JPH10512439A

JPH10512439A - 新規ポリペプチド

Info

Publication number: JPH10512439A
Application number: JP8516759A
Authority: JP
Inventors: バルガネツシユ，タンジヨール・サウンダララージヤン; タウン，クリステイーン・メアリー
Original assignee: アストラ・アクチエボラーグ
Priority date: 1994-11-24
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 1998-12-02
Also published as: WO1996016082A1; FI972215A0; AU3088795A; FI972215A; CN1173182A; DE69533485D1; CN1127516C; EP0792284A1; ATE275579T1; HUT77487A; GB9513306D0; EP0792284B1; GB2290792A; NO972353D0; US6027906A; NO972353L; DE69533485T2; SE9404072D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、細菌のペプチドグリカン生合成に関与するタンパク質であるペニシリン結合タンパク質（PBP）の変異体に関する。上記PBP変異体をコードするDNA分子、ならびにこのようなDNA分子が導入されたベクターおよび細胞も開示されている。本発明はまた、PBPに高い親和性を有する治療的に有用な化合物を検定および設計する方法において、上記PBP変異体を利用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ポリペプチド技術分野本発明は、細菌のペプチドグリカン生合成に関与するタンパク質であるペニシリン結合タンパク質（PBP）の変異体に関する。上記PBP変異体をコードするDNA 分子、ならびにこのようなDNA分子が導入されたベクターおよび細胞も開示される。本発明はまた、上記PBP変異体を利用してPBPに高い親和性を有する治療的に有用な化合物を検定および設計する方法に関する。背景技術細菌および大部分の他の単細胞生物は、ペプチドグリカンと呼ばれる架橋された多糖−ペプチド複合体からなる細胞壁を有する。ペプチドグリカンの生合成は (１)サイトゾル内での前駆体（糖ヌクレオチド）の合成、(２)膜を横切る前駆体の輸送および多糖鎖の形成、ならびに(３)細胞壁内における個々のペプチドグリカン鎖の架橋の３段階から構成される。ペプチドグリカン生合成の最終段階においては、発生したグリカン鎖と既存のペプチドグリカンの間に新たな結合が形成されなければならない。新たに合成された鎖は約10二糖長であり、トランスグリコシラーゼ酵素によって約100〜150二糖単位の最終グリカン鎖に伸長される。ペプチドグリカンは、１つのグリカン鎖の末端D-Alaを隣接領域におけるジアミノピメリン酸残基上の遊離ε−アミノ基に連結させるトランスペプチダーゼの作用によって架橋される。多くの抗生物質は、ペプチドグリカン層の形成を妨害することによって細菌の増殖を阻害する。架橋反応は、２つの重要なクラスのこのような抗生物質、ペニシリンおよびセファロスポリン類の作用の標的である。ペニシリンは架橋を触媒するトランスペプチダーゼと不可逆的に反応すると考えられる。ペニシリン相互作用タンパク質は、３つのグループに分類される。すなわち、 β−ラクタマーゼ、主としてカルボキシペプチダーゼを含む低分子量−ペニシリン結合タンパク質(PBP)および高分子量−ペニシリン結合タンパク質である。ペニシリン結合タンパク質は放射標識ペニシリンＧと結合することが明らかにされたそれらの酵素である。Escherichia coli（大腸菌）では、このようなタンパク質は、たとえばPBP 1AおよびPBP 1Bと呼ばれて、いずれも高分子量−PBPクラスに属する。膜結合タンパク質であることが知られているPBP 1AおよびPBP 1Bは細胞の統合性を維持し、増殖時におけるペプチドグリカン側の壁部の伸長を制御する。PBP 1AまたはPBP 1Bのいずれかを不活性化しても細菌は耐容性を示すが、一方、ponAおよびponBと命名されている両遺伝子の欠失は致死的である（Yousifら，1985）。 PBP 1Bはトランスペプチダーゼおよびトランスグリコシラーゼ両活性をもつ二機能性酵素であることが知られている（Ishinoら，1980）。PBP 1Aは、PBP 1Bを代用できることから、二機能性であると考えられる。β−ラクタム抗生物質たとえばペニシリンは、これらのタンパク質のトランスペプチダーゼ活性のみを阻害する。トランスグリコシラーゼ反応は、たとえば、動物の栄養飼料中に成長促進物質として用いられるリン糖脂質であって、広範なスペクトルの殺菌活性を有することが明らかにされているモエノマイシンによって阻害される。酵素トランスグリコシラーゼは、大腸菌、Staphylococcusaureus（黄色ブドウ球菌）、Bacillus m egaterium（変敗菌）および Bacillus subtilis（枯草菌）に存在することが明らかにされている。これは、トランスグリコシラーゼの阻害によるペプチドグリカン生合成の妨害が臨床的に重要なすべての病原菌において致死的である可能性を示唆するものである。 PBP 1Bのトランスグリコシラーゼドメインの候補としては、Ｎ末端の478アミノ酸がアサインされている(Nakagawaら，1987)。この領域は、PBP 1AおよびPBP 1B両方のＮ末端ハーフ間で保存されている３つのアミノ酸連鎖を包含し、これらはトランスグリコシラーゼ活性に関与する残基である可能性が考えられる。黄色ブドウ球菌からペニシリン結合タンパク質２Ａの調製は EP-A-0505151に開示されている。発明の開示抗生物質に抵抗性を示す細菌の報告数が増加している。したがって、ペニシリン結合タンパク質に結合することによって細菌の増殖を阻害する新規化合物の要求がある。本発明は、PBPに高い親和性を有する治療的に有用な化合物の検定および設計方法を容易にするPBP変異体を提供する。すなわち、本発明の目的は、細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質の水溶性の活性誘導体であるポリペプチドを提供することにある。この場合、上記ペニシリン結合タンパク質は、細菌細胞内で発現されたときその細胞膜に結合し、トランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ両活性を発揮することが可能であり、上記誘導体は、膜結合配列を欠くが上記酵素活性の一方もしくは両方を発揮する能力は維持している。上述の「細菌細胞」は好ましくは大腸菌細胞または Streptococcuspneumoniae（肺炎連鎖球菌）細胞である。本発明の可溶性PBP変異体はトランスグリコシラーゼ活性を維持し、可溶性PBP 変異体は膜結合配列を欠いても、脂質連結基質を認識し、二糖を反復単位に重合できることを示している。したがって、膜への付着に関与する残基を欠く他のPB P類縁体も酵素機能を有するものと想定できる。可溶性PBP変異体のペニシリン相互作用領域と相互作用する分子は、野生型PBP に同様に相互作用できるものと考えられる。したがって、本発明の可溶性PBP変異体は、野生型ペニシリン結合タンパク質と相互作用する化合物の同定に使用することができる。さらに、膜結合タンパク質は結晶化が極めて困難なこともよく知られている。可溶性の酵素的に活性なPBP変異体は結晶化に使用することが可能で、したがって、高分子量−PBPを阻害する治療用化合物の、Ｘ−線結晶解析に基づく理論的設計を容易にするものである。本発明の他の目的は細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質の部分的に切断された水溶性誘導体であるポリペプチドを提供することにある。この場合、上記ペニシリン結合タンパク質は細菌細胞内で発現されたときその細胞膜に結合し、トランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ両活性を発揮することが可能であり、上記誘導体は膜結合配列を欠くがトランスグリコシラーゼ活性を発揮する能力は維持する。上述の「細菌細胞」は好ましくは大腸菌細胞である。高分子量−ペニシリン結合タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントならびにβ−ラクタマーゼおよびカルボキシペプチダーゼのペニシリン結合に関与するモチーフのコンピレーションにより、PBP 1AおよびPBP 1BのＣ末端ハーフはトランスペプチダーゼ活性の機能性ドメインであり、ペニシリン結合ドメインを包含することが示唆された。これに加え、Nakagawaら(1987)はPBP 1BのＮ末端478アミノ酸をコードするトランケィテッドponB遺伝子にトランスグリコシラーゼ反応の能力があることを示した。これらの所見に基づき、高分子量PBP 1Aおよび1Bタンパク質は２ドメインタンパク質であり、そのＮ末端ハーフはトランスグリコシラーゼドメインを形成し、Ｃ末端ハーフはトランスペプチダーゼドメインを形成することが示唆された。これら２つのドメインは、コンピューター解析によりそのタンパク質の機能には構造的にもまた酵素的にも寄与しないリンカーもしくはヒンジ領域によって連結されていると予想された。大腸菌PBP 1Bのリンカー領域は位置545〜559からであり、大腸菌PBP 1Aでは位置501付近であると予想されている。本発明によるPBPの一機能性トランケィテッド変異体は、Ｘ−線結晶解析に用いた場合、ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインの構造情報の取得を容易にする。さらに、一機能性変異体におけるサイズの低下は結晶化を容易にするものである。好ましい形態では、本発明の水溶性ポリペプチドは配列表における配列番号：２、４、６、12または13と同一のアミノ酸配列を有する。 ponAおよびponB両遺伝子の欠失が致死的であるとの観察（Yousifら，1985）は、その欠失がトランスグリコシレーションおよびトランスペプチデーション活性の両方を喪失させるので、コードされたPBP 1Aタンパク質のトランスグリコシラーゼ活性の本体に関する疑問を解決しない。さらに、この実験ではPBP 1Aまたは PBP 1B以外の他のペニシリン結合タンパク質がトランスグリコシラーゼ酵素活性に寄与できる可能性を解決するものでもない。トランスグリコシラーゼ活性に寄与するこれまで報告されていないペニシリン結合タンパク質および／または他のタンパク質が存在する可能性もある。ミノ酸のアラインメントにより、これらの２つのタンパク質のＮ末端ハーフ内で 12中９(領域１)、9／10（領域２）および8／10(領域３)が同一アミノ酸の３つの連鎖が明らかにされた(Broome-Smithら，1985)(図14)。この同一の３つの領域は、最近報告された他の２つのタンパク質配列、すなわち肺炎連鎖球菌PBP 1A（Ma rtinら，1992）およびHaemophilusinfluenzae(インフルエンザ菌)からの94 kDa タンパク質(Tombら，1991)中でも同様に保存されている。このように多様な種におけるこれらの残基の保存は、そのタンパク質の構造面の維持またはトランスグリコシレーション反応自体におけるそれらの決定的な要求を示唆するものである。 PBP 1Aおよび1Bの重複した機能性トランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ活性はまた触媒中心の保存ならびにPBP 1Aの触媒中心と相互作用するように設計された分子がPBP 1Bとも反応する可能性を示唆する。発現されたタンパク質の機能性トランスグリコシラーゼ活性は、適当な基質を用いる直接的インビトロアッセイ、またはそのタンパク質が染色体中の相当する遺伝子の欠失を相補する能力を測定するアッセイにより検討することができる。野生型生成物（PBP 1AまたはPBP 1B）をコードする遺伝子をもつプラスミドが大腸菌細胞の生存能を維持できることが明らかにされている（Yousifら，1985）。このトランス相補方法は、一方の酵素（トランスグリコシレーションまたはトランスペプチデーション）機能が不活性化された突然変異を有するPBPをコードする突然変異遺伝子の機能的性質を評価するために使用できる。このような突然変異生成物が染色体ponAおよびponB遺伝子の欠失をトランスに相補する能力によれば、各酵素機能に必須の要求が同定できる。したがって、ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼ活性の特異的な不活性化の影響の検討を可能にする研究手段が必要である。したがって、本発明の他の態様は細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼ活性欠損誘導体であるポリペプチドであり、この場合、上記ペニシリン結合タンパク質は、細菌細胞内で発現されたときその細胞膜に結合し、トランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ両活性を発揮することが可能であり、上記誘導体はトランスグリコシラーゼ活性を発揮する能力は欠くがトランスペプチダーゼ活性を発揮する能力は維持している。上述の「細菌細胞」は好ましくは大腸菌細胞である。トランスグリコシラーゼ欠損PBP変異体は、PBPの活性部位の構造的情報の取得の目的でのＸ−線結晶解析に有利に使用することができる。可溶性のトランスグリコシラーゼ欠損PBP変異体の結晶型の構造解析によれば、触媒領域の描写が可能になり、トランスグリコシラーゼ活性を特異的に阻害できる分子の設計が容易になる。好ましい形態においては、本発明のトランスグリコシラーゼ欠損ポリペプチドは、上記ポリペプチドをコードする遺伝子の第二の保存領域における突然変異または欠失により、トランスグリコシラーゼ活性を欠くポリペプチドである。さらに好ましい形態では、本発明のトランスグリコシラーゼ欠損ポリペプチドは配列表の配列番号：７、８、９または10と同一のアミノ酸配列を有する。ペニシリン結合タンパク質の濃縮に用いられる慣用の精製操作では「ペニシリン」親和性が使用されてきた。タンパク質のペニシリンへの結合は共有結合であり、結合したタンパク質を溶出するためには過酷な条件が要求される。これがタンパク質の酵素活性のある程度の不活性化を招くことがある。したがって、タンパク質の効率的な精製には別の親和性マトリックスが必要である。したがって、本発明は、(ａ)本発明のPBP変異体である第一のポリペプチドと( ｂ)親和性マトリックスへの結合を可能にする付加的ポリペプチドからなり、上記両ポリペプチドの間に切断部位が存在するポリペプチドを包含する。上述の「付加的ポリペプチド」は、好ましくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと実質的に類似のポリペプチドである。このような付加的ポリペプチドは、Glutathione Sepharose（登録商標）親和性マトリックスを用いるタンパク質の迅速な精製を可能にする。他の好ましい形態では、付加的ポリペプチドはヒスチジン残基に富むポリペプチドであり、この残基はタンパク質にNi親和性カラムへの結合能を付与する。付加的ポリペプチドは可溶性／膜結合PBPのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合させることができる。親和性マトリックスへの融合タンパク質の結合能はタンパク質の固定化を可能にする。このような固定化タンパク質は、結合活性タンパク質への様々なリガンドの競合的結合の解析に、すなわち、興味ある酵素ドメインに結合する化合物のスクリーニングに使用することができる。本発明のポリペプチドは配列表に示すいずれかの配列に厳密に限定されるものではない。そうではなく本発明は、置換、小部分の欠失、挿入または逆位のような修飾を有するが、配列表に開示されたアミノ酸配列のPBP変異体の生化学的活性を実質的に有するポリペプチドを包含する。したがって本発明は、本発明のPBP変異体のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％のホモロジーを示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本発明の他の目的は、本発明のPBP変異体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離および精製DNA分子を提供することにある。本発明の好ましい形態においては、上記DNA分子は配列表の配列番号：１、３または５と同一のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、本発明のDNA分子は配列表に示すいずれかの配列に厳密に限定されるものではない。そうではなく本発明は、置換、小部分の欠失、挿入または逆位のような修飾を有するが、本発明によるPBP変異体の生化学的活性を実質的に有するタンパク質をコードするDNA 分子を包含する。本発明はまた、本発明によるPBP変異体をコードする上記ヌクレオチド配列と遺伝子暗号が縮重するヌクレオチド配列を有するDNA分子を包含する。遺伝子暗号の天然の縮重は本技術分野において周知である。すなわち、配列表に示すDNA 配列は配列表に示すアミノ酸配列のPBP変異体をコードする多くの、ただし特定のグループのDNA配列中の例にすぎないことを理解すべきである。本発明のさらに他の態様は、本発明のDNA分子を有し、その発現を誘導できる複製可能な発現ベクターである。この場合、「複製可能」の語は、ベクターが導入された与えられた種類の宿主細胞内において複製できることを意味する。ベクターの例はウイルス、たとえばバクテリオファージ、コスミド、プラスミドおよび他の組換えベクターである。核酸分子は本技術分野において周知の方法によりベクターゲノム中に挿入される。本発明のベクターは、好ましくは以下の表１に掲げるプラスミドの一つとすることができる。本発明はまた、本発明によるベクターが導入された宿主細胞を包含する。このような宿主細胞は、原核細胞、単細胞真核細胞または多細胞生物体から誘導される細胞とすることができる。すなわち、宿主細胞はたとえば、細菌、酵母または哺乳動物細胞とすることができる。宿主細胞へのベクターの導入を行うために用いられる方法は組換えDNA技術の熟練者には周知の通りである。本発明のさらに他の態様は、ペニシリン結合タンパク質の誘導体であるポリペプチドの製造方法において、本発明の宿主細胞をポリペプチドの発現のための培養培地中または培養培地上で増殖させ、所望によりそのポリペプチドを回収することからなる方法である。適当な宿主細胞は上述の任意の細胞型とすることができ、細胞の増殖に用いられる培地はその目的に適した任意の慣用培地とすることができる。高分子量−ペニシリン結合タンパク質は膜に結合することが示されているが、タンパク質の大部分は、細胞の細胞周辺腔内に存在する（Edelmanら，1987）。したがって、膜シグナル／結合配列を欠くPBP誘導体は異種環境すなわちサイトゾル内ではそれらのネイティブな状態へのフォールディングを強いられる。これはミスフォールディングを生じることが多く、発現したタンパク質の大部分は封入体と呼ばれる不活性型に凝集する。上記PBP変異体をコードする遺伝子の調節された転写によれば、驚くべきことに、高収率の活性な水溶性PBP変異体が得られることが見出された。このような調節された転写は、(ｉ)至適以下の濃度のインデューサー、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）の使用、および(ii)PBP 変異体を発現する細胞の低温における培養を包含する。これらの因子の累積効果が活性な可溶性タンパク質の総回収率に寄与する。その結果、(ｉ)プロモーター系の至適以下の脱抑制および(ii)培養温度の低下による世代時間の延長の上述の組合せによって達成される発現速度の低下が、膜結合セグメントを欠くタンパク質の溶解度を上昇させることになる。本発明のさらに他の重要な態様は、本発明による水溶性ポリペプチドの製造方法において、上記ポリペプチドのDNAコード配列をイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）誘導性プロモーターの制御下に有する発現ベクターが導入された大腸菌細胞を培養することからなり、この培養を上記プロモーターの誘導に至適以下の濃度のIPTGの存在下、20〜24℃の範囲の温度、好ましくは22℃で行う方法である。IPTGの濃度は約0.01mMとすることが好ましい。本発明のPBP変異体をコードする遺伝子、ponA del 23の発現の場合、(ｉ)至適以下濃度のインデューサー、IPTGの使用によるＴ７プロモーターの制御された脱抑制および(ii)22℃における培養による増殖速度の低下によって調節された転写によれば誘導された総タンパク質のほぼ50％に達する活性タンパク質収率が得られる。この増殖および誘導条件は、より高い温度での増殖またはより高いIPTG濃度での誘導では大部分のタンパク質が不活性化し封入体を形成することから、可溶性タンパク質の効率的な回収に必須であった。制御された発現のためのこの方法は、他の誘導性プロモーター系、たとえばインデューサーがIPTGで宿主がlacY陰性宿主の場合のtac系にも適用可能であると考えられる。酵素の活性部位コンフィギュレーションに関する関連構造情報を得る経路は、酵素反応を阻害できるモノクローナル抗体の産生と特性解析である。活性を阻害する抗体は、基質の活性部位ポケットへの進入を遮断するかもしくはそれと競合する分子であるか、または触媒活性に必要な構造転位を妨害できる分子である。いずれの場合も、これらの抗体は、阻害抗体の親和性が既知であれば、相互作用の親和性を判断すべき放射標識阻害化合物の結合と標的酵素の相互作用の定量手段として使用できる。さらに、阻害抗体によって認識されるエピトープのマッピングに使用すれば、活性部位を形成する残基の描出が可能である。したがって、本発明のさらに他の態様は、細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質を結合できる抗体の同定方法において、本発明によるポリペプチドを抗体結合アッセイに使用し、ポリペプチドに結合する抗体を選択する工程を包含する方法である。本発明はまた本発明のPBP変異体に対するモノクローナル抗体を包含する。このようなモノクローナル抗体は、免疫処置動物からの抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合し、所望の抗体を産生する得られた融合腫細胞系を選択することにより、既知の融合腫技術を用いて調製することができる。本発明の他の態様は、ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法において、(ａ)本発明のPBP変異体であるポリペプチドを検討すべき化合物と接触させ、ついで(ｂ)上記化合物が上記PBP変異体に結合するかどうかを検出することからなる方法である。たとえば、ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法は、(ａ)本発明の宿主細胞を培養し、(ｂ)上記細胞を溶解させて粗製の細胞抽出物を単離し、(ｃ)上記細胞抽出物をペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｄ)ペニシリン結合タンパク質に結合することが既知の物質を上記細胞抽出物に導入し、(ｅ)上記物質の非結合分画を除去し、ついで(ｆ)細胞抽出物中に残存する上記物質の存在をアッセイすることからなる方法とすることができる。ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の他の検定方法は、(ａ)本発明の PBP変異体であるポリペプチドを固体支持体上に固定化してペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)固定化したポリペプチドにペニシリン結合タンパク質に結合することが既知の物質を暴露し、(ｃ)上記物質の非結合分画を除去し、ついで(ｄ)固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法とすることができる。好ましい形態においては、上記方法は、ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合する化合物の検定方法であり、(ａ)本発明のポリペプチドのトランスグリコシラーゼドメインを、そのポリペプチドがトランスグリコシラーゼ欠損PBP変異体ではないことを条件に、固体支持体上に固定化してペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合することが既知の物質を固定化したポリペプチドに暴露し、(ｃ)上記物質の非結合分画を除去し、ついで(ｄ)固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法である。トランスペプチダーゼに特異的な抗体は、BIAcoreセンサーチップ表面に固定化することができる。BIAcore（BIAは”Biospecific Interaction Analysis”の略である）システムはPharmacia Biosensor,Swedenから入手できる。固定化された抗体へのタンパク質の結合は放出RU−シグナルにより検出される。TPインヒビターのスクリーニングは、可溶性タンパク質を試験化合物と予めインキュベートする競合アッセイにより可能である。試験化合物のタンパク質への結合はTP特異的抗体へのタンパク質の結合の低下を生じることになる。同様に、トランスグリコシラーゼに特異的なモノクローナル抗体はTGインヒビターのスクリーニングに使用できる。同様の方法で、アンピシリンまたは改良モエノマイシンを表面にカップリングさせ、BIAcoreへの導入に先立ちタンパク質を試験リガンドとプレインキュベートする間接競合アッセイに使用することができる。したがって、ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物のさらに他の検定方法は、(ａ)本発明のPBP変異体であるポリペプチドをペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質に結合することが既知の物質を固体支持体上に固定化して上記ポリペプチドを暴露し、ついで( ｃ)固定化した物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法とすることができる。好ましい形態においては、上記方法は、ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合する化合物の検定方法であり、(ａ)本発明のポリペプチドのトランスグリコシラーゼドメインを、そのポリペプチドがトランスグリコシラーゼ欠損PBP変異体ではないことを条件に、ペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合することが既知の物質を固体支持体上に固定化して、上記ポリペプチドを暴露し、ついで(ｃ)固定化した物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法である。上述の「ペニシリン結合タンパク質に結合することが既知の物質」とは、たとえば、モノクローナル抗体もしくは標識抗生物質化合物たとえば[³H]アンピシリンとすることができる。本発明の他の態様は、本発明のPBP変異体であるポリペプチドをＸ−線結晶解析に利用することを特徴とする、ペニシリン結合タンパク質のタンパク構造の決定方法である。本発明の好ましいPBP変異体の一部の特徴を以下の表１にまとめる。表に掲げたプラスミドはブタペスト条約により、the National Collections of Industri al and Marine Bacteria Limited（NCIMB），Aberdeen，Scotland，UKに寄託された。寄託日は1994年６月28日である。発明の実施例以下の実施例において、「標準プロトコール」ならびに「標準操作」の用語は、通常の実験マニュアル、たとえばSambrook，Fritsch & Maniatisのマニュアル（1989）にみられるプロトコールおよび操作と理解すべきである。実施例１１.１．大腸菌PBP 1Aの可溶型をコードする遺伝子の構築 PBP 1Aの膜結合領域に包含される可能性のあるアミノ酸の残基をKyte & Dolit tle(1982)により報告されたコンピュータープログラムに従い推定した。Ｎ末端6 0アミノ酸の予想される疎水性を図１に示す。この疎水性プロフィルに基づき、そのタンパク質の膜結合ドメインにはＮ末端23アミノ酸の寄与が深く関わっていることが予想されたが、膜結合ドメインを必ずしも包含するとは考えられない。したがって、この領域を推定的に「膜結合」関連領域と命名した。ネイティブなponA遺伝子(野生型PBP 1Aをコードする)が導入されているプラスミドpBS98はUniversity of Sussex，Brighton，UKのSchool of Biological Scie nces，Microbial Genetics GroupのB.S．Spratt教授から恵与された。pBS98の構築についてはBroome-Smithら(1985)に記載されている。pBS98が導入された細胞からのプラスミドDNAは、以下の標準プロトコールに従って調製された。ポリメラーゼチェーン反応(PCR)に用いたオリゴヌクレオチドプライマーはApp lied Biosystems 380A型で合成した。使用した5′−オリゴヌクレオチドプライマーはTG-82：とした。 TG-82は以下の特性を導入する。(１)それは発現された突然変異タンパク質の２番目のアミノ酸として野生型PBP 1Aの24番目のアミノ酸（グリシン）をもつ生成物をコードする突然変異ponA遺伝子の構築を可能にする。(２)それは制限酵素 NcoＩによって認識されるDNA配列を導入する。これは適当なシステム内で発現された場合、突然変異PBP 1Aの最初のアミノ酸に相当するコドンATGを導入する。使用した3′−オリゴヌクレオチドプライマーはTG-64：とした。 TG-64は以下の特性を有する。(１)それは、PBP 1Aの構造タンパク質の850番目のアミノ酸に続いて終結コドンを導入する。(２)それは、制限酵素BamH I部位を導入し、適当な発現ベクターへのクローニングを容易にする。これらのプライマーを使用し、鋳型としてpBS98DNAを用いて標準プロトコールに従いPCRを行った。約2.5 kbのDNAフラグメントが増幅された。フラグメントを制限酵素NcoＩで消化し、ついでBamHＩにより消化した。この2.5 kb NcoＩ−Bam HＩ DNAフラグメントをついで、予めNcoＩおよびBamHＩで切断したベクターpBR3 29(Covarrubiasら，1982)にライゲートした。２つのDNAフラグメントのライゲーションは標準プロトコールを用いて行い、ライゲーション混合物を大腸菌DH5α にトランスフォームした。トランスフォームされた細胞を、50μg／mlのアンピシリンを含むLBアガールプレート上にて平板培養した。37℃で一夜インキュベートしたのち、Nco Ｉ−BamHＩ領域への挿入によりプラスミドをクロラムフェニコールおよびテトラサイクリン感受性にして、個々のアンピシリン抵抗性コロニーについて、それらのテトラサイクリン感受性を試験した。2.5 kb挿入体を有する組換えプラスミドはpARC 0488と命名した。 NcoＩ−BamHＩ 2.5 kb DNAフラグメントをpARC 0488から放出させ、NcoＩ−Ba mHＩ切断、精製pARC 038(図２)にライゲートした。プラスミドpARC 038は、pET 11ｄ（Studierら，1990）の誘導体であり、そのEcoRＩおよびPstＩ部位はT4エキソヌクレアーゼによりブラント末端化され、EcoRＩ−PstＩ 0.75 kb DNAフラグメントはブラント末端化カナマイシン抵抗性カートリッジ（Pharmacia Biochemi cals）で置換されている。ライゲーション混合物を大腸菌BL26(DE3)のコンピーテント細胞にトランスフォームした。トランスフォーメーション混合物を、50μ g／mlのカナマイシンを含むLBアガール上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを数個のカナマイシン抵抗性コロニーから調製して、標準操作を用いて制限エンドヌクレアーゼマッピングによりスクリーニングした。期待された構造を有するプラスミド（図３）が導入されたコロニーの１つを、 pARC 0558と命名した（NCIMB 40666）。ponA del 23と表示した突然変異ponA遺伝子のDNA配列を、配列番号：１として示す。可溶性PBP 1A del 23のアミノ酸配列を配列番号：２として示す。１.２．ponA del 23の発現大腸菌BL26（DE3）細胞（Brookhaven National Lab.，Long Island，NY，USA のBiology Dept.：J.J．Dunn博士から入手）にpARC 0558を導入し、50μg／ml のカナマイシンを含むLB上で600nmにおけるＯ.Ｄ.が0.6に達するまで増殖させ、0.01mMイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）で６時間誘導した。６時間誘導後、細胞を収穫し、フレンチプレスを通過させて破壊した。低速で遠心分離して破壊されていない細胞および細胞屑を除去したのち、サイトゾル（可溶性）分画を以下の２つの方法のいずれかで得た。すなわち、(１)ペレット、膜および可溶性タンパク質をスクロース勾配遠心分離により分離する Pageら(19 82)によって報告された操作、または(２)得られた上清を200,000×ｇで90分遠心し、ついで得られた上清をサイトゾル／可溶性タンパク質分画として採取する操作による方法である。１.３．発現したPBP 1A del 23のペニシリン結合得られたサイトゾル分画について、Rojoら（1984）の方法により、突然変異PB P 1Aの存在を試験した。この操作は標識ペニシリンとしてPBP 1Aに特異的な［¹² ⁵ I］セフラジンの使用を包含する。標識セフラジンを結合できる突然変異PBP 1A del 23はサイトゾル分画中に証明することができた。発現した突然変異タンパク質の約50％は可溶性タンパク質として分画化され、一方、残りの50％は封入体および／または膜関連分画中に分画化された。すなわち、細胞は至適以下の濃度のIPTGで誘導され、培養体は22℃で増殖させたことから、活性な突然変異PBP 1A del 23のレベルの上昇が達成された。可溶性PBP 1A del 23のペニシリン結合プロフィルを図４に示す。１.４．可溶性PBP 1A del 23の精製 22℃における６時間の誘導後得られた大腸菌BL26（DE3）／pARC 0558の細胞ペレットを緩衝液Ａ（30mMトリス−Cl，pH 8.0；10mM EDTA； 10μg／mlロイペプチン；10μg／mlアプロチニン；５mM DTT）で２回洗浄し、同一の緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を1200psiでフレンチプレスを通過させた。溶解物を10,000rpmで10分間遠心し、得られた上清を 200,000×ｇで45分間遠心分離した。得られた上清をついで硫酸アンモニウムで30％飽和に調整した。混合物を12,000rpmで10分間遠心し、ペレットを１Ｍ NaClを含む緩衝液Ａに再懸濁した。溶解したペレットをついでセフラジン−Affigel 10マトリックスで処理した。セフラジンは製造業者（Biorad Laboratories，USA）の説明書に従いAffige l 10に接合させた。可溶性PBP 1A del 23含有分画を１Ｍ NaCl含有緩衝液Ａに溶解し、セフラジン−Affigel 10ビーズと４℃で16時間インキュベートした。ついでビーズを１Ｍ NaCl含有緩衝液Ａにより280nmにおける吸収がほぼ０になるまで洗浄した。PBP 1A del 23の溶出は洗浄液中のペニシリン結合活性のアッセイによってモニターした。この活性は、Rojoら（1984）の記載に従い調製した［¹²⁵I ］セフラジンを用いて測定した。結合したPBP 1A del 23をビーズから１Ｍヒドロキシルアミン（pH 8.5）を用いて25℃で120分間溶出した。この分画を、0.25 Ｍ NaCl含有緩衝液Ａ中YM30フィルター(Amicon，USA)を用い、限外ろ過によって濃縮した。この限外ろ過によりヒドロキシルアミンも除去された。PBP 1A del 2 3に相当するタンパク種の＞85％を含む精製分画は、ペニシリン結合活性およびトランスグリコシラーゼ酵素活性の両方を示した。精製の様々な段階で得られた異なる分画のクーマッシーブリリアントブルー染色によって観察されたタンパク質プロフィルならびに[¹²⁵I]セフラジン／ペニシリン結合プロフィルを図５に示す。可溶性PBP 1A del 23のＮ末端アミノ酸配列は精製タンパク質の配列決定で確認された。１.５．可溶性PBP 1A del 23のトランスグリコシラーゼ活性可溶性PBP 1A del 23タンパク質のトランスグリコシラーゼ活性は、ほぼIshin oら（1980）によって記載された方法を用いて測定した。酵素活性の検出のための基質は、Heijenoortら（1992）によって記載されたプロトコールにほぼ従って調製し、精製した。形成されたペプチドグリカンの量として測定したPBP 1A del 23の濃度依存性トランスグリコシラーゼ活性は、様々な濃度の膜結合型ネイティブPBP 1Aにより形成されるペプチドグリカンの量に匹敵した。図６に示すように、突然変異可溶性PBP 1A del 23のペプチドグリカン重合効率は膜結合型タンパク質の酵素活性とほぼ同一であった。したがって、この23アミノ酸残基の連鎖の除去はタンパク質の能力を妨害しないことが見出され、そのネイティブな構造は、両酵素活性すなわちトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ活性を発揮できることが推定される。実施例２２.１．可溶型大腸菌PBP 1Bをコードする遺伝子の構築 PBP 1BをコードするponB遺伝子はプラスミドpBS96に導入された形でUniversit y of Sussex，Brighton，UKのSchool of Biological Sciences，Microbial Gene tics Group: B.S.Spratt教授から恵与された。 pBS96の構築ならびに野生型ponB遺伝子のヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配列はBroome-Smithら（1985）に記載されている。 Kyte & Doolittle(1982)の方法を用いて誘導されるＮ末端約150アミノ酸のハイドロパシープロットを図７に示す。ハイドロパシープロットの解析により、PB P 1B配列の位置65〜87におけるアミノ酸がＮ末端の疎水性に大きく寄与することおよびタンパク質の膜結合ドメイン候補としてアサインできることが示された。さらに、Edelmanら(1987)のβ−ラクタマーゼの研究により、アミノ酸位置87に対してＣ末端のアミノ酸は大腸菌細胞の細胞周辺腔に存在すること、およびPBP 1Bの位置65に対してＮ末端のアミノ酸は細胞のサイトプラズマ内にあることが示されていた。可溶型PBP 1Bをコードする突然変異ponB遺伝子の構築に用いられた戦略を図８に示す。最初に、ponB遺伝子の5′−末端約200 bpのDNAフラグメントを、プラスミドpBS96上のponB遺伝子(Broome-Smithら，1985)からPCRにより増幅した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、その配列のATG開始コドンと一致してNcoＩ制限酵素部位を含有する5′−プライマー、TG-77（5′-GAA AAA CCA TGG CCG GG A ATG ACC-3′）、および制限酵素NruＩ部位を包含し、PBP 1B配列の位置64に相当するアミノ酸をコードする3′−プライマーTG-84（5′-AAG TCG CGA GCC GCG TTT GCC AC-3′）とした。工程１：酵素NcoＩおよびNruＩにより制限後のPCR増幅フラグメントをクローニングベクターpBR329(Covarrubiasら，1982)のNcoＩ−NruＩ部位にクローン化した。ライゲーション、トランスフォーメーションおよびスクリーニングは標準プロトコールを用いて実施し、期待された構造をもつ組換えプラスミドを得て、 pARC 0547と命名した（図８）。約1.2 kbの他のDNAフラグメントは、アミノ酸87〜480に相当するプライマー配列を使用して、PCRにより増幅した。このDNAフラグメントはPBP 1BのTGドメインのＣ末端ハーフをコードする。使用したプライマーは、制限酵素EcoRＶの切断部位のヌクレオチド配列を含む5′−プライマー、TG-79（5′-CGG ATA TCG ATC AA A AAA TTC GTA GCC G-3′）、およびBamHＩ切断配列を包含する3′−プライマー、TG-80（5′-GCG GAT CCT TAG TCG ACG ACC ACA ATC GCA G-3′）とした。工程２：このフラグメントのPCR増幅は鋳型としてpBS96上ponB遺伝子(Broome- Smithら，1985)DNAを用いて行った。増幅されたフラグメントはpBR329(Covarrub iasら，1982)のEcoRＶ−BamHＩ部位に標準プロトコールを用いてクローン化した。得られた組換えプラスミドはpARC 0534と命名した（図８）。工程３：pARC 0547にクローン化した200 bpのNcoＩ−NruＩフラグメントをNco Ｉ−NruＩフラグメントとして切り出し、NcoＩ−EcoRＶ切断pARC 0534中にクローン化してpARC 0551を得た（図８）。 pARC 0551上の突然変異ponB遺伝子は、PBP 1BのＮ末端64アミノ酸をコードするDNA配列がアミノ酸88〜480をコードするヌクレオチド配列に融合したDNA配列を有する。pBS96の1.3 kb PstＩ−BamHＩ DNAフラグメントを、ついでPstＩ−Ba mHＩ切断pARC 0551にライゲートし、ライゲーション混合物を標準操作を用いて大腸菌DH５αにトランスフォームした。ついで個々のトランスフォーマントをスクリーニングして、期待された構造をもつ組換えプラスミドが導入されたコロニーを同定した。このプラスミドは、pARC 0552と命名された。ついで、突然変異p onBの完全遺伝子を包含するpARC 0552からNcoＩ−BamHＩフラグメントを切り出し、T7発現ベクターpARC 038にライゲートしてpARC 0559を得た（NCIMB40667，図９）。工程１のクローン化フラグメントの3′末端はヌクレオチド配列TCG(部分NruＩ部位配列)を有し、一方、工程２にてクローン化されたフラグメントの5′末端は配列ATC(部分EcoRＶ切断配列)を有する。TCGとATCの融合の結果である接合ヌクレオチド配列により、セリンおよびイソロイシンのコドンが導入される。すなわち、この突然変異ponB遺伝子は野生型PBP 1Bに相当するアミノ酸配列１〜64が配列87〜844に融合したPBP 1B をコードする。２つの連鎖はアミノ酸セリンおよびイソロイシンで連結される。この突然変異ponB遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号：３として、それから誘導されるアミノ酸配列を配列番号：４として示す。２.２．可溶性PBP 1Bの発現 pARC 0559のプラスミドDNAをT7発現宿主、大腸菌BL26(DE3)にトランスフォームし、トランスフォームされたプラスミドの制限地図プロフィルを標準操作を用いて確認した。大腸菌BL26（DE3）／pARC 0559を22℃で増殖させ、0.01mM IPTG で誘導し、細胞を６時間増殖させた。ついで細胞を収穫し、フレンチプレスを通過させて破壊した。溶解物を10,000rpmで10分間遠心分離し、得られた上清をBec kman超遠心分離器により200,000×ｇで45分間遠心分離した。２.３．発現した可溶性PBP 1Bの特性解析得られた上清、すなわちサイトゾル／可溶性分画について、突然変異PBP 1Bの存在を、放射性リガンドとして［¹²⁵I］アンピシリンを用いて試験した。［¹²⁵I ］アンピシリンは［¹²⁵I］セフラジンの調製についてのRojoら（1984）の記載と同様にして調製した。突然変異PBP 1Bは可溶性分画に検出され、放射性アンピシリンに結合した。可溶性PBP 1Bはまた、アンピシリン−Affigelビーズを用い、項１.４に記載の操作と同様の操作によっても精製することができた。クーマッシーブルー染色によって観察された様々の分画のタンパク質プロフィルおよびPBP 1B濃縮分画の［¹²⁵ I］アンピシリンの結合を図10に示す。精製されたタンパク質はペプチドグリカン・トランスグリコシラーゼアッセイ（Heijenoortら，1992）において酵素的に活性であり、膜結合性のネイティブな PBP 1Bの場合に匹敵する親和性でペニシリンに結合した。実施例３３.１．肺炎連鎖球菌PBP 1Aの可溶型をコードする遺伝子の構築肺炎連鎖球菌PBP 1Aの分子構造はそのタンパク質がＮ末端膜結合配列を介して膜に結合する事実から、大腸菌のPBP 1AおよびPBP 1Bの場合と類似することが推定される。ネイティブな膜結合肺炎連鎖球菌PBP 1Aをコードする遺伝子のヌクレオチド配列およびそれから誘導されるアミノ酸配列は Martinら(1992)によって記載されている。Kyte & Doolittleプロットによって誘導されるＮ末端の100アミノ酸のハイドロパシシティープロフィルを図11に示す。38アミノ酸の連鎖がこの領域の疎水性に有意に寄与し、膜相互作用ドメインであることが推測された。肺炎連鎖球菌PBP 1Aの突然変異遺伝子は肺炎連鎖球菌PBP 1AのＮ末端38アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失させることによって構築された。標準PCRプロトコールによって、野生型の肺炎連鎖球菌PBP 1A遺伝子をコードする配列を、Martinら（1992）により報告された配列に基づき設計されたプライマーを用い、肺炎連鎖球菌株PM１（Brookhaven National Laboratory，Upton，N ew York，USAのBiology Department：S.A．Lacksから入手）（Lacks,1968）の染色体からの2.5 kb DNAフラグメントとして増幅し、増幅されたフラグメントを肺炎球菌のベクターpLS 101（Balganesh & Lacks，1984）中にクローン化した。肺炎連鎖球菌PBP 1Aの可溶型をコードする突然変異遺伝子は、野生型遺伝子が導入されたプラスミドDNAを鋳型として用い、標準操作でのPCRにより2.3 kb DNA フラグメントを増幅することによって構築された。使用したプライマーの配列は、5′−プライマーTG-24（5′-TAC GTT ACC ATG GCT CCT AGC CTA TCC-3′）および3′−プライマーTG-25（5′-GAC AGG ATC CTG AGA AGA TGT CTT CTC A-3′）とした。 5′−プライマーTG-24は制限酵素NcoＩの認識配列を包含し、一方、3′−プライマーTG-25は制限酵素BamHＩの認識部位を包含する。NcoＩおよびBamHＩで消化したPCR増幅DNAフラグメントをNcoＩ−BamHＩ切断pARC 039にライゲートした。プラスミドpARC 039 はpET8cの誘導体であり(Studierら，1990)、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子がカナマイシン抵抗性カートリッジによって置換されている。標準プロトコールを用いたライゲーションおよびスクリーニング後、組換えプラスミドの構造は詳細な制限地図の作成によって確認し、T7発現宿主、大腸菌BL 21(DE3)（Studierら，1990）にトランスフォームした。この組換えプラスミドは pARC 0512（NCIMB 40665）と命名し、模式的に図12に示す。突然変異肺炎連鎖球菌PBP 1A遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号：５として、それから誘導されるアミノ酸配列を配列番号：６として示す。３.２．可溶型肺炎連鎖球菌PBP 1Aの発現および特性解析可溶性肺炎連鎖球菌PBP 1Aをコードする遺伝子は項１.２の記載と同様に操作して発現させた。大腸菌BL21（DE3）／pARC 0512のサイトゾル分画を単離し、可溶型肺炎連鎖球菌PBP 1A del 38の存在を試験した。結合試験に用いた放射性リガンドは前に記載されたようにして調製した[³H]ベンジルペニシリン(Amersham) とした。培養菌を、22℃、0.01mM IPTGにおいて増殖させ誘導した場合、突然変異遺伝子からの発現タンパク質の約50％は可溶性分画中にあり、[¹²⁵I]ペニシリン(Rojoら，1984)もしくは［³H］ペニシリン（Amersham）と結合することが見出された。この増殖および誘導条件は可溶性タンパク質の効率的な回収に必須であって、より高い温度での増殖またはより高いIPTG濃度における誘導では大部分のタンパク質が不活性化し、封入体を形成した。可溶性の活性タンパク質の至適レベルは６〜８時間の誘導後に認められた（図13）。可溶性肺炎連鎖球菌PBP 1A del 38タンパク質も可溶性大腸菌PBP 1Bタンパク質の精製に用いたプロトコールにほぼ従い、効率的に精製することができた。可溶性PBP 1A del 38のペニシリン結合効率はネイティブな膜結合肺炎連鎖球菌PBP 1Aの場合に匹敵するものであった。実施例４４.１．トランスグリコシラーゼ欠損大腸菌PBP 1B 領域２内の保存されたアミノ酸（図14）を部位特異的突然変異誘発のために選択した。10アミノ酸のこの連鎖内に３つの異なる突然変異を構築した。 (a) PBP 1B配列の位置270および271におけるグルタミンをアラニンに変化させた。 (b) PBP 1B配列の位置270および271におけるグルタミンをロイシンに変化させた。 (c) 位置264〜271のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の欠失。 ponB遺伝子の突然変異体はKunkelら（1985）の操作にほぼ従って構築した。プラスミドpBS96のponB遺伝子の1.5 kb EcoRＩ−SalＩフラグメントを切り出し、E coRＩ−SalＩで切断したＭ13mp 19中に標準プロトコールによってクローン化した。 (ａ) グルタミン残基270および271をコードするヌクレオチド配列をアラニン残基をコードする配列に突然変異させるために使用したプライマーはTG-21：であった。 (ｂ) グルタミン残基270および271をコードするヌクレオチド配列をロイシン残基に突然変異させるために使用したプライマーはTG-23：であった。 (ｃ) すべて保存領域２内にある位置264〜271のアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失を作成するために使用したプライマーはTG-22：であった。突然変異後、突然変異したEcoRＩ−SalＩフラグメントのヌクレオチド配列をS angerら（1977）のプロトコールに従って決定した。配列決定によってヌクレオチドの変化を確認し、無関係な変化を除外した。この突然変異1.5 kb DNAフラグメントをEcoRＩ−SalＩで切断したpBS96にライゲートして戻し、ライゲートした DNAを標準プロトコールによって大腸菌DH５α細胞にトランスフォームした。カナマイシン抵抗性トランスフォーマントについてそれらのプラスミドプロフィルを解析し、TG-21突然変異(ａ)を有するプラスミドをpARC 0438と命名した(NCIMB 40661)。突然変異タンパク質は、PBP 1B QQ-AAと呼ぶ（配列番号：７）。 TG-23によって導入された突然変異(ｂ)を有するプラスミドは、pARC 0468と命名した（NCIMB 40662）。この突然変異タンパク質は、PBP 1BQQ-LLと呼ぶ（配列番号：８）。 TG-22 を用いて得られた欠失(ｃ)を有するプラスミドは、pARC 0469 と命名した(NCIMB 40663)。突然変異タンパク質は、PBP 1B del８と呼ぶ（配列番号：９）。 pBS96、pARC 0438、pARC 0468およびpARC 0469の４種のプラスミドDNAをそれぞれ、欠失したponB遺伝子がスペクチノマイシン抵抗性マーカーで標識された大腸菌ponB：spc^r細胞（Broome-Smithら，1985）にトランスフォームした。プラスミドpBS96、pARC 0438またはpARC 0469をそれぞれ有する大腸菌ponB：s pc^r細胞を増殖させ、Spratt（1977）により記載された操作に従い膜プレパレーションを作成し、ペニシリン結合タンパク質のプロフィルを放射性ペニシリンで標識後８％SDS-PAGE上で解析した。突然変異タンパク質は最初に精製した膜結合ネイティブPBP 1Bに対して産生させた抗−PBP 1B血清を用いて、インビボ安定性および膜への局在を解析した（図15）。突然変異タンパク質は膜に局在することが見出され、抗体と反応する分解タンパク質フラグメントは検出できず、肉眼的な不安定性は認められなかった。さらに、突然変異タンパク質は野生型PBP 1Bの場合に匹敵する親和性でペニシリンに結合した（図15）。トランスグリコシラーゼ活性をHeijenoortら（1978）の記載に従いアッセイしたが、活性は突然変異タンパク質を発現する膜中には検出できず、一方野生型PB P 1Bを有する膜にはトランスグリコシラーゼ活性が認められた。これからアミノ酸263〜271はトランスグリコシラーゼ活性に必須なことが確認される。突然変異タンパク質が野生型の場合に匹敵する親和性でペニシリンを結合できることは、突然変異タンパク質のトランスペプチダーゼ活性も野生型の場合に匹敵することを示唆するものである。プラスミド上で発現された二機能性タンパク質PBP 1BがponAおよびponB両方の欠失をトランスに相補できることがわかっている（Yousifら，1985）ので、トランスグリコシラーゼ陰性／トランスペプチダーゼ陽性タンパク質PBP 1B QQ-AAおよびPBP 1B del８が染色体によりコードされるPBP 1AおよびPBP 1Bの不存在を相補する能力について試験した。野生型ponBおよび突然変異ponB遺伝子を、低コピーベクターpMAK 705(Hamilto n，1989)にクローン化した。得られたプラスミドはpARC 0462（野生型ponB，図1 6）、pARC 0463(ponB del８，図17)、およびpARC 0470(ponB QQ-AA，図18)と命名した。これらのプラスミドをそれぞれ、大腸菌del ponA（ponA遺伝子の欠失した大腸菌）にトランスフォームした。大腸菌del ponA／pARC 0462、大腸菌del ponA／pARC 0463および大腸菌del po nA／pARC 0470をponB：spc^rマーカーの形質導入のためのP1ファージのレシピエントとして用いた。形質導入は Miller(1972)の記載に従い行った。ファージP1 溶解物は大腸菌ponB：spc^r株について作成した（Yousifら，1985）。感染後、感染細胞をスペクチノマイシン上で平板培養した。レシピエントに形質導入された ponB：spc^rを含有するDNAフラグメントの組込みは、染色体ponB遺伝子の不活性化を生じ、染色体をponA^-およびponB^-する。この遺伝子型は細胞に致死的で、大腸菌のスペクチノマイシン抵抗性トランスダクタントはponBまたはponB突然変異体をコードするプラスミドがその機能をトランスに相補可能である場合にのみ生存を維持できる。以下の大腸菌株をトランス−相補のファージＰ１形質導入解析に付した。すなわち、(１)染色体に野生型ponAおよびponBがコードされている大腸菌AMA 1004； (２)染色体のponBは不活性化され、突然変異ponB遺伝子をコードするプラスミドの宿主である大腸菌AMA 1004；(３)野生型ponB遺伝子をコードするプラスミドpARC 0462を保持する大腸菌AMA 1004宿主；(４)PBP 1B del８をコードするプラスミドpARC 0463を有する大腸菌AMA 1004宿主；および( ５)PBP 1B QQ-AAをコードするプラスミドpARC 0470を有する大腸菌AMA 1004である。結果 Km^r導入体数／ml (1) 大腸菌 AMA 1004 3.0×10⁴ (2) 大腸菌 AMA 1004，ponB：spc^r ＜1 (3) 大腸菌 AMA 1004，ponB：spc^r(PBP 1B wt) 1.1×10⁴ (4) 大腸菌 AMA 1004，ponB：spc^r(PBP 1B del 8) ＜1 (5) 大腸菌 AMA 1004，ponB：spc^r(PBP 1B QQ-AA) ＜1 同じP1ファージ溶解物を用い、内部マーカー：trp形質導入についても、匹敵する数のトランスダクタントが得られた。上述の結果は、生存可能なトランスダクタントは野生型PBP 1Bでのみ得られ、 ponB QQ-AAもしくはponB del８によってコードされるTG^-TP⁺生成物はPBP 1Aおよび1Bをコードする染色体の喪失を相補できなかったことを指示している。しかしながら、これらの突然変異タンパク質はペニシリンに結合し、トランスペプチダーゼ活性をもつと推定できることから、相補不能はトランスグリコシラーゼ酵素活性がないことによるものと思われる。これらの結果から、大腸菌細胞の生存能には、PBP 1Aまたは1Bのトランスグリコシラーゼ活性は必須の性質であることが確認される。記述した突然変異体により、領域２はタンパク質のトランスグリコシラーゼ活性に関与することが明らかである。アミノ酸のこの連鎖は４種の高分子量ペニシリン結合タンパク質、すなわち、大腸菌PBP 1A、1Bならびに肺炎連鎖球菌1Aおよびインフルエンザ菌の94 kDaタンパク質内に保存されている（図14）ことから、大腸菌のPBP 1Aおよび1Bによって用いられる基質と類似の基質を利用するすべてのトランスグリコシラーゼ酵素において、この領域の類似の触媒的または構造的関与を推測することは理にかなっている。４.２．トランスグリコシラーゼ欠損大腸菌PBP 1A 保存された領域２を部位特異的突然変異誘発のために選択して、大腸菌PBP 1A の位置123および124のグルタミンをコードするヌクレオチド配列を、以下のように、PCR突然変異誘発によってアラニンをコードする配列に変化させた。ponA遺伝子の5′側ハーフを２つのフラグメント、アミノ酸１〜123に相当する5′フラグメント(フラグメントＡ)およびアミノ酸124〜434に相当する3′フラグメント（フラグメントＢ）として増幅させた。フラグメントＡの増幅に用いた5′−プライマーの配列はTG-93（5′-GCG CGG ACC ATG GTG AAG TTC GTA AAG TAT-3′）とし、一方、フラグメントＡの増幅に用いた3′−プライマーはTG-106（5′-CAG TGC TGC AGT AAT GGT ACT TGC CCC T TG-3′）とした。フラグメントＡの増幅のための3′−プライマーは位置123および124のグルタミン残基をコードする配列のアラニン残基をコードするヌクレオチド配列への変換を可能にする制限酵素PstＩの配列を包含する。フラグメントＢは5′−プライマーTG-107（5′-ATT ACT GCA GCA CTG GCG AGA AAC TTC TTC-3′）および3′−プライマーTG-108（5′-TCG CGA GAT ATC TGG CG GATT GAT CGA CAC-3′）を用いて増幅した。フラグメントＢの増幅のための5′−プライマーは、フラグメントＡを増幅するための3′−プライマーの配列と重複する制限酵素PstＩの配列を包含する。フラグメントＡの3′−末端をフラグメントＢの5′−末端にライゲーションすると、PstＩ部位が再生され、グルタミン123および124をコードするヌクレオチド配列のアラニン123および124への変化が生じる。増幅されたフラグメントＡおよびＢをそれぞれpBR329にクローン化して、相当するクローンpARC 0565 およびpARC 0566 を得た。 pARC 0565およびpARC 0566から得られたフラグメントＡおよびＢをライゲートしてpARC 0567を得た。pARC 0567にpARC 0489[これは、さらにLacＩおよびLacオペレーター配列をもつ以外はpARC 0558(図３)と同一である]のXhoＩ−BamHＩフラグメントを導入することによりponA配列を完成させてpARC 0568を得た。ついでQ₁₂₃-Q₁₂₄のA₁₂₃-A₁₂₄への突然変異領域を包含するpARC 0568のMluＩ−BglII フラグメントを用いて、他の点では同一のpBS98のMluＩ−BglIIフラグメントを置換してプラスミドpARC 0571（図19；NCIMB 40668）を得た。突然変異タンパク質は、PBP 1A QQ-AAと命名した（配列番号：10）。突然変異体発現試験により、突然変異タンパク質は膜に局在し（抗PBP 1A抗体により検出）、ネイティブなPBP 1Aの場合に匹敵する親和性でペニシリンを結合することが明らかにされた（図20）。前項の記述と同様のインビボ相補アッセイを突然変異PBP 1Aタンパク質のトランスに相補する能力をチェックすることによって実施した。インビボ相補はファージP1形質導入を用い、突然変異タンパク質PBP 1A QQ-AAをコードするプラスミドを含有する宿主、大腸菌（レシピエント）del ponAにponB：spc^rを形質導入して行った。相補解析を実施するためには、野生型のponA遺伝子を、低コピーベクターpMAK 705（Hamiltonら，1989）にクローン化してpARC 0583を得、PBP 1A QQ-AAをコードする突然変異ponA遺伝子をpMAK705にクローン化してpARC 0582を得た。以下の大腸菌株をトランス−相補のファージP1形質導入解析に付した。すなわち、(１)染色体にponAおよびponBがコードされている大腸菌AMA 1004；(２)染色体のponAは不活性化されているが、突然変異ponA遺伝子をコードするプラスミドの宿主である大腸菌AMA 1004 ponA；(３)野生型ponA遺伝子をコードするプラスミドpARC 0583を保持する宿主；および(４)PBP 1A QQ-AAをコードするプラスミドpARC 0582を保持する宿主である。結果 Spc^r導入体数／ml (1) 大腸菌 AMA 1004 2.1×10³ (2) 大腸菌 AMA 1004，ponA ＜1 (3) 大腸菌 AMA 1004，ponA（PBP 1A wt） 1.64×10³ (4) 大腸菌 AMA 1004，ponA（PBP 1A QQ-AA）＜1 同じP1ファージ溶解物を用い、内部マーカー：trp形質導入についても、匹敵する数のトランスダクタントが得られた。上に示したように、レシピエントとして大腸菌del ponA／pARC 0582を用いた場合には、生存可能なトランスダクタントを得られず、突然変異PBP 1A QQ-AAは PBP 1A／1Bをコードする染色体の不存在を相補できなかったことを指示している。これは、相補機能の喪失がトランスグリコシラーゼ活性の喪失の反映に違いないことから、PBP 1Aの領域２のQ₁₂₃およびQ₁₂₄もタンパク質のトランスグリコシラーゼ活性に影響することを指示している。タンパク質のトランスペプチダーゼ活性は、そのペニシリン結合親和性により試験して、影響されていない。これらの結果は領域２がトランスグリコシラーゼ酵素機能に関与するアミノ酸の重要な連鎖であることを支持するものであり、このアミノ酸連鎖の進化の過程における強力な保存に対する説明であろうと考えられる。実施例５５.１．トランケィテッド大腸菌PBP 1B Ｎ末端553アミノ酸から構成されるトランケィテッドPBP 1Bをコードする突然変異遺伝子は、5′−プライマーTG-77（5′-GAA AAA CCA TGG CCG GGA ATG ACC- 3′）と3′−プライマーTG-116（5′-ATG GGA TCC TTA ATC ATT CTG CGG TGA-3 ′）を用い、PCR増幅によって構築された。プライマーの5′−末端は野生型におけるアミノ酸553相当し、続いて停止コドンおよび制限酵素BamHＩ部位を設けた。鋳型としてpBS96 DNAを使用し、1.7 kb のフラグメントを増幅した。PCRにより増幅されたフラグメントをPstＩおよびBa mHＩで切断し、PstＩ−BamHＩ制限pARC 0555（pARC 0555は発現ベクターpET 11d にNcoＩ−BamHＩフラグメントとしてクローン化された完全長ponB遺伝子を有する。NcoＩ部位は開始コドンATGを包含する）にクローン化して、pARC 0592(NCIM B40669；図21)を得た。発現タンパク質（配列番号：11）はトランスグリコシラーゼ活性をもつことが示され、したがって、このドメインは機能に無関係であることが確認された。可溶性のトランケィテッドPBP 1BすなわちＮ末端553アミノ酸を有するが65〜8 7の膜結合疎水性ドメインを欠くPBP 1BはpARC 0592のPstＩ−BamHＩフラグメントでpARC 0559（図９）のPstＩ−BamHＩフラグメントを置換することにより構築し、pARC 0593（NCIMB 40670；図22）として得られた。突然変異ponB遺伝子は可溶型のPBP 1Bをコードし、発現タンパク質（配列番号：12）はトランスグリコシラーゼ活性をもつことが見出された。５.２．トランケィテッド大腸菌PBP 1Bの最小基質結合ドメイン PBP 1Bの推定TGドメイン(aa 1〜553)の構造についての詳細なコンピューター解析により、脂質連結基質の結合およびトランスグリコシラーゼ反応には多分aa 210〜368で十分であることが指示された。アミノ酸のこの連鎖は３つの保存されたドメイン、領域Ｉ、IIおよびIIIを包含する。トランケィテッドタンパク質連鎖210〜368をコードする突然変異遺伝子は以下のようにして構築された。配列TG-154(5′-CAA TCC ATG GGT GAG CAG CGT CTG TTT G-3′)を有し、開始コドンATGの直後にPBP 1Bの210番目のアミノ酸をコードする配列が続く5′−プライマーを用い、基質としてのpBS96からサイズ約480 bpのフラグメントを増幅した。配列TG-155(5′-T CCA GAA TTC CAG TTT TGG GTT ACG-3′)に相当する3′−プライマーは、PBP 1Bのアミノ酸368をコードする配列に続いて、エンテロキナーゼ認識部位ならびにヒスチジン連鎖をコードする配列への融合を可能にするEcoR Ｉ制限部位を与えるヌクレオチド配列を有し、これによりタンパク質はNi親和性カラム上で迅速に精製することができる（以下の項６.２参照）。 NcoＩ−EcoRＩフラグメントをNcoＩ−EcoRＩで制限されたプラスミドpARC 040 0にクローン化して組換えプラスミドpARC 0392(NCIMB 40659；図23)を得た。この組換えプラスミドを大腸菌BL26（DE3）にトランスフォームすると、IPTGによる誘導後、約17 kDaのタンパク質は大部分が可溶性分画中に検出された。同様に、PBP 1Aの最小基質結合領域は野生型タンパク質の連鎖 62〜220を包含することが推定できた。このタンパク質のヒスチジン連鎖との融合体としての製造は発現生成物のNi²⁺カラムを用いる高効率の親和性精製を可能にする。結果はトランケィテッドPBP 1Bで得られた結果と同様であろうことが推測できる。実施例６６.１．可溶性大腸菌PBP 1Aのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼへのＮ末端融合 ponA del 23遺伝子のその5′−末端におけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼコード配列へのインフレーム融合は次項に記載する方法で行った。融合遺伝子の構築に選択されたベクターは Pharmacia Biochemicalsから入手したpGEX-3Xであった。ponA del 23の5′−開始コドンATGをグルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼをコードする遺伝子とインフレームに融合させるためには、制限酵素EcoRＩの認識配列を包含するPCRプライマーを用いてBamHＩ部位を導入した。用いた5′−プライマーはTG-115：とした。 3′−プライマーとしては、項４.２に記載のTG-106を使用した。PCR増幅DNAフラグメントＡをBamHＩおよびPstＩで消化して、標準クローニングベクターpUC８のBamHＩ−PstＩ部位にクローン化し、pARC 0496を得た。このフラグメントＡは PBP 1A del 23タンパク質のＮ末端102アミノ酸を包含する。フラグメントＡから得られたBamHＩ−MluＩ(部位はフラグメントＡ内に存在)270 bpフラグメント、pARC 0490［pARC 0490は低コピーベクターpWK S29（Fu Wangら，1991）のXbaＩ−BamHＩ部位にクローン化された野生型ponA遺伝子を有し、ponA del 23遺伝子の3′−末端のEcoRＩフラグメントとしての切断を容易にする］から得られたponA遺伝子の残りの部分を含む2.2 kb MluＩフラグメント、およびEcoRＩ−BamHＩ切断pGEX-3Xを一緒にライゲートし、コンピーテントな大腸菌細胞にトランスフォームした。個々のトランスフォーマントについて組換えプラスミドをスクリーニングし、期待された構造を有するプラスミドを pARC 0499と命名した(NCIMB 40664；図24)。pARC 0499上にコードされる融合生成物は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ配列がそのＣ末端で、Xa因子切断認識配列を介してPBP 1A del 23配列に連結している。１mM IPTGで誘導後、期待されたサイズの融合タンパク質の誘導が認められた。このタンパク質はペニシリンを結合し、トランスグリコシラーゼアッセイにおいて活性であった。懸濁液をフレンチプレスに通して細胞を溶解させたのち、PB P 1A del 23の精製について項１.４に詳述したようにして細胞を含まない上清分画を調製した。上清分画をGlutathione Sepharose（登録商標）マトリックス（P harmacia Bio-chemicals）に通して、結合したGST-PBP 1A del 23をグルタチオンで溶出した。溶出したタンパク質は80％の均一性を示した。遊離のグルタチオンを透析によって除去し、GST-PBP 1A del 23をXa因子で切断した。このようにして精製されたPBP 1A del 23はペニシリン結合およびトランスグリコシラーゼ反応の両方において活性であることが認められた。６.２．可溶性大腸菌PBP 1Aのヒスチジン連鎖へのＣ末端融合 ponA del 23遺伝子のその3′−末端における６個のヒスチジン連鎖コード配列へのインフレーム融合は以下の記載のように実施した。最初の工程においてはponA del 23遺伝子を、鋳型としてpBS98DNAを使用し、5 ′−プライマーTG-115(5′-TCG AGG ATC CCC ATG GGC CTA TAC CGC TAC ATC G-3 ′)および3′−プライマーTTG-121(5′-GTT AGA ATT CGA ACA ATT CCT GTG-3′) を用いて増幅した。 3′−プライマーはponA del 23遺伝子の3′−末端にEcoRＩ部位を導入し、一方、翻訳停止コドンを除去した。PCRによって増幅された修飾ponA del 23遺伝子フラグメントをPstＩとEcoRＩで消化して930 bp5′−末端フラグメントを遊離させ、PstＩ−EcoRＩ消化pBR 329にライゲートして組換えプラスミドpARC 0467を得た。次工程においては、６個のヒスチジンをコードする配列を有する二本鎖合成オリゴヌクレオチドおよびエンテロキナーゼ切断部位として認識されるアミノ酸をコードするDNA配列を合成し、新たにpARC 0467上のponA del 23遺伝子の3′−末端に作成されたEcoRＩ部位にライゲートした。用いた合成オリゴヌクレオチドは TG-122：ならびにTG-123（5′-GAT CCT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTG TCG TCG TCG TCG-3′）とした。プラスミドpARC 0467をEcoRＩで線状化し、合成二本鎖オリゴヌクレオチドをライゲートした。ライゲーション後PstＩ−BamHＩ部位(フラグメントＡ)をライゲーション混合物から遊離させ、pARC 0558(図３)の PstＩ−BamHＩ部位にクローン化してpARC 0400(NCIMB 40660；図25)を得た。突然変異ponA del 23融合遺伝子はしたがってPBP 1A del 23配列を有するタンパク質がそのＣ末端において、His-His-His-His-His-Hisに融合したアミノ酸配列Asp -Asp-Asp-Asp-Lysに融合した配列をコードする。Asp-Asp-Asp-Asp-Lys配列はプロテアーゼであるエンテロキナーゼによって認識されて、リジン残基の後で切断される。６個のヒスチジン残基はタンパク質に金属ニッケルへの結合能を付与する。組換えプラスミドpARC 0400は、大腸菌BL26（DE3）細胞にトランスフォームし、PBP 1A del 23の精製に用いた条件と同一の培養および温度条件下に誘導した。細胞をフレンチプレスを通して溶解した。溶解物は、10,000rpmで10分間遠心分離した。低速遠心分離後に得られた上清を200,000×ｇで45分間遠心分離し、得られた上清をサイトゾル分画とした。この分画は、融合遺伝子によってコードされるタンパク質を含有し、組換え融合タンパク質はPBP 1A del 23EHと命名された。このタンパク質PBP 1A del 23EHは［¹²⁵I］セフラジンを結合し、トランスグリコシラーゼアッセイにおいて活性を示した。可溶性分画をNi親和性カラムに通して、結合したタンパク質をQIAGEN Inc.，9259 Eton Avenue，Chateworth ，CA 91311，USAから入手した“The Qia Expressionist”に記載の操作にほぼ従い、イミダゾールの濃度を上昇させていくバッチ法で溶出させた。PBP 1A del 2 3EHの大部分は250mMイミダゾールで溶出し、ほぼ85％の均質性を示した。カラムから溶出したのはセフラジン結合タンパク質のみであった。すなわち、融合タンパク質がNiカラムに結合する能力は活性タンパク質の効率的な精製ならびに固定化の両方に容易に活用することができる。実施例７７.１．細胞抽出物の酵素アッセイおよびスクリーニングにおける使用実施例６によって調製された粗細胞抽出物は、Hackenbeck（1983）に従って調製された［³H］アンピシリンと反応させて、ペニシリン結合能を解析することができる。操作を大規模なスクリーニングに適合させるためには、反応液の容器に 96ウエル付きマイクロタイタープレートを用い、アッセイはBeckman Biomek ロボットを使用して行った。粗細胞抽出物を［³H］アンピシリンと37℃で15分間混合した。反応液中のタンパク質をTCAで沈殿させ、ガラスフィルター上に集めて、非結合アンピシリンを洗い流し、フィルターをシンチレーションカウンター内でカウントした。別法として、アンピシリンの結合の程度のアッセイにオートラジオグラフィーを使用することができる。上述の方法に基づき、競合アッセイを、PBP変異体のトランスペプチダーゼ部位に結合する試験化合物の能力の評価に使用することができる。このアッセイにおいては、アンピシリンの添加前に、試験化合物を粗細胞抽出物に15分間暴露する。陽性の結果は、ガラスフィルター上に存在する放射能の量の低下によって指示される。７.２．可溶性固定化タンパク質のスクリーニングにおける使用上述のようにして精製したヒスチジンペプチド含有タンパク質は、トランスペプチダーゼ活性またはトランスグリコシラーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングに使用することができる。精製した完全長またはトランケィテッドタンパク質を、予めNi（II）をカップリングさせたアガロースゲル上に固定化する。ついで、固定化したタンパク質を含有するビーズのアリコートをマイクロタイタープレートのウエルに移し、プレートに試験化合物を加えてインキュベートしたのち、非結合試験物質を洗い流す。二機能性タンパク質のトランスペプチダーゼ部位に結合する化合物は反応容器に［³H］アンピシリンを添加し、以下ほぼ上述のようにして検出することができる。別法として、トランスペプチダーゼ領域に結合することが既知のモノクローナル抗体を用いることもできる。トランスグリコシラーゼ部位に結合する化合物は、タンパク質のトランスグリコシラーゼ領域に結合するモノクローナル抗体の使用により競合アッセイで評価することができる。実施例８８.１．PBP 1Aに対するモノクローナル抗体の産生モノクローナル抗体（mAb）の産生のためのプロトコールは“Anti-bodies-A L aboratory Manual”(Harlow David Lane編，Cold Spring Harbor，USA)の記載にほぼ従った。精製した膜結合PBP 1Aを免疫原として用いた。６〜８週齢のBalb− Ｃマウスを、フロインドの完全アジュバント中精製したネイティブなPBP 1A 50 μgで免疫した。フロインドの不完全アジュバント中、PBP 1A 20μgのブースター注射を腹腔内に行った。２週後に、コーティング抗原としてPBP 1Aを用いるEL ISAによって血清抗体の存在をチェックした。循環抗体を有するマウスを、４日間毎日食塩水中PBP 1A 20μgで腹腔内に免疫処置し、マウスを屠殺して融合体を発生させるために脾細胞を単離した。融合実験に使用した骨髄腫細胞系はSp2／0-Ag14とし、これらの細胞を免疫マウスからの脾細胞と10：1の比で融合させた。融合は標準プロトコールを用いて行い、クローンからの抗体の産生は細胞が＞90％コンフルーエントに達したとき PBP 1Aに対するELISAによりモニターした。抗体産生能の高い72のクローンを24ウエルのプレートに展開し、分泌抗体を以下の篩分けにより特性を解析した。すなわち(１)PBP 1Aの膜結合型に対するELISA；(２)PBP 1A del 23の可溶型に対するELISA；(３)精製時のコンフィギュレーションの変化のみにより界面活性剤可溶化精製PBP 1Aと反応するモノクローナル抗体を除外するための膜結合PBP 1Aに対するドットブロット解析；ならびに(４)PBP 1Bの膜結合型に対するELISAである。これらの篩分けに基づき５つの分泌クローンのパネルを選択し、単クローン性を確実にするために２回サブクローニングした。標準操作に従い、これらの融合腫クローンで腹水を誘導させ、これらの腹水液からProtein-G-Sepharose(登録商標)親和性クロマトグラフィーをProtein-G-Sepharose（登録商標）（Pharmacia Biochemicals製）を用いてIgGを精製した。これらの精製抗体は膜結合型および可溶型の両PBP 1Aと、ELISA、ドットブロットおよびウエスタンブロッティングで特異的に反応する。クローンは３細胞／ウエルを用いるクローニング操作によって取得した。単クローン性を確実にするため、これらのクローンを１細胞／ウエルでの限外希釈により、96ウエル付きマイクロタイタープレート中にサブクローニングした。ウエルに１個の細胞が存在することを顕微鏡下に注意深く確認し、単一の融合細胞からの子孫細胞が得られるように、マクロファージフィーダー層で増殖させた。サブクローニング後、完全長PBP 1Aを用いELISAによりPBP 1Aに対するmAbの分泌を再度アッセイした。最後にそれぞれの親ハイブリドーマ腫から２個のクローンを選択し、それらの１個をプリスチン初回抗原刺激Balb／ｃマウスの腹水中で増殖させた。５個のクローンすべてが腹腔内の増殖に適合し、腹水mAbを産生した。腹水mAbを精製PBP 1Aに対しELISAで滴定した。腹水mAbはすべてELISA で＞５×10⁵の力価を示し、ウエスタンイムノブロットにおいて完全長タンパク質を認識した。腹水mAbはプロテイン−Ｇ親和性カラムによって精製した。 mAbの免疫グロブリンアイソタイプは、Sigma Chemicals USAから入手したキットを用いELISAで、マウスIg−アイソタイプによって決定した。４つのモノクローナル抗体はIgG１に、１つはIgG 2a免疫グロブリンアイソタイプに属した。 mAbの特徴の更なる解析には、完全長膜結合PBP 1A／1Bを用いてウエスタンブロットを実施した。さらにmAbのトランスグリコシラーゼ（TG）およびトランスペプチダーゼ（TP）ドメイン特異性を、膜結合性PBP 1AのＮ末端、PBP 1BのＮ末端およびPBP 1BのＣ末端の各種トランケィテッド型を用いてウエスタンイムノブロットにより測定した。多様な完全長およびトランケィテッド膜結合PBPを発現させ、調製された膜分画をSDS-PAGE上で分画した。タンパク質をニトロセルロース膜に移送し、ポリクローナル大腸菌PBP 1A抗体およびモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット解析に付した。 mAbのペニシリン結合阻害能力の評価はBlaauwenら(1990)によって報告されたプロトコールにほぼ従って実施した。プロテイン−Ｇ親和性により精製したmAb をPBP 1Aとプレインキュベートしたのち、[³H]ベンジルペニシリンまたは[¹²⁵I] セフラジンを添加した。２つのmAbがPBP 1Aへの放射標識ペニシリンの結合を競合的に阻害した。 PBP 1AのTGドメインに特異的なモノクローナル抗体は、最初のハイブリドーマクローンの分泌抗体を、PBP 1AのＮ末端434アミノ酸に相当するタンパク質との反応性についてウエスタンブロットでスクリーニングすることにより得られた。クローンTG-2からの抗体は、PBP 1AのＮ末端トランケィテッド434アミノ酸類縁体と反応し、またPBP 1Aのトランスグリコシラーゼ活性を阻害した（＞80％阻害）。これは、抗体が(ａ)基質の結合、(ｂ)酵素の触媒作用、または(ｃ)タンパク質のコンフォーメーションのアロステリックな変化に関与するタンパク質中の配列を認識することを示している。３つの可能性のいずれにおいてもTG-2のPBP 1Aへの結合に競合する化合物の同定はPBP 1A上の同一配列と相互作用する分子を示す。すなわち、競合結合アッセイは、TG阻害化合物の同定のためのスクリーニングアッセイとして使用できるものと考えられる。図面の簡単な説明図１大腸菌PBP 1Aのヒドロパシシティープロフィル。図はPBP 1AのＮ末端55アミノ酸のヒドロパシシティーパターンを拡大した形で示す。図２ T7翻訳融合発現ベクターpARC 038の模式的表示。をコードする遺伝子（lacＩ_q）、複製の起源（ori）、T7lacオペレータープロモーター、T7ファージターミネーター様々な遺伝子の転写方向を矢印で示す。関連制限酵素部位を示す。制限部位の隣の数字は上部の12時の位置を０としてヌクレオチドの位置を表している。図３大腸菌の可溶性PBP 1A del 23をコードするベクターpARC 0558の模式的表示。性Km^r、ラクトースリプレッサー（lacＩ_q）および複製の起源 ori 図４可溶性PBP 1A del 23の発現。パネルＡは、pARC 0558が導入された大腸菌BL26 （DE3）の非誘導および誘導培養液の[¹²⁵I]セフラジン結合プロフィルのオートラジオグラムを示す。パネルＢは、同一の非誘導および誘導細胞のクーマッシーブリリアントブルー染色タンパク質プロフィルを示す。レーン(１)：非誘導サイトゾル分画；(２)非誘導膜分画；(３)誘導サイトゾル分画；(４)誘導膜分画；(Ｍ)分子量マーカー図５精製PBP 1A del 23のSDS-PAGEパターン。パネルＡ：クーマッシーブルー染色。パネルＢ：［¹²⁵I］セフラジン結合タンパク質プロフィル。レーン(１)：大腸菌BL26（DE3）／pARC 0558サイトゾル分画(200,000ｇ上清)；(２)30％硫酸アンモニウムの上清分画；(３)30％硫酸アンモニウムペレット分画；(４)セフラジン affigel通過分画；(５)分子量マーカー；(６〜８)セフラジンaffigel溶出液図６精製タンパク質を用いた野生型PBP 1Aおよび突然変異PBP 1A del 23のトランスグリコシラーゼ活性プロフィル（▲−▲）は可溶性PBP 1A del 23の活性を示す。（●−●）はオクチル−β−グルコシドで可溶化した膜結合PBP 1Aの活性を示す。Ｘ軸は用いたタンパク質の濃度をμgで示す。Ｙ軸は形成されたペプチドグリカン量を示す。図７大腸菌PBP 1Bのハイドロパシシティープロフィル。本図は大腸菌PBP 1BのＮ末端150アミノ酸の拡大ハイドロパシシティープロフィルを示す。図８大腸菌PBP 1Bの可溶性トランスグリコシラーゼドメインのクローニングの模式的表示。配列 PBP 1BのＮ末端64アミノ酸をコードするNcoＩ−NruＩフラグメントをpARC 053 4のNcoＩ−EcoRＶ部位にクローン化し、プラスミドpARC 0551を得た。この組換えプラスミドにはPBP 1Bのアミノ酸65〜87が内部欠失したPBP 1Bのアミノ酸１〜 480をコードする遺伝子が導入されている。図９可溶性PBP 1BをコードするpARC 0559の模式的表示。ラクトースリプレッサー(lacＩ_q)、カナマイシン抵抗性（Km^r）および複製の起源（ori）の配列図10 可溶性PBP 1Bの精製。パネルＡ：各種分画のSDS-PAGE、クーマッシーブルー染色。パネルＢ：同じ分画の［¹²⁵I］アンピシリン結合プロフィル。レーン(１)および(２)：大腸菌BL26（DE3）／pARC 0559誘導細胞のサイトゾル分画；(３)アンピシリン−Affigelカラム通過分画；(４)分子量マーカー；(５ )および(６)アンピシリン−Affigelカラムからの溶出分画図11 肺炎連鎖球菌PBP 1Aのハイドロパシシティープロフィル。図は肺炎連鎖球菌PBP 1AのＮ末端100アミノ酸のハイドロパシシティープロフィルの拡大プロフィルを示す。図12 肺炎連鎖球菌PBP 1Aの可溶型をコードするプラスミドpARC 0512の模式的表示。カナマイシン抵抗性Km^rおよび複製の起源(ori)の配列を示す。図13 可溶性肺炎連鎖球菌PBP 1Aのペニシリン結合プロフィル。宿主：大腸菌BL21（DE3）／pARC 0512。パネルＡ：クーマッシーブルー染色。パネルＢ：［³H］ベンジルペニシリンによるインビボ標識ついでSDS-PAGE。レーン(１)および(２)：22℃でそれぞれ２時間および20時間誘導した細胞のサイトゾル分画；(３)30℃で２時間誘導した細胞のサイトゾル分画；(４)37℃で２時間誘導した細胞のサイトゾル分画；(５)分子量マーカー図14 高分子量ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインの保存領域のアミノ酸アラインメント。本図はＥ.1A(大腸菌PBP 1A)、Ｅ.1B（大腸菌PBP 1B）、Ｓ.1A(肺炎連鎖球菌PB P 1A)およびH．inf（インフルエンザ菌PBP 1A）の間の領域１、２および３における保存残基を比較する。(^*)は同一アミノ酸残基を指示する。図15 突然変異PBP 1Bをコードする遺伝子をもつプラスミドが導入された大腸菌細胞の膜タンパク質の解析。パネルＡ：［³H］ベンジルペニシリンの結合プロフィル。パネルＢ：抗−PBP 1B血清によるウエスタンブロッティング。レーン(１)分子量マーカー；(２)大腸菌JM 101／pBS96細胞の膜分画；(３)大腸菌900521 ponB：spc^r細胞の膜分画（この宿主は染色体コードPBP 1Bを欠く）；(４)大腸菌900521 ponB：spc／pARC 0438細胞の膜分画；(５)大腸菌900521 po nB：spc／pARC 0469の膜分画；および(６)大腸菌900521 ponB：spc／pARC 0468 の膜分画図16 野生型PBP 1BをコードするプラスミドpARC 0462の模式的表示。ルトランスフェラーゼ(cm^r)およびlacZ多重クローニング部位の部分の配列図17 突然変異ponB遺伝子をコードするプラスミドpARC 0463の模式的表示。の起源(ori)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cm^r）およびlacZ多重クローニング部位の部分の配列図18 突然変異ponB遺伝子をコードするプラスミドpARC 0470の模式的表示。複製の起源(ori)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cm^r)およびlacZ多重クローニング部位の部分の配列図19 突然変異ponA遺伝子が導入されたpARC 0571の模式的表示。および複製の起源（ori）の配列図20 野生型および突然変異大腸菌PBP 1Aの［¹²⁵I］ペニシリン結合タンパク質プロフィル。レーン(１)大腸菌AMA 1004 ponB：spc^r／pBS98（w.t.ponA）；(２)大腸菌BL21（DE3）ponB：spc^r／pARC 0570（w.t.ponA）；(３)大腸菌AMA 1004 del p onA／pARC 057（QQ-AA ponA）；(４)大腸菌AMA 1004 del ponA／pBS98（w.t.pon A）；(５)分子量マーカー図21 プラスミドpARC 0592の模式的表示。ケイテッドponB遺伝子、カナマイシン抵抗性（Km^r）、ならびに複製の起源（ori）の配列図22 プラスミドpARC 0593の模式的表示。ンジ1B)をコードする突然変異トランケィテッドponB遺伝子、カナマイシン抵抗性（Km^r）および複製の起源（ori）の配列図23 プラスミドpARC 0392の模式的表示。ロキナーゼ部位ついで６個のヒスチジンの連鎖をコードする配列とインフレームに融合したPBP 1Bタンパク質のトランケィテッドフラグメントをコードする突然変異遺伝子、カナマイシン抵抗性Km^r、ならびに複製の起源（ori）の配列図24 プラスミドpARC 0499の模式的表示。Ｓ−トランスフェラーゼをコードする配列とインフレームに融合した突然変異ponA del 23遺伝子をコードする配列、β−ラクタマーゼamp^rおよび複製の起源（ori）の配列図25 プラスミドpARC 0400の模式的表示。部位ついで６個のヒスチジンの連鎖をコードする配列とインフレームに融合した突然変異ponA del 23配列、カナマイシン抵抗性Km^rおよび複製の起源（ori）の配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質の水溶性の活性誘導体であるポリペプチドであって、上記ペニシリン結合タンパク質は、細菌細胞内で発現された場合には細胞膜に結合し、またトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ両活性を発揮することが可能であり、上記誘導体は、膜結合配列を欠くが上記酵素活性の一方または両方を発揮する能力を維持しているポリペプチド。２．アミノ酸配列が配列表の配列番号：２、４、６、12または13と同一であるかまたはそれと実質的に類似する、請求項１記載のポリペプチド。３．細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼ欠損誘導体であるポリペプチドであって、上記ペニシリン結合タンパク質は、細菌細胞内で発現された場合には細胞膜に結合し、またトランスグリコシラーゼおよびトランスペプチダーゼ両活性を発揮することが可能であり、上記誘導体は、トランスグリコシラーゼ活性を発揮する能力を欠くがトランスペプチダーゼ活性を発揮する能力は保持しているポリペプチド。４．誘導体が、ポリペプチドをコードする遺伝子の第二の保存領域における突然変異または欠失によりトランスグリコシラーゼ活性を欠く、請求項３記載のポリペプチド。５．アミノ酸配列が配列表の配列番号：７、８、９または10と同一であるかまたはそれと実質的に類似する請求項３記載のポリペプチド。６．細菌細胞は大腸菌細胞あるいは肺炎連鎖球菌細胞である、請求項１または３記載のポリペプチド。７．(ａ)請求項１または３記載の第一のポリペプチドおよび(ｂ)親和性マトリックスへの結合を可能にする付加的ポリペプチドからなり、上記両ポリペプチドの間には切断部位を設けたポリペプチド。８．付加的ポリペプチドがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに実質的に類似したポリペプチドである、請求項７記載のポリペプチド。９．付加的ポリペプチドがヒスチジン残基に富むポリペプチドである、請求項７記載のポリペプチド。 10．請求項１、３または７記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離および精製DNA分子。 11．ヌクレオチド配列が配列表の配列番号：１、３または５と同一であるかまたはそれと実質的に類似する、請求項10記載のDNA分子。 12．請求項10記載のDNA分子を有し、その発現を仲介することができる複製可能な発現ベクター。 13．ベクターが、 pARC 0558（NCIMB 40666号）、 pARC 0559（NCIMB 40667号）、 pARC 0512（NCIMB 40665号）、 pARC 0438（NCIMB 40661号）、 pARC 0468（NCIMB 40662号）、 pARC 0469（NCIMB 40663号）、 pARC 0571（NCIMB 40668号）、 pARC 0593（NCIMB 40670号）、 pARC 0392（NCIMB 40659号）、 pARC 0499（NCIMB 40664号）または pARC 0400（NCIMB 40660号）である、請求項12記載のベクター。 14．請求項12記載のベクターが導入された細胞。 15．ペニシリン結合タンパク質の誘導体であるポリペプチドの製造方法において、請求項14記載の細胞をポリペプチドの発現のための培養培地中または培養培地上で増殖させ、所望によりポリペプチドを回収することからなる方法。 16．請求項１記載の水溶性ポリペプチドの製造方法において、上記ポリペプチドのDNAコード配列がイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)誘導性プロモーターの制御下にある発現ベクターを導入した大腸菌細胞を培養することからなり、この培養は上記プロモーターの誘導に至適下限濃度のIPTGの存在下に20〜24℃の範囲の温度で行う方法。 17．細菌の二機能性ペニシリン結合タンパク質を結合できる抗体の同定方法において、請求項１または３記載のポリペプチドを抗体結合アッセイに用い、そのポリペプチドに結合する抗体を選択する工程を包含する方法。 18．ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項１、３または７記載のポリペプチドを調査対象の化合物と接触させ、ついで( ｂ)上記化合物がペニシリン結合タンパク質に結合するかどうかを検出することからなる方法。 19．ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項14記載の細胞を培養し、(ｂ)上記細胞を溶解させて粗製の細胞抽出物を単離し、(ｃ)上記細胞抽出物をペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｄ)ペニシリン結合タンパク質を結合することが知られている物質を上記細胞抽出物に導入し、(ｅ)上記物質の非結合分画を除去し、そして(ｆ)細胞抽出物中に残存する上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。 20．ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項１、３または７記載のポリペプチドを固体支持体上に固定化してペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質を結合することが知られている物質を上記の固定化したポリペプチドに暴露し、( ｃ)上記物質の非結合分画を除去し、そして(ｄ)固定化したポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。 21．ペニシリン結合タンパク質に結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項１、３または７記載のポリペプチドをペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質を結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化し、これに上記ポリペプチドを暴露し、(ｃ)固定化物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。 22．ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項１もしくは７記載のポリペプチドを固体支持体上に固定化させて、該ポリペプチドのトランスグリコシラーゼドメインをペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼ活性の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインを結合することが知られている物質を固定化した上記ポリペプチドに暴露し、(ｃ)上記物質の非結合分画を除去し、そして(ｄ)固定化されたポリペプチドに結合した上記物質の存在をアッセイすることからなる方法。 23．ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合する化合物の検定方法において、(ａ)請求項１または７記載のポリペプチドのトランスグリコシラーゼドメインを、ペニシリン結合タンパク質の潜在的インヒビターに暴露し、(ｂ)ペニシリン結合タンパク質のトランスグリコシラーゼドメインに結合することが知られている物質を固体支持体上に固定化して、それに上記ポリペプチドを暴露し、(ｃ)固定化された物質に結合したポリペプチドの存在をアッセイすることからなる方法。 24．ペニシリン結合タンパク質を結合することが知られている物質がモノクローナル抗体である、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。 25．ペニシリン結合タンパク質を結合することが知られている物質が標識した抗生物質化合物である、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。 26．ペニシリン結合タンパク質のタンパク構造を決定する方法において、請求項１または３記載のポリペプチドをＸ−線結晶解析に利用することを特徴とする方法。