アミノ酸配列PSSQYGAPAQTの繰り返し単位を含む請求項2のバイオエラストマー。
アミノ酸配列SSSYGAPまたはSSTYGAPまたはSTTYGAPを含む繰り返し単位を含む請求項 2のバイオエラストマー。
ジチロシンが酵素媒介架橋によって形成される請求項1〜17のいずれかのバイオエラストマー。
酵素がペルオキシダーゼである請求項 18のバイオエラストマー。
ペルオキシダーゼがアルスロマイセスペルオキシダーゼである請求項 19のバイオエラストマー。
ジチロシンが電子受容体の存在下でトリス-ビピリジル Ru(II)錯体の光分解による光誘導架橋によって形成される請求項1〜 17のいずれかのバイオエラストマー。
ジチロシンがγ線、UVBまたは可視光での照射によって形成される請求項1〜 17のいずれかのバイオエラストマー。
5 〜100 アミノ酸毎に１つの架橋を含む請求項1〜22のいずれかのバイオエラストマー。
20〜50 単量体単位毎に１つの架橋を含む請求項 23のバイオエラストマー。
共通配列 SXXYGXP、（ここでSはセリン、Xはアミノ酸、Yはチロシン、GはグリシンおよびPはプロリン）を有する複数の繰り返し単位を含む単離ポリペプチド、ただし該ポリペプチドはプロ-レシリンではない。
請求項2 〜 17のいずれかに示す複数の繰り返し単位を含む請求項 25の単離ポリペプチド。
配列番号25、27、29または31に示すアミノ酸配列を含む請求項 25のポリペプチド。
請求項 25のポリペプチドをコードする単離核酸。
配列番号17-24、26、28または 30の何れかに示すヌクレオチド配列を有する単離核酸。
以下の工程を含む請求項 1のバイオエラストマーの調製方法：
(1) 請求項 25のポリペプチドを提供する工程;
(2)架橋反応を開始させる工程;および、
(3)バイオエラストマーを単離する工程。
請求項 25のポリペプチドおよび、好ましくはイガイ足糸タンパク質、クモ絹タンパク質、コラーゲン、エラスチン、およびフィブロネクチン、またはそれらの断片からなる群から選択される第二のポリマー分子を含むハイブリッド分子。
スプリング機構として作用する請求項 25のポリペプチドおよび該スプリング機構が作用する装置を含むナノマシン。
請求項 25のポリペプチドまたは請求項1〜 24のいずれかのバイオエラストマーまたは請求項 31のハイブリッド分子を含むバイオセンサー。
請求項1〜24のいずれかのバイオエラストマーまたは請求項 31のハイブリッド分子からなる、あるいは請求項1〜24のいずれかのバイオエラストマーまたは請求項 31のハイブリッド分子を含む製品。