JPH07501450A - 環状ジグアニレート代謝酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 環状ジグアニレート代謝酵素 発明の分野 本発明は、タンパク質の生産および代謝経路の操作のための組み換えＤＮＡ技術 の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、ジグアニレートシクラーゼのオペ ロンのクローニング、オペロンの発現および調節、および微生物におけるセルロ ースの生産を変更するためにオペロンを使用する方法に関する 発明の背景 セルロースは、紙製品および創傷の包帯を包含する、ある数の有用な製品のため の原料として使用される。セルロースは植物および種々の培養微生物、例えば、 アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）属のセルロース生産性細菌から得るこ とができる。アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）は特徴的にはゲノム陰性 の、がん状細菌０．６〜０．８μｍＸ１．０〜４μｍである。それは厳格には好 気的である１代謝は呼吸的であり、決して発酵的ではない。さらに、それは化学 的にセルロースと同一の、多数のポリβ（＋−４）−グルカン鎖を生産する能力 により区別される。多数のセルロース鎖またはミクロフィブリルは細胞壁上の部 位において細菌表面上で合成される。アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ） によるセルロースの生産は、少なくとも１９３０年代以来の、強い主題であった 。とくに、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕ ｍ）は、完全な細胞におけるセルロース合成のメカニズムを解明する試みにおい て広く研究されてきているｌ２９〕。

ルロース合成のための酵素的経路は研究され、そして本質的に４つの酵素的段階 がアセトバクター・キシリヌム（Ａ、　ｘｙｌｉｎｕｍ）の細胞不含抽出物にお いて特徴づけられ、これらの段階はグルコースからセルロースへの完全な経路を 構成するように思われる。これらはグルコキナーゼによりグルコースのリン酸化 ＣＢｅｎｚｉｍａｎら、（１９７２）、１．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｌｉｔ　 ：　３２５−３３０）　、ホスホグルコムターゼによるグルコース−６−ホスフ ェートのグルコース−１−ホスフェートへのホスホグルコムターゼおよびｔｌＤ Ｐ−グルコースピロホスホリラーゼの活性に影響を与える因子、Ｍ、　Ｓｃ、ｔ ｈｅｓｉｓ　、エルサレムのヘブライ大学、エルサレム、イスラエル（１９７４ ）　）　；　ＵＤＰＧ−ピロホスホリラーゼによりウリジン５′−ジホスホグル コース（ＬＩＤＰ−ｇｌｃ）の合成（Ｆｒｅｉ−Ｒｏｉ　ｔｍａｎ、前掲；　５ ｗ１ｓｓａ、アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎ ｕｍ）におけるセルロースの生合成、Ｐｈ、　Ｄ。

ｔｈｅｓｉｓ、エルサレムのヘブライ大学、エルサレム、イスラエル（＋９７７ ８））　、およびセルロース合成反応である。

新規なヌクレオチドアクナベ−ターＣ−ジーＧＭＰ　、すなわち環状ジグアノシ ンモノホスフェートはセルロースシンターゼの高い活性のために必須である、Ｒ ｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５　：　２７９−２８１　（１９８７）；Ｒｏｓ ｓら、Ｃｒｂｏｈｙｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４９　：　１０１−１１７　（＋９８ ６）　、アセトバクター・キシリヌム（Ａ、　ｘｙｌｉｎｕｍ）からの細胞不含 調製物の研究はあるモデルを発生させ、このモデルにおいて、Ｃ−ジーＧＭＰは 膜結合セルロースシンターゼ、すなわち、セルロース生合成において［拘束され た（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）　Ｊ段階を実行する酵素の可逆的、アロステリックア クチベーターとして機能する。Ｃ−ジーＧＭＰの濃縮、すなわち、Ｃ−ジーＧＭ Ｐの進行する合成および分解の正味の結果は、これらの２つの経路を一緒に説明 する関連する酵素の反対の作用によりコントロールされる。ジグアニレートシク ラーゼ（ＤＧＣと略す）は、２つの明確なピロホスフェート解放段階において、 線状ジヌクレオチドトリホスフェート１）ＩＩＩＩＧｐＧを介する、ＧＴＰの２ つの分子からのＣ−ジーＧＭＰの合成を触媒する。細胞内で、無機のピロホスフ ェートは急速に切断されてオルトホスフェートを生ずる、Ｂｅｎｚｉｍａｎおよ びＰａ１ｇ１．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１０４　：　２１１−２１８　 （１９７０）　、　ｃ−ジーＧＭＰ分解の経路は、Ｃ−ジーＧＭＰ特異的Ｃａ← 惑受性ホスホジェステラーゼＡ。

ＰＤＥ−Ａにより開始され、このＰＤＥ−Ａは環状構造の中の単一のホスホジェ ステラーゼ結合を切断し、線状二量体ｐｃｐｃを生じそして同時にこの分子を不 活性化する。次いで、不活性二量体構造のモノヌクレオチド残基は、ホスホジェ ステラーゼＢ、　ＰＤＥ−Ｂの作用により遊離５’−ＧＭＰ単位として回収され る。ＰＤＢ−ＡのＣａ←阻害は調節コントロールの追加の位置を表すことができ る；このモデルに従うと、Ｃａ”レベルの変動は、それらが系におけるアクチベ ーターのレベルに影響を及ぼすので、セルロース合成速度を変調することができ る。

その環状モノヌクレオチド形成性相手であるアデニレートおよびグアニレートシ クラーゼに関すると、アセトバクター・キシリヌム（Ａ、　ｘｙｌｉｎｕｍ）の ジグアニレートシクラーゼは細胞質および膜関連の両者の形態で存在するように 思われる。

ジグアニレートシクラーゼに帰属されるＣ−ジーＧＭＰ合成の経路は、ＧＴＰか らジグアノシンテトラホスフェート中間体ｐｐｐＧｐＧを介して進行する（１１ ５　：　Ｐ、　Ｒｏｓｓ、　Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、エルサレムのヘブラ イ大学、＋９９０）。この経路における２つの３’−５’ホスホジ工ステラーゼ 結合形成ピロホスフェート解放段階の各々は、別々のｐｐｐｃ＋ｐｃ形成活性が 精製の過程において単離されたなかったということに基づいて単一の酵素により 触媒されるように思われる。

天然のジグアニレートシクラーゼはマルチ−サブユニットの酵素であるように思 われるが、そのサブユニットの組成の正確な性質は完全には確認されてきていな い。この酵素はＧＴＰ基質の固定化された形態に基づくアフィニティークロマト グラフィーにより約２０００倍縮された２つの異なるペプチド（６１および５７ ｋＤａ　、また、それぞれ、バンドＩＩ＋およびＩＶと呼ぶ）に対してレイズさ れたポリクローナル抗体は、自然の酵素に結合するが、もとの抗原に関して交差 反応性ではないことが示された（Ｐ、　Ｒｏｓｓ、　Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉ ｓ、　ｓ−ルサレムのヘブライ大学、１９９０）。こうして、１９０ｋＤａの分 子量を有するジグアニレートシクラーゼの自然の可溶性の形態は、ヘテロオリゴ マーのタンパク質であるように思われる。

２つのホスホジェステラーゼ、すなわち、ＰＤＥ−ＡおよびＰＤＥ−ＢはＣ−ジ ーＧＭＰの分解経路に関連する。ＰＤＥ−Ａは、Ｃ−ジーＧＭＰ分子を切断して ｐＧｐＧを形成するので、Ｃ−ジーＧＭＰレベルを決定するとき、２つの酵素の うちでいっそう重要なものである。陰性の対照のこの形態は、少なくともｉｎ　 ｖｉｔｒｏ系内で、ｐＧｐＧ分解中間体が、急速に分解して５’−ＧＭＰの２つ の分子を生成するよりむしろ、再リン酸化（ＡＴＰの同時の存在において）を受 けるという意味において、不可逆的である。２分子の５’−ＧＭＰを生成するこ の反応は、ＰＤＥ−Ｂの活性により触媒され、明らかにサルベージの役割を演じ 、１ラウンドのＣ−ジーＧＭＰの形成および新規のＧＴＰ合成のための破壊から モノホスフェートの単位を再生する。

Ｍｇ”″依存性ＰＤＥ−ＡおよびＰＤＥ−Ｂの反応は、主として２価のカチオン に対する感受性、細胞内の分布の異なる程度、および免疫化学的分析の基準、な らびに基質の特異性により、明確な酵素であると決定された（Ｒ，Ｍａｙｅｒ、 　ＭＳｃ　Ｔｈｅｓｉｓ、エルサレムのヘブライ大学）。

膜調製物におけるＰＤＢ−Ａ／ＰＤＥ−８の活性の比はほぼ１０：１であるが、 可溶性抽出物において、この比は逆転する。ＰＤＥ−Ａ活性を効果的に阻害する 抗血清は、ＰＤＥ−Ｂ酵素に対して阻害または結合活性をもたない。さらに、Ｐ ＤＥ−８の反応と対照的に、Ｍｇ＋＋を必要とする（Ｋ。

＝ｍＭ）　ＰＤＥ−Ａ活性、Ｃａ”イオンの低い（Ｋ＋ｚｔ　＃５０μＭ）濃度 において阻害される。反応速度論的には、ＰＤＥ−Ａ反応は単一の基質結合部位 を有する酵素に対して典型的な第１次の速度のパターン（Ｋ。

＃　０．２５μＭ）に従う。

Ｃ−ジーＧＭＰ特異的、Ｃａ”感受性のＰＤＢ−Ａはきわめて重要な調節の役割 を占め、そしてとくに調節性質および基質の特異性に関して、詳細に研究された 。８５ｋＤａのサブユニットの分子量は、可溶性の形態て約１９０ｋＤａの自然 重量を表示する、膜関連ＰＤＥ−Ａに帰属された。

Ｃ−ジーＧＭＰの加水分解速度へのＣａ”の阻害作用は、Ｋａ作用からよりむし ろ、ＰＤＥ−Ａ活性の触媒定数（Ｖ、、、　）の減少から生ずるように思われる （Ｒｏｓｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６６　：　１８９３３−１８ ９７３　（１９９０））。

阻害のメカニズムは、存在するとき酵素を無力にする特定のＣａ−結合部位を介 するような、性質がアロステリックであるように思われず、むしろ環状ジヌクレ オチド基質との特定の相互作用を含むことができる。ＰＤＥ−Ａ活性はポリエチ レングリコールの存在に対して同様によく感受性である；Ｃ−ジーＧＭＰ分類の 阻止は、細胞不含アッセイ条件下のセルロースシンターゼの反応へのこの親水性 タンパク質凝集性ポリマーの従来報告された増強作用について、適切な説明を提 供する。

アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）以外の生物かｃｄｇペプチドおよびセ ルロースシンターゼのペプチドに対して相同性であるペプチドを有するというこ とを示唆する、生化学的証拠か存在する。この証拠は、アグロバクテリウム・ツ メファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のよう なセルロース合成細菌におけるＣ−ジーＧ１１ｌＰ合成活性、ＧＤＣ活性、およ びセルロースシンターゼ活性、およびセる抗血清と交差反応するこれらのペプチ ドは、また、アフィニティー標識化研究においてＵＤＰＧおよびＣ−ジーＧＭＰ と結合する。それらの実験の概観については、Ｐ、　Ｒｏｓｓら、（＋９９１） 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５５（＋）、　３５−５８を参照のこと。

セルロースシンターゼ活性の調節におけるＣ−ジーＧＭＰの重要性か与えられる と、組み換えＣ−ジーＧＭＰ代謝酵素を生産する能力は、セルロースの合成を調 節する有用なメカニズムを提供し、究極的に培養において成長した細胞からのセ ルロースの生産を増大する。

発明の要約 本発明は、Ｃ−ジーＧＭＰ　（環状ジグアノシンモノホスフェート）の生合成お よび分解のための酵素をコードするオペロン、すなわち、セルロースシンターゼ のアロステリックレギュレーターを提供する。

アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）から単離された３つのオペロン配列を 詳しく開示する：ｃｄｇｌ、　ｃｄｇ２、およびｃｄｇ３゜これらのオペロンは 、ングアニレートシクラーゼ（ｄｇｃ）およびＣ−ジーＧＭＰホスホジェステラ ーゼ（ｐｄｅＡ）をコートする遺伝子を含有する。これらのオペロンは、また、 ＣＤＧＩＡおよびＣＤＧＩＤを包含する、問題の他のタンパク質をコードするヌ クレオチド配列を含有する。ｃｄｇｌ、　ｃｄｇ２、およびｃｄｇ３またはそれ らの一部分を包含する、ｃｄｇオペロンのヌクレオチド配列は、オペロンにより コードされるポリペプチドの精製された組成物、ｅｄｇオペロンのタンパク質を コートするヌクレオチド配列を含有するベクター、およびｃｄｇオペロンの遺伝 子をコードする遺伝子の検出のためのハイブリダイゼーションプローブの調製を 包含する、種々の用途を見いだす。

本発明の池の面は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）種を包含する、セ ルロース生産細菌の遺伝子操作された株を提供することであり、ここてｃｄｇオ ペロンによりコートされたタンパク質の発現レベルは増加されるか、あるいは減 少され、これによりＣ−ジーＧＭＰの細胞内レベルを変更し、それゆえ細胞の中 のセルロース合成活性およびセルロースの合成を変更する。増大したレベルのＣ ＤＧ活性および／または減少したレベルのＰＤＥ−Ａ活性を生産する遺伝子操作 された株の生産は、とくに重要である。

図面の簡単な説明 第１図はｃｄｇｌオペロンおヌクレオチド配列（配列番号：１）である。図面中 の配列は５２７６ｂｐの長さである。オペロンは少なくとも４つの同定されたオ ーブンリーディングフレームに分割される。第１オーブンリーデイングフレーム 、ｃｄｇｌＡ、ヌクレオチド２０６−８２９、および第２オーブンリーデイング フレーム、ｐｄｅＡｌ　、ヌクレオチド８４６−３１５０、第３、ｄｇｃｌ、ヌ クレオチド３１８４−４９２３、および第４、ｃｄｇｌＤ　、ヌクレオチド４９ ３３−５３４６゜第２図はｃｄｇ２オペロンの核酸配列（配列番号　２）である 。このオペロンは少なくとも２つのオーブンリーディングフレームに分割される 。第１オーブンリーデイングフレームｐｄｅＡ２、ヌクレオチド９８−２３５３ 、および第２オーブンリーデイングフレームｄｇｃ２、ヌクレオチド２４６５− ４１８６゜ 第３図はｃｄｇ３オペロンおヌクレオチド配列（配列番号：３）である。このオ ペロンは少なくとも２つのオーブンリーディングフレームに分割される。第１オ ーブンリーデイングフレームｃｄｇＡ３、ヌクレオチド３９２−２６１１、そし て第２オーブンリーデイングフレームはｄｇｃ３、ヌクレオチド２６６５−４１ ４３である。

第４図はＣＤＣＩＡの推定されたアミノ酸配列（配列番号：４）である。

第５図はＰＤＥＡＩの推定されたアミノ酸配列（配列番号：５）である。

第６図はＤＧＣ＋の推定されたアミノ酸配列（配列番号・６）である。

第７図はＣＤＧＩＤの推定されたアミノ酸配列（配列番号ニア）である。

第８図はＰＤＥＡ２の推定されたアミノ酸配列（配列番号：８）である。

第９図はＤＧＣ２の推定されたアミノ酸配列（配列番号、９）である。

第１０図はＰＤＥＡ３の推定されたアミノ酸配列（配列番号：ＩＯ）である。

第１１図はＤＧＣ３の推定されたアミノ酸配列（配列番号・１１）である。

第１２図は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）のｃｄｇｌ、　ｃｄｇ３ 、およびｃｄｇ３オペロンのヌクレオチド配列の間の相同性の比較である。

第１３図は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）のタンパク質ＰＤＥＡＩ 。

ＰＤＥ＾２、およびＰＤＥＡ３のアミノ酸配列の間の相同性の比較である。

第１４図は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）のタンパク質ＤＧＣＩ。

ＤＧＣ２およびＤＧＣ３のアミノ酸配列の間の相同性の比較である。

第１５図は、リゾビンム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｎｍ　ｍｅｌｌｉｌｏｔｉ ）　ｆｉｘのタンパク質およびアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）のＣＤ ＣＩＡタンパク質の間の相同性の比較である。

第１６図は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｐｕｒＡのタンパク質およびアセドパ発 明の詳細な説明 ここに記載する本発明がいっそう完全に理解されるように、次の詳細な説明を記 載する。

Ａ、定義 ここにおいて使用するとき、用語「アセトバクターＰｕｂｌ　１ｓｈｅｒｓに詳 細に記載されている細菌の特定の属である。本発明のヌクレオチド配列からのア セトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）の特定の株は、単離された場合、アセト バクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）　＋３０６−ＩＩ（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ、　５ ３２６３）およびアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）　＋３０６−２１　 （ＡＴＣＣ受託Ｎｏ、　５３５２４）であり、それらの単離はＰＣＴ出願ＰＣＴ ／ＵＳ９０１０１８１１号に記載されている。

ここにおいて使用するとき、用語［ジグアニレートシクラーゼ」はジグアニレー トシクラーゼ活性を有する１または２以上のポリペプチドを意味する。ジグアニ レートシクラーゼ活性は、２分子のＧＴＰ（グアノシントリホスフェート）をビ ス−（３’５’）−環状ジグアニル酸に酵素的に変換する性質を意味する。少な くとも３つのジグアニレートソクラーゼ酵素が、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂ ｃｔｅｒ）において、ＤＧＣＩ、　ｃｄｇｌオペロンの中のｄｃｇｌ遺伝子によ りコードされる、およびＤＧＣ２，ｃｄｇ２オペロンの中のｄｇｃ２遺伝子によ りコードされる、およびＤＧＣ３，ｃｄｇ３オペロンの中のｄｇｃ３遺伝子によ りコードされる、として同定された。用語ｒＤＧＣＪは、ＤＧＣｌ、　ＤＧＣ２ およびＤＧＣ３を包含する、ジグアニレートシクラーゼ活性をもつ酵素を意味す る。

用語［ジグアニレートホスホジエステラーゼ」は、「ジグアニレートホスホジエ ステラーゼ活性」を育するｌまたは２以上のポリペプチドを意味する。［ジグア ニレートホスホジエステラーゼ活性」は、線状二量体ｐＱｐにを生ずるＣ−ジー ＧＭＰの中の単一のホスホジエステル結合を酵素的に切断する性質、すなわち、 酵素のジグアニレから少なくとも３つのジグアニレートホスホジエステラーゼが 同定された、ＰＤＥＡｌ、　ｃｄｇ１オペロンの中のｐｄｅＡｌ遺伝子によりコ ードされる、ＰＤＥＡ２．　ｃｄｇ２オペロンの中のｐｄｅＡ２遺伝子によりコ ードされる、およびＰＤＥＡ３．　ｃｄｇ３オペロンの中のｐｄｅＡ３遺伝子に よりコードされる。用語ｒＰＤＥ−Ａ　Ｉは、ＰＤＥＡＩおよびＰＤＥＡ２を包 含する、ジグアニレートホスホジエステラーゼ活性をもつ酵素を意味する。

用語［環状ジグアニル酸のオペロンＪ、ｒｃｄｇオペロンＪ、ｒｃｄｇＪおよび ｒｃｄｇオペロンＪは、同一のものを意味し、そしてジグアニレートシクラーゼ 活性、ジグアニレートホスホジエステラーゼ活性、または両者をもつ酵素をコー ドする遺伝子を含有するオペロンを意味する。ｃｄｇオペロンは、また、１また は２以上のｃｄｇオペロンのタンパク質の発現を変調する性質を有するｌまたは ２以上の調節タンパク質をコートすることができる。これらの用語は、特定のア セトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）の株または種に制限されない。

オペロンは、また、転写および翻訳の調節要素、例えば、プロモーター配列、転 写ターミネータ−配列、アテニュエーター配列、オペレーター配列などを包含す ることができる。ｒｃｄｇＨｌ　ｒ　Ｃ６ｇ２Ｊおよびｒ　ｃｄｇ３」は、それ ぞれ、第１図、第２図、および第３図によりのｃｄｇオペロンを意味する。

用語ｒ　ｃｄｇオペロンの遺伝子」は、ポリペプチド生産物をコードしそしてｃ ｄｇオペロンによりコードされる核酸配列として定義される。

用語ｒ　ｃｄｇオペロンのタンパク質（またはポリペプチド」」は、ｃｄｇオペ ロンの遺伝子によりコードされるポリペプチドを意味する。

用語ｒ　ｃｄｇオペロンのタンパク質」は、ｃｄｇオペロンの遺伝子によりコー ドされるポリペプチドを意味することに加えて、ＰＤＥ−Ａ。

ＰＤＥ−Ａ２．　ＰＤＥ−Ａ３．　ＤＧＣｌ、　ＤＧＣ２，ＤＧＣ３，ＣＤＣＩ Ａ　、およびＣＤＧＩＤを包含し、天然に存在するｃｄｇオペロン配列によりコ ードされるポリペプチドの種々の誘導体を意味する。

［作用可能に連鎖したｊは、成分の通常の機能を実行することができるような近 位を意味する。こうして、コントロール配列に「作用可能に連鎖した」コーディ ング配列は、コーディング配列をこれらの配列のコントロール下に発現すること ができる立体配置を意味する。このようなコントロールは、直接的であることが できる、すなわち、単一の遺伝子が単一のプロモーターに関連するか、あるいは ポリシストロンの転写が単一のプロモーターから発現される場合におけるように 、間接的であることができる。

「コントロール配列Ｊは、特定の宿主生物において作用可能に連鎖したコーディ ング配列の発現または調節（転写または翻訳）に必要なｌまたは２以上のＤＮＡ 配列を意味する。例えば、原核生物のために適当なコントロール配列は、プロモ ーター、必要に応じてオペレーター、リポソーム結合部位、転写ターミネータ− １および可能ならば他のまだよく理解されていない配列を包含する。真核生物の 細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサ−、サイレンサーな どを使用することが知られている。

問題の分子の発現の「増大したレベル」とは、「増大したレベル」のその分子を 発現する細胞が、所定の組の成長条件下に各細胞について、［増大したレベルＪ の問題の分子を生産しない同様な細胞より、より多い分子を含有することを意図 する。

問題の分子の発現の「減少したレベル」とは、「減少したレベル」のその分子を 発現する細胞が、所定の組の成長条件下に各細胞について、「減少したレベル」 の問題の分子を生産しない同様な細胞より、より少ない分子を含有することを意 図する。

「細胞」または［組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」はしばしば互換的に使 用され、そしてすべてのこのような表示は子孫を包含する。こうして「形質転換 体ｊまたは［形質転換された細胞」は、転移の数を無視して、初代の主題細胞お よびそれらから誘導された培養物を包含する。また、理解されるように、すべて の子孫は、慎重なまたは不注意な突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一な いことがある。本来形質転換された細胞においてスクリーニングしたとき同一の 機能を有する突然変異の子孫が包含される。明確な表示を意図する場合、それは 文脈から明らかであろう。

特定のポリヌクレオチド配列を呼ぶとき、言及するタンパク質のアミノ酸配列は 天然に存在する配列から誘導されたアミノ酸配列を包含する。表示した配列［か ら誘導されたＪポリペプチドは、その配列の中にコードされたポリペプチドと同 一であるか、あるいは実質的にそれに対応するするアミノ酸配列を育するポリペ プチド、あるいはその一部分を意味し、ここて前記一部分は少なくとも５〜ＩＯ アミノ酸配列、より好ましくは少なくとも１０〜１５アミノ酸から成り、前記配 列の中にコードされたポリペプチドで免疫学的に同定することができるか、ある いはここに記載するｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏのアッセイにおいて 参照タンパク質のそれと同様な生物学的活性を示す。

アミノ酸について言及でここにおいて使用するとき、「実質的に対応する」は、 １０より少ないアミノ酸、より通常５より少ないアミノ酸だけ通常具なる配列を 意味する。組み換えタンパク質は、天然に存在するタンパク質と実質的に同一の 生物学的性質を有する。生物学的性質は免疫学的性質を包含することができ、こ こで真性のタンパク質に対してレイズされた抗体は組み換えタンパク質と交差反 応する。

特定のヌクレオチド配列を言及するとき、ヌクレオチド配列は天然に存在する配 列から誘導されたヌクレオチド配列を包含することを意味する。表示した配列「 がら誘導された」ポリヌクレオチド、例えば、ｐｄｅＡｌからのＤＮＡは、表示 したヌクレオチド配列のある領域に対応する、すなわち、それと同一または相補 的である、少なくとも６〜２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５〜 ２ｏヌクレオチドの配列から構成されたポリヌクレオチド配列を意味する。核酸 配列に対する対応はほぼ７０％またはそれより大きく、好ましい少なくとも８０ ％またはそれより太き、なおより好ましくは少なくとも９０％であろう。

誘導された配列の他の配列に対する対応または非対応は、適当なストリンジエン シイの条件下に、液相中または固体の支持体上の標準のＤＮＡハイブリダイゼー ション技術を使用して決定することができる。核酸配列の相補性を決定するハイ ブリダイゼーション技術はこの分野において知られている（例えば、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、第２版、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨークを参照のこと ）。さらに、ハイブリダイゼーションにより形成した二重らせんのポリヌクレオ チドの不一致は、既知の技術、例えば、ヌフレアーゼ、例えば、Ｓｔ（二重らせ んのポリヌクレオチドの中の一本鎖の配列を特異的に消化する）を使用する消化 により決定することができる。

誘導されたポリヌクレオチドは示されたヌクレオチド配列から物理的に必ずしも 誘導することは必要ではないが、任意の方法、例えば、化学的合成、ＤＮＡの複 製または逆転写において発生させることができ、前記方法は、ポリヌクレオチド が誘導された１または２以上の領域における塩基の配列により得られた情報に基 づく。

ｃｄｇオペロンのポリペプチドを特性決定するためにここにおいて使用する用語 ［組み換えポリペプチド」は、ゲノムの、ｃＤＮＡ、半合成、あるいは合成の核 酸配列によりコードされるポリペプチドを意図し、前記ポリペプチドは、それら の起源または操作により、（１）それらが事実関連するか、あるいはライブラリ ーの形態であるポリヌクレオチドのすべてまたは一部分に関連しない；および／ または（２）それが事実連鎖されるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチ ド配列に連鎖している。

「発現系」は所望のコーディング配列およびコントロール配列を操作可能に連鎖 して含有するＤＮＡ配列を意味し、こうしてこれらの配列で形質転換された宿主 細胞はコードされたタンパク質を生産することがてきる。形質転換を実施するた めに、発現系をベクターの中に含めることができる。しかしなから、関係するＤ ＮＡを宿主の染色体の中に組み込むこともてきる。

用語「異種」は、ポリヌクレオチド配列に関して使用するとき、細胞の中に天然 に存在しないか、あるいは特定のゲノムの位置に存在するポリヌクレオチド配列 を意味する。こうして、用語異種は、例えば、ＡおよびＢ遺伝子か同一生物から のものであるとき、ならびに１つの種のポリヌクレオチド配列が異なる種（また は株）の細胞に転移される場合、構造遺伝子Ｂに操作可能に接合された遺伝子へ のプロモーターを包含する。

ここにおいて使用するとき、用語「ベクター」は、核酸配列を宿主細胞の中に転 移するために適当なポリヌクレオチド配列を意味する。この用語は、プラスミド 、ミニ染色体、ファージ、裸のＤＮＡなどを包含することができる。

用語「遺伝子操作Ｊは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ技術、ｉｎ　ｖｉｖｏ技術、または１ ｎｖｉ　ｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの両者の技術の組み合わせにより、ポリヌ クレオチド配列の目的をもった変更を意図する。「遺伝子操作」は、染色体の中 へのあるいは染色体外で複製する要素としての異種ポリヌクレオチド配列の細胞 中の導入、染色体のポリヌクレオチド配列の変更、転写および／または翻訳の調 節シグナルの染色体の遺伝子またはプラスミドによりエンコードされた遺伝子へ の付加および／または置換、および問題の遺伝子の中の種々の挿入、欠失および 置換の突然変異を包含する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝子操 作の方法は当業者に広く知られており、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、第２版、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８ ９）、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ 、１８５゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）　、アセトバクター（ Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）種の遺伝子操作のための特定の技術は、米国特許出願第 ０７／６８９．００８号（これをここに引用によって加える）の中に見いだすこ とができる。

用語１組み換え」は、細胞を言及するために使用するとき、遺伝子操作された細 胞、あるいは遺伝子操作された細胞の子孫である細胞を意図する。

この出願において使用するすべての細菌の成長培地の組成は、米国特許出願第０ ７／　６８９．００８号、　１９９１年４月２２日提出、の中に見いだすことが できる。

Ｂ　特定の態様 この節は、ｃｄｇｌ、　ｃｄｇ２およびｃｄｇ３のオペロンのヌクレオチド配列 、ｃｄｇオペロンによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列、ｃｄｇオペロ ンのタンパク質の精製された調製物、および増大したレベルまたは減少したレベ ルの１または２以上のｃｄｇオペロンのタンパク質を生産する能力を有する細胞 を提供する。

れた少なくとも３つのＣ−ジーＧＭＰオペロンの部分のヌクレオチド配列を提供 する。オペロンの第１のｃｄｇｌ　（配列番号・１）は少なくとも４つの遺伝子 からなる。転写の順序において、これらの遺伝子は次の通りである・　（］　） 　ｃｄｇｌＡ　、未知の機能の遺伝子：　（２）ｐｄｅＡｌ　、ジグアニレート ホスホジエステラーゼ；（３）ｄｇｃｌ、ジグアニレートンクラーゼ、（４）　 ｃｄｇｌＤ　、未知の機能の遺伝子。

３つの単離されたオペロンの第２のｃｄｇ２　（配列番号・２）は少なくとも２ つの遺伝子を有し、転写の順序において、これらの遺伝子次の通りである、（２ ）　ｐｄｅＡ２、ジグアニレートホスホジエステラーゼ、および（２）　ｄｇｃ ２、ジグアニレートシクラーゼ。

３つの単離されたｃｄｇオペロンの第３のｃｄｇ３は少なくとも２つの遺伝子を 有する：　（１）　１）ｄｅＡ３、ジグアニレートホスホジエステラーゼ；およ び（２）ｄｇｃ３、ジグアニレートシクラーゼ。

ｃｄｇ１オペロンは４より多い遺伝子を含有することができ、ｃｄｇ２オペロン は２より多い遺伝子を含有することかでき、そして０６ｇ３オペロンは２より多 い遺伝子を含有することかできる。これらの他の遺伝子は、標準の組み換えＤＮ Ａライブラリーのスクリーニング技術、例えば、（ｄｇｌ、　ｃｄｇ２、または ｃｄｇ３のオペロンの配列の５′または３′末端から誘導されたハイブリダイゼ ーションプローブを使用するゲノムのライブラリーの核酸のハイブリダイゼーシ ョンのスクリーニングにより容易に検出することができる。次いで、ライブラリ ーのスクリーニングにより発見された追加のｃｄｇオペロンの配列をＤＮＡの配 列決定にかけてオーブンリーディングフレームを検出し、こうしてこれらの他の ｃｄｇオペロンかコードするアミノ酸配列を検出することかできる。

本発明の重要な面は、安定な株が１より多いｃｄｇオペロンを含有することかで きるという発見である。多数のｃｄｇオペロンの存在の知識かないと、ｃｄｇが エンコードする遺伝子の不活性化のための有望な方法は、非不活性化遺伝子の残 留発現のために、達成することかできるであろう。

ｃｄｇオペロンの遺伝子は、第１２図〜第１６図において見ることができるよう に、アミノ酸およびヌクレオチドのレベルの両者において互いに高度に相同性で ある。相同性のスコアは、インテレジェネティックス（Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｅ ｔｉｃｓ）からのジエナリン（Ｇｅｎａｌ　ｉｇｎ）多重配列整列プログラムの 方法に基づいて計算する。

当業者は理解するように、タンパク質の間の相同性の領域は進化的に観察するこ とかでき、そして実質的なアミノ酸配列の変化はタンパク質の酵素的性質を変更 しないで保存された領域においてなすすることができるように思われる。こうし て、異なるｃｄｇオペロンのポリペプチドおよび核酸配列の間の相同性の領域を 考慮することによって、タンパク質の生物学的性質を実質的に損失しないて、ｃ ｄｇオペロンのタンパク質のアミノ酸配列を修飾するための指針か得られる。

ｃｄｇｌＡおよびｃｄｇｌＤによりコードされるタンパク質の機能は同定されて きていないが、ＣＤＧＩＡおよびＣＤＧＩＤのアミノ酸配列をタンパク質のデー タベースと比較することによって、既知のタンパク質との相同性が明らかになる 。ＣＤＣＩＡは、窒素固定のオペロン調節遺伝子であるリゾビウム・メリロチ（ Ｒｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｌｉｌｏｔｉ）のｆｉｘＫによりコードされるタンパ ク質と、２９％のアミノ酸の同一性および５３％の類似性を有する。ＣＩ）ＧＩ Ｄは、アデニロスクシネートシンターゼである大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のｐｕ ｒＡによりコードされるタンパク質と、＋００アミノ酸残基にわたって、３８９ ６のアミノ酸の同一性および５９％の類似性を有し、このシンターゼはＩＭＰを アデニロスクシネートに変換する（後にＡＴＰに変換する）。

当業者は理解されるように、遺伝コードの縮重の結果、いくつかはヌクレオチド 配列ｃｄｇｌおよびｃｄｇ２に対して最小のヌクレオチド配列の相同性を有する 、多数のヌクレオチド配列を生産することができる。本発明は、第１図〜第３図 に適用するとき標準のトリプレットの遺伝コードに従いなされる可能なアミノ酸 およびコドンの選択に基づく組み合わせを選択することによって、なすことがで きる、ペプチドまたはヌクレオチドの配列の各々およびすべての可能な変動を特 別に考慮し、そしてすべてのこのような変動は詳しく開示されていると考えるべ きである。

ｃｄｇオペロンｃｄｇｌおよびｃｄｇ２のヌクレオチド配列を提供することによ って、本発明は特定の増殖条件下にあるレベルのｃｄｇオペロンのポリペプチド を生産する能力に関して変更されるように遺伝子操作された細胞を提供する。問 題の遺伝子操作は、ｃｄｇオペロンのヌクレオチド配列またはｃｄｇオペロンの 配列に隣接する配列の変更を包含する。これらの変更は、遺伝子操作の前のレベ ルの比較して増大したレベルでｌまたは２以上のｃｄｇオペロンのタンパク質を 発現する能力、減少したレベルにおけるＩまたは２以上のｃｄｇオペロンの遺伝 子のタンパク質の発現、およびｌまたは２以上のｃｄｇオペロンのタンパク質の 発現の変更された調節を包含する。また、遺伝子操作された細胞を生産すること ができ、この細胞において、いくつかのｃｄｇオペロンがコードするポリペプチ ドの発現を変更して、野性型レベルに関して異なる発現のレベルが達成される、 すなわち、１つのｃｄｇオペロンがコードするタンパク質の発現を増加し、そし て第２のｃｄｇオペロンがコードするタンパク質の発現を減少することができる 。

ｃｄｇオペロンの遺伝子操作のための細胞は原核生物または真核生物の細胞であ ることができ、原核生物の細胞は好ましい。遺伝子操作のための原核生物の細胞 は、自然にｃｄｇオペロンを含有する細菌の種およびｃｄｇオペロンを自然にコ ードしない種の株を包含する。

遺伝子操作のためにとくに好ましい種は、セルロースを生産する細菌の種、こと にアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）種である。また、自然にセルロース シンターゼを生産しないが、それをなすように遺伝子操作する細胞の中でｃｄｇ オペロンを遺伝子操作することは興味あることである。

組み換えＤＮＡ法を使用して、完全な不存在を包含する、減少したレベルのｃｄ ｇオペロンのタンパク質を生産する細菌株をつくることができ、ＰＤＥ−Ａの減 少したレベルはと（に重要である。減少したレベルのｃｄｇオペロン誘導タンパ ク質を生産するこれらの株の発生は、「不活性化性遺伝子構成体」を遺伝子操作 のための細菌の中に導入することによって達成できる。遺伝子操作のための細胞 の中に導入したとき、不活性化性構成体を好ましくは相同的組み換えメカニズム によりｃｄｇオペロン内の種々の部位、あるいは隣接するポリヌクレオチド配列 の中に組み換えて、ｌまたは２以上のｃｄｇオペロンのポリペプチドの発現を減 少させる。不活性化性構成体は、ｃｄｇオペロンの一部分に対して実質的に相同 性のヌクレオチド配列の領域を含存することができる。「実質的に相同性」とは 、細胞の内因性の相同的組み換えメカニズムを機能させるために十分な、２つの 配列の間の相同性が存在することを意図する。ｃｄＨオペロンの一部分に対して 実質的に相同的な遺伝子構成体の領域は、好ましくは、相同的領域の崩壊を含有 する。崩壊とは、ｃｄｇオペロンの染色体のコピーの中に存在する場合、ｌまた は２以上のｃｄｇオペロンのタンパク質の発現を減少する突然変異を意図する。

これらの突然変異は、１または２以上のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換 （好ましくは置換を操作するナンセンスコドン）を包含する。好ましい突然変異 は、不活性性ベクターのｃｄｇオペロン領域のコーディング領域内の挿入である 。より好ましくは、これらの挿入のヌクレオチド配列は、問題の生物において選 抜可能な遺伝子のマーカーをコードし、これによりｃｄｇオペロンの崩壊のプロ セスの監視を提供する。

不活性化性遺伝子構成体は、ベクター領域、すなわち、独立に複製することがで きるヌクレオチド配列を含有するか、あるいは含有しないことができる。不活性 化性遺伝子構成体は、好ましくは、修飾すべき生物の中で複製することができな い。こうして、修飾のための生物の中への不活性化性遺伝子構成体導入は、必然 的に染色体の中への組み換えまたは引き続く細胞分裂における損失を生ずるであ ろう。

不活性化性構成体は少なくとも１つの生物における複製機能を含有することがで きるが、遺伝子操作すべき生物の中で複製することができない。レプリコンを含 有する不活性化性構成体は、好ましくは、移動化構成体を含有し、この構成体は 不活性化性構成体をレプリコンが機能的である種からレプリコンが機能的てない 種へ転移させることができる。あるいは、レプリコンを含有しない不活性化性構 成体を遺伝子操作のための細胞の中に形質転換法により導入することかてきる。

ｃｄｇオペロン内のシグナル遺伝子を不活性化するとき、好ましい不活性化性遺 伝子構成体は突然変異をその中でつくるｃｄｇオペロンのタンパク質の遺伝子の リーディングフレームを崩壊しないヌクレオチド配列の変更を含存し、これによ り他のｃｄｇオペロンのタンパク質の転写への極性作用を最小にすることができ る。

ｃｄｇオペロンがコードする遺伝子の発現を減少する他の手段は、ｃｄｇオペロ ンの一部分に対して相補的なアンチセンスＲＮＡの生産を包含する。このアンチ センスＲＮＡはプラスミドのベクターから、あるいは問題の細胞の中に挿入され たベクターから発現させることができる。

ｃｄｇオペロンの遺伝子を発現する能力を欠如する細胞をつくるとき、その細胞 の中に存在する遺伝子のすべての発現されたコピーを不活性化することが必要で あり、そうでなければｃｄｇオペロンの遺伝子の他のコピーからの残留発現が起 こることがある。アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）種、とくにアセトバ クター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）　１３０６−２１において、各ｃｄｇオペロン はｐｄｅＡおよびｄｇｃ遺伝子を含有することかできる。■より多いｃｄｇオペ ロンが細胞の中に存在するとき、異なるオペロンを異なる割合で転写することが でき、こうして細胞の中のｃｄｇオペロンのすべてより少なくを不活性化するこ とによって、ｃｄｇオペロンの遺伝子の発現の有意な減少を達成することができ る。ｌより多い不活性化性遺伝子構成体によりｌより多いｃｄｇオペロンを不活 性化するとき、異なる不活性化性遺伝子構成体は異なる選抜可能なマーカーを含 有することか好ましい。

ｃｄｇオペロンの遺伝子を減少または排除するために不活性化性遺伝子構成体を 使用することに加えて、本発明は、また、アンチセンスＲＮＡによる０６ｇオペ ロンの遺伝子の発現の減少または排除を提供する。種々の０６ｇオペロン、また はその一部分、好ましくは同一生物からの異なる０６ｇオペロンのイソ酵素の間 に保存される部分をプロモーターの配列に逆向きに機能的に接合してアンチセン ス転写体をつくることかできる。アンチセンスＲＮＡは多数のオペロンから転写 された遺伝子の発現を減少するためにとくに有用である。アンチセンスＲＮＡの 転写を開始するプロモーター（および関連する配列）は、構成的または誘発性で あることができる。アンチセンスＲＮＡを生産する「遺伝子ｊは問題の生物の染 色体上に位置するか、あるいは染色体外に位置することができ、例えば、プラス ミド支持であることができる。

本発明は、また、増大したレベルの１または２以上の０６ｇオペロンがコードす るポリヌクレオチド配列を生産する細胞を提供し、増大したレベルのＤＧＣはこ とに重要である。増大したレベルの発現は種々の遺伝子操作により達成すること ができ、このような遺伝子操作はマルチコピーのプラスミド（または他の同様な ベクター）上の０６ｇオペロン、またはその一部分の配置、およびｃｄｇ配列（ プラスミドまたは染色体上の）への高いレベルの異種プロモーターの操作可能な 接合を包含する。高いレベルの異種プロモーターはｉｎ　ｖｉｔｒ。

の操作により発現のためのｃｄｇ配列に操作可能に連鎖し、そして問題の細胞の 中に導入することができる。問題の細胞の中に導入したとき、異種プロモーター 配列に接合したｃｄｇ配列を染色体の中に組み換えて、０６ｇオペロンに自然に 接合したプロモーター配列を含有する染色体の領域を置換することができる。

０６ｇオペロンかコードする遺伝子に高いレベルのプロモーターを操作可能に連 鎖することに加えて、他の転写コントロール配列（プロモーター、オペレーター 、アテニュエーターなど）を０６ｇオペロンの遺伝子に操作可能に連鎖して、０ ６ｇオペロンがコードするｌまたは２以上の遺伝子の誘発可能なまたは構成的発 現を得ることができる。こうして、０６ｇオペロンの遺伝子の調節を変更して、 特定の成長期の間にかつ所望の生活環境条件下に発現を得ることができる。

ｃｄｇオペロン配列に転写コントロール配列を接合するための一般的技術は、ｃ ｄｇオペロン配列に高いレベルの異種プロモーターを接合するだめの前述の技術 と本質的に同一である。

０６ｇオペロンの遺伝子の発現を修飾する前述の技術は酵素をコードする遺伝子 に限定されず、また０６ｇオペロンがコートする調節遺伝子の発現の修飾を包含 する。理解されるように、０６ｇオペロンの遺伝子の発現の増加は、転写のアク チベーターの発現を増加するか、あるいは転写のリプレッサーの発現を減少する ことによって増加することができる；　０６ｇオペロンの遺伝子の発現の減少に ついて逆は真実である。

０６ｇオペロンの発現レベルを修飾する他の手段は、ｃｄｇオペロン内の特定の ヌクレオチド配列に結合する能力を有する０６ｇオペロンの調節ポリペプチドの 滴定を包含する。これらの調節タンパク質における滴定は、適当細胞の中で複製 することができるマルチコピー数のプラスミド上に、調節タンパク質に結合する ０６ｇオペロンのヌクレオチド配列を配置することによって達成することができ る。例えば、０６ｇオペロンの遺伝子の発現は、０６ｇオペロンの転写を刺激す るポリペプチドが存在し、そしてポリペプチドがそれに結合するヌクレオチド配 列が高いコピー数のプラスミド上に配置する場合、減少させることができる。０ ６ｇオペロンの調節タンパク質に結合することができるヌクレオチド配列は、０ ６ｇオペロンの遺伝子の発現を修飾することか知られているヌクレオチド配列の 配列の欠失分析を実施することによって容易に決定することかできる。

本発明は、０６ｇオペロンまたはその一部分、ことにｄｇｃ遺伝子からなる遺伝 子構成体を問題の細胞の中に転移することによって、種々の細胞上てＣ−ジーＧ ＭＰを所望のレベルて生産する能力の付与を提供する。これらの遺伝子構成体は 、ＤＧＣｌまたはＤＧＣおよびＰＤＥＡの両者を発現することかできる。Ｃ−ジ ーＧＭＰを合成する問題の細胞は真核生物または原核生物の細胞であることがで きるが、原核生物の細胞か好ましい。Ｃ−ジーＧＭＰとの修飾された相互作用で あることができる活性を有するセルロースシンターゼ、好ましいアセトバクター ゼを生産する能力を有する細胞の中に、これらの遺伝子構成体を導入することは とくに重要である。問題の細胞はセルロースシンターゼを自然に生産することが できるか、あるいはそれを生産するように遺伝的に修飾することができる。さら に、セルロースシンターゼを自然に生産しない細胞にセルロースシンターゼを生 産する能力を転移する方法を詳細に説明することは重要であり、例えば、大腸菌 （Ｅ、　ｃｏ！ｉ）は同時係属米国特許出願第０７／６８９．００８号、１９９ １年４月２２日提出（これをここに引用によって加える）の中に見いだすことか てきる。Ｃ−ジーＧＭＰはセルロースシンターゼの活性を増加することができる ので、Ｃ−ジーＧＭＰを生産する能力をセルロースシンターゼを生産する細胞に 付与することは重要であろう。

（ｉｉｉ）ｃｄｇオペロン配列の単離 ｃｄｇオペロンをコードするｐｎを、実施例に記載するようにして、のエドマン 分解法のアミノ酸の配列決定により得られた情報に基づいて、オリゴヌクレオチ ドのプローブのプールを生成した。オリゴヌクレオチドのプールを、アセトバク ター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）の染色体のＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応のための プライマーとして使用した：染色体のＤＮＡの増幅された領域を、ライブラリー をクローニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。あ るいは、ＰＣＲ増幅工程に頼らないで、精製されたタンパク質から得られたアミ ノ酸配列の情報のみから、ハイブリダイゼーションプローブを生成した。単離さ れたタンパク質のアミノ酸の配列決定から得られたアミノ酸配列に対するクロー ンを、ＤＮＡの配列決定から得られた推定されたアミノ酸配列と比較することに よって、ライブラリーの分離物を確証した。ライブラリーから単離されたＤＮＡ 配列を使用して、クローニングした遺伝子によりエンコードされるタンパク質の 生産か壊滅されたアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）の株を構成した。こ れらの遺伝子操作された株の酵素活性の分析は、多数のＰＤＥＡおよびＤＧＣを エンコードする遺伝子の存在を明らかにした。特定の０６ｇオペロンのポリペプ チドを生産しないように遺伝子操作されたアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅ ｒ）株から作られた抽出物の５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンプロットを 使用して、クローニングされた遺伝子の同一性を確証した。

オペロンｃｄｇｌ　（配列番号：　Ｉ）　、ｃｄｇ２　（配列番号＝２）、およ びｃｄｇ３　（配列番号：３）のヌクレオチド配列またはその一部分を、種々の 種（ｃｄｇｌおよびｃｄｇ２を単離した種属外の種を包含する）のゲノムから生 産された遺伝子のライブラリーから相同性遺伝子を単離するためのハイブリダイ ゼーションプローブとして使用することができる。とくに重要な種は細菌のセル ロースシンターゼを生産する種ア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）の属からの種を包含する 。遺伝子のライブラリーをスクリーニングする技術は、例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、 Ｓａｍｂｏｒｏｏｋら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ　（ １９８９）の中に見いだすことができる。

ｃｄｇオペロンの遺伝子の相同的配列の検出のために適当な核酸のハイブリダイ ゼーションプローブは、ｃｄｇｌ、　Ｃｄｇ２またはｃｄｇ３の配列からの少な くとも１４、好ましくは２５、より好ましくは少なくとも５００核酸塩基対から なる。ハイブリダイゼーションプローブは種々の標識、例えば、ラジオヌクレオ チド、例えば、′！Ｐまたは１Ｓ、あるいは酵素の標識、例えば、アビジン／ビ オチンのカップリング系などを介してプローブにカップリングされたアルカリ性 ホスファターゼにより標識化することができる。

ハイブリダイゼーションのためにプローブは、酵素および１ｎｖｉｔｒｏの両者 の技術により合成することができる。短いハイブリダイゼーションプローブは、 好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの方法、例えば、商業的に入手可能なりＮＡ合成 装置、例えば、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ’　）装置の使用により合成される。

核酸のハイブリダイゼーションプローブの追加の使用は、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＩ’りのためにプライマーとしてのそれらの使用を包含する。ポリメラー ゼ連鎖反応は、米国特許第４．９６５．１８８号、米国特許第４．６８３．２０ ２号および米国特許第４．８００．　＋　９５号に詳細に記載さｃｄｇオペロン のヌクレオチド配列、ならびにｃｄｇオペロンによりエンコードされるポリペプ チドのアミノ酸配列が提供されたので、本発明は組み換えＤＮＡの発現技術によ り、そしてｉｎ　Ｖｉｔｒｏのペプチド合成およびｉｎ　ｖｉｖｏの生産の両者 により、精製されたｃｄｇオペロンかコードするタンパク質の生産を可能とする 。

ここに開示するポリペプチドの直接的合成のための自動化装置は商業的に入手可 能である。このような装置は、直接的合成によるか、あるいは他の既知の技術を 使用してカップリングすることができる１系列の断片の合成により、本発明のペ プチドへの便利なアクセスを提供する。

ｃｄｇオペロンのタンパク質の合成の他の方法は、こうして生産されたＲＮＡ転 写体の１ｎｖｉｔｒｏ翻訳と組み合わせた、ｃｄｇオペロンの遺伝子配列のｉｎ 　ｖｉｔｒｏ転写を包含する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写系はこの分野においてよく 知られている。ｉｎ　ｖｉｖｏ転写系は、典型的には、問題のコーディング配列 が強いプロモーター、例えば、５Ｐ−６またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼに対して 特異的なプロモーターから下流に位置スルヌクレオチド配列を発生させ、引き続 いて前記プロモーターに対して特異的なＲＮＡポリメラーゼ、および反応のため の基質を添加することを包含する。同様に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系はこの分野 においてよく知られており、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写系により生産された種 々の転写体からのｃｄｇオペロンのタンパク質の生産に使用することができる。

発現ベクターを使用して、種々の細胞宿主の中である量のｃｄｇオペロンのタン パク質を発現することができる。多数の発現ベクターおよびそれらの使用の詳細 な説明は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ、　Ｖａｔ、　１８５　（１９９０）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓの中 に見いだすことがてきる。発現ベクターは、問題の宿主の中で機能的なプロモー ターを含有する。このプロモーターを問題の遺伝子のコーディング配列に操作可 能に連鎖して、ｃｄｇオペロンのタンパク質をエンコードする翻訳可能なｍＲＮ Ａ転写体を生産することができる。一般に、発現ベクターは、コーディング核酸 配列の挿入するために便利な制限部位をプロモーター配列付近の位置に有する。

適当な発現ベクター、ことに真核生物の細胞の中で使用するための発現ベクター の中のプロモーターは、構成的であるか、あるいは誘発可能であることができる 。プロモーター配列を有することに加えて、発現ベクターは、ｃｄｌ＜オペロン のタンパク質の発現を最大する目的で、種々のエンハンサ−配列などを含有する ことができる。

本発明を説明したが、下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。これら の実施例は本発明を限定しない。

した。使用したＧＴＰアフィニティーカラムの精製スキームは、ＰＡＧＥにより 可視化することができる４つのポリペプチドのバンドの単離した：バンドＩａ、 約８０ｋＤａ見掛けの分子量を有する、バンドＩｂ。

７８ｋＤａの見掛けの分子量を有する、バンドＩＩ＋、　６５ｋＤａの見掛けの 分子量を有する、およびバンドＩＶ、　５９ｋＤａの見掛けの分子量を有する。

バンドＩａおよびＩｂは、ジグアニレートホスホジエステラーゼ活性を有するタ ンパク質により生産されることが発見された。バンドＩＩＩおよびＩＶはジグア ニレートシクラーゼ活性を存するタンパク質により生産されることが発見された 。

■、ジグアニレートシクラーゼのＮＨ，末端のアミノ酸配列アプライド・バイオ システムス・インコーホレーテッド（Ａｐｐｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ、）の４７０Ａ型配列決定装置で自動化エドマン分解法により、ペプチド を分析した。バンド１１１、すなわち、６５キロダルトンのポリペプチドのバン ドの分析は配列を与えず、Ｎ−末端の残基がブロックされていることを示した。

アシル化を脱ブロックするか、あるいは末端のＮ−ホルミルメチオニン上のホル ミル基を加水分解するために、ペプチドの試料をトリフルオロ酢酸で処理するこ とは、試料の直接的配列決定を不可能にした。

次いて、バンドＩＩＩのペプチドを過ギ酸の酸化により部分的に消２５％ＣＨ＝ ＣＮ／ＨｚＯに対して透析し、そして乾燥した。次いで、調製物を４０℃におい て１００μｌの６Ｍ塩化グ了ニシン、９８μｌの０．０５ＭＴｒｉｓ　ｐＨ９， １，２ｕ　ｌのアキロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）からのりシル エンドペプチダーゼ（０，０２２ｍＭ　ＴｒｉＳ　ｐＨ８，ｌ中の２００μｇ／ ４００μりの中で４時間インキュベーションした。この消化からのペプチドを引 き続いてＣ４逆相カラム−１により分離し、０〜７０％の溶媒Ｂの勾配で溶離し 、ここで溶媒ＡはＨｚＯ中の０．１％ＴＦＡであり、そしてＢは０．０８５％Ｔ ＦＡ／　８５％ＣＨｓＣＮ　／Ｈ，Ｏであった。５カラムの両分の中のペプチド を配列決定した。両分５０の配列はとくに有用であった。

表１ ジグアニレートシクラーゼのペプチドの配列ＨＰＬＣ画分５０　；　ＳＥＱ　９ ０４＊　ＬＥＤ　ＳＥＲＧＬＵ　ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＴＨＲＡＳＰ　ＴＨ ＲＬＥＵ１３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２＋　２２　２３ 　２４Ｔ）ＩＲＡＬＡ　ＬＥｔＪ　ＬＥＤ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＧＬＹ　 ＰＨＦ、ＡＳＮ　Ｔｌ（ＲＡＬＡＬＥｔＪ　ＳＥＲＡＬＡ　ＡＬＡ　ＬＥＬＩ　 ＧＬＹ　専　ネ　ネ　ＬＹＳ＊アミノ酸残基が同定されなかったことを示す。

■　ジグアニレートシクラーゼをクローニングするためのすリゴヌアミノ酸配列 の情報に基づいて、アミノ酸７〜１１　（ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＴＨＲＡＳＰ　ＴＨ Ｒ）およびアミノ酸１９〜２４　（ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　ＴＩＩＲＡＬＡ） に相当するオリゴヌクレオチドのプールが画分５０（実験９０４）から得られた 。オリゴヌクレオチドのプールを表２に記載する。

表２ ３′領域 オリゴヌクレオチドのプローブ 表２　（続き） ５′領域 オリゴヌクレオチドのプローブ オリゴヌクレオチドのプールの種々の組み合わせを、アセトノくフタ−（Ａｃｅ ｔｏｂｃｔｅｒ）　１３０６−３　ＤＮＡのＰＣＲ増幅におけるＰＣＲプライマ ーとして使用した。アミノ酸７と２４との間の距離は５３ヌクレオチドであるの で、特異的に結合するヌクレオチドを含有するプールはＰＣＲによる増幅のとき ５３ｂｐのＤＮＡ生産物を生産することが期待されるであろう。５３ｂｌｌの増 幅された配列はジグアニレートシクラーゼをコートする遺伝子について正確に合 致することか期待されるであろう。

ＰＣＲ増幅を３ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　ｌｏｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３，５０μ Ｍ　ＫＣｌ、　１００　μｇ１ｍｌゼラチン、２００μＭ　各ｄＮＴＰ、　５０ ０μＭプライマー（下流）、５０〜５００μＭ　プライマー（上流）、２単位の Ｔａｑポリメラーゼの中で５０μｌの体積で実施した。９３°Ｃにおいて鋳型を 加熱変性した後、反応混合物を３５°Ｃのアニーリングのために放冷した。次い て、温度をＤＮＡ合成のために６８°Ｃに３０秒間上昇させた。次いで、変性の ために温度を９３°Ｃに再び上昇させた。この反応サイクルを１５〜３０回反復 した。Ｃｅｌ　−２＋Ｃｅｌ　−５およびＣｅｌ　−２＋Ｃｅｌ　−８のプライ マーのプールの組み合わせは、ゲル電気泳動により可視化したとき、５３ｂｐの ＤＮＡのバンドを生成した。

主範囲の移動化可能なコスミドのｌ］ＫＴ２３０ｃＯ３ｓて構成した。コスミド のインサートの平均のサイズは約３０Ｋｂである。この遺伝子ノくンクは約２０ ００クローンを含有した。

５３ｂｐのＰＣＲ生成物を使用するコスミドのバンクのブロービングのためにハ イブリダイゼーションの条件 コスミトのバンクを次のようにしてプロービングした：はぼ２０００クローンか らのプラスミドＤＮＡを含有するニトロセルロースのフィルターを、まず、６　 Ｘ５ＳＣ，５Ｘデンノ）ルト　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、５０ｍＭ　ＮａＰＯ ＊　ｐＨ６，５，４０％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子Ｄ ＮＡを含有する溶液中で、４２°Ｃにおいて０．５時間前ノ＼イブリダイゼーン ヨンした。この溶液を、２０μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡのみを含有する同 様なハイブリダイゼーション溶液と置換した。５３ｂｐのプローブをガンマ３２ Ｐ　ＡＴＰて２．１６ｘ　ＩＯ’ｃｐｍ／ｐｍｏｌに末端標識化し、そして４． １７Ｘ　ｌｏ’ｃｐｍの沸騰したプローブを５０ｍ１のハイブリダイゼーシヨン 溶液に添加した。フィルターを６０°Ｃにおいて３時間インキュベーションした 。次いてフィルターを５　ｘｓｓｃ　＋０．１％ＳＤＳ溶液て室温において５分 間１回洗浄し、２　ｘＳＳＣ＋　０，１％ＳＤＳて６０°Ｃにおいて１０分間１ 回洗浄し、そしてＩ　Ｘ５ＳＣ＋　０．１％ＳＤＳで６０°Ｃにおいて、それぞ れ、１０および３０分間２回洗浄した。フィルターをコダック（Ｋｏｄａｋ”　 ）ＸＡＲフィルムに対して１時間露出し、そして陽性のクローンを記録した。コ スミドのクローンを５０μｇ／ｍｌでＳｔｒを含有するＲ２−４上にストリーキ ングした。３つの独特なコスミドのクラスが同定され、そしてコスミド６Ｃ５， ３Ｆ３、および＋５Ａ８と表示した。６Ｃ５はｃｄｇ２オペロンを含有し、３Ｆ ３はｃｄｇｌオペロンを含有し、そして１５Ａ８はｃｄｇ３オペロンを含有する 。

クローン３Ｆ３およびオーバーラッピング１２Ａ７をそれ以上の分析のために研 究した。３Ｆ３および１２Ａ７の制御分析はインサートがオーバーラツプするこ とを明らかにした；両者のクローンはＣｅ１−２１にハイブリダイゼーションし た１、　７Ｋｂおよび１．６ＫｂのＰｓｔｌ断片を含有した。また、クローン１ ５Ａ８および６Ｃ５が単離された。１５Ａ８は、Ｃｅｌ　−２１にハイブリダイ ゼーションする２、　３ＫｂのＰｓｔｌ断片を含有する。クローン６Ｃ５はＣｅ ｌ　−２１にハイブリダイゼーションする単一の２．６にｂのＰｓｔｌバントを 含有する。

種々のクローンをプライマーＣｅ１−１４およびＣｅ１−８、またはＣｅｌ　− ２およびＣｅｌ　−８でＰＣＲ増幅すると、クローン６Ｃ５のみをもつ５３ｂｐ の生産物を明らかにし、６Ｃ５がジグアニレートシクラーゼ遺伝子を含有するこ とを示し、この遺伝子は引き続いてｃｄｇ２遺伝子として同定された。引き続い て、このクローンはｄｇｃ２遺伝子のみを含有することが発見された。

ジグアニレートシクラーゼ遺伝子のクローニング完全のｄｇｃ２遺伝子および他 のｄｇｃ遺伝子をクローニングするために、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔ ｅｒ）　１３０６−３から調製した第２の遺伝子バンクをスクリーニングした。

遺伝子バンクを調製し、そして本質的にクローン６Ｃ５，３Ｆ３、および１５Ａ ８の単離について記載したようにスクリーニングした。Ｃｅ１−１８をハイブリ ダイゼーションブローフトシテ使用シタ。６つのクローン、５Ｃ１０，１３０１ ，１３Ｇ６．２２Ｄ６゜１６Ｇ３および２１Ｂ４が単離された。Ｐｓｔｌおよび Ｈｉｎｃｌｌの制限消化は、Ｔｌ６Ｇ３および７２１８４が互いに類似し、残り の４つのクローンはまた互いに類似するが、他の２つのクローンではないことを 示す。

ＰＣＲ増幅を使用して、ジグアニレートシクラーゼ遺伝子の存在を確証した。Ｐ ＣＲはＣｅ１−１５を５′プライマーとして、そしてＣｅｌ　−８を３′プライ マーとして、節ｒｌｌに記載する条件下に使用して実施した。５Ｃ１０および＋ ３ＤＩは完全なジグアニレートシクラーゼ遺伝子を含有した。

■、ジグアニレートホスホジエステラーゼへのジグアニレートホスホジエステラ ーゼ遺伝子のＮ−末端のアミノ酸配列のクローニングアセトバクター（Ａｃｅｔ ｏｂｃｔｅｒ）　１３０６−２１を精製のために使用した。

成長条件および培地は、「種母培養」について節Ｘｌ＋においてに記載する通り である。

約９ｇの細胞（乾燥重量）を遠心し、そしてＴＭＥ　（５０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１＊、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、次いで 細胞を同一緩衝液＋２０％ポリエチレングリコールの中に懸濁させ、そしてフレ ンチプレスで破壊した。崩壊した細胞を遠心し、そして第２洗浄の上澄み液を２ ｍｌのＧＴＰ−アガロースカラム上に負荷した。第１洗浄の上澄み液は、有意な 量のバンド１ｂタンパク質の存在のために、廃棄した。このカラムを５０ｍ１の ＴＭＥおよび３０ｍ　ｌのＩ　ｍＭ　ＡＴＰ、　２０ｍ１の１ｍＭＣＴＰ　、お よび２０ｍ１のＩ　ｍＭ　５’　ＧＭＰ　、各々ＴＭＥ中、で洗浄し、次いで３ ０ｍ１のＴＭＥで洗浄した。ジグアニレートシクラーゼを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　 ｐＨ？、５．１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２００ｍＭ　Ｋ ＣＩで溶離した。９ｍｌのＴＭＥで洗浄した後、ＰＤＥＡを１５ｍ１のＴＭＥ中 の２ｍＭＧＴＰで溶離した。５ＤＳＰＡＧεはＰＤＥＡの大部分が２〜７ｍｌの 間で溶出することを示した。これいてデザインした。表３は合成したオリゴヌク レオチドのプローブらの５ｍｌをプールし、そしてアミコン・セントリコン（Ａ ｍｉｃｏｎＣｅｎｔｏｒｉｃｏｎ）　１０濃縮装置で０．５ｍｌに濃縮した。タ ンパク質は５ＤＳＰＡＧＥ上でＢＳＡに関してほぼ９μｇであると推定された。

この試料をスピード・バク（Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）の中でｌＯμｌに乾燥し、Ｓ ＤＳ　ＰＡＧＥにかけ、そしてＰＶＤＦ膜に移した。ＰＤＥＡバンドの上部およ び下部の半分を切り出し、そして別々にＮ−末端のアミノ酸の配列決定にかけた 。

最終の精製は、ＰＤＥＡが他のタンパク質よりも細胞膜にいっそう緊密に結合し 、より少ない量の汚染タンパク質を含有する出発調製物を可能とするという観察 を利用した。追加の分離はカラムをまず２０ｍＭ　ＫＣＩで溶離することによっ て得られ、これはまた有意な量のバンドＩｂのタンパク質を除去した。さらに、 転移されたタンパク質のバンドを半分に分割すると、最終の配列へのバンドＩｂ のタンパク質の寄与を除去することが促進された。バンドＩｂは５Ｏ３−ＰＡＧ Ｅ上でＰＤＥＡのちょうど下に移動し、こうしてＰＤＥＡバンドの下部とオーバ ーラツプことかあった。このオーバーラツプは下部の半分からの配列の中の汚染 する初期のＭｅｔの存在において見ることができ、これは上部の半分の中に存在 しない。３つの変更の各々はタンパク質の回収を有意に減少した。

アプライド・バイオシステムス・インコーホレーテッド（Ａｐｌ）ｌｉｅｄＢｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）の４７０Ａ型配列決定装置を使用して、バンド Ｉａのタンパク質のＮＨ，−未満のアミノ酸配列を決定した。ＮＨｌ−末端の配 列は、次の通りであると決定された：ＮＨ３−−−Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒ。

Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　−Ｃｏｏｌホスホジェステラーゼへ のクローニングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブを、精製 したホスホジェステラーゼの最初の５アミノ末端のアミノ酸に基づドツトプロッ トを調製した。ＤＮＡをエタノール沈澱させ、そして８５のプールの要約である 。

表３ オリゴヌクレオチドのプールＣｅｌ−１１７〜Ｃｅｌ　−１２０（各々は２４配 列を含有する）は、アラニンの最初の４アミノ酸および最初の２塩基についての すへての可能なコドンの組み合わせを表す。オリゴヌクレオチドのプールＣｅｌ −１２１およびＣｅｌ−１２２をまたＮ−末端のアミノ酸配列に基づいてデザイ ンしたが、第３コドンの位置をＣｅｌ　−１２１においてＧおよびＣに、モして Ｃｅｌ−１２２においてＡおよびＴの限定した。

プールを”Ｐ−ＡＴＰでほぼｌ　Ｘ　ｌｏ’ｃｐｍ／　ｐｍｏｌにキナーゼ化し た。キナーゼ化プローブのプールを使用して、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃ ｔｅｒ）＋３０６−３の染色体のＤＮＡのドツトプロットに対してハイブリダイ ゼーションした。

１００μｇの１３０６−３染色体ＤＮＡをＰｓｔｌで消化することによって、ｕ ｌのｌｏＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４，１５μｆｆｉの２Ｎ　ＮａＵＨ＆よひ ５０岨の２０ＸＳＳＣを含有する溶液の中に再懸濁させた。ＤＮＡを８０°Ｃに おいて１０分間インキュベーションし、２０μｌの２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，４ を添加した。１０μｌｌＴ’＋ｈｋｅ−Ｌｒ−＋Ｊ−ｐｌ＋、Ｍ’７／７’ｔｍ ７＋１７アー１−ｒ−７７Ｍ、、＋；；；７”ノノフ′シナー２倍の系統的希釈 を行い、そしてフィルター上にスポツティングした：こうして、５．８８．２． ９．１．４７および０．０７ＭｇのＤＮＡをスポツティングした。５つのＤＮＡ 試料の各々を６回スポツティングした。フィルターを引き続いて真空下に８０℃ において１時間ベーキングした。

フィルターをストリップ、１列／ストリップに切断した。各ストリップを別々に 単一のオリゴヌクレオチドのプールでブロービングした。ｌＸｌ０”計数／ｍｌ のハイブリダイゼーション溶液を添加し、ハイブリダイゼーションを４０°Ｃに おいて一夜進行させた。フィルターを引き続いて各５０ｍ１の５　ｘＳＳＣ＋　 ０，１％ＳＤＳで室温において１０分間、２　Ｘ５ＳＣ＋　０．１％ＳＤＳで４ ０°Ｃにおいて１５分間、そして１Ｘｓｓｃ＋０、】％ＳＤＳで４０％において １５分間洗浄した。オートラジオグラフィーは、Ｃｅｌ−１２１が最も強くハイ ブリダイゼーションするのが、Ｃｅｌ−１１９は多少いっそう弱くハイブリダイ ゼーションすることを明らかにした。プールＣｅｌ−１１８およびＣｅｌ−１２ ０は極端に弱くハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションの情報に 基づいて、サブプールＣｅｌ−１２１に基づいてデザインし、そしてサブブール Ｃｅｌ−１２３〜Ｃｅｌ−１２８をＣｅｌ−１１９に基づいてデザインした。

サブプールを本質的に上のようにドツトプロットのためのハイブリダイゼーショ ンプローブとして使用した。Ｃｅｌ−１２１およびＣｅｌ　−１２３は最も強く ハイブリダイゼーションするように思われた。

米国特許出願第０７／６８９．００８号、１９９１年４月２２日提出に記載され ているベクターＰＬＩＣ１８−８２４の中に挿入されたアセトバクタ−（Ａｃｅ ｔｏｂｃｔｅｒ）　１３０６−３のゲノムのＤＮＡから調製した他の遺伝子バン クを、ｄｇｃ遺伝子についてハイブリダイゼーションのブロービングを実施した のと本質的に同一の方法で、標識化Ｃｅｌ−１２１およびＣｅｌ−１２３の組み 合わせたプローブでブロービングした。はぼ５０００使用して、レプリカをプレ ートしたニトロセルロースのフィルターに対してハイブリダイゼーションするこ とによってクローニングした。フィルターを”Ｐ−ＡＴＰ標識化Ｃｅｌ−１２１ およびＣｅｌ−１２３てブロービングした。プローブを５　Ｘ　ＩＯ’ｃｐｍ／ 　ｐｍｏｌＯ比活性レベルにキナーゼ化することによって標識化した。各プロー ブのｌ　Ｘ　ＩＯ＠ｃｐｍ／ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を添加し、そし てドツトプロットハイブリダイゼーションを実施したのと本質的に同一の方法で 、ハイブリダイゼーション／洗浄を実施した。６つの強くハイブリダイゼーショ ンする独立のクローンが単離された。６つのクローンの制限マツピングはすへて か姉妹細胞であることを明らかにした。１つのクローンのＰＤＥＡ−７Ａをそれ 以上の分析のために選択した。

サザンプロット分析は、Ｃｅｌ−１２１がＰＤＥＡ−７Ａの０．８ｋｂのＰＳｔ ＋断片にハイブリダイゼーションするが、他のＰｓｔｌ断片にハイブリダイゼー ションしないこと明らかにした。Ｐｓｔｌ断片を引き続いてサブクローニングし そして配列決定した。

コスミトのクローンｐＫＴ２３０ｃｓｏ５−３Ｆ３上に存在するＰＤＥＡ遺伝子 ｌ５ＰＤＥＡ−７Ａ上のｐｄｅＡのヌクレオチド配列の決定は、ＰＤＥＡをコー ドする遺伝子、すなわち、ｐｄｅＡｌがｄｇｃｌのクローニングの間に単離され たコスミトのクローンである３Ｆ３上に存在すること明らかにした。

他の相同性の遺伝子か株１３０６−３の中に存在するかどうかを決定するために 、株１３０６−３から単離された染色体のＤＮＡについてサザンプロット分析を 実施した。ＤＮＡの２μｇのアリコートを種々の制限酵素で消化し、１％アガロ ースゲルの電気泳動により分離し、ナイロンジーンスクリー（ＧｅｎｅＳｃｒｅ ｅｎ’　）膜にエレクトロブロッティングし、そして放射線標識化ＰＤＥＡ−７ ＡのＰＤＥＡ遺伝子を含有する３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片てブロービングした。標 識化ヌクレオチドとして”Ｐ　ｃＣＴＰを使用して、２００μｇのＤＮＡ断片を ７４ＤＮＡポリメラーゼで標識化した。次いでＩ　ｘｌＯ＠ｃｐｍ／ｍｌにおい て本質的にジーンスクリ−（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ’　）ノ製造業者の条件下に プローブを使用したが、ただし４０９６のホルムアミドを使用し、そしてハイブ リダイゼーション温度は４０°Ｃてあった。これらの条件は、ｐｄｅＡｌに対し て多少相同的であるゲノムの中の配列の検出を可能とした。サザンプロットの耐 性は、ゲノムの中で少なくとも３および６〜７程度に多い相同的配列が存在する ことを示唆する。

Ｖｌ、　ｐｄｅＡｌ遺伝子の崩壊 ｃｄｇｌオペロンはコスミト３Ｆ３上に位置する。このコスミトを制限分析によ り、次いてサザンプロット分析によりマツピングした。普通の制限部位を利用し て、挿入不活性化によりｄｇｃｌおよびｐｄｅＡｌを崩壊した。

３Ｆ３の４．２ＫｂのＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＡｃＹｃ１８４のＥｃｏ Ｒ１部位の中にサブクローニングした。クロランフェニコール（Ｃａｍ）感受性 クローンを単離し、そしてＤＮＡをこのクローンから調製した。このプラスミド ＤＮＡをＥｃｏＲＶでで部分的に消化し、そして線状化されたＤＮＡを、その粘 着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで修復した後、ｐＢＲ３２２から単離されたβ −ラクタマーゼ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＡＩｗＮＩ断片に結合した。アン ピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）の両者に対して耐性のク ローンを同定し、ここてβ−ラクタマーゼ遺伝子をヌクレオチド１８５５および １８７３　（配列識別番号＝１）に位置する蒸発部位の間に挿入して、Ｎ−末端 からほぼ半分のところて遺伝子の崩壊を引き起こした。生ずるプラスミドをＢａ ｍ１ｌｌて線状化し、そしてこのＤＮＡを使用してエレクトロボレイションによ り株＋３０６−３および＋３０６−２１を形質転換した。生ずる形質転換体をＰ ２Ｏ−２＋１００μｇ／ｍｌのＡｍｐプレートから単離した。この形質転換体を １３０６−２］　：　Ｄｉｓｌ　と表示した。すへての１３０６−２１形質転換 体は均一にＣｅｌ”であった。分離物をＲ２０−２＋　１００μｇ／ｍｌのＡｍ ｐの中で成長させ、そしてそれらの染色体のＤＮＡを精製した。このＤＮＡをＰ ｓｊｌまたはＨｉｎｃｌｌ＋Ｂｇｌｌｌて消化し、そしてＤＮＡをサザンプロッ トにより分析した。３μｇの消化したＤＮＡをアガロースゲル上の分割し、セー タープローブ（Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ’　）フィルター（バイオラド）上にプロ ットし、そして製造業者のインストラクションに従いｐｄｅＡｌ遺伝子を含有す る４、　ＯＫｂのＥｃｏＲＩ断片でブロービングした。これらの結果か示唆する ように、株＋３０６−２１　：　ＤｉｓｌはｐｄｅＡ＋遺伝子の中で期待するよ うに崩壊された。期待したｐｄｅＡｌ制限断片へのハイブリダイゼーシヨンに加 えて、ｐｄｅＡｌプローブをまた他のホスホジェステラーゼ遺伝子、例えば、ｐ ｄｅＡ２にハイブリダイゼーションさせた。

セルロースシンターゼ、ジグアニレートホスホジエステラーゼＡ、およびジグア ニレートシクラーゼのアッセイを突然変異体について実施した。（結果について は表５〜６を参照のこと）。これらの結果か示唆するように、ｐｄｅＡＩの崩壊 はこれらの組み換え株においてホスホジェステラーゼおよびジグアニレートシク ラーゼの両者の作用を８０〜９００６減少した。また、これらの結果が示唆する ように、ｐｄｅＡＩ遺伝子の崩壊はｄｃｇｌ遺伝子の発現に対して極性の作用を 有する。これらの株のセルロースの生産は３０〜４０％だけ減少した。

３Ｆ３上のＥｃｏＲＶ部位の間にａｍｐ遺伝子を挿入することによってｐｄｅＡ Ｉ遺伝子を崩壊する、前述の遺伝子の崩壊に加えて、広い範囲のプラスミドｐＫ Ｔ２３０から単離したｓｔｒ遺伝子を挿入することによって、同様な崩壊した突 然変異体を構成した。この抗生物質耐性遺伝子を含有する断片を、Ｈｉｎｄｌｌ ｌおよびＢａｍＨＩを使用する消化により、プラスミドｐＮＶＩ６から単離した 。断片の末端を７４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰで修復した後、断片をｐ ｄｃａｌの中に位置する２つのＥｃｏＲＶ部位の間に結合した。次いて、崩壊し た遺伝子を株＋３０６−２１および１３０６−３の中に前述の遺伝子の置換法に より導入した。これらの形質転換体を、それぞれ、＋３０６−２１　：　ＡＢＴ ３および１３０６−３・ＡＢＴ３と表ジグアニレートシクラーゼ遺伝子ｄｇｃ２ を、ＥｃｏＲＶ部位の中にβ−ラクタマーゼ遺伝子を挿入することによって崩壊 した。崩壊した遺伝子をもつ不活性化性遺伝子構成体を、エレクトロボレイショ ンによりアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）　１３０６−２１の中に導入 した。アンピシリン耐性株のサザンプロット分析は、内因性の完全なｄｇｃ２遺 伝子か崩壊した遺伝子で置換されたことを確証した。これらの株はＣｅｌ’表現 型をプレート上に保持した。ウェスタンプロット分析は、これらの株がバント（ Ｖを欠如することを示した。

不活性化性遺伝子構成体は、次のようにして、崩壊したジグアニレートンクラー ゼ遺伝子ｄｇｃ２をｐＡｃＹｃＩ８４の中に挿入することによって作った。ｄｇ Ｃ２遺伝子をプラスミド＋１１５３１−１からＨｉｎｄｌｒｌ−ＢａｍＨＩ断片 として単離し、そしてプラスミドｐＡＣＹＣＩ８４のＥｃｏＲＶ部位の中にクロ ーニングした。ｐＡＣＹＣＩ８４はアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）の 中に複製することかできず、そしてスイサイドベクターとして働く。

β−ラクタマーゼ遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２からεｃｏＲＩ−Ａ１ｗＮＩ 断片として単離した。この断片をクレノーで修復し、そしてスイサイドプラスミ ドの中のｄｇｃ２遺伝子のＥｃｏＲＶ部位の中にクローニングした。

ＥｃｏＲＶ部位はシクラーゼ遺伝子のコーディング領域の中央付近に位置する。

β−ラクタマーゼ遺伝子がｄｇｃ２遺伝子に関していずれかの方向に向いている プラスミド、すなわち、不活性化性遺伝子構成体が得られた。それらをＴＲＴ１ ４６−２およびＴＲＴｌ４６−４と表示した。β−ラクタマーゼ遺伝子は、ＴＲ Ｔ１４６−４の中てクロランフェニコール耐性遺伝子と同一の転写の向きにある 。

ＩＯμｇの各プラスミドをＥｃｏＲＩて消化し、そしてセントリコン回転管の中 でＲ２０で洗浄した。さらに、ｌｏｌｌｇの各々の未切断のＤＮＡを洗浄した。

これらのＤＮＡを使用して、エレクトロボレイションにより１３０６−２１の約 １ｏｌＧの細胞を形質転換した。形質転換の混合物を１ｍｌのＲ２０−２の中で ３０°Ｃにおいて１時間成長させ、そして５０μｇのＡｍｐを含有するＲ２０− ２プレート上でプレートした。これらのプレートを３０°Ｃにおいて５日間イン キュベーションし、そして記録した。

各形質転換からの単一のコロニーを取り上げ、そして５０μｇのアンピシリンを 含有するＲ２０−２プレート上にストリーキングした。

プラスミドＴＲＴ１４６−２およびＴＲＴ１４６−４を含有する株を、それぞれ 、１３０６−２１　：　ＴＲＴｌ５０−１および＋３０６−２１　：　ＴＲＴ１ ５１−１と表示した。

染色体のＤＮＡをこれらの分離物から調製した。４つの形質転換体および野生型 株＋３０６−２１からの染色体のＤＮＡをＨｉｎｃｌ　ＩまたはＨｉｎｄｌｌｌ ＋Ｓｍａｌで消化した。サザンプロット分析を標準の手順に従い実施した。２つ の同一のパネルをｄｇｃ２特異的プローブ、ＣＥＬ３０　、またはβ−ラクタマ ーゼ特異的プローブ、ＡＰＩ０８でブロービングした。

すべての４つの形質転換体は、完全な遺伝子の代わりに崩壊した遺伝子を含有し た。完全なプラスミドを使用したとき、遺伝子の重複は起こらず、遺伝子の置換 が２つの組み換え工程において起こったに違いないことを示唆した。

■、　ｄｇｃｌの崩壊 ｄｇｃｌのための不活性化性遺伝子構成体を生産するために、コスミド３Ｆ３か らの３．５Ｋｇの断片を１ｌＡｃＹｃ＋８４のｔｅｔ耐性遺伝子の中のＥｃｏＲ Ｖの中にクローニングした。ｔｅｔ感受性大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）分離物をス クリーニングし、そしてインサートを含有するプラスミドを調製し、そしてＮｒ ｕ　Ｉでて部分的に消化した（独特Ｎｒｕ　Ｉ制限部位はｄｇｃｔの５′末端に 非常に近接して存在する）。線状化された全長のプラスミドＤＮＡを、ｐＢＲ３ ２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する平滑末端の断片に結合した。ａｍａｐ およびｃａｍ（クロランフェニコール）に対して耐性であるコロニーを分析し、 モしてｄｇｃｌの中のＮｒｕ１部位の中にいずれらの向きで中断するａｍｐ遺伝 子を含有する２つのプラスミドが同定された。各プラスミドをＢａｍＨｌによる 消化で線状化し、そして株１３０６−２１および１３０６−３の形質転換に使用 した。すべての形質転換体の表現型は均一にＣｅｌ’であった。反対の向きで挿 入されたβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する２つの独立の分離物をＲ２０−２＋ １００μｇ／ｍｌのＡｍｐの中て成長させた。これらの組み換え株を１５０ｍ１ のＲ７０−２＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの中に成長させ、そして染色体 のＤＮＡを調製した。次いでこれらの株を単離し、そしてＰｓｔｌまたは５ｔｕ ｌで消化し、そしてゲル上で展開した。これらの株をＤｉｓ４突然変異株と命名 した。

得られたアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）組み換え株がＣ６ｇ２オペロ ンの中のｄｇｃｌにおける遺伝子の置換の事象から生じたことを確認するために 、ゲノムのサザンプロット分析を実施した。染色体のＤＮＡを調製し、そしてプ ローブを５５°Ｃにおいてハイブリダイゼーションさせた以外、本質的に前述し たように分析した。結果はｄｇｃｌが崩壊するが、ｄｇｃ２は崩壊しないことを 示す。

組み換え株からのＤＮＡをｄｇｃ２特異的プローブでブロービングして、崩壊し たコピーが高度に相同的なｃｄｇ２位置の中に組み換えられないことを確認した 。ｄｇｃ２開始ＡＴＧの前に操作された旧ｎｄ［１部位を含有する、ＡＴＧ、ヌ クレオチド２４６５において開始しそしてヌクレオチド４５５５に延長するｄｇ ｃ２を含有する２０９０ｂｐのＨｉｎｄｌｌ［−Ｈ１ｎｃｌｌ断片［配列番号＝ ２］を調製することによって、プラスミド１ｌＴＲＴ９３−３からｄｇｃ２プロ ーブを単離した。このプローブを７４ＤＮＡポリメラーゼで０’　Ｆａｒｒｅｌ 、　Ｐ、　（＋９８１）　Ｆｏｃｕｓ　３　（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）、マリ イランド州）に記載されているように標識化し、そして５５℃においてハイブリ ダイゼーションした。株Ｄｉｓ４および組み換え株ＴＲＴｌ５０−１　（ｄｇｃ ２において崩壊されそして結局ウェスタン分析により決定して５７ＫｄのＤＧＣ ２ペプチドを欠如する）を、比較の目的で、ゲノムのサザンプロット分析にかけ た。結果が示唆するように、中断したｄｇｃｌコピーはｄｇｃ２位置の中に組み 換えられなかった。

別のサザンプロット分析において、染色体のＤＮＡを規定されたゼー９−−−ｊ ロー７−　（Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ”　）より低いストリンジェントのハイブリ ダイゼーション条件下に、すなわち、５０°Ｃにおいて、同一のｄｇｃ２プロー ブでブロービングした。このゲノムのサザン分析において、ｄｇｃ２プローブは Ｃ６ｇ２オペロンの中のｄｇｃ２にハイブリダイゼーションしたばかりでなく、 かつまたｃｄｇｌオペロンの中のｄｇｃｌにハイブリダイゼーションした。プロ ーブがハイブリダイゼーションした断片は、ｃｄｇｌおよびｃｄｇ２オペロンの 制限地図と一致する。

ｃｄｇ２オペロンを不活性化するために、コスミド６Ｃ５からの５．６ＫｂのＨ ｉｎｄｌｌｌ−Ｓｍａ［断片を含有する、プラスミドｐＲＴ９３−４から、ｐｄ ｅＡ２およびｄｇｃｌをスパンする１、　５ＫｂのＰｓｔｌ断片を欠失させた。

生ずる断片をｐＡｃＹｃ１８４の中の旧ｎｄｌｌＩおよびＥｃｏＲＶ部位の間に 導入した。テトラサイクリン感受性クローンを同定し、そしてＤＮＡを大腸菌（ Ｅ。

９貝）の中で調製した。プラスミドＤＮＡをＰｓｔｌで線状化し、末端を修復し 、そしてａｍｐ耐性遺伝子を含有する断片を結合した。ａｍｐ耐性クローンを単 離し、そしてプラスミドＤＮＡを調製し、ＢａｍＨで線状化し、そして株１３０ ６−３および＋３０６−２１の中に導入し、そしてまたｓｔｒ崩壊ｃｄｇｌを含 有する株、すなわち、ＡＢ７３株の中に導入した（節Ｖｌを参照のこと’）　、 　Ｒ２０−２＋　１００／μｇ　Ａｍｐ上でプレートすることによって形質転換 体を調製し、そしてこれらの二重突然変異株のＳｔｒ　コロ＝−は表現型的にＣ ｅｌ”−であった。ｐｄｅＡｌ、　ｌ１ｄｅＡ２、およびｄｇｃ２の中に崩壊を 含有する二重オペロンの突然変異株をＡＢＴＩと表示した。ｃｄｇ２の欠失およ び遺伝子の崩壊のみを含有する株は表現型的にＣｅｌ”であった。ｐｄｅＡ２お よびｄｇｃ２遺伝子の中にのみ崩壊を含有するこれらの株をＡＢ７２株と呼んだ 。

二重オペロンの突然変異株の構成 ｃｄｇ２を含有するコスミド６Ｃ５からの５．６ＫｂのＳｍａｉｆ（ｉｎｄｌｌ ｌ断片をゲル電気泳動により精製し、そしてプラスミドｐＡｃＹｃ１８４からの 精製したＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＶ断片に結合した。この結合混合物を使用し て大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＭＭ２９４を形質転換した。細胞を４μｇ／ｍｌ のＣｍを含有するＲ２−４プレート上にプレートした。Ｃａｍ耐性かつＴｅｔ感 受性であり、断片のＤＮＡを含有するクローンが同定された。１つのこのような りローンから調製したプラスミドＤＮＡを、ｐｄｅＡ２遺伝子内に位置するＢｇ ｌ１１部位において線状化した。末端を７４ＤＮＡポリメラーゼで修復した。こ の９．８Ｋｂの断片のほぼ４００ｎｇを、はぼ４００ｎｇの前述の１．５Ｋｂの ＥｃｏＲＩ−Ａ１ｗＮＩ修復β−ラクタマーゼ遺伝子に結合した。この結合混合 物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＭＭ２９４を形質転換した：　Ａｍｐ およびＣｍ耐性コロニーを単離した。１つのこのようなコロニーのミニーブレブ ＤＮＡを制限消化により分析して、ｐｄｅＡ２のコーディング領域におけるａｍ ｐ遺伝子の挿入を確証した。ミニーレブＤＮＡの残部（２〜５μｇ）をＢａ、ｍ ＨＩで線状化し、そして株１３０６−３、１３０６−２１．１３０６−３　：　 ＡＢＴ３および＋３０６−２１　＋　ＡＢＴ３の形質転換のために使用した。Ａ ＢＴ３突然変異株は、ｐｄｅＡ２のＢｇｌ＋１部位の中に導入されたＳｔｒ”遺 伝子を含有する。生ずる突然変異株／形質転換体を、それぞれ、１３０６−３　 ：　ＡＢＴ９、！３０６−２１ＡＢＴ９．１３０６−３ＡＢＴ１１および１３０ ６−２１：　ＡＢＴＩ＋と表示した。表現型的にＡＢＴ　９の突然変異株はＣｅ ｌ’であるか、ＡＢＴ１１二重突然変異株はＣｅｌ”−であった。

ａｍｐ遺伝子かｃｄｇ１オペロンの中のｃｄｇｌＡ遺伝子の上流のＳｍａ　１部 位の間に挿入された株を、また、作った。この構成体はｃｄｇｌオペロンのプロ モーターの崩壊を引き起こした。この株を１３０６−２１　：　ＡＢＴ８と表示 した。その表現型はＲ２０−２プレ一ト＋５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ上でｐｄｅＡ Ｉか不活性化された突然変異株の中てｄｇｃｌを過剰の発現する試みを行った。

ＰＤＥＡ活性の１５％のみが突然変異株１３０６−２１　：　Ｄｉｓｌの中に残 留する（表４を参照のこと）。

この突然変異株の中のｄｇｃｌの過剰の発現かセルロースの生産に陽性の作用を 有するかどうかを試験するために、実験を実施した。

ｄｇｃｌの過剰生産を実施するために、シャトルベクターのｐＵＣ１９−８２４ ：　ｄｇｃｌを構成した。ｃｄｇ１オペロンを含有するコスミド３Ｆ３から、３ 、５Ｋｂの５ｔｕｌ断片を単離した。５ｔｕｌ断片はほぼ３５０ｂｐのｐｄｅＡ ｌの３′末端および全体のｄｇｃｌ遺伝子を含有する。５ｔｕｌ断片をシャトル ベクターｐｔｌｃ＋９−８２４のＳｍａ１部位の中に結合した。この結合混合物 を使用して、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＤＧＩＯＩ株を形質転換した。形質転 換混合物を、ニトロセルロースのフィルター上のＲ２−４＋５０μｇ／ｍｌのＡ ｍｐｍ−プレート上レートした。コロニーをｄｇｃｌ特異的プローブＧＥ４０４ （５’　−ＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＧＧＧＡＴＡＧ−３’　）でブロービングし た。いくつかの陽性のクローンが単離された。一方がｌａｃプロモーターから下 流にｄｇｃｌ遺伝子を含有しそして他方が反対の向きである２つのクローンを、 それぞれ、ｐＵｃ１９−８２４　：　ｄｇｓ＃　８および＃１１と表示した。こ れらの株におけるジグアニレートシクラーゼ活性は、１３０６−２１において約 １０９６のレベルで構成的に発現された。クローンからのミニーブレブＤＮＡを 使用して、次の株を形質転換した：　１３０６−３　。

１３０６−２１．１３０６−３　：　ＡＢＴ３および１３０６−２１　：　ＡＢ Ｔ３゜これらの株を、それぞれ、１３０６−３・　ＡＢＴＩｏ、　１３０６−２ １　：　ＡＢＴＩＯＰ　１３０６−３　＋　ＡＢＴ６および１３０６−２１　： 　ＡＢＴ６／　Ｌ　ｌおよび＋３０６−２１　：　ＡＢＴ６／Ｓ　１と表示した 。１３０６−２１　：　ＡＢＴ３形質転換体は２つのコロニーの表現型を有し、 アンピシリン３０００の１３０６−２１　：　ＡＢＴ３形質転換体の大きい（Ｌ ｌ）および小さい（Ｓｌ）、１０は大きいコロニーの表現型を有した）そして残 部は小さいコロニーの表現型を有した。酵素のアッセイ（表５参照）が示すよう に、１３０６−２１：　ＡＢＴＩＯにおけるＤＧＣ活性のレベル表４はｃｄｇｌ およびｃｄｇ２のオペロンの中に崩壊をもつ組み換えアセトバクター（Ａｃｅｔ ｏｂｃｔｅｒ）株の要約である。表５は野生型のレベルの百分率で与えた突然変 異株におけるＰＤＥＡおよびＤＧＣの活性の要約である。表５の最後の欄は、突 然変異株１３０６−２１　：　Ｄｉｓｌにおける阻害に関するセルロースシンタ ーゼの活性を阻害する各組み換え株の能力を示す。

結果か示すように、ＣｄｇｌオペロンはＰＩ）ＨＡおよびＤＧＣの活性の約８５ ０６をコードし、そしてｃｄｇ２オペロンはＰＤＥＡおよびＤＧＣの活性の５〜 １５％をコートする。ｃｄｇ３オペロンは残部の活性を多分コートする（１〜５ ９６）。なぜなら、ｃｄｇｌおよびｃｄｇ２のオペロンの不活性化はＰＤＥＡお よびＤＧＣの活性の１〜５％を生ずるからである。ｐＵＣＩ９−８２４プラスミ ド上のｄｇｃｌ遺伝子の余分のコピーは、親株１３０６−２１と比較して、約４ 倍だけＤＧＣ活性を増加する。

表４ 崩壊したｃｄｇオペロンをもつ組み換え株の要約株　突然変異株　マーカー　挿 入部位 味の要約 株　変更　シンセターゼ　ｐｄｅＡ　ｄｇｃ　Ｄｉｓｌのの活性　阻害 １３０６−２１　なし　１００９６１００％　＋００９６９０％Ｄｉｓｌ　ｐｄ ｅＡＩ　７０９６　１５９６ｉ　１２％　ＮＡＤｉｓ４　°ゝ　ｄｇｃｌ　８３ ！％　６５％°　１２％”　５５９６゜ＴＲＴ１５０　ｄｇｃ２　９５９＋５　 ９２％　９５％　９５％八ＢへＩ、ｐｄｅＡ］、　７６９６　５％　１％　０Ａ ＢＴ３　ｐｄｅＡＩ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＡＢＴ６／Ｓｌ　〃ＮＴ　ＮＴ　 ＮＴ　ＮＴＡＢＴ８　ｃｄｇｌＡの上流　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＡＢＴ９　ｐ ｄｅＡ２　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＡＢＴ２０　ｄｇｃ２　１００９６　１２５ 　１０９　１０５ＢＩ８０−１２　２５％　４７％　９％　５２％Ｃ９０−１４ ２４％　１５％　５％　０ＮＡ＝適用不可能 ＮＴ−試験せず。

＊＝２つの独立の分離物、Ｄｉｓｌ＝Ｄｉｓ２およびＤｉｓ４＝　Ｄｉｓ７の平 均。

ＸＩｌ、ｐｄｅＡ突然変異株の中のセルロースの生産アセトバクター（Ａｃｅｔ ｏｂｃｔｅｒ）の組み換え株を、セルロースの生産レベルの変更について試験し た。セルロースシンターゼのオペロンに操作可能に連鎖したＰＬプロモーターを もつ株の構成は、米国特許出願第０７／６８９．００８号、１９９１年４月２２ 日提出に報告されている。

アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）からセルロースを得る方法についての 詳細は、米国特許第４．９２９．５５０号および米国特許出願第０７／６０４． ５８７号、１９９０年ｌθ月２６日提出の中に見いだすことができる。

これらの株のセルロースの生産は、フロキサン（Ｆｌｏｘａｎ）　ＥＡ−１３４ ０をもつフラスコの中で測定した。フラスコを低い攪拌でインキュベーションし て、セルロースの生産のために最適な条件をつくった。

すべての種母培養物をＲ７０−３培地＋０．５％（ｗ／　ｖ　）　ＴＹＥ、　２ ５ｍＭＤＭＧおよび０．１％（ｖ　／　ｖ　）セルラーゼ（１，２，３シクラー ゼ・シーンコル（Ｇｃｎｅｎｃｏｒ））の中で成長させた。１３０６−２１種子 培養物は３％（ｗ　／　ｖ　）グルコースを有したが、＋３０６　３培養物は３ ％（Ｗ／　Ｖ　）フルクトースの中て成長させた。組み換え株は１００μｇ／ｍ ｌのＡｍｐの中で成長させた。１３０６−３組み換え株のいくつかは、比較的小 さいまたは大きいコロニーから本来単離された。これらの異なる分離物を、それ ぞれ、［小さい」または「大きい」の表示を有する。

この実験のための試験培地は、Ｒ７０−３＋１　ｇ／ｌのフロキサンＥＡ−１３ ４０，２％（ｖ／ｖ）　ε８１０Ａ　）ウモロコシ浸出液（Ｃ３Ｉ、）　（）ウ モロコシ浸出液、コーン・プロダクツ・インコーホレーテッド（Ｃｏｒｎ　Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓ　ｉｎｃ、）　、イリノイ州アンゴ）および２５ｍＭ　ＤＭＧであ った。すべての１３０６−２１株は１０ｇ／ｊ’のグルコースの中で成長させた が、すべての１３０６−３株はＩＯｇ／ｌのフルクトースの中で成長させた。す べての組み換え株は１００μｇ／ｍｌのＡｍｐの存在下に成長させた。

実験は１２５ｍ１のバッフルドフラスコ（２５ｍｌの培地／フラスコ）であった 。種子フラスコを３０°Ｃ，１２５ｒｐｍにおいて一夜インキユベーションし、 次いで各フラスコの中の細胞の塊をＯＤｓ、。の測定により決定した。１３０６ −２１試験フラスコに５％（Ｖ　／　Ｖ　）接種物を入れ、そして試験フラスコ の残部に３．５％〜９％の接種物を入れ、こうしてフラスコのすべてが時間０に おいて同一の細胞の塊を有するようにした。試験フラスコを３０°Ｃ，１２５ｒ ｐｍにおいて３日間インキュベーションし、次いてセルロースおよび細胞の塊を 標準の手順により決定した。

１３０６−２１および１３０６−３の培養の結果を表６および７に記載する。

培養物のすべては５．６〜５．９の最終ｐｌ（を有した。これらの高いｐＨ値は 、前のグルコース限定フラスコの実験において観測されなかった。

しかしながら、この実施例はε８０１Ａ　Ｃ３Ｌを使用し、そしてε８０１Ａ　 ＣＳＬ培地は比較的高いレベルの乳酸を有する。高いｐＨは細胞が大量の乳酸を 消費する結果である可能性が最も強い。

表６が示すように、ｐＡＢＣＤまたはＰＬを含有する１３０６−２１株は同様な レベルのセルロースを生産した。プラスミドｐＡＢＣＤまたはＰＬはセルロース シンターゼのオペロンをエンコードする配列を含有し、そして細菌の細胞の中で セルロースシンターゼを発現する、これらのプラスミドの構成の詳細については 同時係属米国特許出願第０７／６８９．００８号を参照のこと。

１３０６−２１組み換え株を使用して観察された結果は、１３０６−３組み換え 株を使用して観察されなかった。表７が示すように、１３０６−３ＰＬ株は対照 より少ないセルロースを生産する。１３０６−３培養物のすへてをフルクトース の中で成長させて、ｐＨの問題を最小にした。

推定上のＰＤＥＡ遺伝子崩転子のすべて（１３０６−２１Ｄｉｓｌ　、　１３０ ６−２１Ｄｉｓ２および１３０６−３１）ｉｓ５）は、それらのそれぞれの対照 より少ないセルロースを生産した。１３０６−２１推定上のＰＤＥＡ脱染株は、 また、セルロース／細胞の比の有意な低下を有するように思われた。

表６ セルロース　平均の　細胞量　セルロース／（ｇ／ｌ）　セルロース　（ｇ／ｌ ）　細胞の比表７ 変更したＰＤＥＡおよびＩＩＧＣの活性をもつ株のセルロースの生産種々の突然 変異株を、セルロースを生産するそれらの能力の変更について評価した。種子の 培養物をＲ７０−３＋２５ｍＭ　ＤＭＧ、　３０ｇ／　１２のグルコース、０． ５％（ｗ／　ｖ　）　ＴＹＩＥおよびｏ、ｉ％セルラーゼの中で成長させた。す べての実験のための試験培地は、Ｒ７０−３＋１％（ｖ／　ｖ）　ε８０１Ａ　 Ｃ３Ｌ、　１　ｇ／　ＡのフロキサンＥＡ−１３４０，１０ｇ／ｆ！のグルコー スおよび２５ｍＭ　ＤＭＧてあった。１３０６−２１　：　ＡＢＴ３を除外した すべての組み換え株は、種子および試験フラスコにおいて１００μｇ／ｍ１のＡ ｍｐを有する。株１３０６−２１　：　ＡＢＴ３は種子および試験フラスコにお いて４０μｇ／ｍｌのＳｔｒを有した。すべての試験フラスコに５％の接種物を 入れ、そしてフラスコを３日間３０°Ｃ，２５Ｏｒｐｍ　（ビの行程）において インキュベーションした。

実験の結果を表８に記載する。セルロース生産の最大の低下は、二重ｄｇｃｌ／ ｄｇｃ２突然変異株１３０６−２１：　ＡＢＴ２１において見いだされた。

１３０６−２１：　ＡＢＴＩＯは、対照より多いセルロースを生産するように思 われる。１３０６−２１：　ＡＢＴｌｏは、親の株＋３０６−２１において過剰 に発現されたｄｇｃｌを有する。

表８ ＋３０６−２１　：ＡＢＴ３　３．７０　３．７０　（６８％’）　１．５９　 ２．３３Ｘｌ１１．　Ｃ６ｇオペロンのためにプローブｃｄｇオペロンの中のＤ ＮＡ配列の検査において、遺伝子ｐｄｅＡＩ。

ｐｄｅＡ２．　ｐｄｅＡ３．　ｄｇｃｌ、　ｄｇｃ２、およびｄＢ３は、ＤＮＡ の高度に相同性の領域を共有することか明らかにされた。この領域は、３つのｃ ｄｇオペロンを位置決定するために使用した、実施例ＩＩＩに記載する５３ｋｂ のＰＣＲ生産物の中に含有される。この５３ｋｂのＤＮＡプローブを使用して、 他のアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）株、セルロース合成細菌、あるい は植物細胞および他のセルロースを合成する種において、ｃｄｇオペロンを同定 しかつクローニングすることができる。このプローブを利用するためのハイブリ ダイゼーション条件は、実施例３に記載されている。他の生物の中の遺伝子を同 定するために、低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件、例えば、 より低い温度を使用することができる。

ｐｄｅＡ遺伝子単独またはｄｇｃ遺伝子単独に対して特異的なオリゴヌクレオチ ドの領域か、また、同定された。これらのプローブは、ｐｄｅＡ遺伝子に対して 特異的なプローブとして、プローブｅｅｌ−１４１ＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＣ ＴＧＣＴＣＡ　、およびｅｅｌ−１４２ＣＣＧＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＡＡＣを 包含する。これらのプローブは、ｐｄｅＡの３つの遺伝子内で１００％の相同性 を共有した。ＤＮＡプローブＴＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣおよびＣＡ ＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧは、それぞれ、ｄｇｃ遺伝子に対して特異的なプロ ーブとして、ｃｄｇｌオペロンのヌクレオチド３４９０および３７６０に位置し た。これらの領域は、また、ｄｇｃｌおよびｄｇｃ２の遺伝子内で１００％の相 同性を共有する。これらのプローブを使用して、他の生物の中の対応するｐｄｅ Ａおよびｄｇ遺伝子、ならびにｃｄｇオペロンを同定することができる。使用し たハイブリダイゼーション条件は、密接に関係する株および種についてのストリ ンジェントな条件から、より進化的に発散する生物を使用する低いストリンジェ ントの条件で変化することかできる。

これらの共通の領域によりエンコードされるジゴペプチドに対して調製された抗 血清を使用して、他の生物の中のＰＤＥＡおよびＤＧＣを同定すること、ならび に発現ライブラリーをスクリーニングすることかできる。

表９ ｐｄｅＡ及びｄｇｃ遺伝子内の共通ドメインｄｅＡ２ ｐｄｅＡ３ ｄｇｃｌ ｇｃ２ ＤｓＬＴＧＬＬＮＲｇ−１ 生物の寄託 １９９１年１２月６日に、出願人はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） 米国マリイランド州ロックビレ）に、ここに記載する、コスミドｐＫＴ２３０ｃ Ｏ３５１５ＣＩＯ（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８８６９）、コスミドｐＫＴ２３０ ｃＯ３５／３Ｆ３（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８８７０）およびコスミドｐＫＴ２ ３０ｃＯ３５／　１５Ａ８　（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８８７１）を寄託した。

これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的認識ついての ブダペスト条約の規定（ブダペスト条約）に従いなされた。これは寄託の日から ３０年間生活可能な培養物の維持を保証する。生物はＡＴＣＣによりブダペスト 条約の規定に従い、かつ関係する米国特許の発行のとき制限されない入手可能性 を保証出願人とＡＴＣＣの間の合意に従い、入手可能となるであろう。寄託され た株の入手可能性は、特許法に従い政府の権威下に許諾された権利に違反して本 発明の実施に対するライセンスとして解釈すべきではない。

引用したすべての特許、特許出願、および刊行物引用をによって前述の詳細な説 明は当業者が本発明の実施を可能とするために十分であると考えられる。事実、 分子生物学および関係する分野の当業者にとって明らかな本発明を実施する前述 の方法の種々の変更は、請求の範囲内に包含される。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ベチマン、モセ （ｉｉ）発明の名称　環状ジグアニレート代謝酵素（ｉｉｉ）配列の数：ｌｌ （ｉｖ　）応答住所 （Ａ）住所ニリンバッハ・アンド・リンバッハ（Ｂ）町：２００１　フェリービ ルディング（Ｃ）市：サンフランシスコ （Ｄ）州：カリホルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ　：　９４１１１ （Ｖ）コンピューター・リーダプル・フオーム＝（Ａ）媒体の型：フロッピーデ ィスク （Ｂ）コンピューター＋　ＩＢＭ　ＰＣコンバーティブル（Ｃ）　ｔヘレーティ ン’１’　−’／スｆム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェアー ：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃　１．０Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ （Ａ）出願番号：　ｔｌｓＯ？／８００．２１８（Ｂ）出願日：　１９９１年１ １月２９日（Ｃ）分類 （ｖｉ）代理人情報 （Ａ）氏名：ボートナー、スコツトＲ （Ｂ）登録番号：　３４．２９８ （Ｃ）参照番号：　ＷＥＹＲ２００３０ＵＳＡ（２）配列番号ｌの配列情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　５９０４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）Ｈの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）分子型：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉ）ハイポセティカル二Ｎ ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒ　ｘｙｌｉｎ ｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ＴＧｋＴＣＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＧ　ＣＧＧｋＣｋＴＧＧＣＣＧＡｍＣ ＣＴＴ　（、ＣＣＣＴＧＡＣＣＡ　ＣＣにＡＧＡＣＴＧＴ　V２０ ＣＡＧＣＣＧＣＣ％　ＣＴＣｋＧＴＧＣＣＴ　ＴＣＣ入τＣＧＧＧｋ　ＣＣＡに ＣＴｒＡＴＣτｃｃｃｃｃｃ入＾ＣＧＧＣＧＣＣＣＣｋＴ　V１１０ ＣＣＡＴＡＴＴＣ？Ｃ（ＪＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＣＧＴ ＯＧＣＣＣＡＩ：ＣＣＡＧＡＡＴ　ＧｋＣＩＧＣＧ入入Ｇ　W４０ ＭＣＣＡＧＧＣＧＧ　ＣＧＧｋｋＴＣＣＣＴ　ＧＴＧＧＧＧＣＡＴＴ　ＣＣＣＣ ＧＣＧＣＣＧ　ＡＣＧＴＣｋＴＣＧＧ　ｅｃｃｃＡＡＴｃＴメ@１０２０ ＧｋＣＴＧＣＣＴＧＧ　ＴＣＣＣＣＩＣＣＣＧ　ＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴ　ＧＡＣ ＣＡＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡ　ＣＣＧＣｋＡＣ（１GＣ１０８０ （ｉＡｃＡｃｃｃｃＧｃ　ＡＴｕＣＣＣＣ４％？　ＴＧＴＣＧＣ；ＣＡＣ＾　Ｔ ｃＧ（：ＧＣＣＡｅｃ　？＋、ＣＡＣＴＴＣＡＣＣＣＧＣＧbＣＣ，ｋＴ　１１ ４０ ＧＧＧＧｊｕ丁ＡＣＡ　ＴＣＴＣＴにＣＣＣＡ　ＧＣＴＴＴｃＧｃＴｃ　ＴＣＣ ＡＡＣＣＴＧＣｋＧＧＴＧＣＧＣＣＡ　ＧＧＧＣＣ，ｋｃＡ`Ｇ　ｌス００ ＣＧＧＣＴＣＡＣＣＴ　ＡＣＴＡＣＡＴＧＣに　ｅＧＴＧＡＴｃＡＡＧ　ｋＡｃ ＧＴｃＡｃＧＧ　ＡＧにＡＩＪＧＣＣＡ　ＧＣＧＣＣＣＣＡ`Ｇ　１２６０ ＡＴＣＣＴＯＮＴＣＣτＧＣＡＧＡＡＣＧＡ　ＣＧＴＧＣＴＧＣ＾Ｇ　ＧＣＧＣ ＴＧＣｒＣＣＡ　ＧＣＧＡＣＡＴＧＣＴ　ＧＡＴＣＣＡＧＧ`Ｔ　１３２０ ＡＴ丁にＧＣＧＡＧＣＴＧ＾ＴＣτＧＣＣＧ　Ｃ入ＡＧＧ丁τＧ入＾　ａｃｅτ 丁ＣＧＴＧＣＣＣ入ＸＣτＣＧＧＴ　ＣＧＣＧＧＣＣτＴ０@１３８０ ＾ＣＣＣＴＣＣ，ＴＧｋ　ＣＣＣ，ｋＡＧＧＣＧＴ　ＣＣＡに＾ＣＣＧ＾ＣＣ＾ ＣＣ八ＧＣＧＣＧ　ＡＣへＴＣＣτＧ（Ａ　ＧｋｋＡＣτＣ■`Ｃ２９４０ ＧＣＴＧＣ入ＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣ？ ＧｅＴＡ　ＣＧＧＧＡＴＡＧＡＴ　ＣＣＡＧＣＣＡＴＡＣ３P８０ ＧＣＣＡτＧＴＣＡＣτＣＡＡＧＣＡＣＯＡ　ＴＧ八へＣにＣＣＴＧ　ＣＧＣに ＣＣＣＴＧＡ　ＣＣ（：ＡＣＣＡＧＧＡ　ττｅｌｌ：ＧＡ■■嘯b３２４０ ＴＯＧＧＣＣＣＡＴＧ　ＴＴＧＴＧＧＡＣ入Ａ　ＴＣＴＣＣτＧ＾ＴＣＧＴＧＧ ＣＣＡＴＴＡ　ＣＣＧｋＴＧＴＧＣＧ　ＴＧＧＴＧＴＧ八Ｔs　へ　３３００ ｋｃｃＴＡＴＧＴＧｋ　ＡＴＧＡＣ（ＣＣＴＴ　τＴＧＣにＡＧ八τへ　ＡＧＣ ＣＧＣＴＡＣＣＣＧＣＧＴＧ入ＡＧ八　＾ＣＴへＣＴＧＧＣS３３６０ ｃｃｃｘｃｃｃｘτＣＣＣ入τＣＧＴＣ入Ａ　ＴＴＣＣＧＧＣＴＡＴ　Ｃ＾τＧ ＾τＧＣＧｋ　ＧＣＴＴＣ丁丁ＣＡＧ　ＧＣｋＧｋτＧτ＾メ@３４２０ ｅｃｃＡｃｃＡ？ｃｃ　ＧＧＧＧＧＧＣＣＣＡ　ＣＡＴＡτＧＧＣＣ，ＣＧＧＣ ＣＣＡＡＴＣＴ　Ｃ，ＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣ入ＡＧＣＡＴＧbＣ３４ＢＯ ＡＣにＣＴＧＴＡＣＴ　ＧＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＮＴＣＣＣＣｋＡ ＧＣＡＣＡ　ｋｃＴｃｃｃＴＴＧＧ　ＣＧＣＧＧＴＴＧｋＧ@コ５４０ ＧＧＣＴＡＴＧＴＣＧ　ＣＣＡｅＣＣにＴＴＴ　ＣＧＡＣＡＴＴＡＣＣＣＡＡＣ ＴＣＡＴＧＡ　ＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡ　ＣＣＣＧＣＴＣＡＡf　３６００ ＴＣＧＣττＧＣＣＧ　ＣにＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣ，ＧＧ　ＣＴＣ ττＣ入＾ＣＣＧＴＧ（、τａｃｅτ丁　ＣＡＡＣＡＡＣＣsＣ３６６０ ＣＴＣＣＡＧ＾ＣＣＧ　ＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡ　Ｔ入入へＴＣＧＣＡＧ　ＡＡＣ ＡＴＴＡＣＣＣＧＣＧＡＣ１丁（：ＡＴ　ＧＣＴＧＧＴＣＡsＧ　コア２０ ’ｒ丁ｃｃｘ’ｒｅＴｃｃ　ＡＴＧＧＣＴＴＣｋｋ　ＧＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡ ＣＡＴ丁ＣＡＴＧ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣにＧＧＣＧＡＴＧsＧ　３フ８０ ＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧ　ＴＧＡτ丁丁ＣＣＡＡ　ＣＣにＣＣＴ？ＣＴＧ　ＧＣＣ ，ＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＧＡ　ＴＣｅＧＧＴｅＴbＣ３８４０ ＣＣ，ＧＣＴＧＧＧＧＧ　ＧＣＧＡＴにＡＧＴＴ　ＴにＣＧｃＴＣＡＴＣＣＴＣ ＡＡＣＣＡＴｈ　ＣＣＣＴＧＣＡＴ入Ａ　ｋｍｃｃｃｃＴ’s　３９００ ＴＣＣＣτＣＡＴにＣτＧＧｋＧｋｋＧＣ丁　ＧＣＴＧＧＣＣＧＡＧ　ＣＴＣＧ 入ＡＧＣＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＣＴ　ＧＧＧＣＭＣｋＣＣコX６０ ＡＴＧＧＴＣＡＡＣＧ　ＴＣＴＣＧＧＧＣＡＧ　ＣへτＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣ ＣＣＡＴＣＧ　ＣＣＡＧＣＣ＾ＧＧＡ　入＾ＧＴＧＣＣＧへO　４０２０ 丁ｃｃｃＴｃｃｘｃ＾　入入ＡＡＴＧＣＣＧＡ　？ＮＴＣＧＣＧＣ丁Ｔ　ＴＡＴ ＧＣＣＣＣＣＡ　ＡＧＣＧＣＧＣＧＣＧ　ＴＧＧＣｅＡＣＣ`Ｇ　４０８０ ＧＣＧＣＧＣｋＴＣ；丁　丁ＴＧｊｋＣＡＴにＡＣＣＣ？ｌ：ＣＡＣＣＡＣＣｋ ＴＧＣＧＣ’ｒＧＧ　ｋＧｃＧＧＣｃＧｃＡ　ＧｋＴＣＣＴbｋ＾丁　４１４０ ＧＡＴＧＣＧＣＧＴＧ　ＡＡＣＧＧＣＴにＡＴ　にＡＡＧＣＡＣＣＡＧ　ＴＴＣ ＧＡＧＣＴＴＴ　ＡＣ？ＡＣＣＡＣＣＣＧＡＴＣＡＴ（ｉＡ`Ｃ４２００ ＴＴＣＡＧＣＡＣＣＧ　（ｉｃＭＧＴＧＣＧＡ　ＣＣＡにＡＴＣ：ＧＡＧ　ＧＣ Ｃ，ＣＴＧＣＴＧＣＩ：、ＣＴＧＧＣ＾ＣＣＡ　ＣＣＣＧＣbＧＧＣＣ４２６０ ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣ；　ＣＧＧＣＣ−ＧＡＡＡＧ　ＣＴｒＣＣＣＣにＡＴ　Ｇ ＴｋＴ丁ＣＣＴＴＧ　Ａ丁ＧＣＧＧＣＴＣＴ　ＧＧＣＧＣＧfＧＣＣ４ココ０ ＾丁ＧＡＧＣＣＣＣ；ＣＧＣＣ丁Ｃ，ＧＴＣ八ＡへτｃｃττＣＣＭ；　入ＡＴ ＣへＣ＾τＧＣＣＣＡτＣ丁ＧＧ入Ａ　τ＾ＣＡＡＣＣＣτb４３８０ にＡＣＣＣＣ？ＡＴＣＣＣＡＡＣＣＴにへＣＣＡＴＣ入ＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＧ ＣＴＧＧ　＾ＣＣ丁ＧＣＴＣ入八　へＡ丁ＣＧ（，０１丁（F　４４４０ ＣＡＣ，ＭＴＧ八ｃへ　ＴＴｃｘｃｃｃｉｃｘ　ＡＡτ入入入ＧＣＧＧ　ＣＡＧ ＧＧＴＧＧＣＡ　ｋＧＧｃＧＧｃｃＧＡ　ＴＴＡＣにＴＧＣs＋１；　４５００ Ｇ入＾＾丁入丁ＣＧＧ　ＡＡＡＧＣＣＴＧＣＴ　ＧＣ；ＣＧＧＧＣＡＧＧ　ＣＧ ＣＴＣＣＧ八丁ＣＣτＧへＣＣτＧＣ＾　ＧｅＧＣＣ丁ＣＣ`Ｇ　４５６０ ＴＣＡＴＧＡＣＡＣＧ　ＣＣＡＴＧＣにＣＣ丁　丁ＡＣττ丁ＡＴＡＣＡＣＣＩ Ｉ：ＡＣτＡＣτ　ＣＣＡＴτＣＧ入ＡＣＣＣＴ丁ＡτＡＴ`Ｃ４９８０ ＣＣにＣＧＣＣ；ＣＧＣＧＣＡＣτ（Ｘ、ＣＧＧ　ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ　ＧＣ ＣＣ，ＣＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＴ　ＣＡＴＴＡτ丁bＣＣ５１６０ ＣＡＴ＾丁Ｃ入τＣＣＧＣＣＴＴＡＴＧＧ八　（、にＣにＧＡＴＡＴＧ　ＣＧＣ 八入へ＾ττＧ　ＴＧＴＣＣＴＧ丁入Ａ　ＴＣＣＴＣ入入入`Ｃ５２２０ 人入λＣＴＧτ入入Ａ　入τＣ入ＧＣＣ’ＴＣＡ　ＴＣ，ＣｋＧＧＣＡＧＧ　Ｃ τＧＡＡＧＣ，ＣＡＴ　ＣＴＧＡＣＣＣＧＣＴ　Ｇ丁ｃｃへ■fＣＧ＾　５４０ ０ 丁ＣＣＣＣＲＴＣＧＯＡ丁τＣ入入入入ＡＴ　ＣＧＣＧＣＣ，ＴｋＴＣＧＧ入＾ ＴＣ，ＣＴＣＡ　Ｇ丁ＧＴＣｋＴＣＣ＾　ＡτＣ八τへＡＧbＣ５４６０ ＡＣＡＧＧ入八ＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＧＣＣＧＴＴＧＣＣττＧＧＣ ＣτＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣ５６４O ｃｃｃｃｃｃｃ＾ＴＧ　ＧＣＣＣＡＴＣ，ＡＡＡＴＣ（、Ｇ　５９０ａ（２）配 列番号：２の情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：　４５５８塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）ｌ−ボロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉ）ハイボセテイカル： Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号＝２＝ ＣＣＣ入ＣＧＴＣ（ＴＧＣＡＣ八Ａ丁Ａへ　ＣＡＴＣＧＡＧＣにＣＣτＧＡＴＣ ＡτＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣ，Ａ　ＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣ１■S０ ＣＣロττＣＴにＣＡ　にＧ入ＡＴＴＧＣＡＴ　τＣＣＣＡＴＧＴに＾　丁ＣＣ へＧＧＧＣτ＾　τＣτＴττＣＴＣＧ　Ａへ〇ＣＣＡＣＴ`Ｃ２２８０ ＣＡＡＣＣＡＣ（、ＣＣＡＴＡＣＡＧＣＡＴＧ　ＴＣＣ，ＴＣ，ＣＣＣＣＧ　Ｃ ＡＣＴＧＣＣＡ（：ＣＧＧＴＧＴＴＴＣＡＧ　ＧＣＣＣＡＴb，ＣＧＧ　２４０ ０ ＧＧＧＣＣＧＣ−ＴＴＴ　ＧＡＣＴτＣＡＴＧＡ　ＣＧＣＡＴｋＡＣＡＧ　ττ ＴＧＴ↑丁τＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡ丁τ　ＣＣＡＧＧＣＧＧfＡ　２４６０ 八ＣＡＴＧにＣＡＴＴ　＋１；ＣＡＡＣＡＣＣＡＴ　Ｇへ丁ＣＣ，ＣＣＴＧＣＧ ＧＣＣＣＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＡＣＧＡＴ　ＧＣＧＣ，ｋＴsＴＣＴ　２５２０ ＧＣＧＣＴＯＡＴＣ？　Ｇｌｌ；ＴＴＧＡＴＡＡＴ　ＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧ　Ｔ ＣＣＣＧＡＴＴＡＣにＧＡＴＡＧＣＣ；ＡＧ　ＧＧＣＧＴＣ`ＴＣＡ　２５８０ ＣＣ丁ＡＣＧＴＧＡＡ　ＴＧＡＣＣ（：ＣＴＴＴ　ＴＧＣＧＡＧ八τ入Ａ　へＧ ＣＣＡＧτ八ＣＴＣへＧＣＧ（Ｃ；八ＧにＡＡ　ＣＴＣＧＴbＧ（、ＡＴ　２６ ４０ ＣＣ，ＡＣＧＣ八ｃｃへ　ｃへＴＣＣＴＣ入Ａ丁　τＣＣＧＣＣＴＸＣＣＡＴ（ ：へτｃｃｃｃへ　丁τττττＣＣＧＧ　ＧへτＣＴｃτ■i（２７００ ＣＣＡＣＣＡＴＣ入Ａ　ＣＧＣにＣＣ（：Ｃ入Ａ　Ｃ７ＣＴＣＣＣ（：にＧ　Ｃ Ｃ入Ａ丁ＡτｃＴｃ　ｃ入ＡＣＣＣＣ（：ＣＣ入ＡＧＣＡＴfＣＧＴ　２７６０ Ｃ１；ＣＴＧ丁ＡＣＴＧ　ＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＡＡ ＧＡＴＣＧＡ　ＣＣＧＧＣＡＧにＧＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＧ@２Ｂ２０ ０Ｇτ八ＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧ丁丁（（：ＡＧＡＴＴ八ＣＣＧへ　ＡＡＣ τＣ＾丁ＯＡＡ　Ｃへ〇〇ＣＧＣＣ＾ＣＣＧＧＣＴＧτＧＴf　２８１１０ ＣＡττｃｃｃｃｃｃ　ｃｃｃＴｃｘτＧＣＧ　ＣＧＣＧＣ，ττＣ，ＣＴ　Ｇ ＧＡＡＣＴＧＣ＾τ　τＣ，ＣＡＣＧＧＧＧＣ；　ＡＧＧＣbＣ，ＡＣＣＧ　４ ３８０ ｃｃｃｃｃｃｃｃｒｃ　ＧＣＣ，ＣＣＣＴＣＣ，ＣＧＴにＴＣＡ丁ｃｃｘ　ｃｃ ｃｃｃ′Ｔｃｃｘｃ　ｃａｃｃｃｃｃτＴＧ　ｃＣ（：ＧＴ`？ＣＡＴ　４４４ ０ （２）配列番号＝３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　４１３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型＝ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（伍）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： ：ｃ？ｃｃｃ＾丁ＧＯＧＣ，入Ａ丁＾丁ＡＴＣτＣＣににＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣ ，ＣＴＣ；ＴＣＣｋｋＧＧＴＣＣ，τＧ　ＡＡＣＧ＾丁ＣＡb＾　フ２゜ ＡＧＣＧＣ八τＣτへＴττＣＡ丁ＧＧＧＣＧＴＡＴＣ；ＡＡＣＡＡ　ＴＧＴＣ ＡＣＣＡＡ（：　にＡＸＡにＣ（：ＡＧｃ　ＡＧＣＧＣ入ＡbＡＴ　７８０ ＣＡＣＧＣ（、ＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＴにＡＣＣＧ　Ａ（ｉ入τＣＡＡにＡＴ　Ｃ ｃＡＣＣＧＣ入ｃｃ　τＴＣＡＴＣＡＡＣＧ　ＡｆｆＴＣＧ`ＧＣＡ　２コ４゜ 丁ＣＡＣＡＣＣＡＡＴ　にＣＣＣＡＧＧＣＣＧ　ＴＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧ ｈＴＣＧＧＣｋ丁ｃＧＧｃＴｃＧｃ　ＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴ@２４００ 人入＾ＣＣＴＴＧｋＧ　ＣＡＧＣＡＣＡＴｅＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧ　ＣＧＡＣ ＡＴＣＣＧＴ　ＧｋＡＣＴＣｋｋＣＣＴＴＧｋＡＣＣＣＴＣR９６０ ＡＣＣＡτＴＣＴＧＧ　ＡＡＧＴＡＡＣＣＧＡ　ＧＣＡＧＡＴτＣＴＴ　ＣＡＣ ，ＧＧＣ；ＣＧＧＣＧＧＣ，ＣＧＣ，入入入Ａ　ｋＡＡｃｃfｃｃ丁丁　４０２ ０ ＾ＣＭ；ＴＣＣＣＣＣＴＴ？ＣＣＡＣＣＣＴ　ＧＧＧＧｃＡＡＣＴＧ　ＣＣにＴ ＴＣＣＡＧＴ　ＣＧＣＴＣＡλＧＣＴ　Ｔ　４０１（２）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４： ＾１＆＾ｒｇ　にｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　八１１　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ（２）配列番号８５の 情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さニア６５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）分子の型、蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル；ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二ＮＯ （ｖｉ　）由来・ （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒ　ｘｙｌｉｎ ｕｍ）（ｘｌ）配列の記載：配列番号＝５ 入ｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　＾１＆　入＊Ｐ　Ｃ１ｙＣｙ餞　Ａｒｇ　Ｌ ｙｓ　ＶａＬ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　入Ｌ＆　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｌ１＋■ Ａｓｐ　Ｖａｌ　にＬｕ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａユ１　Ａｓｎ　Ａｌａ　 ５＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　）ｌｉｔ　Ｌ会ｕ　ＶａP Ｔｒｐ　入ｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　ｇｅｒ　ＨＩＩｔ　Ｃｙ−Ａｒｇ　 Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｓａｔ　Ｃｙｓτｙｒ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ｐｒｏ　ＶａＩＭａｔλｌａ　Ｃ１ｙ　Ａ！Ｐ　ＧＡＹ　Ａｒｇ　Ｖａｌ 　’ｒｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ＾Ｌａ　Ｌａｕ　丁ｙｒ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ 　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ｃａｎ　Ｌｓｕ　ＧＬｙ　＾１＆　τｒｐ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｎ　Ａｒｇｌ）２°０　２６５　２”。

Ｌｅｕ　ＶａｌＧｌｙ　Ａｌａ　Ｃｙｍ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａ Ｌａ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ＨＬｓ２７５　２Ｂ０　２８ ５ Ｃ１ｙ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　 Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｍｅｔ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　！１ｓ３０５　コニ０　３ １５　３２０ ＡｌａＧＬｎＰｒｏｌＪｙＡｓｎＡｒｇτｈｒＬａｕＡｌａＩｌｅＰｈｅＨｅｔ ＬｓｕＡｓｐｆｆｌｅＡｓｐ３２５　３コｏ　３３５ ＾ｒｑ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｘｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｌａｕ　 ｃｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　八ｌａ　Ａｓｐ　Ｇ１ｎＣｙｓ　Ｓｅ：　Ｉ ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｘ１ｅ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ＾１＆＾ｓｎ　Ｇｌｙ 　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ａ ｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ　八ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖ ａｌ　八１ａＰｈｅ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙτｙｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ｌｅｕτｈｒ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＬｅｕＴｈｒ　Ａ ｓｎ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　ＡＬａ　ＶａＬτｈｒ　ｓａｔ＾Ｌａ　ＶａＬ　Ｈａ　 Ｇｌｙ　工Ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｕｒ＾ｒ９Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｐｒ ｏ　ＡＬａ　Ａｌａ（２）配列番号二６の情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ・５８０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （１ｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス、Ｎｏ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物・アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒ　ｘｙｌｊｎ ｕｍ）（ｘｉ）配列の記載・配列番号二６・ １１＠　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　にｌｕ　Ｌａｕ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｌｌ會Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓ ｉｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　５ｅｒ　Ｐｈ＠　ＰＭ　Ａｒ ｇ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｓｐ　（Ａｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ 　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　ＶａＩ　Ａｌａ　丁ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ 　Ｌｙｓ　＋４支■ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　にｌｙ　Ｌ＠ｕ 　Ｌ＠ｕ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｐｈａ　入ｒX コ５５　３６０　３６Ｓ ＾ｓｐ　Ｖａｌ　ｐｈ＠　Ｌ＠ｕ　Ａｓｐ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｌａｕ　ＡＬａ　 Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＬｅｕＶａｔ　Ｌｙｅ　５ ｅｒ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａ＠ｐ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｎ　Ｔｈｅ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ３８５　３９Ｃ３９５４００ Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　にＬｕ　Ｉｌｅ　 Ｓｅｔ：　にＬｕ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃ１■ （２）配列番号、７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Δ）長さ：１３８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）分子の型；蛋白質 （ｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス、ＮＯ （ｖｉ　）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕ　”（ｘｉ）配列の記載：配列番号＝７： ｓｅｔ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　 Ｓｅｔ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　？？＋ｒ　Ｌｓｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙ■ Ｉ　Ｓ　１０　ｉｓ 丁ｈｒ　）Ｉｉｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　）！ｉｓ　Ｌｅ ｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌ唐■ コＳ　４０　４５ （２）配列番号＝８の情報 （ｉ）配列の特徴。

（Δ）長さ、７５２アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｔｅｒ　ｘｙｌｉｎ ｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号二８： ＾ｓｎ入１晶＾ｓｐ　ｌｒｑ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　工１ｅ　ＧＬｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌ ｙ＾ｒ９＾ｒｇ　Ｉｌｅ＾ｒｇ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＡｍｎ　Ｌａｕ　ｌｉｅ　Ａｓ ｎ　Ａｌａ　Ｘｌ＠Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ 　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ４２０　４２５　４コ○ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　５ａｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　工１ｅ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｉｎ　（：ｌ■ ４コＳ　４４０　４４５ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｓｅｒ　ＨＬｓ　 八ｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＡｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖ ａｌ　ＡＬａ　Ｃ１ｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　５ ｅｒ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　＾３ｐ？ｈｒ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｃ１ ｙ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ｓｉｒ　入ｒ ｇ　Ｔｒｐ　Ｈ４５ＳＩＳ　５２０　５２５ 八ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＩＬｌｌ　Ｌｙｅ　ｌｉ＠ 　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｉｎ　＾５■ ６６０　６６５　６’＋０ Ｐｈｅ　ＧＬｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　八Ｌ＆　ＧＬｎ　八Ｌａ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｚｌｅ　Ｃ１ｙ６７５　６８ｏ　６ ８５ （２）配列番号：９の情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝５７４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型、蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二ＮＯ （ｖｉ　）由来： （Ａ）生物二アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｌ）配列の記載、配列番号：９： 入１１　＾ｔＩｐ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　＾Ｌ＆　Ａｓｐ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ａｓｐ 　Ａｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ヱｌｅ　Ｖａｌ　ＡＬａ　ｒｌ■ τｈｒ　Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｚｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｖａｌ　Ａ自ｎ　Ａｍｐ　Ａｔｑ　Ｐｈ＠Ｃｙｓ　に１ｕＺｌ＠Ｓｅｒ　Ｇｉｎ 　Ｔｙｒ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ 　Ｔｈｒ　）ｌｉｓ＾ｒｇ　ｌ１ｅτＭｒ　Ｃ１ｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　入ａｎ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　＾３Ｐ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｃｙｍ　ｃｌｕ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　 Ｇｌｕ　τｈ【１３０　１コ５　ユ４０ ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　 にｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ａｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ）１ｉｓ　Ｇｌｙ　 Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　八Ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 八ｌａ　Ｉｌ＠　八Ｌａ　５ｅｒ　Ａｒ■ ＬｅＬＩ　Ａ廖ｎ　）Ｉｉｓ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈ ｅ　Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　ｘ＊ｐ　ＧPｎ ４Ｂ５　４９０　４９５ （２）配列番号＝ｌＯの情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、７４０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｌ）配列の記載：配列番号＝１０＝ｃｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌ ａ　Ｐｈｅ　ＶａＬ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｓｒ　Ｓｉ ｒ　）Ｉｔｓ　＾１ｎ　＾ｒX Ｃｙｍ　ｔｉｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　ｃｌｕＧｉｕ　ｒｌ＠　＾ １畠　入１ａ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｉｌｅ　ＡＬａ　Ｌｙ＠　Ｇ ｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌ＠ｕコ５５　３６０　３６５ 八Ｌａ　Ｖａｌ　）ｌｉｅ　Ｐｈ＠　Ａｒｇ　＾Ｉｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ 　Ｐｒｏ　にｌｕ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ａｌａ　八ｌａ　Ｌ＠■ Ｓ＠ｔ　Ｉｌ＠　＾ｒ９　人ｔｓｎ　ｒｌ＠　Ｃ１ｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ 　Ｓａｒ　Ｎｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃ１ｙ　τｈ■ Ｌｙｓ　Ｘｉｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈｅ　Ｘ１＠ｊｖｎ　Ｊｖｐ　Ｐ ｈｅ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ（２）配列番号＝１１ の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４９３アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）由来： （Ａ）生物：アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉ ｎｕｍ）（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｙ　ｆｌｓ　ｒｌｅ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　ＭＰ　ＬＹ自 　Ｐｈｅ　Ｃ２Ｓ　ＧＪ、ｕＡｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｇｌｕ 　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐ？ｌ＠　Ｃ１ｕ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉ ｎ　ＰｒB ３２５　３コ０　３３５ ０Ｌｙ　Ｐｈ＠　Ｃ１ｙ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　 Ｓｌｙ　Ｔｙｒ　（ｉｌｙ　Ｔｈｒ　ＶａＩ　Ａｒｇ　Ｌ＠■ ４６５　４７０　４）５　４８゜ 手続補正書（方式） 平成６年６月２ト日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．環状ジグアニレート（ｃｄｇ）オペロン遺伝子を含有する単離されたポリヌ クレオチド配列。 ２．前記ｃｄｇオペロンがアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ）株のゲノム に由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。 ３．前記ｃｄｇオペロンがｃｄｇ】（配列番号：１）、ｃｄｇ２（配列番号：２ ）およびｃｄｇ３（配列番号：３）から成る群より選択される、請求項２に記載 のポリヌクレオチド配列。 ４．少なくとも１つのｃｄｇオペロンのタンパク質を発現し、前記ｃｄｇタンパ ク質を自然に生産しない細胞。 ５．前記ｃｄｇオペロンのタンパク質が、ＤＧＣＩ（配列番号：６）、ＤＧＣ２ （配列番号：９）、ＤＧＣ３（配列番号：１１）、ＰＤＥＡ１（配列番号：５） 、ＰＤＥＡ２（配列番号：８）、ＰＤＥＡ３（配列番号：１０）、ＣＤＧｌＡ（ 配列番号：４）、およびＣＤＧＩＤ（配列番号：７）から成る群より選択される 、請求項４に記載の細胞。 ６．前記細胞がセルロースシンターゼを生産することができる、請求項５に記載 の細胞。 ７．前記細胞がヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドを含んでなり、前記配 列がセルロースシンターゼのオペロンの少なくとも一部分を含んでなる、請求項 ５に記載の細胞。 ８．前記プラスミドがｐＡＢＣＤである、請求項７に記載の細胞。 ９．精製されたｃｄｇオペロンのタンパク質。 １０．請求項４に記載の細胞から単離されたｃｄｇオペロンのタンパク質。 １１．変更されたレベルの少なくとも１つのｃｄｇオペロンのタンパク質を発現 する細胞。 １２．前記ｃｄｇオペロンのタンパク質が増大したレベルで発現される、請求項 １１に記載の細胞。 １３．前記ｃｄｇオペロンのタンパク質をコードする遺伝子のコピーがマルチコ ピーのプラスミド上に存在する、請求項１２に記載の細胞、１４．前記ｃｄｇオ ペロンのタンパク質をコードする前記遺伝子が異種プロモーター配列のコントロ ール下にある、請求項１２に記載の細胞。 １５．前記ｃｄｇタンパク質がジグアニレートシクラーゼである、請求項１２に 記載の細胞。 １６．前記ｃｄｇタンパク質が減少したレベルで発現される、請求項１１に記載 の細胞。 １７．前記ｃｄｇオペロンのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が突然変 異を含有するか、あるいは前記ｃｄｇオペロンのタンパク質をコードするヌクレ オチド配列から転写的に上流のｃｄｇオペロンの領域の中に極性の突然変異が存 在する、請求項１６に記載の細胞。 １８．前記ｃｄｇタンパク質がジグアニレートホスホスホジエステラーゼである 、請求項１６に記載の細胞。 １９．前記細胞が減少したレベルのＰＤＥＡ１（配列番号：５）、ＰＤＥＡ２（ 配列番号：８）およびＰＤＥＡ３（配列番号：１０）を生産する、請求項１８に 記載の細胞。 ２０．前記が増大したレベルの少なくとも１つのジグアニレートシクラーゼを生 産する、請求項１６に記載の細胞。 ２１．前記ジグアニレートシクラーゼがＤＧＣＩ、ＤＧＣ２およびＤＧＣ３から 成る群より選択される、請求項１８に記載の細胞。 ２２．遺伝子ライブラリーをｃｄｇタンパク質から誘導されたオリゴヌクレオチ ド配列のハイブリダイゼーシヨンプローブでブロービングする工程を含んでなる 、遺伝子ライブラリーからｃｄｇオペロンの遺伝子を単離する方法。 ２３．前記プローブが少なくとも２つのアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂｃｔｅｒ ）ｃｄｇオペロンの間のヌクレオチド配列の相同性の領域に由来する、請求項２ ０に記載の方法。