CN113543818A - 基于重组生物聚合物的组合物及其作为生物墨水的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含重组生物聚合物的组合物，所述重组生物聚合物由“弹性蛋白样重组体”(ELR)类型的单体、包含“丝蛋白”序列的单体和/或包含属于称为拉链蛋白的天然蛋白类别的HLF序列的单体的组合制成。所述组合物可用作3D打印的生物墨水。此外，本发明还涉及用于获得本发明的组合物以及3D生物材料的方法，并且涉及该组合物和所获得的生物材料的不同用途。
Description
技术领域
本发明涉及组合物，其包含由弹性蛋白样重组(ELR)单体合成的重组生物聚合物，所述重组生物聚合物包含源自家蚕Bombyx mori的被称为“丝蛋白(silk)”的序列，和/或包含被称为HLF的序列且属于称为拉链蛋白(zipper)的一类天然蛋白质的单体。这些组合物可用作3D打印的生物墨水。另外，本发明涉及用于获得本发明的组合物的方法，3D生物材料以及该组合物和包含该组合物的生物材料的不同用途。
背景技术
3D生物打印技术包括立体平版印刷、基于喷墨的生物打印、基于激光的生物打印和基于挤出的生物打印，后一种技术应用最为广泛。在基于挤出的生物打印中，将水凝胶引入墨盒内，并通过压力将其挤出到表面上。印刷结构是通过借助CAM–CAD(计算机辅助制造-计算机辅助设计)软件进行时空运动控制，对材料进行逐层沉积而制成的。
到目前为止，已经使用挤出技术进行了大量研究来模仿组织，例如骨骼、心脏组织、软骨、肝脏、肺、神经组织、皮肤和胰腺组织(Ozbolat,I.T.等人，Drug DiscoveryToday,2016.21(8):p.1257-1271)。它也已经用于执行疾病和药物释放的体外建模(Vanderburgh，J.等人，Ann Biomed Eng，2017.45(1)：p.164-179)。
材料要满足以便可以在3D生物打印中使用的参数，是指印刷过程，尤其是可印刷性，它受诸如流变性质(粘度、假塑性、粘弹性和屈服强度)和交联机制等理化参数的影响；以及允许它们用作生物医学材料的那些特性，例如生物相容性，并指出其降解动力学必须与细胞形成其自身细胞外基质的能力相一致，并且其降解产物对其无毒。
有许多材料用作生物墨水，其中包括随着时间的推移在组织工程中使用的具有水凝胶结构的材料。这些用作生物墨水的水凝胶分为天然水凝胶(例如：藻酸盐、明胶、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖、脱细胞的细胞外基质，DNA肽和结构蛋白，例如胶原蛋白、丝素蛋白和纤维蛋白)和合成水凝胶(例如：聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、普朗尼克酸、聚乙二醇(PEG)、聚(L-乳酸)(PLA)和聚(ε-己内酯)(PCL))。尽管基于天然生物聚合物、合成生物聚合物，甚至两者的混合物，现有的生物墨水种类繁多，但仍然存在许多缺点，限制了它们的使用，特别是在印刷基质的机械和结构性能方面，在某些情况下显示出很高的亲水性，亲水性限制了它们在细胞中的使用，高粘度，高粘度阻碍了它们的印刷，低形状完整性，快速胶凝和交联等。尚未克服的另一个缺点还在于缺乏允许细胞相互作用的生物相容性或生物活性结构域。
为了解决基于聚合物的生物墨水的上述缺点，出现了几种策略：(1)稳定结构的胶凝方法，主要基于物理过程(离子相互作用，氢键或疏水相互作用)，化学过程(通过化学反应产生的共价键))或两者的组合(Jungst，T.等人，Chemical Reviews.2016 116(3)：1496-1539)；(2)多组分或混合墨水的使用，通常试图弥补一种墨水的结构缺陷，同时又具有另一种墨水的良好可印刷性，并且在现有技术中几乎所有现有的生物墨水都存在混合物(Chimene,D.等人，Ann Biomed Eng.2016，44(6)：2090-2102；(3)使用牺牲性墨水为印刷提供更大的结构和支撑，以及(4)使用合成材料作为支持物。
迄今为止，有几种可商购的生物墨水组合物，例如：基于明胶聚合物并结合不同生长因子的Gel4Cell(Bioink Solutions，Inc.)，基于纳米纤维素和藻酸盐的CELLINK(CELLINK)，分别基于PEG/明胶/透明质酸和磷酸钙的Bioink和Osteoink(RegenHU)，以及分别基于Pluronic F127和甲基丙烯酸明胶的Bio127和bioGel(Biobot)。这种类型的生物墨水的缺点在于，由于形成它们的明胶聚合物是从动物胶原水解中获得的且因此不能确保它们的相似性，因此无法确保它们在每个生产批次中的行为。
尽管在新的生物墨水及其生物印刷技术的开发方面已取得了巨大的进步，但是仍然需要寻找能够满足合适的生物墨水的所有必要要求(例如良好的可印刷性和形状保真度)的新型生物材料。具体地，期望开发为细胞印刷提供保护环境的具有快速胶凝或固化能力的新生物材料，以及可以以低浓度使用、产生合适的生物力学性能和高孔隙率的生物材料。
发明概述
本发明描述了新的ELR重组生物聚合物，其由具有天然弹性蛋白中存在的结构域的单体，除了包含称为“丝蛋白”的序列的单体和/或包含属于称为拉链蛋白的天然蛋白类别的称为HLF的序列的单体形成，它们是非毒性的，因此适合用作生物墨水。具体地，本发明涉及包含所述生物聚合物的组合物，并且主要用作3D打印的生物墨水。
基于ELR的生物材料已被证明在组织工程中具有巨大的潜力，这主要是因为它们具有非凡的生物相容性、生物降解性和可调节的机械性能。它们还可以产生多种自组装结构，例如胶束、纳米颗粒、水凝胶、膜或纳米纤维。如今，所述聚合物被广泛用于生物医学应用中，例如：基因疗法，疫苗释放系统，表面生物功能化以及作为组织工程应用中的水凝胶。ELR允许细胞生长和增殖，并且在生物系统中不诱导任何免疫反应，因此易于植入。在组织工程领域，这些材料已用于软骨和椎间盘、血管移植物以及眼和肝组织的再生。
由于它们是通过重组DNA技术生产的，因此可以设计ELR的氨基酸结构来调节它们的交联或自组装能力，其中它们可以自组装成物理和/或化学水凝胶。随后改善了机械性能，并且该性能将有利于将其用作3D生物打印机中的生物墨水。另外，其他功能可以通过融合其他蛋白质或包含生物活性结构域(例如细胞粘附基序(RGD、REDV等)、生长因子或金属蛋白酶)来在其序列中实现，从而有利于最终结构体的分解。
除生物学要求外，本发明中所述的ELR生物聚合物还具有可用于其用作生物墨水的用途的其他特性。这些材料显示出可用于3D生物打印的温度响应能力：由于聚合物在一定温度以上经历的快速构象变化，该聚合物能够在打印机墨盒中保持液态，并当它沉积在加热板上时迅速变为凝胶态。因此，它以液态和低粘度注射，减少了施加在针头上的应力，这有助于沉积并保护细胞免受可能的膜破裂。这种行为称为逆温度转变(ITT)，其特征在于转变温度Tt，取决于平均聚合物极性，可以通过改变ELR生物聚合物序列中存在的氨基酸组成来调节平均聚合物极性。因此，由于ITT性质，包含本文所述的生物聚合物的本发明的组合物从低于其Tt温度时的水合和无序状态转变为超过其Tt时的有序疏水折叠。这种独特性质的使用允许将所述组合物用作生物墨水，因为它们能够产生可在温度控制的挤出系统下沉积的聚合物长丝。所述长丝以高精度沉积并且允许形成表现出时间和空间形状保真度的结构矩阵，这允许以高通用性、可靠性和可再现性逐层设计复杂结构。
作为本发明所述组合物的部分的生物聚合物包含不同的ELR单体，以及包含胶凝增强序列的单体，优选地，包含属于称为拉链蛋白的自然蛋白类别的称为HLF的序列的单体，以及包含结构增强序列的单体，优选地包含源自蚕的被称为“丝蛋白”的序列的单体。
本发明中用于获得所述生物聚合物的ELR单体全部基于相同弹性蛋白结构域VPGXG(SEQ ID NO：7)的使用，其中X可以是除氨基酸L-脯氨酸以外的任何氨基酸，其中氨基酸缬氨酸、谷氨酸和异亮氨酸是优选的。单体B在本发明中使用的ELR单体中。
单体B是亲水的并且具有被设计为在生理温度范围内不转变的组成。为了本发明的目的，单体B包含肽肽VPGXG(SEQ ID NO：7)的重复，更具体地，单体B包含肽肽VPGVG(SEQID NO：7)和VPGEG(SEQ ID NO：7)的重复，甚至更具体地说，单体B包含序列SEQ ID NO：2([(VPGVG)2(VPGEG)(VPGVG)2)。
单体C是疏水的，并且具有被设计为在低于生理温度的温度下产生转变并引起初始物理交联的组成。为了本发明的目的，单体C包含肽肽VGIPG(SEQ ID NO：3)的重复，更具体地，本发明生物聚合物中的单体C包含SEQ ID NO：3的2至250个重复，更特别地SEQ IDNO：3的40至80个重复，甚至更具体地，它包含SEQ ID NO：3的60个重复。
单体Y是用于改善本发明生物聚合物胶凝的单体之一，所述单体包括弹性蛋白结构域的两亲性聚合物序列和源自家蚕Bombyx mori的序列“丝蛋白”(SEQ ID NO：8；GAGAGS)的组合。为了本发明的目的，单体Y包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的重复，更优选地，单体Y包含SEQ ID NO：8的1至15个重复，更优选5个重复。在另一个更优选的实施方案中，单体Y包含如SEQ ID NO：5所定义的氨基酸序列。
单体X是用于改善本发明生物聚合物结构的单体之一，所述单体包括本发明生物聚合物的增强序列。所述单体X包含“拉链蛋白”结构基序的氨基酸序列，其是被称为HLF的氨基酸序列，属于称为拉链蛋白的天然蛋白质类别，优选地，所述拉链蛋白基序属于天然人拉链蛋白质类别。为了本发明的目的，单体X包含如SEQ ID NO：4所定义的氨基酸序列。
因此，本发明中描述的生物聚合物包含上述单体的不同重复，以产生可用作2D和/或3D打印的生物墨水的生物聚合物。
因此，在第一方面，本发明涉及包含生物聚合物的组合物，所述生物聚合物包含形成单体B、单体C和至少单体X、单体Y或两者的氨基酸序列。
如本文包括的实施例中所示，当本发明的组合物优选包含除ELR单体(B和C)外在其序列中还包含单体X和Y的组合，甚至是生物聚合物的组合的生物聚合物时，包含至少一种由上述单体形成的重组生物聚合物的本发明的组合物可用作生物墨水，其中第一生物聚合物除了ELR单体(B和C)还包含单体X，第二生物聚合物除其ELR单体(B和C)外还包含单体Y。因此，包含拉链结构域的单体X与其余单体一起包含在生物聚合物中会引起形成的物理水凝胶的两亲相互作用通过形成源自拉链结构域序列的拉链的卷曲螺旋相互作用而稳定。物理上可以观察到这种现象，这是由于所说的“拉链”相互作用加速和增强了ELR单体随温度的转变。因此，当本发明的组合物用作生物墨水时，它以可沉积的细丝形式显示出良好的可印刷性和良好的短期稳定性。相反，如在实施例中观察到的(参见实施例4)，如果组合物仅包含生物聚合物，所述生物聚合物除ELR单体外还包含单体X，由于相互作用的可逆性，所述稳定性不能随时间推移而得以保持。
此外，包含构成丝蛋白序列的单体Y与形成本发明组合物的其余单体一起通过两亲性物理交联形成水凝胶形式的生物聚合物，并且其中所述生物聚合物通过形成起源于丝蛋白序列的β片层而稳定。包含ELR单体和单体Y(不包含单体X)的这种组合物不允许进行可靠的打印，因为它通过3D打印机的注射器的挤出不是均匀的，不会形成细丝，因此一经印刷不能固定其形状(请参见实施例4)。相反，如实施例4中观察到的，所述组合物随时间推移而显示出高的稳定性。在这种情况下，通过ITT机理发生的转变不足够快速而使沉积的聚合物保持其结构，因为增强相互作用较慢，因此在印刷步骤之后的步骤中是有效的。
考虑到上述因素，因此，本发明的组合物将包括包含单体B、C、X和/或Y的生物聚合物，更优选地，本发明的组合物将包括包含单体B、C、X和Y的生物聚合物，或者可替代地，包括生物聚合物的组合，其中第一生物聚合物包含单体B、C和X，第二生物聚合物包含单体B、C和Y。
考虑到上述内容，本发明基于以下支柱：
-包含ELR序列的单体(单体B)和单体C与包含丝蛋白(单体Y)序列和拉链蛋白(X单体)序列的单体的组合；或包含ELR单体与丝蛋白单体(单体Y)的生物聚合物的组合，以及包含ELR单体(单体B)和单体C与拉链单体(单体X)的生物聚合物的组合。这样，单体X提供必要的可印刷性，即初始保持结构的能力，而单体Y确保随着时间的推移结构得以保持。
-形成本发明组合物的生物聚合物的浓度(参见实施例3)允许它们溶解在几种溶剂中，表现出低粘度和牛顿行为(参见实施例4)，从而有利于在3D打印机中进行印刷，避免了高印刷力的施加，高印刷力的施加可能会损坏打印机和溶液中的材料以及生物墨水，并且有利于使用直径较小的针，从而可以形成更细的细丝。
-本发明的组合物允许以非常好的形状保真度用于2D和/或3D打印中(参见实施例4和6)。它们还允许用于印刷载体并包封各种活性成分和细胞，因此可用于生物医学，例如但不限于再生医学，例如用于细胞疗法中的体外或体内细胞生长用于组织再生的方法。为此，细胞和/或活性成分优选均匀地分散在本发明的组合物中，使得在印刷后，它们以预定的方式分布在基质中，并允许活性成分的受控释放或细胞的良好的粘附性和增殖，再生受损的组织并因此充当有效的植入物和天然的细胞外基质。
-通过发明人先前通过特定软件预先规定的设计，以受控方式将这些组合物作为生物墨水沉积在印刷表面上。印刷过程需要将挤出头保持在低于组合物的Tt的低温下，同时将加热床的温度保持在组合物的Tt以上。这样，注射器溶液的组合物在沉积时就立即转变，从而使其从处于针中的杂乱液态转变为分配在床上的有序的疏水水合状态，从而实现了在床上形成长丝，可以逐层沉积以保持结构。
-另外，本发明的组合物可以进一步包含至少另一种单体D，其中所述单体D包含生物活性域的序列，例如RGD和REDV细胞粘附基序，生长因子例如VEGF，或金属蛋白酶，它们有利于所形成的结构的受控解聚等。在包含本发明的组合物的生物聚合物中引入这种类型的生物活性结构域可以设计具有不同功能和生物活性的结构，其目的是例如包含重组引入其序列中的特定细胞结合序列，在当今任何生物墨水中都不存在这种可能性。不同序列的引入将预先确定例如结构上的细胞行为，能够产生具有高度分化的细胞区域的基质，这对于可植入的组织或微器官的模拟设计是必要的特性。
因此，在第一方面，本发明涉及包含生物聚合物的组合物，所述生物聚合物包含单体B、单体C和至少单体X、单体Y或两者，其中，
如前所述，B是由ELR结构域重复形成的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，更优选地，单体B包含SEQ ID NO：2，
C是由ELR结构域重复形成的氨基酸序列，更优选地，单体C包含SEQ ID NO：3，
X是包含“拉链”结构基序的氨基酸序列，更优选地，单体X包含SEQ ID NO：4，并且
Y是包含弹性蛋白结构域序列和源自家蚕Bombyx mori的称为“丝”的序列的组合的氨基酸序列(SEQ ID NO：8；GAGAGS)，更优选地，单体Y包括SEQ ID NO：5。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物还包含单体D。更优选地，单体D是细胞结合序列，其包含至少一种选自以下的肽：RGD(Arg-Gly-Asp)作为αvβ3，α5β1和αIIbβ3整联蛋白受体的(SEQ ID NO：9)，LDT(SEQ ID NO：27)，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：19的细胞粘附结构域，或除了属于酶、uPA(尿激酶纤溶酶原激活剂系统)和其他有助于蛋白质降解的类似序列的GTAR序列(SEQ ID NO：28)和DRIR序列(SEQ IDNO：29)之外，还来自植物凝血素、凝集素、生长因子、金属蛋白酶的肝素结合结构域或糖结合结构域。优选地，单体D包含RGD结构域(SEQ ID NO：9)，并且优选地是SEQ ID NO：6。
RGD结构域是众所周知的，并且如其名称所示，由氨基酸精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。该结构域被各种细胞类型的细胞表面蛋白识别，并起细胞粘附结构域的作用。REDV结构域(SEQ ID NO：10)也是众所周知的，并且如其名称所示，由氨基酸精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和缬氨酸组成，也起细胞粘附结构域的作用，并被内皮细胞识别。肝素结合结构域是细胞表面糖胺聚糖结合结构域，因此起细胞结合结构域的作用。同样，糖结合结构域允许通过具有膜糖蛋白的糖与细胞结合。植物凝血素和凝集素具有众所周知的糖结合结构域。SEQID NO：18存在于层粘连蛋白中，并且可以被多种细胞类型识别，SEQ ID NO：19被神经突识别，换句话说，是神经元体的任何扩展，无论是树突状还是轴突状。这些序列是本发明生物聚合物的一部分，可被它们各自的细胞类型识别并促进其结合。包含SEQ ID NO：10或SEQID NO：19的生物聚合物可用于组织产生。
另外，本发明的生物聚合物可以任选地包含另外的单体，即单体A，其可以连接至它们的5′末端，并且是起始核苷酸序列的转录的结果。因此，单体A可以包含SEQ ID NO：20，其是核苷酸序列SEQ ID NO：1的转录的结果。
根据所描述的结构形成单体的氨基酸序列(术语“肽”可以互换使用以指氨基酸序列)产生本发明的生物聚合物，可以通过共价键或任何其他类型的键连接，产生保持本发明生物聚合物性能的结构。该键选自但不限于包含氢键、离子对、疏水性缔合或包合物形成的列表。
在一个优选的实施方案中，作为本发明生物聚合物的部分的单体可以直接彼此连接，或通过被称为多肽间隔子或接头的促进其连接的序列彼此连接。
因此，出于本发明的目的，术语“连接子”或“多肽间隔子”是指短的氨基酸序列，优选长度为至多20个氨基酸，更优选长度为至多15个氨基酸，更优选地，最高达10个氨基酸的长度，甚至更优选地，最高达5个氨基酸的长度，位于形成本发明的生物聚合物的单体B，C，X，Y和/或D的氨基酸序列之间，如通常所描述的或在下面定义的式(I)或(II)中所述，允许不同单体之间的连接。有利地，所述多肽间隔物是结构柔性肽，例如产生非结构域的肽。实际上，任何结构上柔性的肽都可以用作肽间隔基。然而，所述肽间隔基的说明性非限制性实例包括含有氨基酸残基重复序列(例如Val，Gly和/或Ser的氨基酸残基重复序列)的肽，或任何其他合适的氨基酸残基重复序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物的特征在于，包含它的生物聚合物具有结构(I)：
[(Bb-Cc)-Zz]n-Dd
其中B，C和D是上述单体，
Z选自以上定义的单体X和Y，
b的值介于5到15之间
c的值介于50到70之间；
z的值介于1到5之间
n的值介于1到5之间，并且
d的值介于0到3之间。
在本发明组合物的另一个优选实施方案中，更具体地，包含具有结构(I)的生物聚合物的组合物，单体Z为SEQ ID NO：4。
在本发明组合物的另一个优选实施方案中，更具体地，包含具有结构(I)的生物聚合物的组合物，单体Z为SEQ ID NO：5。
在一个更优选的实施方案中，本发明的组合物的特征在于其包含结构(I)的生物聚合物的组合，其中第一生物聚合物包含SEQ ID NO：4的单体Z，并且在所述组合物中的浓度为至少20重量％，优选20至40重量％，更优选至少40重量％，并且第二生物聚合物包含SEQ ID NO：4的单体Z，并且在组合物中的浓度为至少60重量％，优选60-80重量％。
在本发明的组合物的另一个优选的实施方案中，所述组合物的特征在于包含它的生物聚合物具有结构(II)：
Z1z-[(Bb-Cc)-Z2z]n-Dd，
其中B，C和D已预先定义，
Z1是包含“拉链蛋白”结构基序的氨基酸序列，更优选地，其包含单体X，甚至更优选地，其包含SEQ ID NO：4，并且
Z2是包含“丝蛋白”结构基序的氨基酸序列，更优选地，其包含单体Y，甚至更优选地，其包含SEQ ID NO：5，
b，c，z，n和d先前已定义。
在本发明组合物的另一个优选的实施方案中，所述组合物的特征在于b的值为10，c的值为60，z的值为1，n的值为2，d的值为0或1。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含具有结构(I)的至少一种生物聚合物，所述结构(I)选自：SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或其组合。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含结构(I)的生物聚合物的组合，其中第一生物聚合物包含选自以下的序列：SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15，更优选为SEQID NO：15，并且第二生物聚合物包含选自以下的序列：SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14，更优选为SEQ ID NO：14。
在另一个更优选的实施方案中，本发明的组合物包含SEQ ID NO：16的生物聚合物。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含细胞、生物活性分子、活性成分或其组合。
表1显示了本发明中描述的不同生物聚合物，以及包含它们的每种单体以及每种单体的结构。
表1.本发明生物聚合物的表征。
本发明的第二方面涉及一种核酸，其包含编码本发明的第一方面的生物聚合物的氨基酸序列的核苷酸序列。
核酸(下文中，本发明的核酸)包括核酸序列，其转录产物信使RNA(mRNA)编码相同的氨基酸序列(下文中，本发明的氨基酸序列或发明的氨基酸序列)。还包括本发明核苷酸序列的简并变体序列，其产物是具有与本发明生物聚合物相同特性的生物聚合物。还包括编码在其N末端，C末端和/或任何内部氨基酸位置有修饰以使所得生物聚合物的功能与从本发明的核苷酸序列转录的mRNA的序列翻译后的功能相同的氨基酸序列的核苷酸序列。氨基酸序列可以由产生本发明的任何氨基酸序列的任何核苷酸序列编码。假设遗传密码是简并的，则一个相同的氨基酸可以被不同的密码子(三联体)编码。为此，相同的氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。
如前所述，包含在本发明生物聚合物中的编码单体B，C，X，Y和/或D的核苷酸序列可以直接彼此连接，或通过多肽间隔子或连接子彼此连接。为了本发明的目的，因此编码本发明的每种生物聚合物的多核苷酸序列可以包含连接子。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的每种生物聚合物的核苷酸序列选自：SEQID NO：21，其编码包含SEQ ID NO：11的生物聚合物1；和SEQ ID NO：22，其编码包含SEQ IDNO：12的生物聚合物2；SEQ ID NO：23，其编码包含SEQ ID NO：13的生物聚合物3；SEQ IDNO：24，其编码包含SEQ ID NO：14的生物聚合物4；SEQ ID NO：25，其编码包含SEQ ID NO：15的生物聚合物5；以及SEQ ID NO：26，其编码包含SEQ ID NO：16的生物聚合物6。
本发明的核酸可以具有连接到其5'末端的核苷酸序列，作为转录起始序列。该序列可以是但不限于核苷酸序列SEQ ID NO：1，其在本发明的每种生物聚合物中编码氨基酸序列SEQ ID NO：20，在每种生物聚合物的最终结构中也称为单体A。同样，本发明的核酸可具有连接至其3'末端的转录终止序列，例如但不限于序列GTATGA。
将编码作为本发明组合物的部分的生物聚合物的氨基酸序列的核苷酸序列插入表达载体中。因此，本发明的另一方面涉及包含本发明核酸的表达载体。
为了本发明的目的，术语“表达载体”是指具有在特定宿主中复制的能力的DNA片段，并且如该术语所指示的，它可以用作媒介物，用于繁殖已经与其融合(插入)的另一个DNA片段。插入物是指与载体融合的DNA片段。在本发明的情况下，载体可以包含与本发明的任何生物聚合物融合的编码本发明的任何生物聚合物的任何核苷酸序列，其可以在合适的宿主中复制。载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，而不排除对应于所提供的载体定义的另一种类型的载体。
在较早的段落中定义的细胞转染是使用现有技术中已知的技术进行的，例如但不限于电穿孔，生物弹药，根癌农杆菌或允许在任何宿主细胞(无论是基因组、叶绿体还是线粒体)DNA中整合本发明的任何核酸的任何其他技术。
如上所述，核酸在本发明细胞中的表达产生了可以通过现有技术中已知的技术纯化的生物聚合物。
本发明的第三方面涉及用本发明的第二方面的核酸转染的分离的细胞。
如本发明中所理解的，术语“细胞”是指原核或真核细胞。该细胞可以是能够复制转化的外源DNA的细菌，例如大肠杆菌种的任何菌株，或者是能够将目的DNA转移到植物中的细菌，例如根癌土壤杆菌。优选地，细胞是指植物的真核细胞，并且在该组中，更优选地，是指属于植物界的那些细胞。因此，如果细胞是植物细胞，则术语细胞至少包括薄壁组织细胞，分生组织细胞或任何类型的细胞，其是分化的或未分化的。同样，该定义中还包括原生质体(缺少细胞壁的植物细胞)。
术语“转染”是指通过质粒、病毒载体(在这种情况下也可以提及转导)或其他转移工具将外部遗传物质引入细胞。用于非病毒方法的术语转染用来指代哺乳动物的真核细胞，而用于描述遗传物质向细菌和非动物性真核细胞(如真菌、藻类或植物)的非病毒转移时，术语“转化”是优选的。
一旦确定了它们的序列，构成本发明组合物的生物聚合物就可以成为现有技术中众所周知的其他处理方法，例如均质化和纯化方法的目标，有助于获得所需的细胞相容性水平，从而实现将其与具有不同诊断活性的细胞或其他生物活性分子和/或组分组合使用，甚至与用作生物墨水的组合物结合使用，例如基于藻酸盐、明胶、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖、脱细胞的细胞外基质、DNA肽以及结构蛋白(例如胶原蛋白、丝素蛋白和纤维蛋白)的天然生物墨水；合成生物墨水，例如聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，普鲁尼克酸，聚乙二醇(PEG)，聚L-乳酸(PLA)和聚(ε-己内酯)(PCL)。同样，它们可以通过不同的机械、酶和/或化学步骤进行加工，以实现所需的聚合物性质，包括形态性质和物理性质。几种表征方法也将用于确保其在完美条件下的使用，例如其氨基酸组成的分析，物理表征或由本发明所述的组合物形成的生物墨水的流变学分析。
本发明的第四方面涉及本发明的组合物作为生物墨水，优选作为3D打印的生物墨水的用途。
本发明的第五方面涉及包含本发明所述的组合物的生物墨水。
为了本发明的目的，使用无菌组分制备生物墨水，并始终确保其在无菌条件下使用。设计用于形成所述生物墨水的不同生物聚合物可以在有或没有细胞的情况下进行印刷，也可以用作其他生物墨水的支持物，例如从脱细胞的组织和器官制备的材料。
本发明的第六方面涉及包含本发明的组合物的3D生物材料。
在本文所述的任何实施方案中，本发明所述的组合物、生物墨水和生物材料可进一步包含一种或多种适于预期目的的试剂(例如，赋形剂、添加剂、活性成分、生物活性剂等)。包括治疗剂(例如生物活性剂)和生物样品。通常，据说添加此类试剂可“功能化”组合物、生物墨水或生物材料，从而提供附加的功能。适于添加以使本发明的组合物、生物墨水和生物材料功能化的所述试剂的非限制性实例包括但不限于：导电或金属颗粒；或无机颗粒染料/颜料；药物或活性成分(例如，抗生素、小分子或低分子量有机化合物)；蛋白质及其片段或复合物(例如，酶、抗原、抗体及其抗原结合片段)；细胞及其级分(病毒和病毒颗粒，原核细胞例如细菌，真核细胞例如哺乳动物细胞和植物细胞，真菌)。
如本文所用，术语“生物活性剂”是指行使至少一种体外或体内生物学效应的任何分子。例如，生物活性剂可以是用于治疗或预防受试者的疾病状态或病症的治疗剂。生物活性剂包括但不限于有机分子、无机材料、蛋白质、肽、核酸(例如基因、基因片段、基因调节序列和反义分子)、核蛋白、多糖、糖蛋白和脂蛋白。可掺入本文所述的组合物中的生物活性化合物的类别包括但不限于抗癌剂、抗生素、镇痛药、抗炎药、免疫抑制剂、酶抑制剂、抗组胺药、抗惊厥药、激素、肌肉松弛剂、解痉剂、眼药、前列腺素、抗抑郁药、抗精神病药、营养因子、骨诱导蛋白、生长因子和疫苗。
在一些实施方案中，添加剂是治疗剂。如本文所用，术语“治疗剂”是指为了诊断、治疗、预防医学或兽医目的而施用给生物体的分子、分子组、复合物或物质。如本文所用，术语“治疗剂”包括“药物”或“疫苗”。该术语还可以具体包括核酸和包含产生治疗作用的核酸的化合物。
术语“治疗剂”还包括能够在其所应用的生物系统中提供局部或全身生物学、生理或治疗作用的试剂。例如，除其他功能外，治疗剂可用于控制感染或炎症，增强细胞生长和组织再生，控制肿瘤生长，用作止痛药，促进抗细胞结合并增强骨生长。其他合适的治疗剂可包括抗病毒剂、激素、抗体或治疗蛋白。其他治疗剂包括前药，所述前药是在给药时不具有生物活性但在向受试者给药后通过代谢或某些其他机制转化为生物活性剂的药物。另外，基于丝蛋白的药物递送组合物可包含治疗剂或两种或更多种治疗剂的组合。
在一些实施方案中，该试剂刺激组织形成和/或自然组织愈合和再生长，及其任何组合。在注射部位增加新组织形成和/或刺激天然组织愈合或再生长的药剂可以包括生长因子(成纤维细胞生长因子(FGF)，转化生长因子β(TGF-β，血小板)等。导出的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，结缔组织激活肽(CTAP)，成骨因子，包括骨形态发生蛋白、肝素、血管紧张素II(A-II)及其片段，胰岛素样生长因子，肿瘤坏死因子，白介素，集落刺激因子，促红细胞生成素，神经生长因子，干扰素，生物活性类似物，此类生长因子的片段和衍生物及其任何组合。
在一些实施方案中，该试剂是伤口愈合剂。如本文所用，“伤口愈合剂”是积极促进伤口愈合过程的化合物或组合物。
在某些实施方案中，本文所述的活性剂是免疫原。在一个实施方案中，免疫原是疫苗。
在一些实施方案中，所述试剂可以是细胞，例如生物细胞。可用于并入组合物中的细胞可以来自任何来源，例如哺乳动物、昆虫、植物等。在一些实施方案中，该细胞可以是人细胞、灵长类细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞等，最好是人类细胞。在一些实施方案中，细胞可以是基因修饰的细胞。可以对细胞进行遗传修饰以表达和分泌所需化合物，例如生物活性剂、生长因子、分化因子、细胞因子等。用于遗传修饰细胞以表达和分泌目的化合物的方法是本领域已知的，并且本领域技术人员可以容易地进行调整。
在一些实施方案中，本发明的组合物、生物墨水和生物材料可包括着色剂，例如颜料或染料或其组合。可以包括有机和/或无机、荧光等的颜料和着色剂。
因此，鉴于上述内容，本发明的另一方面涉及用作药物的本文所述的组合物、生物墨水和生物材料。
本发明的另一方面涉及用于组织再生以及用于产生模仿病理的组织的本发明所述的组合物、生物墨水和生物材料，所述组织用作疾病模型或包含用于测试新的治疗和/或预防性化合物的缺陷，从而阻止了动物模型的使用。
本发明的另一方面涉及一种用于获得本发明的组合物的方法，包括以下步骤：
(a)在适于表达本发明第二方面的核酸的条件下培养本发明第三方面的细胞。
(b)纯化由所述核酸编码的生物聚合物。
多功能设计需求所带来的组成复杂程度无法通过标准的大分子合成技术来实现。通过适应的分子和生物技术生物学技术，在基因改造的微生物或植物中，以重组蛋白的形式获得生物聚合物。
将编码本发明生物聚合物的氨基酸序列的核苷酸序列插入上述定义的表达载体中。
在较早的段落中定义的细胞转染是使用现有技术中已知的技术进行的，例如但不限于电穿孔，生物弹药，根癌农杆菌或允许在任何宿主细胞(无论是基因组、叶绿体还是线粒体)的DNA中整合本发明的任何核酸的任何其他技术。
核酸在本发明的细胞中的表达产生了可以通过现有技术中已知的技术纯化的生物聚合物。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变型形式并不意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，本发明的其他目的、优点和特征可以从本发明的说明书和实施例中部分推导出。下列实施例和附图以举例说明的方式提供，并不意图限制本发明。
附图说明
图1显示了生物聚合物1的丙烯酰胺凝胶电泳，其分子量标记位于左侧泳道，而生物聚合物1位于右侧泳道。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图2显示了生物聚合物1的质谱分析(MALDI-ToF或“基质辅助激光解吸/电离-飞行时间”)分析，该图显示了其实验分子量为92897Da，其中理论分子量为93175Da，两者之间的差异可归因于测量误差。还观察到了分子的单分散性质，仅观察到一个窄峰。
图3显示了生物聚合物1的红外光谱(FTIR-ATR或“傅立叶变换红外-衰减全反射”)分析，该分析显示了设计的蛋白质生物聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图4显示了生物聚合物1的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)、属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图5显示了生物聚合物2的丙烯酰胺凝胶电泳，其中分子量标记在右侧泳道中，而生物聚合物2在左侧泳道中。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图6显示了生物聚合物2的MALDI-TOF分析，其显示了其实验分子量101664Da的值，其中理论分子量为101696Da，并且两者之间的差异可归因于测量误差。
图7显示了生物聚合物2的FTIR-ATR分析，该分析显示了设计的蛋白质聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图8显示了生物聚合物2的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)、属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图9显示了生物聚合物3的丙烯酰胺凝胶电泳，其中分子量标记在左侧泳道中，而生物聚合物3在右侧泳道中。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图10显示了生物聚合物3的MALDI-TOF分析，其显示了其实验分子量103793Da的值，其中理论分子量为104119Da，并且两者之间的差异可归因于测量误差。
图11显示了生物聚合物3的FTIR-ATR分析，该分析显示了设计的蛋白质聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图12显示了生物聚合物3的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)、属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图13显示了生物聚合物4的丙烯酰胺凝胶电泳，其中分子量标记在右侧泳道中，而生物聚合物4在左侧泳道中。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图14显示了对生物聚合物4的MALDI-TOF分析，该分析显示了其实验分子量122122Da的值，其中理论分子量为123345Da，并且两者之间的差异可归因于测量误差。
图15显示了生物聚合物4的FTIR-ATR分析，该分析显示了设计的蛋白质聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图16显示了生物聚合物4的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)、属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图17显示了生物聚合物5的丙烯酰胺凝胶电泳，其中分子量标记在右侧泳道中，而生物聚合物5在左侧泳道中。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图18显示了生物聚合物5的MALDI-TOF分析，该分析显示了其实验分子量120611Da的值，其中理论分子量为120921Da，并且两者之间的差异可归因于测量误差。
图19显示了生物聚合物5的FTIR-ATR分析，该分析显示了设计的蛋白质聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图20显示了生物聚合物5的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)，属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图21显示了生物聚合物6的丙烯酰胺凝胶电泳，其中分子量标记在右侧泳道中，而生物聚合物6在左侧泳道中。分子量以千道尔顿(kDa)表示。
图22示出了对生物聚合物6的MALDI-TOF分析，该分析显示了其实验分子量的值为125857Da，其中理论分子量为126393Da，并且两者之间的差异可以归因于测量误差。
图23显示了生物聚合物6的FTIR-ATR分析，该分析显示了设计的蛋白质聚合物中存在的酰胺基(～1700cm-1)的特征信号。
图24显示了生物聚合物6的核磁共振(NMR)分析，其中观察到属于胺基团NH(7.5-8.5ppm)、属于甲基团CH3(0.5-1.0ppm)和属于亚甲基团CH(1.0–2.3；3.5–4.5ppm)的氢的信号。
图25显示了用组合物印刷的生物材料的照片，该组合物包含A列所示的预固化生物聚合物5(SEQ ID NO：15)以及B列所示的生物聚合物4(SEQ ID NO：14)的不同浓度(300、250、200、180、150和120mg/ml)，使用PBS1x作为溶剂。
图26显示了使用PBS1x作为溶剂以250mg/ml的浓度用本发明的不同组合物印刷的不同生物材料的照片，其中清楚地显示了所述生物材料的可印刷性(A列)和原纤维观察结果(B列)。BP：生物聚合物。生物聚合物组合的百分比是指以重量表示的百分比。
图27显示了由经受增加的剪切速度(1/s)的本发明的不同生物聚合物形成的生物墨水的粘度(以帕斯卡/秒，Pa.s表示)。
图28示出了在短时间间隔内经受高剪切速度的本发明的不同生物墨水中粘度变化的评估。步骤1：剪切速度为5s-1。步骤2：剪切速度为1000s-1。步骤3：剪切速度为5s s-1。
图29显示了温度对本发明的不同的所分析的生物墨水的粘度的影响。
图30示出了用使用PBS1x作为溶剂的，包含生物聚合物4(SEQ ID NO：14)的生物墨水印刷的不同结构的照片，其中示出了印刷结构在3天内的稳定性。
图31显示了用使用PBS1x作为溶剂的，包含预固化生物聚合物5(SEQ ID NO：15)的生物墨水印刷的不同结构的照片，其中显示了印刷结构在两天内的稳定性。
图32示出了用生物墨水印刷的不同结构的照片，所述生物墨水包含生物聚合物，60重量％的生物聚合物4(SEQ ID NO：14)和40重量％的预固化生物聚合物5(SEQ ID NO：15)的组合，使用PBS1x作为溶剂，显示了印刷结构在40天内的稳定性。
图33示出了使用PBS1x作为溶剂的，包含生物聚合物6(SEQ ID NO：16)的生物墨水印刷的不同结构的照片，其中示出了印刷结构在40天内的稳定性。
图34示出了显示在30分钟，2小时和4小时的时间的早期细胞粘附的分析的图，其是SEQ ID NO：14的生物聚合物4(60重量％)和SEQ ID NO：15的预固化的生物聚合物5(40的重量％)的混合物，包括RGD粘附序列(白色方框)，以及SEQ ID NO：13的生物聚合物3(60％重量)和SEQ ID NO：12的生物聚合物2(40％重量)的混合物，不包含细胞粘附序列(黑色方框)。
图35示出了基于SEQ ID NO：14的生物聚合物4(60重量％)和SEQ ID NO：15的预固化生物聚合物5(40重量％)的包含RGD粘附序列的混合物(白色方框)以及SEQ ID NO：13的生物聚合物3(按重量计60％)和SEQ ID NO：12的生物聚合物2(按重量计40％)的不包含细胞粘附顺序的混合物(黑色方块)在印刷表面上21天的细胞增殖的分析。
图36示出了用生物墨水印刷的表面的显微照片，所述生物墨水包含SEQ ID NO：14的生物聚合物4(60重量％)和SEQ ID NO：15的预固化生物聚合物5(40重量％)的组合，用PBS1x作为溶剂，在其上接种了HFF-1细胞并培养了7天。
图37示出了用生物墨水印刷的表面的显微照片，所述生物墨水包含SEQ ID NO：14的生物聚合物4(按重量计60％)和SEQ ID NO：15的预固化生物聚合物5(按重量计40)的组合，使用PBS1x作为溶剂，在其上接种HFF-1细胞并培养7天。示出了不同的焦平面以证实系统的三维性。
图38显示了与生物聚合物6一起印刷的人类成纤维细胞HFF-1在21天内的生存力。将印刷的栅格的生存力与对照(未印刷的沉积材料)进行比较。
图39显示了在21天内用与人成纤维细胞HFF-1混合的生物聚合物6印刷的表面的显微照片。比例尺对应于500μm。
发明详述
实施例
下面通过发明人进行的测定来说明本发明，所述测定描述了本发明的组合物的合成及其特征。提供这些实施例是为了理解描述的目的，而不是意图限制本发明。
实施例1.获得和表征形成本发明组合物的重组蛋白质生物聚合物。
如WO/2010/092224中所述进行编码所使用的不同生物聚合物的氨基酸序列的合成核苷酸序列的设计和获得，所述不同生物聚合物包括包含本发明的组合物的生物聚合物。同样，如WO/2010/092224中所述进行生物聚合物的表达，纯化和表征。
简而言之，ELR是通过重组DNA技术设计和生产的。一旦将编码所需蛋白质的核苷酸序列引入细菌菌株大肠杆菌中，就将所述菌株在发酵罐中进行培养，从而可以绝对控制生产条件。当细菌培养物生长曲线达到固定相时，通过超声裂解细菌壁提取所需的ELR。生物聚合物的纯化将使用其逆温度转变特性进行，进行细菌碎片加热和冷却循环，直到获得纯聚合物为止。
经过透析除盐过程后，所有使用的生物聚合物均被冻干，呈现出白色和棉质外观，并搁置直至在-20℃下以这种状态使用。
为了表征获得的生物聚合物，使用了以下技术：
-在SDS存在下的丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，除了可以验证其纯度之外，还可以近似估计生物聚合物的分子量。
-在Q-Star光谱仪中进行MALDI-TOF质谱分析，以精确获得聚合物的分子量。
-在布鲁克ARX300光谱仪中的质子核磁共振(H1-NMR)光谱。
-使用Cary 50分光光度计的红外(FT-IR)光谱。
-使用带有WATERS 2487检测器的WATERS 600HPLC梯度系统，通过UV检测进行HPLC色谱测定，从而可以确定氨基酸组成。
-在Mettler Toledo 822e DSC设备中以50mg/ml的浓度对材料的水溶液进行差示扫描量热(DSC)，以获得聚合物的逆转变温度。
为了证明本发明的组合物，特别是用作生物墨水的有效性，设计了以下生物聚合物(表2)，以随后确定哪种是用作生物墨水的最佳组合物。
表2.生物聚合物、结构以及氨基酸和核苷酸序列：
生物聚合物1(1107个氨基酸)
结构：(A)-{(B10-C60)}2-D。
氨基酸序列：SEQ ID NO:11:MESLLP-{[VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60}2-([VPGIG]5AVTGRGDSPASS)6-V
由核苷酸序列SEQ ID NO：21编码。
表3列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外光)检测获得的氨基酸组成。
表3.生物聚合物1的氨基酸组成的分析
产量为227.65mg/l。
生物聚合物1的理论分子量为93175Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图1)和MALDI-TOF质谱进行了实验估算，得出92897Da。图2、3和4分别显示了生物聚合物1的HPLC、红外(IR)和核磁共振(NMR)光谱。
通过DSC在MQ中于pH 7.8获得的转变温度为19.10℃，而在1X PBS中于pH 7.65获得的转变温度为14.66℃。
生物聚合物2(1233个氨基酸)
结构：(A)-{(B10-C60)-Y}2
氨基酸序列SEQ ID NO：12：MESLLP-{([(VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60)-[V(GAGAGS)5G]2}2
由核苷酸序列SEQ ID NO：22编码。
表4列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外线)检测获得的氨基酸组成。
表4：生物聚合物2的氨基酸组成的分析。
产量为178.9mg/l。
聚合物2的理论分子量为101696Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图5)和MALDI-TOF质谱法(图6)进行了实验估算，得出101664Da。在图7和8中分别示出了对于生物聚合物2获得的IR和NMR光谱。
通过DSC在MQ中于pH 6.14获得的转变温度为20.08℃，而在1X PBS中于pH 6.40获得的转变温度为16.92℃。
生物聚合物3(1213个氨基酸)
结构：(A)-{(B10-C60)-X}2
氨基酸序列SEQ ID NO：13：MESLLP-{[VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60-[VGGGGGKENQIAIRASFLEKENSALRQEVADLRKELGKCKNILAKYEAGGGGG]}2
由核苷酸序列SEQ ID NO：23编码。
表5列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外光)检测获得的氨基酸组成。
表5：生物聚合物3的氨基酸组成的分析。
产量为517.22mg/l。
聚合物F的理论分子量为104119Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图9)和MALDI-TOF质谱法(图10)进行了实验估算，得出103,793Da。在图11和12中分别示出了对于生物聚合物3获得的IR和NMR光谱。
通过DSC在MQ中于pH 7.5获得的转变温度为15.30℃，而在1X PBS中于pH 7.5获得的转变温度为14.18℃。
生物聚合物4(1435个氨基酸)
结构：(A)-{(B10-C60)-X}2-D
氨基酸序列SEQ ID NO：14：MESLLP-{[VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60-[VGGGGGKENQIAIRASFLEKENSALRQEVADLRKELGKCKNILAKYEAGGGGG]}2-([VPGIG]5AVTGRGDSPASS)6-V
由核苷酸序列SEQ ID NO：24编码。
表6列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外光)检测获得的氨基酸组成。
表6.生物聚合物4的氨基酸组成的分析
产量为239.81mg/l。
生物聚合物4的理论分子量为123345Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图13)和MALDI-TOF质谱(图14)通过实验估算得出122882Da。在图15和16中分别示出了对于生物聚合物4获得的IR和NMR光谱。
通过DSC在MQ中于pH 6.48获得的转变温度为17.58℃，而在1X PBS中于pH 6.02获得的转变温度为14.92℃。
生物聚合物5(1455个氨基酸)
结构：(A)-{(B10-C60)-Y}2-D
氨基酸序列SEQ ID NO：15：MESLLP-{([(VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60)-[V(GAGAGS)5G]2}2-([VPGIG]5AVTGRGDSPASS)6-V
由核苷酸序列SEQ ID NO：25编码。
表7列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外光)检测获得的氨基酸组成。
表7.生物聚合物5的氨基酸组成分析
产量为203.07mg/l。
生物聚合物3的理论分子量为120921Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图17)和MALDI-TOF质谱法(图18)进行了实验估算，得出120611Da。在图19和20中分别示出了对于生物聚合物2获得的IR和NMR光谱。
通过DSC在MQ中于pH 6.59获得的转变温度为20.84℃，而在1X PBS中于pH 7.24获得的转变温度为17.26℃。
生物聚合物6(1508个氨基酸)
结构：(A)-X-{(B10-C60)-Y}2-D
氨基酸序列SEQ ID NO：16：MESLLP-[VGGGGGKENQIAIRASFLEKENSALRQEVADLRKELGKCKNILAKYEAGGGGG]-{([(VPGVG)2-(VPGEG)-(VPGVG)2]10[VGIPG]60)-[V(GAGAGS)5G]2}2-([VPGIG]5AVTGRGDSPASS)6-V
由核苷酸序列SEQ ID NO：26编码。
表8列出了理论氨基酸组成和通过HPLC进行UV(紫外光)检测获得的氨基酸组成。
表8.生物聚合物6的氨基酸组成的分析
产量为116mg/l。
生物聚合物6的理论分子量为126393Da，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(图21)和MALDI-TOF质谱(图22)进行实验估算，得出125857Da。在图23和24中分别示出了对于生物聚合物6获得的IR和NMR光谱。
通过DSC在MQ中于pH 7.50获得的转变温度为20.42℃，而在1X PBS中于pH 7.50获得的转变温度为17.41℃。
实施例2.确定允许最佳印刷的本发明生物墨水的组成。
考虑到表2中描述的不同生物聚合物或它们的混合物的逆转变温度，利用表2中描述的不同生物聚合物或它们的混合物进行3D打印。所述转变温度与本发明生物聚合物的组合物的特定性质一起，通过简单的温度变化使潜在的生物墨水胶凝化。
所使用的实验系统包括一个REGEMAT 3D打印机，其上安装了与冷却浴相连的头，该头可使注射温度保持在4℃。此外，打印机具有加热床，该加热床在打印过程中保持在30℃的温度下。
就生物聚合物1(SEQ ID NO：11)而言，胶凝化是由于其嵌段C(疏水性)和嵌段B(亲水性)之间存在疏水性分子间力。嵌段D，具体包括在其序列中另外引入的肽RGD，不影响凝胶形成，而是被引入以向生物聚合物提供生物功能。假定该生物聚合物1将不包含任何单体X、单体Y或两者都不包含在内，该生物聚合物1将被用作生物印刷的阴性对照。
其余的生物聚合物2(SEQ ID NO：12)、3(SEQ ID NO：13)、4(SEQ ID NO：14)、5(SEQID NO：15)和6(SEQ ID NO：16)除了其他单体X和/或Y以外，还包含碱性单体C(疏水)和B(亲水)，也显示出这些疏水相互作用。它们都进一步包含嵌段D，在所示的实施例中，该嵌段D具体包括肽RGD，以为生物聚合物提供生物功能，从而诱导细胞粘附。
生物聚合物4(SEQ ID NO：14)和3(SEQ ID NO：13)包含拉链序列(SEQ ID NO：4)，该拉链序列可通过带电氨基酸之间的静电力相互作用形成α螺旋，从而有助于聚合物的稳定性。生物聚合物5(SEQ ID NO：15)和2(SEQ ID NO：12)表现出相同的疏水相互作用，但在这种情况下通过在它们的氨基酸中存在的酰胺基和羧基之间形成氢键，由于形成源自丝蛋白序列(SEQ ID NO：8)的β片层而得以稳定。
对于生物聚合物5(SEQ ID NO：15)的特定情况，已经进行了当所述生物聚合物已经进行预固化处理(以下称为预固化生物聚合物5)时或未进行上述处理(将继续称为生物聚合物5)时，其胶凝之间的比较。由于生物聚合物5在分子水平上的结构方面的可变性而进行预固化处理，在生物聚合物5中，它可能呈现不同程度的β片层形成，从而影响其机械特性。在生物聚合物5的生产和纯化过程中，β片层通过氢键形成。所述交联在不同批次的生物聚合物之间是不均匀的，从而产生具有不同初始交联的批次。通过预固化处理破坏氢键可确保所有批次中β片层形成的初始状态均相同。为了进行预固化处理，首先，通过使用甲酸破坏其分子间力来使生物聚合物均质化，这允许从不存在β片层的状态开始。在该状态之后，生物聚合物在37℃下固化24小时，有利于β片层的形成。由此在所有批次的聚合物中确保相同的初始状态，并且该过程从可预见的更适合于印刷的预胶凝状态开始。
与生物聚合物4(SEQ ID NO：14)混合在一起的生物聚合物1(SEQ ID NO：11)和与预固化的生物聚合物5(SEQ ID NO：15)混合的生物聚合物1(SEQ ID NO：11)都可用作印刷的阴性对照。它们的印刷证明只有在混合物同时包含两个增强序列时才能获得最佳印刷效果(图26)。
此外，为了确认当单体X和Y位于相同的生物聚合物中时聚合物4和预固化的聚合物5的混合物是否表现相同，合成了生物聚合物6(SEQ ID NO：6)。该生物聚合物6既表现出初始的疏水相互作用，又表现出源自拉链蛋白和丝蛋白序列的静电和氢键相互作用。
用包含生物聚合物1、4、5，预固化的生物聚合物5和生物聚合物6的组合物进行单独或组合的不同印刷操作。为此，借助REGEMAT 3D打印机软件，设计了栅格，尺寸为10x10毫米，高度为1.30毫米(相当于6层高度)，并且以90°的角度布置了1.5毫米的孔隙度。将用0.25mm的喷嘴和0.06mm/s的流量注射本发明的生物聚合物的不同组合物。如果需要，可以分别对流量进行调整，以实现宽度相近的生产线，从而使结构彼此之间更佳地进行比较。
如图25所观察到的，在不同浓度的1x PBS(120、150、180、200、250和300mg/ml)下溶解的预固化生物聚合物5的最佳印刷浓度估计为250mg/ml，假定所述浓度是溶液粘度适合于借助3D打印机进行“注射”过程的浓度。因此，选择250mg/ml的浓度用于各种印刷操作的比较。对于生物聚合物4的情况，也如图25所观察到的，在3D打印机中用于注射过程的合适浓度为250mg/ml。
印刷设计的栅格允许通过测量可印刷性来进行本发明的各种生物聚合物的可印刷性的半定量，这给出了关于印刷结构相对于设计结构的相似性的想法。在这种情况下，设计并打印方孔，因此建立了参数(Pr)，用于测量相对于这些方格的打印操作的相似性。
表现出良好可印刷性的生物墨水必须通过挤出具有恒定形态的细丝来沉积，这些细丝可以在高度上沉积而不会彼此融合。如果生物墨水显示出较低的可印刷性，则不会发生这种情况，并且细丝趋于塌陷并彼此融合，从而形成趋于呈圆形的孔隙。因此，圆度定义为：
其中L定义周长，A定义面积。所获得的值越接近1，则圆度越大，其中1是正圆。
在正方形的情况下，圆度将为π/4，基于正方形的参数Pr可定义为：
为了获得理想的可印刷性，相互连接的孔应为正方形，Pr值为1。
参数Pr的确定是通过使用LEICA DMS 1000数字显微镜拍照来进行的，并且通过Image J软件(n＝5)分析所拍摄的光学图像(图26)。
表9总结了所述用于测定样品的参数的结果。
表9：在以250mg/ml的最终浓度印刷的每种生物墨水中获得的可印刷性(Pr)的测量。
用于确定生物墨水可印刷性的另一个参数(在这种情况下是定性的)是原纤维观察，换句话说，如果逐层沉积聚合物的沉积物并观察到沉积的纤维，则相比这些纤维彼此融合的情况，结构将倾向于较少塌陷，会导致形状保真度降低。
在图26中，观察了所执行的打印的照片。在测量参数Pr之后，可以观察到，在Pr值为0.90之后，以受控的方式执行印刷操作，允许沉积在沉积时彼此不混合的纤维，从而保持其原纤维结构的高度。
如图26中观察到的，生物聚合物1在印刷后不会胶凝，因此它不保持其结构。考虑到该聚合物不包含单体X和/或Y，该行为与预期的相符，该单体X和/或Y允许所形成的凝胶的稳定性。
与生物聚合物1中发生的情况不同，当生物聚合物具有单体X和/或Y时，如在生物聚合物4、5和预固化生物聚合物5的情况下，用相同的聚合物进行印刷。生物聚合物5允许对其进行印刷，但是印刷的结构迅速分解，从而使得不能测量其印刷性。相反，尽管预固化聚合物5具有高印刷保真度，但预固化聚合物5仍显示出过度胶凝，这在纤维的非线性沉积中观察到。因此，样品由于温度变化而胶凝化的事实不是为实现该系统的良好生物墨水所期望的充分条件，并因此获得了显示出与设计结构真正相似的结构的印刷表面。胶凝现象和胶凝前后材料的机械性能改变是决定因素，可能不足，无法预测哪种材料适合用作生物墨水。
最后，生物聚合物4显示出0.94的Pr值的可靠结构(图26)。
假定预固化聚合物5显示的可印刷性参数高于聚合物5，以证明单体X和Y的协同作用，则选择预固化聚合物5作为单体Y的载体，从而印刷以下混合物：生物聚合物4(按重量计80％)+预固化生物聚合物5(按重量计20％)；生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)和生物聚合物4(20重量％)+预固化生物聚合物5(80重量％)。生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的比例的印刷显示出在印刷混合物中获得的最高Pr值，因此该混合物可被认为是3D打印的最佳选择。当预固化生物聚合物5的比例较高时，获得最低值。此外，生物聚合物4(60重量％)+生物聚合物5(40重量％)的混合物的印刷允许观察到，当这种类型的聚合物的印刷混合物最佳时，如果生物聚合物5不进行预固化，可印刷性降低，如果要获得更好的结构保真度，则必须使用预固化生物聚合物5。
为了确认单体X和Y之间的协同作用，包含生物聚合物5(40重量％)+生物聚合物1(60重量％)的混合物和生物聚合物4(60重量％)+生物聚合物1(40重量％)的混合物也被印刷出来。所述混合物显示出具有较差的可印刷性的印刷，证实了要获得良好的可印刷性，包含单体X和Y的生物聚合物的混合物是必需的。
最后，生物聚合物6的印刷显示出非常好的形状保真度，其中观察到纤维的沉积，使得它们最终不会完全重叠。该聚合物获得了最高的可印刷性值，对应于0.97。尽管对于该聚合物获得的Pr值与包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的Pr值相差不大，但在印刷中观察到了更大的沉积容易性，并且能够对沉积的纤维进行更好的控制。
实施例3.本发明的组合物的机械性能。
进行流变学分析以分析用作生物墨水的本发明组合物的机械性能。选择那些具有较高可印刷性的组合物，其对应于包含生物聚合物4、生物聚合物6、预固化生物聚合物5和生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物。
流变学研究是用配备有珀尔帖板且直径为40mm的几何结构的TA Instruments AR200 EX流变仪进行的。在测定过程中，所有分析的组合物均保持在4℃下。
第一个表征是基于对本发明的组合物在经受增加的剪切速度时用作生物墨水所经历的粘度变化的研究(图27)。当提高剪切速度时，生物聚合物4和包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物均未显示出粘度降低，因此表现得像牛顿流体一样，表现出相对较低的粘度(大约1Pa.s)。它们表现得像低粘度牛顿流体一样的事实允许以较低的剪切应力进行受控沉积，从而保护嵌入所述组合物中的细胞。而且，由预固化生物聚合物5形成的组合物在增加剪切应力时表现出粘度降低，其从10Pa.s的粘度开始并且在生物墨水经受高剪切速度时稳定在1Pa.s的粘度。生物墨水的这种行为类似于假塑性流体所描述的行为。
此外，包含生物聚合物6的组合物具有粘塑性(或宾汉(Bingham)塑性)特性，在达到对应于248.6 1/s的临界变形应力之前显示2.35Pa.s的粘度，此后粘度开始稍微降低直至达到1.41Pa.s。
可以得出结论，包含单体Y的组合物在生物墨水中显示出假塑性行为。在生物聚合物6的情况下，这种行为会出现延迟，一旦超过临界变形应力，就可以开始观察到这种延迟。所述行为对应于表现出粘塑性或宾汉塑性行为的塑料。
为了模拟当本发明的组合物在打印机中用作生物墨水时本发明的组合物要经受的注射过程，对其进行了触变性分析。该分析包括使生物聚合物在短时间内经受高剪切速度，试图反映出在打印过程中穿过直径很小的针头时生物墨水所承受的力。
在上述组合物的触变分析中获得的结果清楚地表明，当模拟注射过程时，其粘度没有变化，换句话说，当短时间段内经受高剪切应力时，所有分析的组合物的粘度都没有变化(图28)。
然后分析当发生温度升高时的粘度的变化。分析确定理想的温度，在该温度下应预热打印床，以在生物墨水中获得更高的粘度，从而获得更高的打印分辨率。
结果表明，所分析的组合物的聚合物粘度随着温度的升高而增加，直至达到取决于每种组合物的最大值，其范围为18-22℃，随后随着温度的持续升高，所述粘度逐渐降低(图29)。对于每种生物墨水组合物，达到的该最大粘度是不同的，并且在不同的温度下达到所述的最大值。因此，如图29所示，包含生物聚合物4的组合物在15.0℃的温度下的粘度为212.5Pa.s；包含预固化生物聚合物5的组合物在18.4℃的温度下具有90.9Pa.s的粘度；包含生物聚合物6的组合物在21.7℃的温度下具有371Pa.s的粘度；包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物在19.5℃的温度下的粘度为242.6Pa.s。
考虑到上述结果，所研究的生物墨水所达到的最大粘度与其可印刷性之间存在相关性。因此，显示出较低可印刷性的生物墨水(分别包含生物聚合物4和预固化生物聚合物5的生物墨水)比具有较高可印刷性的生物聚合物(包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的生物墨水以及包含生物聚合物6的生物墨水)所达到的最大粘度更低。考虑到以下事实做出这种解释：生物墨水表现出的粘度越高，其印刷保真度就越高。
同样，已经观察到，在所有生物墨水中都有一个临界温度点，此后粘度开始逐渐增加，并且对于包含生物聚合物4和生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的生物墨水，所述临界温度点对应于约8.5℃，对于包含预固化生物聚合物5或生物聚合物6的生物墨水，所述临界温度点对应于约11℃。该临界点表明，为了以低粘度进行打印，生物墨水必须在储存器中保持低于此温度。
实施例4.生物墨水的流体稳定性。
接下来，分析本发明中描述的组合物在所选流体中的稳定性，对于本实施例的情况，所述流体为1x PBS。假定用本发明描述的组合物印刷的结构将用于体外培养或用于组织模型，则该结构必须能够在水性介质中长时间保持稳定。对于此实施例，圆柱体的直径设计为6毫米，高度为1.5厘米，通过直径为0.25毫米的喷嘴进行打印操作。所测定的组合物是包含生物聚合物4、预固化的生物聚合物5、生物聚合物6或生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物。
用包含在1x PBS中浓度为250mg/ml的生物聚合物4的组合物进行打印，显示出良好的结构保持性，但无法随时间推移得以保持(图30)。相反，在与上述条件相同的条件下，用包含预固化生物聚合物5的组合物进行的印刷操作在较短的时间间隔内显示出较低的形状保真度及其塌陷，这使得尽管随着时间的推移显示出稳定性，不能印刷适当在高度上保持其形状的结构(图31)。
相反，用包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物进行印刷解决了所述组合物用作生物墨水时单独存在的缺点。这种混合物可以使打印表现出良好的形状保真度，并且可以随时间进行结构维护，从而可以制造复杂的结构(图32)。同样地，包含具有生物聚合物6的组合物的生物墨水也显示出随时间的结构保持性，因为它在其序列中包含单体X和单体Y(图33)。
实施例5.评估组合物的细胞生存力和细胞毒性。
一旦评估了本发明的组合物作为生物墨水的可印刷性及其随时间的一致性，就使用人成纤维细胞系HFF-1评估了它们的细胞毒性和细胞生存力。为此，印刷直径为5mm，高度为1mm的多孔圆形栅格，其侧向孔隙率为1mm。
选择用于进行测定的组合物是包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物，因为如先前实施例中所证明的，这些是具有以下特征的组合物：由于它们包含单体X和Y，因此证明了随时间的最佳可印刷性和稳定性。为了确定所述组合物包含在包含单体D的生物聚合物序列中，特别是包含RGD序列的单体D，更特别是包含序列SEQ ID NO：6的单体D时，所表现出的生物活性，将包含生物聚合物3(60重量％)+生物聚合物2(40％重量％)的混合物的组合物用作阴性对照，其中所述组合物包含与其他测定的组合物相同的结构但是缺少单体D，单体D允许组合物的功能化并因此具有生物活性。
在用上述每种组合物印刷的每个表面上，将接种10,000个细胞。进行阿尔玛蓝(Alamar Blue)分析以研究早期细胞活力和增殖。阿尔玛蓝是一种含有荧光指示剂的试剂，由于细胞代谢活性，该指示剂会通过改变颜色而减少，从而可以定量确定细胞的活力和细胞毒性。通过阿尔玛蓝测定，在接种每种测定的组合物后30分钟，2小时和4小时观察到早期细胞活力。借助于校准线计算粘附在表面上的细胞数量，并且清楚地表明，相对于不包含单体D的包含生物聚合物3(60重量％)+生物聚合物2(40重量％)的混合物的组合物，在已经用包含单体D的包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物印刷的那些栅格中，粘附的细胞数量明显更高(图34)。因此，可以推断出生物墨水中RGD整联蛋白粘附序列的存在允许并改善了早期细胞粘附。
此外，还分析了在用上述组合物印刷的栅格上长时间(即21天)的成纤维细胞增殖。结果显示两种组合物中阿尔玛蓝的还原百分率随时间逐渐增加，在包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的混合物的组合物的情况下，开始从最初的4.4％百分率上升到64.1％百分率，在包含生物聚合物3+(按计60重量％)+生物聚合物2(40重量％)的混合物的组合物的情况下，则从开始时的2.2％上升至53.2％(图35)。在已经用包含在其序列中具有单体D的混合物的组合物印刷的栅格的情况下，所述百分比明显更高。
为了证明细胞已经粘附到用上述组合物印刷的栅格上，进行了DAPI/鬼笔环肽(Phalloidin)染色。DAPI染色用于染色细胞核中存在的DNA的腺嘌呤-胸腺嘧啶键，而鬼笔环肽则用于染色肌动蛋白丝，从而可以观察其余的细胞质。两种染色技术的结合使得可以观察到细胞形态。
DAPI/鬼笔环肽染色是在培养成纤维细胞后的14天利用栅格进行的，该栅格上印有由包含生物聚合物4(60重量％)+预固化生物聚合物5(40重量％)的组合物。在图36中，可以观察到细胞是如何粘附在印刷光栅上的，最好是纵向放置，从而形成三维矩阵。还观察到细胞排列在与不同纤维的沉积相对应的不同高度处(图37)，表明光栅的形态或结构决定了细胞排列和生长。
实施例6.在生物印刷之前评估包埋在生物墨水(生物聚合物6)中的细胞的细胞活力和细胞毒性。
接下来，评估了当与生物聚合物6一起印刷时由人成纤维细胞HFF-1显示的细胞生存力和形态。
为此，将HFF-1细胞(6×106细胞/ml)与溶解在DMEM中的生物聚合物6混合在一起，并印刷在直径为5mm，高度为1mm，侧面孔隙为1mm的多孔圆栅格中。一旦在无菌状态下印刷了表面，将其浸入细胞培养基中并孵育21天。
首先，在印刷表面上进行LIVE/DEADTM染色。这种染色用于通过对活细胞和死细胞染色来确定细胞活力。通过获取印刷栅格不同区域的照片，可以对细胞进行计数，并确定存活率(活细胞百分比)。为了知道细胞存活力是否由于印刷过程而改变，进行对照，所述对照是将相同生物聚合物和相同细胞浓度的沉积物混合并沉积在栅格上而不进行3D生物印刷过程。
在打印后4小时以及不同的天数：第1天，第3天，第7天，第14天和第21天，对活细胞和死细胞的存在进行分析。在图38中，在印刷后观察到与生物聚合物6一起印刷4个小时的细胞中的生存力为76％。但是，培养7天后，活力值显著增加，达到90％的细胞活力。在细胞培养的最初几天中，在印刷的栅格中获得的细胞活力与其相应的对照之间观察到明显的差异。这些结果表明，在培养的前几天中，生物聚合物6的挤出对细胞生存能力有负面影响，尽管所述长期细胞生存能力没有受到影响。
如上所述，通过光学显微镜通过DAPI/鬼笔环肽染色研究了HFF-1的细胞形态、重组和增殖。在打印第1天、第3天、第7天、第14天和第21天后将生物聚合物6与细胞(6x106个细胞/ml)混合在一起后进行染色。如图39所示，从第一天开始，细胞就均匀地分布在印刷表面上，这意味着营养素通过栅格分布良好，从而使细胞既位于其内部又位于其外部。另外，在培养的最初步骤/天中，细胞保持圆形，但是在培养的前三天之后，它们开始形成细长的纤维状形状，这是该细胞类型(成纤维细胞)的特征，培养后7天，已完全扩散。在这一步骤中，细胞开始沿结构形成聚集体，并在剩余的培养天数(直至实验结束的21天)中保持生长和增殖。
因此，如本文包括的实施例所示，包含生物聚合物4+预固化生物聚合物5的混合物的组合物以及包含生物聚合物6的组合物可以用作生物墨水。所述组合物表现出良好的可印刷性，特别是由于单体X和/或Y在其序列中的存在，使得可以印刷高度有分辨力且随时间稳定的结构(表9，图30和图31)。此外，它们具有低粘度，有利于在低温下进行打印(图27)，而粘度随温度升高而迅速增加(图29)，这有助于使被印刷结构在印刷过程中保持稳定。此外，由于单体D的存在，它们可以使细胞粘附和增殖。
序列表
<110> 巴利亚多利德大学
<120> 基于重组生物聚合物的组合物及其作为生物墨水的用途
<130> ES2080.18
<150> P201831008
<151> 2018-10-17
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 另外5?序列（Additional 5?sequence）
<400> 1
atggaatccc tgctgccg 18
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体B（Monomer B）
<400> 2
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
20 25
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体C（Monomer C）
<400> 3
Val Gly Ile Pro Gly
1 5
<210> 4
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体X: 拉链结构域（Monomer X: zipper structural domain）
<400> 4
Val Gly Gly Gly Gly Gly Lys Glu Asn Gln Ile Ala Ile Arg Ala Ser
1 5 10 15
Phe Leu Glu Lys Glu Asn Ser Ala Leu Arg Gln Glu Val Ala Asp Leu
20 25 30
Arg Lys Glu Leu Gly Lys Cys Lys Asn Ile Leu Ala Lys Tyr Glu Ala
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly
50
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体Y: 丝结构域（Monomer Y: silk structural domain）
<400> 5
Val Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 6
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体D:包含细胞粘附蛋白基序或肽（Monomer D: comprises cell adhesionprotein motifs
or peptides）
<400> 6
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp
20 25 30
Ser Pro Ala Ser Ser Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
35 40 45
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val
50 55 60
Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val Pro Gly Ile Gly Val
65 70 75 80
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
85 90 95
Gly Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val
100 105 110
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
115 120 125
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser
130 135 140
Pro Ala Ser Ser Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
145 150 155 160
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val Thr
165 170 175
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
180 185 190
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
195 200 205
Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val
210 215 220
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> ELR域（ELR domain）
<220>
<221> UNSURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自除脯氨酸以外的任何天然氨基酸（Xaa is selected from anynatural amino acid except proline）
<400> 7
Val Pro Gly Xaa Gly
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 丝蛋白序列的区域（Region of the silk protein sequence）
<400> 8
Gly Ala Gly Ala Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> RGD域（RGD domain）
<400> 9
Arg Gly Asp
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> REDV域（REDV domain）
<400> 10
Arg Glu Asp Val
1
<210> 11
<211> 1329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物1的蛋白质序列（Protein sequence of the biopolymer 1）
<400> 11
Met Glu Ser Leu Leu Pro Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
1 5 10 15
Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
20 25 30
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro
35 40 45
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
50 55 60
Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
65 70 75 80
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly
85 90 95
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
100 105 110
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
115 120 125
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
130 135 140
Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly
165 170 175
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
180 185 190
Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
195 200 205
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly
210 215 220
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
225 230 235 240
Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
245 250 255
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
260 265 270
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
275 280 285
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
290 295 300
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
305 310 315 320
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
325 330 335
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
340 345 350
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
355 360 365
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
370 375 380
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
385 390 395 400
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
405 410 415
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
420 425 430
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
435 440 445
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
450 455 460
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
465 470 475 480
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
485 490 495
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
500 505 510
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
515 520 525
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
530 535 540
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Pro Gly Val
545 550 555 560
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly
565 570 575
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
580 585 590
Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
595 600 605
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly
610 615 620
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
625 630 635 640
Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
645 650 655
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val
660 665 670
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
675 680 685
Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
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Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu
705 710 715 720
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
725 730 735
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val
740 745 750
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
755 760 765
Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
770 775 780
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val
785 790 795 800
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
805 810 815
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
820 825 830
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
835 840 845
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
850 855 860
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
865 870 875 880
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
885 890 895
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
900 905 910
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
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Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
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Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
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Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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<210> 15
<211> 1455
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 5 的蛋白质序列（Protein sequence of the biopolymer 5）
<400> 15
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1055 1060 1065
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1070 1075 1080
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1085 1090 1095
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1100 1105 1110
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1115 1120 1125
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1130 1135 1140
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
1145 1150 1155
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ala Gly
1160 1165 1170
Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser
1175 1180 1185
Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly
1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
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<210> 16
<211> 1508
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 6的蛋白质序列（Protein sequence of the biopolymer 6）
<400> 16
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Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
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115 120 125
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
485 490 495
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
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Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
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530 535 540
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545 550 555 560
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
565 570 575
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
580 585 590
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
595 600 605
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625 630 635 640
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660 665 670
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val
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Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
705 710 715 720
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu
725 730 735
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
740 745 750
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val
755 760 765
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
770 775 780
Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
785 790 795 800
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805 810 815
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
820 825 830
Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
835 840 845
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro
850 855 860
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
865 870 875 880
Val Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
885 890 895
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Glu Gly
900 905 910
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
915 920 925
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly
930 935 940
Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile
945 950 955 960
Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro
965 970 975
Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly
980 985 990
Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
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Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
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Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1100 1105 1110
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1115 1120 1125
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1130 1135 1140
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1145 1150 1155
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1160 1165 1170
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1175 1180 1185
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1190 1195 1200
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val Gly Ile Pro Gly Val
1205 1210 1215
Gly Ile Pro Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala
1220 1225 1230
Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala
1250 1255 1260
Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly
1265 1270 1275
Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
1280 1285 1290
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
1295 1300 1305
Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val
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Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
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Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly
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Asp Ser Pro Ala Ser Ser Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
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1445 1450 1455
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1460 1465 1470
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
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Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser
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<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> DGEA域（DGEA domain）
<400> 17
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1
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> YIGSR域（YIGSR domain）
<400> 18
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1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> QAASIKVAV域（QAASIKVAV domain）
<400> 19
Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 单体A（Monomer A）
<400> 20
Met Glu Ser Leu Leu Pro
1 5
<210> 21
<211> 3987
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 1 的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 1）
<400> 21
atggaatccc tgctgccggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 60
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 120
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 180
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 240
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 300
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 360
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 420
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 480
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 540
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 600
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 660
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 720
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt aggtatcccg 780
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 840
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 900
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 960
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ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1080
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1140
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1200
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ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 1920
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 1980
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 2040
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 2100
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 2160
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 2220
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 2280
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 2340
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ggtgttccgg gcattggtgt gccgggcatc ggtgttccag gcattggtgc agtgaccggt 3960
cgtggcgact ctcctgcgtc cagcgta 3987
<210> 22
<211> 3705
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 2 的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 2）
<400> 22
atggaatccc tgctgccggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 60
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ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 480
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 540
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 600
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 660
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 720
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt aggtatcccg 780
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 840
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ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1560
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1620
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtgcaggc 1680
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gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt 2220
gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc 2280
gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc 2340
gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt 2400
gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg 2460
gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt 2520
gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc 2580
gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 2640
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 2700
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 2760
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 2820
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gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 2940
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 3000
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 3060
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 3120
gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc 3180
gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 3240
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 3300
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 3360
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 3420
gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc 3480
gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtgcag gcgcgggttc cggcgctggt 3540
gccggctctg gtgcaggcgc gggtagcggc gctggtgcag gctccggtgc gggcgctggt 3600
tctggcgtag gtgcaggcgc gggttccggc gctggtgccg gctctggtgc aggcgcgggt 3660
agcggcgctg gtgcaggctc cggtgcgggc gctggttctg gcgta 3705
<210> 23
<211> 3639
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物3的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 3）
<400> 23
atggaatccc tgctgccggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 60
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 120
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ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 240
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 300
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 360
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 420
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 480
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 540
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 600
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 660
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 720
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt aggtatcccg 780
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 840
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 900
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 960
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1020
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1080
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1140
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ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1260
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1320
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1380
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1440
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1500
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1560
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1620
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggcggtggt 1680
ggtggcaaag aaaaccagat tgcgattcgt gccagctttc tggaaaaaga aaacagcgca 1740
ctgcgtcagg aagttgcaga cctgcgtaaa gaactgggca aatgcaaaaa cattctggcg 1800
aaatatgaag cgggtggtgg cggtggtgta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 1860
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 1920
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 1980
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 2040
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 2100
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 2160
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 2220
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 2280
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 2340
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 2400
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 2460
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 2520
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 2580
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 2640
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 2700
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 2760
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 2820
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 2880
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 2940
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 3000
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 3060
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 3120
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 3180
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 3240
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 3300
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 3360
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 3420
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 3480
ggcggtggtg gtggcaaaga aaaccagatt gcgattcgtg ccagctttct ggaaaaagaa 3540
aacagcgcac tgcgtcagga agttgcagac ctgcgtaaag aactgggcaa atgcaaaaac 3600
attctggcga aatatgaagc gggtggtggc ggtggtgta 3639
<210> 24
<211> 4305
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 4 的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 4）
<400> 24
atggaatccc tgctgccggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 60
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ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 360
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 420
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 480
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 540
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 600
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 660
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 720
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt aggtatcccg 780
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 840
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 900
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 960
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1020
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1080
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1140
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1200
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1260
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ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1380
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1440
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1500
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1560
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1620
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggcggtggt 1680
ggtggcaaag aaaaccagat tgcgattcgt gccagctttc tggaaaaaga aaacagcgca 1740
ctgcgtcagg aagttgcaga cctgcgtaaa gaactgggca aatgcaaaaa cattctggcg 1800
aaatatgaag cgggtggtgg cggtggtgta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 1860
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 1920
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 1980
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 2040
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 2100
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 2160
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 2220
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 2280
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 2340
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 2400
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 2460
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 2520
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 2580
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 2640
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 2700
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 2760
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 2820
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 2880
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 2940
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 3000
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 3060
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 3120
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 3180
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 3240
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 3300
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 3360
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 3420
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 3480
ggcggtggtg gtggcaaaga aaaccagatt gcgattcgtg ccagctttct ggaaaaagaa 3540
aacagcgcac tgcgtcagga agttgcagac ctgcgtaaag aactgggcaa atgcaaaaac 3600
attctggcga aatatgaagc gggtggtggc ggtggtgtac caggcatcgg tgtgccgggc 3660
atcggtgttc cgggcattgg tgtgccgggc atcggtgttc caggcattgg tgcagtgacc 3720
ggtcgtggcg actctcctgc gtccagcgta ccaggcatcg gtgtgccggg catcggtgtt 3780
ccgggcattg gtgtgccggg catcggtgtt ccaggcattg gtgcagtgac cggtcgtggc 3840
gactctcctg cgtccagcgt accaggcatc ggtgtgccgg gcatcggtgt tccgggcatt 3900
ggtgtgccgg gcatcggtgt tccaggcatt ggtgcagtga ccggtcgtgg cgactctcct 3960
gcgtccagcg taccaggcat cggtgtgccg ggcatcggtg ttccgggcat tggtgtgccg 4020
ggcatcggtg ttccaggcat tggtgcagtg accggtcgtg gcgactctcc tgcgtccagc 4080
gtaccaggca tcggtgtgcc gggcatcggt gttccgggca ttggtgtgcc gggcatcggt 4140
gttccaggca ttggtgcagt gaccggtcgt ggcgactctc ctgcgtccag cgtaccaggc 4200
atcggtgtgc cgggcatcgg tgttccgggc attggtgtgc cgggcatcgg tgttccaggc 4260
attggtgcag tgaccggtcg tggcgactct cctgcgtcca gcgta 4305
<210> 25
<211> 4371
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 5 的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 5）
<400> 25
atggaatccc tgctgccggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 60
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 120
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 180
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 240
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 300
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 360
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 420
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt 480
ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta 540
ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt 600
ggtgttccgg gtgtaggggt accaggtgtt ggtgttccgg gtgttggcgt gccgggcgaa 660
ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgta ggggtaccag gtgttggtgt tccgggtgtt 720
ggcgtgccgg gcgaaggcgt gccgggtgtt ggtgttccgg gtgtaggggt aggtatcccg 780
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 840
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 900
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 960
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1020
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1080
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1140
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1200
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1260
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1320
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg 1380
ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca 1440
ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg 1500
ggcgttggta tccctggtgt aggtatcccg ggcgttggta tcccgggcgt gggtattccg 1560
ggcgttggta tcccgggcgt aggtatccca ggcgttggta tcccgggcgt gggtatcccg 1620
ggcgttggta ttccgggcgt gggtatcccg ggcgttggta tccctggtgt aggtgcaggc 1680
gcgggttccg gcgctggtgc cggctctggt gcaggcgcgg gtagcggcgc tggtgcaggc 1740
tccggtgcgg gcgctggttc tggcgtaggt gcaggcgcgg gttccggcgc tggtgccggc 1800
tctggtgcag gcgcgggtag cggcgctggt gcaggctccg gtgcgggcgc tggttctggc 1860
gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt 1920
gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc 1980
gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc 2040
gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt 2100
gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg 2160
gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt 2220
gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc 2280
gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc 2340
gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt 2400
gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg 2460
gtaccaggtg ttggtgttcc gggtgttggc gtgccgggcg aaggcgtgcc gggtgttggt 2520
gttccgggtg taggggtacc aggtgttggt gttccgggtg ttggcgtgcc gggcgaaggc 2580
gtgccgggtg ttggtgttcc gggtgtaggg gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 2640
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 2700
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 2760
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 2820
gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc 2880
gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 2940
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 3000
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 3060
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 3120
gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc 3180
gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc 3240
gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc 3300
gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt 3360
gtaggtatcc cgggcgttgg tatcccgggc gtgggtattc cgggcgttgg tatcccgggc 3420
gtaggtatcc caggcgttgg tatcccgggc gtgggtatcc cgggcgttgg tattccgggc 3480
gtgggtatcc cgggcgttgg tatccctggt gtaggtgcag gcgcgggttc cggcgctggt 3540
gccggctctg gtgcaggcgc gggtagcggc gctggtgcag gctccggtgc gggcgctggt 3600
tctggcgtag gtgcaggcgc gggttccggc gctggtgccg gctctggtgc aggcgcgggt 3660
agcggcgctg gtgcaggctc cggtgcgggc gctggttctg gcgtaccagg catcggtgtg 3720
ccgggcatcg gtgttccggg cattggtgtg ccgggcatcg gtgttccagg cattggtgca 3780
gtgaccggtc gtggcgactc tcctgcgtcc agcgtaccag gcatcggtgt gccgggcatc 3840
ggtgttccgg gcattggtgt gccgggcatc ggtgttccag gcattggtgc agtgaccggt 3900
cgtggcgact ctcctgcgtc cagcgtacca ggcatcggtg tgccgggcat cggtgttccg 3960
ggcattggtg tgccgggcat cggtgttcca ggcattggtg cagtgaccgg tcgtggcgac 4020
tctcctgcgt ccagcgtacc aggcatcggt gtgccgggca tcggtgttcc gggcattggt 4080
gtgccgggca tcggtgttcc aggcattggt gcagtgaccg gtcgtggcga ctctcctgcg 4140
tccagcgtac caggcatcgg tgtgccgggc atcggtgttc cgggcattgg tgtgccgggc 4200
atcggtgttc caggcattgg tgcagtgacc ggtcgtggcg actctcctgc gtccagcgta 4260
ccaggcatcg gtgtgccggg catcggtgtt ccgggcattg gtgtgccggg catcggtgtt 4320
ccaggcattg gtgcagtgac cggtcgtggc gactctcctg cgtccagcgt a 4371
<210> 26
<211> 4530
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 生物聚合物 6 的核苷酸序列（Nucleotide sequence of the biopolymer 6）
<400> 26
atggaatccc tgctgccggt aggcggtggt ggtggcaaag aaaaccagat tgcgattcgt 60
gccagctttc tggaaaaaga aaacagcgca ctgcgtcagg aagttgcaga cctgcgtaaa 120
gaactgggca aatgcaaaaa cattctggcg aaatatgaag cgggtggtgg cggtggtgta 180
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 240
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 300
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 360
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 420
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 480
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 540
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 600
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg 660
ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt 720
ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta 780
ccaggtgttg gtgttccggg tgttggcgtg ccgggcgaag gcgtgccggg tgttggtgtt 840
ccgggtgtag gggtaccagg tgttggtgtt ccgggtgttg gcgtgccggg cgaaggcgtg 900
ccgggtgttg gtgttccggg tgtaggggta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 960
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 1020
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 1080
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 1140
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 1200
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 1260
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 1320
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 1380
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 1440
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 1500
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg 1560
ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg 1620
ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta 1680
ggtatcccgg gcgttggtat cccgggcgtg ggtattccgg gcgttggtat cccgggcgta 1740
ggtatcccag gcgttggtat cccgggcgtg ggtatcccgg gcgttggtat tccgggcgtg 1800
ggtatcccgg gcgttggtat ccctggtgta ggtgcaggcg cgggttccgg cgctggtgcc 1860
ggctctggtg caggcgcggg tagcggcgct ggtgcaggct ccggtgcggg cgctggttct 1920
ggcgtaggtg caggcgcggg ttccggcgct ggtgccggct ctggtgcagg cgcgggtagc 1980
ggcgctggtg caggctccgg tgcgggcgct ggttctggcg taccaggtgt tggtgttccg 2040
ggtgttggcg tgccgggcga aggcgtgccg ggtgttggtg ttccgggtgt aggggtacca 2100
ggtgttggtg ttccgggtgt tggcgtgccg ggcgaaggcg tgccgggtgt tggtgttccg 2160
ggtgtagggg taccaggtgt tggtgttccg ggtgttggcg tgccgggcga aggcgtgccg 2220
ggtgttggtg ttccgggtgt aggggtacca ggtgttggtg ttccgggtgt tggcgtgccg 2280
ggcgaaggcg tgccgggtgt tggtgttccg ggtgtagggg taccaggtgt tggtgttccg 2340
ggtgttggcg tgccgggcga aggcgtgccg ggtgttggtg ttccgggtgt aggggtacca 2400
ggtgttggtg ttccgggtgt tggcgtgccg ggcgaaggcg tgccgggtgt tggtgttccg 2460
ggtgtagggg taccaggtgt tggtgttccg ggtgttggcg tgccgggcga aggcgtgccg 2520
ggtgttggtg ttccgggtgt aggggtacca ggtgttggtg ttccgggtgt tggcgtgccg 2580
ggcgaaggcg tgccgggtgt tggtgttccg ggtgtagggg taccaggtgt tggtgttccg 2640
ggtgttggcg tgccgggcga aggcgtgccg ggtgttggtg ttccgggtgt aggggtacca 2700
ggtgttggtg ttccgggtgt tggcgtgccg ggcgaaggcg tgccgggtgt tggtgttccg 2760
ggtgtagggg taggtatccc gggcgttggt atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt 2820
atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 2880
attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt atccctggtg taggtatccc gggcgttggt 2940
atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt 3000
atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 3060
atccctggtg taggtatccc gggcgttggt atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt 3120
atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 3180
attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt atccctggtg taggtatccc gggcgttggt 3240
atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt 3300
atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 3360
atccctggtg taggtatccc gggcgttggt atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt 3420
atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 3480
attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt atccctggtg taggtatccc gggcgttggt 3540
atcccgggcg tgggtattcc gggcgttggt atcccgggcg taggtatccc aggcgttggt 3600
atcccgggcg tgggtatccc gggcgttggt attccgggcg tgggtatccc gggcgttggt 3660
atccctggtg taggtgcagg cgcgggttcc ggcgctggtg ccggctctgg tgcaggcgcg 3720
ggtagcggcg ctggtgcagg ctccggtgcg ggcgctggtt ctggcgtagg tgcaggcgcg 3780
ggttccggcg ctggtgccgg ctctggtgca ggcgcgggta gcggcgctgg tgcaggctcc 3840
ggtgcgggcg ctggttctgg cgtaccaggc atcggtgtgc cgggcatcgg tgttccgggc 3900
attggtgtgc cgggcatcgg tgttccaggc attggtgcag tgaccggtcg tggcgactct 3960
cctgcgtcca gcgtaccagg catcggtgtg ccgggcatcg gtgttccggg cattggtgtg 4020
ccgggcatcg gtgttccagg cattggtgca gtgaccggtc gtggcgactc tcctgcgtcc 4080
agcgtaccag gcatcggtgt gccgggcatc ggtgttccgg gcattggtgt gccgggcatc 4140
ggtgttccag gcattggtgc agtgaccggt cgtggcgact ctcctgcgtc cagcgtacca 4200
ggcatcggtg tgccgggcat cggtgttccg ggcattggtg tgccgggcat cggtgttcca 4260
ggcattggtg cagtgaccgg tcgtggcgac tctcctgcgt ccagcgtacc aggcatcggt 4320
gtgccgggca tcggtgttcc gggcattggt gtgccgggca tcggtgttcc aggcattggt 4380
gcagtgaccg gtcgtggcga ctctcctgcg tccagcgtac caggcatcgg tgtgccgggc 4440
atcggtgttc cgggcattgg tgtgccgggc atcggtgttc caggcattgg tgcagtgacc 4500
ggtcgtggcg actctcctgc gtccagcgta 4530
<210> 27
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> LDT域（LDT domain）
<400> 27
Lys Asp Pro
1
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> uPa酶的GTAR结构域（GTAR domain of uPa enzyme）
<400> 28
Gly Thr Ala Arg
1
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> uPa酶的DRIR结构域（DRIR domain of uPa enzyme）
<400> 29
Asp Arg Ile Arg
1
Claims (27)
1.组合物，包括包含单体B、C、X和Y的生物聚合物，或至少两种分别包含单体B、C和X以及单体B、C和Y的生物聚合物，其中
B是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
C是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，
X是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且
Y是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的组合物，其中，所述生物聚合物还包含单体D，所述单体D是细胞结合氨基酸序列。
3.根据权利要求2的组合物，其中，单体D包含选自以下的序列：RGD(SEQ ID NO：9)，LDT(SEQ ID NO：27)，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29。
4.根据权利要求2至3中任一项的组合物，其中，单体D包含SEQ ID NO：6。
5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中，所述生物聚合物具有结构(I)：
[(Bb-Cc)-Zz]n-Dd
其中B、C和D在权利要求1-4中定义，
Z选自权利要求1中定义的单体X和/或Y，
b的值介于5到15之间，
c的值介于50到70之间；
z的值介于1到5之间
n的值介于1到5之间
d的值介于0到3之间，并且
其特征在于，所述组合物包含具有结构(I)的第一生物聚合物，其中Z为SEQ ID NO：4，以及具有结构(I)的第二生物聚合物，其中Z为SEQ ID NO：5。
6.根据权利要求5的组合物，其中，所述第一生物聚合物在所述组合物中的存在浓度为40-60重量％，并且所述第二生物聚合物在所述组合物中的存在浓度为60-40重量％。
7.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中，所述生物聚合物具有结构(II)：
Z1z-[(Bb-Cc)-Z2z]n-Dd，
其中B、C和D在权利要求1-4中定义，
Z1是分别包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，Z2是分别包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4的氨基酸序列；优选地，Z1是氨基酸序列SEQ ID NO：4，并且Z2是氨基酸序列SEQ ID NO：5；
b、c、z、n和d在权利要求5中定义。
8.根据权利要求5至7中任一项的组合物，其中b的值为10，c的值为60，z的值为1，n的值为2，d的值为0或1。
9.根据权利要求2的组合物，其中，所述生物聚合物选自SEQ ID NO：16或选自SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15的生物聚合物的组合。
10.根据权利要求1至9中任一项的组合物，其进一步包括细胞、生物活性分子、活性成分或其组合。
11.根据权利要求1至10中任一项的组合物，其特征在于，其为水凝胶形式。
12.核酸，其包含编码根据权利要求1至11中任一项所述的组合物的生物聚合物的氨基酸序列的核苷酸序列。
13.用根据权利要求12所述的核酸转染的分离的细胞。
14.根据权利要求1至11中任一项的组合物作为生物墨水的用途，优选用于生物材料的2D或3D打印。
15.根据权利要求1至11中任一项的组合物、根据权利要求12的核酸或根据权利要求13的细胞用于制备用于获得器官和/或组织的支持物或用于活性成分或细胞的包封的用途。
16.生物墨水，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的组合物。
17.3D或2D生物材料，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的组合物。
18.用作药物的根据权利要求1至11中任一项的组合物。
19.用于组织再生的根据权利要求1至11中任一项的组合物。
20.包含生物聚合物的组合物作为生物墨水，优选地用于生物材料的2D或3D打印的用途，所述生物聚合物包含单体B、C和至少单体X或Y，其中：
B是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，
C是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，
X是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且
Y是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
21.根据权利要求20的用途，其中，所述生物聚合物还包含单体D。
22.根据权利要求21的用途，其中，单体D是选自以下的细胞结合氨基酸序列：RGD(SEQID NO：9)，LDT(SEQ ID NO：27)，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29，优选为SEQ ID NO：6。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的用途，其中，所述生物聚合物具有结构(I)：
[(Bb-Cc)-Zz]n-Dd
其中B、C和D在权利要求1-4中定义，
Z选自权利要求1中定义的单体X和Y，
b的值介于5到15之间，优选地为10，
c的值介于50到70之间，优选地为60，
z的值介于1到5之间，优选地为1，
n的值介于1到5之间，优选地为2，并且
d的值介于0到3之间，优选地为0或1。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的用途，其中，所述生物聚合物选自SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。
25.根据权利要求20至24中任一项的用途，进一步包含细胞、生物活性分子、活性成分或其组合。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的组合物，用作药物。
27.根据权利要求20至25中任一项所述的组合物，用于组织再生。
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