MXPA05004440A - Cristales de analogos de insulina y metodo para la produccion de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a los cristales de un analogo de insulina, en el que la asparagina (Asn) en la posicion B3 de la cadena B se sustituye por un residuo de aminoacido basico, natural, y al menos un residuo de aminoacido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B es sustituido por otro residuo de aminoacido neutro o acido, natural. De acuerdo con la invencion, la fenilalanina (Phe) puede estar ausente opcionalmente en la posicion B1 de la cadena B, y los cristales existen en el grupo espacial R3 (Nr. 146) con los ejes de celulas A = 81.5 ¦ ¦ 1 ¦ y C = 33.3 ¦ ¦ 1 ¦. La invencion tambien se refiere a la produccion y uso de estos cristales y a una composicion farmaceutica que contiene estos cristales.

Description

CRISTALES DE ANÁLOGOS DE INSULINA Y MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE LOS MISMOS DESCRIPCIÓN La invención se refiere a cristales de un análogo de insulina en el que la asparagina (Asn) en la posición B3 de la cadena B está reemplazada por un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza, y al menos un resto de aminoácido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido neutro o ácido existente en la naturaleza, donde la fenilalanina (Phe) en la posición B1 de la cadena B puede es-tar ausente opcionalmente, estando los cristales presentes en el grupo espacial R3 (No. 146) con los ejes de celda A = 81,5 Á ± 1 Á y C = 33,3 Á ± 1 Á. Por todo el mundo, aproximadamente 120 millones de personas sufren diabetes mellitus. Entre éstas, aproximadamente 12 millones son diabéticos de tipo I, para los que la administración de insulina es la única terapia posible actualmente. La gente afectada tiene una dependencia de las inyecciones de insulina de por vida, por lo general varias veces al día. Aunque la diabetes de tipo II, que sufren aproximadamente 100 millones de personas, no está acompañada en principio de falta de insulina, en un gran número de casos el tratamiento con insulina está considerado como la forma de terapia más favorable o única posible. Con la duración progresiva de la enfermedad, un gran número de los pacientes sufren "complicaciones diabéticas tardías". Lo que está implicado aquí es esencialmente un daño micro y macrovascular, el cual, dependien- do del tipo y alcance, da como resultado fallo renal, ceguera, pérdida de las extremidades o un aumento del riesgo de enfermedades cardiovasculares. Como causa de ello se han considerado principalmente responsables los niveles de glucosa en sangre crónicamente elevados, ya que inclu-so con un ajuste cuidadoso de la terapia con insulina, no se consigue un perfil normal de glucosa en sangre, como correspondería a la regulación fisiológica (Ward, J.D. (1989) British Medical Bulletin 45, 111-126; Drury, P.L. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 127-147; Kohner, E.M. (1989) British Medical Bulletin 45, 148-173). En la persona sana, la secreción de insulina es estrechamente dependiente de la concentración de glucosa de la sangre. Los niveles de glucosa elevados, como sucede después de las comidas, son rápidamente compensados por un aumento en la liberación de insulina. En estado de ayuno, el nivel de insulina en plasma disminuye hasta un valor basal, que es suficiente para garantizar un suministro continuo de glucosa a los órganos y tejidos sensibles a la insulina. Una optimización de la terapia, "terapia con insulina intensificada", está hoy dirigida principalmente a mantener las variaciones de la concentración de glucosa en sangre, especialmente las desviaciones hacia arriba, tan bajas como sea posible (Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, P3-P16; Berger, M. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, P25-P32). Esto conduce a una disminución importante en la incidencia y el progreso del daño diabético tardío (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N. Engl. J. Med. 329, 977-986).

A partir de la fisiología de la secreción de la insulina, puede deducirse que para una terapia mejorada e intensificada con insulina usando preparaciones administradas por vía subcutánea, se necesitan dos preparaciones de insulina que tengan propiedades farmacodinámicas diferentes. Para la compensación del aumento de glucosa en sangre después de las comidas, la insulina debe liberarse rápidamente y puede que sólo actúe durante unas pocas horas. Para el suministro basal, en particular durante la noche, debería estar disponible una preparación que actúe durante más tiempo, que no tenga un máximo pronunciado y que sólo se libere muy lentamente. Sin embargo, las preparaciones basadas en insulinas humanas y animales satisfacen las demandas de una terapia con insulina intensificada sólo en una medida restringida. Las insulinas activas rápidamente (insulinas viejas) alcanzan la sangre y el sitio de acción demasiado despacio y tienen una duración total de la acción excesivamente larga. El resultado es que los niveles de glucosa después de comer son demasiado altos, y varias horas después de la comida la glucosa en sangre disminuye demasiado (Kang, S. et al. (1991) Diabetes Care 14, 142-148; Home, PJ. et al. (1989) British Medical Bulletin 45, 92-110; Bolli, G.B. (1989) Diabetes Res. Clin. Pract. 6, P3-P16). Por su parte, las insulinas básales disponibles, especialmente las insulinas NPH, tienen una duración de la acción demasiado corta y poseen un máximo fuertemente pronunciado excesivamente. Además de la posibilidad de influenciar el perfil de acción por medio de principios farmacéuticos, la ayuda de la ingeniería genética ofrece hoy la alternativa de diseñar análogos de insulina que consiguen ciertas propiedades, tales como el comienzo y la duración de la acción, por sí mismos, debido a sus propiedades estructurales. Por medio del uso de análogos de insulina adecuados, podría conseguirse por tanto un ajuste de la glucosa en sangre que sea significativamente mejor y más estrechamente adaptado a las condiciones naturales. Los análogos de insulina que tienen un comienzo acelerado de la acción se describen en los documentos EP 0 214 826, EP 0 375 437 y EP 0 678 522. EP 0 214 826 se refiere, entre otras cosas, a las sustituciones de B27 y B28, pero no en combinación con la sustitución de B3. EP 0 678 522 describe análogos de insulina que contienen varios aminoácidos, preferiblemente prolina, en la posición B29, pero no ácido glutámico. EP 0 375 437 comprende análogos de insulina que tienen lisina o arginina en B28, que pueden estar opcionalmente modificados adicionalmente en B3 y/o A21. En EP 0 885 961 A1, se describe la insulina humana B3-lisina, B29-glutamato como una insulina novedosa, de acción rápida. En EP 0 419 504, se describen análogos de insulina que están protegidos frente a modificaciones químicas mediante el cambio de la aspara-gina en B3 y al menos un aminoácido más en las posiciones A5, A15, A18 o A21. Los análogos de insulina descritos aquí, sin embargo, tienen sólo una modificación en la posición B3 y ninguna modificación más del grupo mencionado. No hay indicación de que estos compuestos posean cambios en las propiedades farmacodinámicas que tengan como consecuencia un comienzo más rápido de la acción. Los análogos de insulina son análogos de las insulinas existentes en la naturaleza, a saber, la insulina humana o insulinas animales, que difieren por la sustitución de al menos un resto de aminoácido existente en la naturaleza y/o la adición de al menos un resto de aminoácido y/o resto orgánico, de la insulina correspondiente, por lo demás idéntica, existente en la naturaleza. La cadena A de la insulina humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (SEC ID NO 1 ) La cadena B de la insulina humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (SEC ID NO 2).

Los cristales de los análogos de insulina de la presente invención contienen un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, en el que la asparagina (Asn) en la posición B3 de la cadena B está reemplazada por un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza, y al menos un resto de aminoácido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido existente en la naturaleza, donde la fenilalanina (Phe) en la posición B1 de la cadena B puede estar au- senté opcionalmente. Preferiblemente, el análogo de insulina o su sal fisiológicamente tolerable se caracteriza por la fórmula I B1 -B28-B29-B30 en la que (A1-A5) son los restos de aminoácido en las posiciones A1 a A5 de la cadena A de la insulina humana (cf. SEC ID NO 1) o la insulina animal, (A8-A10) son los restos de aminoácido en las posiciones A8, A9 y A10 de la cadena A de la insulina humana (cf. SEC ID NO 1) o la insulina animal, (A12-A19) son los restos de aminoácido en las posiciones A12 a A19 de la cadena A de la insulina humana (cf. SEC ID NO 1) o la insulina animal, (B8-B18) son los restos de aminoácido en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2) o la insulina animal, (B20-B26) son los restos de aminoácido en las posiciones B20 a B26 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2) o la insulina animal, el resto de aminoácido en la posición B30 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2) o la insulina animal, B1 es un resto de fenilalanina (Phe) o un átomo de hidrógeno, B3 es un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza, B27, B28 y B29 son los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2) o la insulina animal o en cada caso otro resto de aminoácido existente en la naturaleza, donde al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido existente en la naturaleza. De los veinte aminoácidos existentes en la naturaleza que son codificables genéticamente, los aminoácidos glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (lie), serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), asparagina (Asn), glutamina (Gln), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp) y prolina (Pro) se designan como aminoácidos neutros, los aminoácidos arginina (Arg), lisina (Lys) e histidina (His) se designan como aminoácidos básicos y los aminoácidos ácido aspártico (Asp) y ácido glutámi-co (Glu) se designan como aminoácidos ácidos. Preferiblemente, los cristales de los análogos de insulina de la presente invención contienen un análogo de insulina de la insulina bovina, insulina porcina, insulina ovina o insulina humana o su sal fisiológicamente tolerable, a saber, un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable de fórmula I, que se distingue en que A8 es alanlna (Ala), A9 es serina (Ser), A10 es valina (Val) y B30 es alanina (Ala) (restos de aminoácido A8 a A10 y B30 de la insulina bovina), A8 es treonina (Thr), A9 es serina (Ser) y A10 es isoleucina (lie) (restos de aminoácido A8 a A10 de las insulinas de humanos o cerdos), donde B30 es alanina (Ala) (resto de aminoácido B30 de la insulina porcina) o B30 es treonina (Thr) (resto de aminoácido B30 de la insulina humana, cf. SEC ID NO 2). Se prefiere particularmente un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I con los restos de aminoácido A8 a A10 y B30 de la insulina humana, que se distingue además en que (A1-A5) son los restos de aminoácido en las posiciones A1 a A5 de la cadena A de la insulina humana (cf. SEC ID NO 1), (A12-A19) son los restos de aminoácido en las posiciones A12 a A19 de la cadena A de la insulina humana (cf. SEC ID NO 1), (B8-B18) son los restos de aminoácido en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2) y (B20-B26) son los restos de aminoácido en las posiciones B20 a B26 de la cadena B de la insulina humana (cf. SEC ID NO 2). Otras modalidades adicionales preferidas de la presente invención son cristales que contienen un análogo de insulina o una sal fisiológica-mente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B1 de la cadena B es un resto de fenilalanina (Phe) o un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B3 de la cadena B es un resto de histidi-na (His), lisina (Lys) o arginina (Arg). Otras modalidades adicionales preferidas de la presente invención son cristales que comprenden un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B está reemplazado por un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se se-lecciona del grupo que consiste en los aminoácidos neutros o ácidos, un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en isoleucina (lie), ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu), preferiblemente en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B está reemplazado por un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos neu- tros, o particularmente preferiblemente en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de isoleucina (lie), o un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos ácidos, preferiblemente en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un. resto de ácido aspártico (Asp), preferiblemente en la que el resto de aminoácido en la posición B27 o B28 de la cadena B es un resto de ácido aspártico (Asp), o en la que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de ácido glutámico (Glu). Una modalidad preferida de la presente invención son también cristales que comprenden un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B29 de la cadena B es un resto de ácido aspártico (Asp). Otras modalidades adicionales preferidas son cristales que comprenden un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B27 de la cadena B es un resto de ácido glutámico (Glu), un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B28 de la cadena B es un resto de ácido giutámico (Glu), o un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B29 de la cadena B es un resto de ácido giutámico (Glu). Unos cristales muy particularmente preferidos son aquellos que comprenden un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, que se distingue en que la cadena B tiene la secuencia Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (SEC ID NO 3), o un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, que se distingue en que el resto de aminoácido en la posición B27 de la cadena B es un resto de isoleucina (lie), preferiblemente un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, que se distingue en que la cadena B tiene la secuencia Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr He Pro Lys Thr (SEC ID NO 4), o un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de fórmula I, en la que el resto de aminoácido en la posición B28 de la cadena B es un resto de isoleucina (lie), preferiblemente un análogo de insulina o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, que se distingue en que la cadena B tiene la secuencia Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr lie Lys Thr (SEC ID NO 5). Los análogos de insulina de fórmula I pueden prepararse preferi-blemente por ingeniería genética. La preparación de la insulina de fórmula I se lleva a cabo principalmente por ingeniería genética por medio de mutagénesis dirigida conforme a métodos estándar. Para esto, se construye una estructura génica que codifica el análogo de insulina deseado de fórmula l y se expresa en una célula hospedante - preferiblemente en una bacteria tal como E. coli o una levadura, en particular Saccharomyces cerevisiae y, si la estructura génica codifica una proteína de fusión, el análogo de insulina de fórmula I se libera de la proteína de fusión; métodos análogos se describen, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 2 1 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0 229 998, EP-A-0 286 956 y la solicitud de patente alemana P 38 21 159. La separación de la porción de la proteína de fusión puede llevarse a cabo químicamente por medio de un haluro de cianógeno (véase el documento EP-A-0 180 920) tras la ruptura de las células. En la preparación por medio de un precursor de preproinsulina que posee una porción de una proteína de fusión (presecuencia) conforme al documento US 5.358.857, la separación de la porción de la proteína de fusión se lleva a cabo en una etapa más tardía, junto con la separación del péptido C. El precursor de insulina se somete seguidamente a sulfitolisis oxidativa conforme al método descrito, por ejemplo, por R.C. Marshall y A.S. Inglis en "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (compilador A. Darbre) 1986, páginas 49 - 53 y a continuación se renaturaliza en presencia de un tiol con la formación de los puentes disulfuro correctos, por ejemplo, conforme al método descrito por G.H. Dixon y A.C. Wardlow en Nature (1960), páginas 721 - 724. Sin embargo, el precursor de insulina puede también plegarse di-rectamente (EP-A-0 600 372; EP-A-0 668 292). El péptido C se separa por medio de una escisión tríptica - por ejemplo conforme al método de Kemmler et al., J.B.C. (1971), páginas 6786 -6791 y el análogo de insulina de fórmula I se purifica por medio de técnicas conocidas, tales como cromatografía - por ejemplo, EP-A-0 305 760 - y crista-lización. En estos procedimientos, el extremo C terminal de la cadena B termina con arginina o con dos restos de arginina. Éstos pueden separarse enzimáticamente por medio de la carboxipeptidasa B. Los análogos de insulina poseen actividad biológica completa. Esto se demostró por administración intravenosa a conejos y la bajada de la glucosa en sangre que resultó de la misma. El comienzo más rápido de la acción tras la administración subcutánea se demostró usando la técnica del parche euglucémico en perros en ayuno (EP 0 885 961 A1, ejem- píos 5 y 6). Se administraron 0,3 lU/kg. La preparación de referencia era insulina humana. En la técnica del parche, tras la inyección de insulina, se mide el valor de glucosa en sangre a intervalos breves de tiempo y se infiltra exactamente la glucosa suficiente para compensar la bajada. Esto tiene la ventaja de que no se produce contrarregulación en los animales, como sería el caso con una gran disminución de la glucosa en sangre tras la administración de la insulina. La cantidad y la variación con el tiempo de la glucosa infiltrada caracteriza la acción de la insulina. Las insulinas Lys(B3), Glu(B29) (SEC ID NO 3) y Lys(B3), lle(B28) (SEC ID NO 4) tienen un comienzo marcadamente más rápido de la acción que la insulina humana. La máxima acción (tasa de infiltración de glucosa) se alcanza después de 100 minutos con la insulina humana, pero después de 80 minutos con la insulina Lys (B3), Glu (B29) (SEC ID NO 3) y tan pronto como después de 60 minutos con la insulina Lys (B3), lle(B28) (SEC ID NO 4). Estos análogos, si se inyectan poco antes de una comida, deberían por tanto compensar el aumento de después de comer de la glucosa en sangre mejor que la insulina humana. Los análogos de insulina descritos son adecuados para la terapia de ambas diabetes mellitus de tipo I y tipo II, preferiblemente en combinación con una insulina basal. Los análogos de insulina pueden emplearse en las preparaciones farmacéuticas también en forma de sus sales fisiológicamente tolerables, como sales de metales alcalinos o de amonio. Una cantidad arbitraria de uno o más análogos de insulina de fórmula I o un análogo de insulina de fórmula I puede estar presente en una mezcla de otros de estos análogos de insulina, independientemente unos de otros en cada caso, en forma disuelta, amorfa y/o cristalina. Las insulinas y análogos de insulina se preparan frecuentemente como formulaciones farmacéuticas acuosas que contienen iones zinc. La adición de iones zinc a las preparaciones de insulina se lleva a cabo esencialmente por dos razones: 1. Los iones Zn2+ tienen una acción estabilizante sobre las preparaciones de insulina, puesto que éstos promueven la formación de hexáme-ros de insulina [Brange et al. Diabetic Medicine, _3, 532-536 (1986)]. 2. Dependiendo de la concentración de ion Zn2+, puede controlarse la variación con el tiempo de la cinética del flujo de entrada y salida de las preparaciones de insulina. En el caso de las insulinas de acción rápida, los puntos 1 y 2 conducen a problemas. Debido al aumento de la estabilidad farmacéutica de la preparación, las altas concentraciones de hexámeros de insulina resultan ventajosas. Puesto que los iones Zn2+, sin embargo, retrasan la cinética del flujo de entrada y salida del análogo de insulina, actúan de forma contraria a la cinética deseada de liberación del compuesto activo. Se ha decidido por tanto preparar uno de los análogos de insulina descritos, a saber la insulina humana Lys B3, Glu B29, en forma de solución acuosa libre de zinc (solicitud de patente internacional PCT/EP02/02625). Para la preparación de la formulación acuosa libre de zinc de los análogos de insulina descritos, en particular la insulina humana Lys B3, Glu B29, existe la necesidad de poder emplear cristales libres de zinc de los análogos de insulina. Además, los cristales libres de zinc de los análogos de insulina conforme a la invención pueden usarse también para la preparación de otras formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, en el caso de formulaciones sólidas o emulsiones para la administración por inhalador, o en el caso de la administración oral. El objetivo en el que se basa la invención fue por tanto la preparación de cristales libres de zinc de los análogos de insulina descritos. Al mis-mo tiempo, debería evitarse también el reemplazamiento de iones zinc por otros iones divalentes, que no son adecuados para formulaciones farmacéuticas debido a su toxicidad. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que los análogos de insulina descritos pueden prepararse como cristales hexaméricos que no contienen iones divalentes, tales como, por ejemplo, iones zinc. Esto puede ilustrarse con mayor detalle mediante el ejemplo del análogo de insulina humana Lys B3, Glu B29. Esta nueva forma cristalina de la insulina humana Lys B3, Glu B29 es cristalográficamente isomorfa con el tipo de insulina 2Zn clásico que se describe en la bibliografía para la insulina porcina y la insulina humana [Baker et al,, Phü. Trans. Roy Soc. 319, 369-454 (1988)]. Los nuevos cristales hexaméricos libres de zinc pertenencen al grupo espacial romboédrico R3 (No. 146) con dos monómeros de insulina por unidad asimétrica. Los ejes de la celda elemental a -70°C (usando el método de congelación de choque) se determinó que eran: A = 81 ,5 Á, C = 33,3 Á. El análisis estructural por rayos X de la nueva forma cristalina a 1 ,8 Á mostró que en lugar de los iones Zn2+ (en el tipo 2Zn clásico) que tienen unas distancias de enlace (Zn2+ -His-B10) de aproximadamente 2,0 Á, en la nueva forma cristalina de la insulina humana Lys B3, Glu B29 solamente se encuentra un pico de densidad electrónica muy pequeño que corresponde a una molécula de agua (H2O) (distancia de enlace H20 -HÍS-B10 aproximadamente 2,3 Á). Tanto la cantidad de densidad electrónica como la distancia de enlace muestran, para una insulina que tiene una cadena lateral de glutamato B21 , una disposición estructural desconocida hasta ahora de la región alrededor de la cadena lateral de la histidina B10. La densidad electrónica (1a-2Fo-Fc) de la región alrededor de la histidina B10 es significativamente diferente al tipo 2Zn clásico, en el que cada ion Zn2+ está coordinado octaédricamente por tres histidinas B 0 adyacentes simétricamente y 3 moléculas de agua. Las distancias de enlace (Zn2+ -His-B 0) de las estructuras del tipo 2Zn depositadas en el banco de datos PDB [Bernstein et al; J.Mol.Bioi. 112, 535-542 (1977)] son entre 1 ,9 y 2,1 A y son significativamente diferentes a las distancias de enlace observadas de aproximadamente 2,3 Á en la nueva estructura cristalina libre de zinc. Lo que es especial de la nueva forma cristalina hexamérica de la insulina humana Lys B3, Glu B29 descrita aquí es que contiene hexámeros de insulina sin los cationes divalentes (por ejemplo, Zn2+, Co2+, Cd2+) de otra manera necesarios para esto. Previamente, se había asumido que la formación de hexámeros de insulina sin cationes divalentes es solamente posible si las fuerzas repulsivas de la cadena lateral del gíutamato B21 pueden reducirse por ingeniería de proteínas (por ejemplo, por el reemplazamiento de Glu B21 por GIn) [Bentley et al., J.Mol.Biol. 228, 1163-1176 (1992)]. La conservación de la cadena lateral de Glu B21 - que promueve la descomposición de los hexámeros de insulina -es, sin embargo, especialmente importante para las insulinas de acción rápida, para la conservación de la cinética rápida del flujo de entrada y salida. La invención se refiere por consiguiente a cristales de un análogo de insulina, en el que la asparagina (Asn) en la posición B3 de la cadena B está reemplazada por un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza, y al menos un resto de aminoácido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido neutro o ácido existente en la naturaleza, donde la fenilalanína (Phe) en la posición B1 de la cadena B puede estar ausente opcionalmente, estando el cristal presente en el grupo espacial R3 (No. 146) con los ejes de celda A = 81 ,5 A + 1 Á y C = 33,3 A ± 1 A; en particular, estando las moléculas del análogo de insulina presentes en forma de hexámeros libres de zinc, que consisten en cada caso en tres dímeros. Una cuestión adicional de la invención son cristales como se ha descrito anteriormente, donde los restos de histidina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidos a una molécula de agua, un ion dihidrogenofosfato (H2PO4"), un ion monohidrogeno-fosfato (HPO42 ) o un ion sulfato (SO42") a través de puentes de hidrógeno.

Una cuestión adicional de la invención son cristales como se ha descrito anteriormente, donde los restos de histidina B10 de las moléculas del análogo de insulina en un hexámero están, en cada caso, plegados hacia su propio dímero, y no está presente la formación de puentes de hidrógeno de los restos de histidina B10 con una molécula de agua. Los cristales conforme a la invención en este caso contienen análogos de insulina conforme a la fórmula I descrita anteriormente, donde en particular el resto de aminoácido en la posición B3 de la cadena B del análogo de insulina es un resto de histidina (His), lisina (Lys) o arginina (Arg); y donde particularmente preferiblemente al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en ¡soleucina (lie), ácido aspartico (Asp) y ácido glutámico (Glu). Los cristales conforme a la invención en este caso en particular contienen un análogo de insulina en el que la cadena B tiene la secuencia Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (SEC ID NO 3). Una cuestión adicional de la invención es una preparación far-macéutica que contiene al menos un cristal tal como se ha descrito anteriormente, donde preferiblemente puede estar presente un excipiente que facilita la absorción del análogo de insulina a la sangre y muy particularmente preferiblemente donde la formulación farmacéutica tiene una actividad insulínica con un comienzo rápido de la acción. Una cuestión adicional de la invención es una preparación farmacéutica que contiene al menos un cristal como se ha descrito anteriormente y un excipiente, que se usa en formulaciones para inhalar y/u orales de insuli-na o análogos de insulina. Una cuestión adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de un cristal como se ha descrito anteriormente, en el que (a) un polvo amorfo, libre de zinc, de un análogo de insulina como se ha descrito anteriormente se disuelve en agua en una con- centración de 15-25 mg/ml, (b) se lleva a cabo la precipitación usando un precipitante adecuado, y (c) los cristales se aislan y se secan; siendo el análogo de insulina en particular insulina humana Lys B3, Glu B29. Una cuestión adicional de la invención es un procedimiento para la preparación de un cristal como se ha descrito anteriormente, en el que el precipitante se selecciona de un grupo que comprende (a) fosfato de dihidrógeno y amonio, (b) una combinación de fosfato de dihidrógeno y amonio y citrato tri sódico; y (c) una combinación de sulfato de amonio y polietilenglicol de varios pesos moleculares; siendo el precipitante usado preferiblemente fosfato de dihidrógeno y amonio o fosfato de hidrógeno y diamonio a pHs entre 3,0 y 8,0, o fosfato de dihidrógeno y amonio/fosfato de hidrógeno y diamonio en combinación con citrato trisódico a un pH de 5,5 ± 1 ,5 o sulfato de amonio en combinación con PEG de varios pesos moleculares a un pH de 6,0 ± 1 ,5. La invención se refiere también al uso de un cristal tal como se ha descrito anteriormente para la producción de un producto farmacéutico para el tratamiento de la diabetes de los tipos I y/o II. La invención se ilustra con mayor detalle por medio de los ejem-píos, sin estar restringida a los mismos. Ejemplo 1 : Preparación de la nueva forma cristalina hexamérica libre de zinc: Se disuelve polvo amorfo, libre de zinc de insulina humana Lys B3, Glu B29 de forma no tamponada en agua destilada/HCl a pH aproximádamente 2,0. Este proceso permite la formación de una solución transparente con unas concentraciones de insulina de aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se lleva a cabo en placas Linbro de 24 pocilios conforme al método de la gota colgante. El precipitante usado es el siguiente reactivo del "Protein Crystallization Screening Kit" de Hampton Research Inc.: 1. fosfato de dihi-drógeno y amonio 0,4 M, pH 4,2.

Ejemplo 2 : Preparación de la nueva forma cristalina hexamérica libre de zinc: Se disuelve polvo amorfo, libre de zinc de insulina humana Lys B3, GIu B29 de forma no tamponada en agua destilada/HCI a pH aproximadamente 2,0. Este proceso permite la formación de una solución transparente con unas concentraciones de insulina de aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se lleva a cabo en placas Linbro de 24 pocilios conforme al método de la gota colgante. El precipitante usado es el siguiente reactivo del "Protein Crystallization Screening Kit" de Hampton Research Inc.: fosfato de dihidrógeno y amonio 1 M, citrato trisódico 0,1 M, pH 5,6.

Ejemplo 3 : Preparación de la nueva forma cristalina hexamérica libre de zinc: Se disuelve polvo amorfo, libre de zinc de insulina humana Lys B3, Glu B29 de forma no tamponada en agua destilada/HCI a pH aproximadamente 2,0. Este proceso permite la formación de una solución transparente con unas concentraciones de insulina de aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se lleva a cabo en placas Linbro de 24 pocilios conforme al método de la gota colgante. El precipitante usado es el siguiente reactivo del "Protein Crystallization Screening Kit" de Hampton Research Inc.: sulfato de amonio 0,2 M, 20% de PEG 3350, pH 6,0.

Ejemplo 4 : Análisis estructural por rayos X Los cristales obtenidos conforme a los ejemplos 1-3 están bien ordenados y hacen posible un análisis estructural por rayos X, que, para una insulina que tiene una cadena lateral de glutamato B21, muestra una disposición estructural desconocida hasta ahora de la región alrededor de la cadena lateral de la histidina B10.

Los cristales de insulina humana del tipo 2Zn que contienen zinc tienen, como grupo espacial, R3 (146) y unos ejes de celda de A = 82,5, C = 34,0 Á. Los cristales libres de zinc del compuesto I son isoamorfos y tienen típicamente unos ejes de celda de A = 81,5, C = 33,3 Á. Las moléculas de insu-lina en la estructura cristalina que contiene zinc de la insulina humana y la estructura cristalina libre de zinc de la insulina humana Lys B3, Glu B29 se plegaron según el tipo T6 o 2Zn. En la insulina 2Zn (T6), los 6 monómeros están presentes en el estado "T = tensado". El extremo N-terminal de las cadenas B se extiende sin un rasgo estructural secundario importante; no está presente una estructura secundaria en hélice-a como en el estado R alternativo. Las diferencias importantes en las estructuras cristalinas de la insulina humana y el compuesto I resultan en la disposición de la región alrededor de la cadena lateral de la histidina B10. Para todos los métodos de preparación conforme a los ejemplos 1 - 3, están disponibles análisis estructurales por rayos X de monocristales de alta resolución, que demuestran el estado libre de zinc de estos cristales hexaméricos de insulina. Los ejes de la celda elemental y la simetría del cristal determinados fueron: Procedimiento de preparación 1: A = 81 ,52, C = 33,31 Á, R3 (grupo espacial No. 146) Procedimiento de preparación 2: A = 81,51, C = 33,43 Á, R3 (grupo espacial No. 146) Procedimiento de preparación 3: A = 81 ,38, C = 33,22 Á, R3 (grupo espacial No. 146)

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1.- Un cristal de un análogo de insulina, en el que la asparagina (Asn) en la posición B3 de la cadena B está reemplazada por un resto de aminoácido básico existente en la naturaleza y al menos un resto de aminoácido en las posiciones B27, B28 o B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido neutro o ácido existente en la naturaleza, donde la fenila-lanina (Phe) en la posición B1 de la cadena B puede estar ausente opcional-mente, estando los cristales presentes en el grupo espacial R3 (No. 146) con los ejes de celda A = 81 ,5 Á ± 1 Á y C = 33,3 Á ± 1 Á.

2 - El cristal según la reivindicación 1 , donde las moléculas del análogo de insulina están presentes en forma de los hexámeros libres de zinc que consisten en cada caso en tres dímeros.

3. - El cristal según la reivindicación 2, donde los restos de hísti-dina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a una molécula de agua a través de puentes de hidrógeno.

4. - El cristal según la reivindicación 2, donde los restos de histi-dina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion dihidrogenofosfato (H2PO4") a través de puen-tes de hidrógeno.

5. - El cristal según la reivindicación 2, donde los restos de histi-dina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion monohidrogenofosfato (HPO42") a través de puentes de hidrógeno.

6. - El cristal según la reivindicación 2, donde los restos de histi-dina B10 de, en cada caso, tres moléculas del análogo de insulina en un hexámero están unidas a un ion sulfato (SO42") a través de puentes de hidrógeno.

7. -El cristal según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, donde los restos de histidina B10 de las moléculas del análogo de insulina en un hexámero están, en cada caso, plegados hacia su propio dimero, y no está presente la formación de puentes de hidrógeno de los restos de histidina B10 con una molécula de agua.

8. - El cristal según una de las reivindicaciones 1 a 7, donde el análogo de insulina es un compuesto de fórmula I, s- S (A1-A5)-Cys-Cys-A8-A9-A10-Cys-(A12-A19)-Cys-Asn s — s ¦ s — ¦ s B1-Val-B3-GIu-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B26)-B27-B28-B29-B30 en la que (A1-A5) son los restos de aminoácido en las posiciones A1 a A5 de la cadena A de la insulina humana o la insulina animal, (A8-A10) son los restos de aminoácido en las posiciones A8, A9 y A10 de la cadena A de la insulina humana o la insulina animal, (A12-A19) son los restos de aminoácido en las posiciones A12 a A19 de la cadena A de la insulina humana o la insulina animal, (B8-B18) son los restos de aminoácido en las posiciones B8 a B18 de la cadena B de la insulina humana o la insulina animal, (B20-B26) son los restos de aminoácido en las posiciones B20 a B26 de la cadena B de la insulina humana o la insulina animal, (B30) es el resto de aminoácido en la posición B30 de la cadena B de la insulina humana o la insulina animal, B1 es un resto de fenilalanina (Phe) o un átomo de hidrógeno, B3 es un resto de aminoácido básico existente en la naturale za, B27, B28 y B29 son los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B de la insulina humana o la insulina animal o en cada caso otro resto de aminoácido existente en la naturaleza, donde al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B está reemplazado por otro resto de aminoácido exis tente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos neutros o ácidos.

9.- El cristal según la reivindicación 8, en el que el resto de aminoácido en la posición B3 de la cadena B del análogo de insulina es un resto de histidina (His), lisina (Lys) o arginina (Arg).

10. - El cristal según una o más de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que al menos uno de los restos de aminoácido en las posiciones B27, B28 y B29 de la cadena B es un resto de aminoácido existente en la naturaleza que se selecciona del grupo que consiste en isoleucina (He), ácido aspartico (Asp) y ácido glutámico (Glu).

11. - El cristal según la reivindicación 10, en el que la cadena B tiene la secuencia Phe Val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (SEC ID NO 3).

12. - Una preparación farmacéutica que comprende al menos un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 11.

13. - La preparación farmacéutica según la reivindicación 12, que contiene además un excipiente que facilita la absorción del análogo de insulina a la sangre.

14. - La preparación farmacéutica según la reivindicación 12, que contiene al menos un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente, que se usa en formulaciones para inhalar y/u orales de insulina o análogos de insulina.

15. - El uso de un cristal según una o más de las reivindicaciones 1 a 11 para la producción de una preparación farmacéutica que tiene una acti- viciad insulínica con un comienzo rápido de la acción.

16.- Un procedimiento para la preparación de un cristal según una de las reivindicaciones 1 a 11 , en el que (d) un polvo amorfo, libre de zinc, de un análogo de insulina según las reivindicaciones 1 a 11 se disuelve en agua en una concentración de 15-25 mg/ml, (e) se lleva a cabo la precipitación usando un precipitante adecuado, y (f) los cristales se aislan y se secan.

17.- El procedimiento según la reivindicación 16, donde el análogo de insulina es la insulina humana Lys B3, Glu B29.

18. - El procedimiento según una de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el precipitante se selecciona de un grupo que comprende (d) fosfato de dihidrógeno y amonio, (e) una combinación de fosfato de dihidrógeno y amonio y c¡-trato trisódico; y (f) una combinación de sulfato de amonio y polietilenglicol de varios pesos moleculares.

19. - Un procedimiento para la preparación del cristal según una o más de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5 y 7 u 11 por un procedimiento según la reivindicación 18, donde el precipitante usado es fosfato de dihidrógeno y amonio o fosfato de hidrógeno y diamonio a pHs entre 3,0 y 8,0.

20. - Un procedimiento para la preparación de los cristales según una o más de las reivindicaciones 1 a 11 por un procedimiento según la reivindicación 18, donde el precipitante usado es fosfato de dihidrógeno y amonio/fosfato de hidrógeno y diamonio en combinación con citrato trisódico a un pH de 5,5 + 1 ,5, o bien sulfato de amonio en combinación con PEG de varios pesos moleculares a un pH de 6,0 ± 1 ,5.

21. - El uso de un cristal según una de las reivindicaciones 1 - 11 para la producción de un producto farmacéutico para el tratamiento de la diabetes de los tipos I y/o II.