CN106085982B - 青霉素结合蛋白Bt-pbp2X及其应用 - Google Patents

青霉素结合蛋白Bt-pbp2X及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型的青霉素结合蛋白Bt‑pbp2X及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明的蛋白质可以用于制备青霉素类抗生素检测试剂，应用于青霉素类抗生素残留的快速检测，其不需要复杂的仪器设备，样品前处理过程非常的简单，并且对于检测人员技术及知识水平有特定要求，非常适于现场快速检测。

Description

青霉素结合蛋白Bt-pbp2X及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种青霉素结合蛋白及其应用。
背景技术
随着我国大众生活水平的不断提高，人们对食品安全的关注度越来越高，食品中抗生素过量残留的问题已经引起人们的强烈反响。β-内酰胺类抗生素指其分子结构中含有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和青霉烯类酶抑制剂等，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。它是现有在食品中添加的抗生素中使用最普及的一类。长期摄入β-内酰胺类抗生素过量残留的食品将严重导致人们身体健康，抗生素过量残留能破坏胃肠道等菌群的平衡，引起长期的腹泻、维生素缺乏及影响其他治疗药物的疗效；摄入β-内酰胺类抗生素过量残留的食品会导致一部分人群的过敏反应，较轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝组织炎等病症，严重时可引起喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命的危害；长期摄入抗生素过量残留的食品会增强体内细菌对人体的耐药性，以至于出现预想的超级细菌，当人体出现疾病时，可增加治疗难度甚至导致治疗失效。
随着乳品中抗生素残留问题的日益严峻，我国对乳品质量的监管也日趋严格，2007年我国通过了《生鲜乳品收购标准修正案》，其中明确将抗生素残留检验列为强制检测项目并明确制定了各类抗生素在牛乳中的最高残留限量。
目前，国内乳品行业广泛应用的牛乳中青霉素残留的检测方法主要依据国标GB4789.27-94《鲜乳中抗生素残留量检测方法》进行，包括试管法和平板法。商检系统的行业标准检测方法为杯碟法。尽管微生物法在基层单位使用广泛，但该法的精确度、准确度都不够高，且检测过程烦琐，耗时较长，不易筛选到敏感菌株，易受其它抗菌药物的影响，根本无法适应牛乳抗生素残留检测需要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种青霉素类抗生素结合蛋白。
本发明的第二个目的在于提供编码所述青霉素类抗生素结合蛋白的基因。
本发明的第三个目的在于提供所述蛋白在检测青霉素类抗生素中的应用。
本发明从苏云金芽孢杆菌中得到了一种新型的与青霉素具有高亲和力的蛋白质Bt-pbp2X，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，序列全长699个氨基酸，表观分子量为76101.4Da，等电点约为8.80，该蛋白质是一种细菌细胞壁合成过程中具有转肽和转糖催化作用的双功能，该酶参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，并在合成过程中发挥糖基转移酶活性，该酶第30到582氨基酸类似于细胞分裂蛋白FtsI，第60到212氨基酸为二聚体结构域pfam03717，第262到565氨基酸转肽酶结构域pfam00905。
应当理解，此领域相关技术人员可以根据此发明公开的蛋白Bt-pbp2X的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其生物活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第80位的Asn替换为Asp，将第190位的Glu替换为Gly或Ala，将第240位的Gln替换为Thr，将第320位的Lys替换为His，将第56～105位氨基酸缺失，将第1位Met增加6个His组氨酸纯化标签或增加GST标签。因此，本发明的Bt-pbp2X蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt-pbp2X同等活性的由Bt-pbp2X衍生得到的蛋白质。
进一步本发明提供编码上述青霉素结合蛋白Bt-pbp2X的基因。
优选地，所述核苷酸序列为：(1)序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或(2)SEQID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，编码Bt-pbp2X的核苷酸序列。
此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域相关技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从苏云金芽孢杆菌中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。
可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过本领域所熟知的转基因方法转入到其他菌种中，使其具有表达所述蛋白的能力。
在本发明的一个实施例中，将PCR扩增得到的Bt-pbp2X基因插入到表达载体pET28a(+)上构建得到重组表达载体pET28a(+)-pbp2X，并最终转化大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)，使其能诱导表达获得Bt-pbp2X蛋白。
进一步，此发明提供了一种专门用于检测食品中青霉素类抗生素残留的检测试剂，其包括所述的Bt-pbp2X蛋白。所述的用于检测的食品可以是固态、半固态、液态等。固态食品可以通过简单的研磨、粉碎等方式处理后溶于相应溶剂，使食品中青霉素得以释放，并用于青霉素的检测。半固态食品直接向其中加入相应的溶剂使青霉素释放，并进行检测。液态食品可以是饮料、牛奶等，一般可以直接进行检测。
本发明提供的Bt-pbp2X蛋白质具有与β-内酰胺环类抗生素进行特异性结合的能力，可将其应用用于食品中β-内酰胺环类抗生素残留的检测，用此技术研发的产品不需要特殊的仪器设备，样品前处理过程简单方便，并且对检测人员的技术以及知识水平要求低，方便用于食品以及家庭进行现场的快速检测。
附图说明
图1是PCR扩增Bt-pbp2X基因的凝胶电泳图，其中M是DNAMaker，1、2为以苏云金芽孢杆菌BMB171为模板PCR扩增得到的Bt-pbp2X基因。
图2是重组质粒pET28a(+)-pbp2X图谱。
图3是pET28a(+)-Bt-pbp2X的验证，M为DNA Maker，1、2为pET28a(+)-Bt-pbp2X，经EcoRV,XhoI酶切结果，片段大小分别为3.9kb，3.4kb。
图4是Bt-pbp2X蛋白质的纯化结果，其中，M是蛋白分子量标准，1是诱导上清，2是纯化蛋白。
图5是不同青霉素浓度与Bt-pbp2X蛋白质发生特异性相互作用后微热泳变化。
图6是使用Bt-pbp2X蛋白质测定青霉素含量标准曲线。
具体实施方式
实施例1 Bt-pbp2X蛋白的制备
1、苏云金芽孢杆菌总DNA提取
(1)将苏云金芽孢杆菌菌株BMB171接种于5ml PA瓶中28℃过夜活化，次日按1％接种量转接至50ml液体培养基中LB培养基中，28℃，200r/min培养至对数生长期，离心收集菌体，STE洗一次。
(2)加5.75ml Solution I(25mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM葡萄糖)和250μL溶菌酶(200mg/mL)冰浴过夜，
(3)加3ml 10％SDS于50-60℃水浴30min；随后加入3.6ml5MNaCl，冰上10min后直接加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)去除蛋白质；12000r/min，离心15min后取上清，加2倍体积无水乙醇沉淀。70％乙醇洗涤一次。
(4)干燥沉淀，用200μL ddH2O或TE溶30min。并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的浓度和质量。
2、引物设计与合成
根据苏云金芽孢杆菌BMB171中预测的基因序列，设计上下游引物，并在上游引物引入酶切位点及其保护碱基，下游引物引入酶切位点及其保护碱基，引物由北京奥科生物科技有限公司合成。
上游引物CCGCATATGATGAAGTGGACAAAAAG(下划线为NdeI酶切位点，灰色背景为保护碱基)
下游引物CCGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAA(下划线为XhoI酶切位点，灰色背景为保护碱基)
3、PCR扩增Bt-pbp2X基因，具体反应体系如下：
DNA模板，0.5μL
上游引物，1μL
下游引物，1μL
10倍Buffer，2.5μL
dNTP混合物(2.5mmol/L)，2μL
pfu Tap酶，1μL
ddH2O，17μL
反应条件如下：95℃预变性5min；95℃0.5min，55℃0.5min，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段(图1)。
4、Bt-pbp2X蛋白表达菌株的构建
回收的PCR产物37℃NdeI和XhoI双酶切4小时，载体pET-28a也经过NdeI和XhoI双酶切4小时，T4连接酶将外源基因与pET-28a连接成pET28a(+)-pbp2X重组载体(图2)，经EcoRV,XhoI酶切验证为3.9kb，3.4kb符合预期(图3)，转入E.coli DH5ɑ菌株；提取含有Bt-pbp2X基因的重组载体pET28a(+)-pbp2X转化大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)。
5、Bt-pbp2X蛋白的诱导
将含有重组质粒pET28a(+)-pbp2X的E.coli BL21(DE3)在平板上挑取单菌落，接种含有卡拉霉素的LB液体培养基中，37℃过夜活化培养，约14小时后，将菌液按1/100比例加入新鲜的卡拉霉素LB液体培养基，200r/min培养至OD600＝0.8～1.0，加入IPTG诱导(IPTG终浓度为0.1mM)200r/min，16℃培养12小时，将培养瓶置于冰上5分钟；4℃，12000r/min离心收集菌体，预冷的ddH2O重悬菌体沉淀，再次离心收集菌体，备用。
6、Bt-pbp2X蛋白的纯化
用4℃的Soluble Binding Buffer(10mM咪唑，NaCl 0.5M，20mM Tris-HCl，pH＝7.9)重悬菌体，置于冰上超声波破碎至悬液变澄清；4℃，12000r/min离心60分钟，收集上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后缓缓加入到Ni琼脂糖凝胶柱中，随后使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗脱杂蛋；然后用Elution Buffer(500mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH＝7.9)洗脱柱子，收集洗脱液。随后15KDa截流管去除咪唑，得到纯化蛋白质Bt-pbp2X，SDS-PAGE鉴定提取蛋白为单一条带无明显杂蛋白(图4)。经测序鉴定为本发明Bt-pbp2X。
实施例2 微量热泳动仪(MST,NanoTemper Technologies)测定Bt-pbp2X测定青霉素相互作用
微量热泳动仪(MST)是基于下述原理：将蛋白进行荧光标记，采用红外激光光源产生一个温度场，小分子化合物与荧光标记的蛋白结合后导致蛋白电荷、构象等发生改变，则荧光标记的蛋白在温度场中的热泳动快慢发生变化，这种变化反应在荧光值的变化上。将小分子稀释为一定的梯度浓度，若小分子与荧光标记的蛋白有结合，则荧光标记蛋白的热泳动变化也呈一定的规律性，由此可以拟合出二者的结合曲线，求得小分子和蛋白的解离常数(Kd值)。
1、Bt-pbp2X蛋白的荧光标记
依据试剂盒说明书，将纯化后的Bt-pbp2X蛋白浓度稀释16μM，使A柱进行bufferexchange，取100μL蛋白样品加入94μL Labeling buffer和6μLRED-NHS染料混匀，于室温黑暗中孵育30min。孵育结束后，用B柱(分子筛)将游离的未结合染料和已经标记的蛋白样品分离，最终获得约500μL标记的H亚基蛋白样品用于相互作用分析。
2、Bt-pbp2X蛋白与青霉素相互作用测定
测定已经标记的Bt-pbp2X蛋白样品荧光值，筛选不同的稀释浓度调节荧光值在200-1500范围之间。经筛选确定，将蛋白样品用PBS稀释20倍并加入终浓度为0.1％的吐温-20以减小蛋白在毛细管内壁的附着。将青霉素溶于PBS缓冲溶液中配制成将小分子配体，即青霉素溶解于PBS中配制成母液，再用PBS稀释不同的浓度梯度。浓度梯度为0.00375、0.0075、0.015、0.03、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μM的标准溶液。稀释后的蛋白样品和小分子配体化合物于12000rpm，4℃下离心5min，随后分别取上清，然后用PBS将小分子配体化合物进行梯度稀释，共16个浓度梯度。将蛋白样品上清与16个不同浓度的小分子配体化合物1:1混合，填充16根毛细管，进行微量热泳动分析。
3、相关性分析
相关性分析使用统计软件SPSS进行，采用双变量皮尔逊相关性分析，双尾(two-tailed)检验，在0.05水平上检验其显著性。经测定Bt-pbp2X蛋白与青霉素亲和常数Kd＝10.36nmol/L(图5)。
实施例3 Bt-pbp2X蛋白检测青霉素标准曲线的绘制
1、青霉素标准样品的制备
青霉素溶于PBS缓冲溶液配置成浓度为1μg/m L的标准使用溶液，向已知无抗牛奶中加入此溶液调配含青霉素浓度一定的标准样品。随后，标准样品置于摇床15min充分混匀。
2、Bt-pbp2X包被酶标板
向酶标板微孔中加入100μL青霉素结合蛋白Bt-pbp2X溶液(4μg/mL)，4℃放置过夜，以使Bt-pbp2X蛋白固定于微孔表面。倾去孔内液体，每孔加入PBS缓冲溶液(300μL，洗涤3遍，滤纸上拍干。
3、酶标板的封闭
每空加入150μL 2％BSA封闭液，37℃孵育3小时，使用PBS缓冲溶液洗涤3次后，滤纸上拍干。
4、加入标准溶液样品
将青霉素溶于PBS缓冲溶液中配制成质量梯度为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0μg/L的标准溶液。每孔中加入50μL不同梯度的标准溶液，再加入50μL辣根过氧化物酶标记的青霉素(HRP-Amp)，37℃孵育30min，倾去孔内液体，用PBST溶液洗涤4次后，滤纸上拍干。
5、加入酶解底物显色
加入100μL新配置的四甲基联苯胺溶液(TMB)，避光37℃孵育10min。立即向每孔中加入50μL 2M H2SO4终止液，蓝色变黄色。
6、测定吸光值
使用酶标仪10min内测测定微孔在450nm处的吸光A450。反应过程中，青霉素和HRP-Amp竞争性结合Bt-pbp2X，若样品中含有青霉素越多，HRP-Amp结合在受体上的量越少，最终导致酶解液的吸光度变小，即样品中的青霉素浓度与微孔中酶解液的吸光度值成反比。
7、标准曲线建立
以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用SPSS软件，绘制标准曲线。当青霉素浓度在0到256μg/的时候，吸光度与青霉素浓度有线性关系A450＝-0.1278ln(CAmp)+1.1067，R2＝0.9757(图6)。
实施例4 利用Bt-pbp2X蛋白测定与牛奶中青霉素残留
1、检测样品的前处理
脱脂奶样本直接上样检测，纯牛奶样本5000转/分，离心5分钟，脱脂后直接检测。
2、牛奶中青霉素残留含量的测定
按照实施例2方法依次配置不同浓度的青霉素标准脱脂牛奶样品，酶标仪测定微孔在450nm处的吸光度A450，以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用Origin 8软件，绘制标准曲线。取不同浓度下牛奶样品，使用酶标仪测定微孔在450nm处的吸光A450。重复3次，每次6个平行，带入标准曲线公式计算出牛奶中青霉素的含量。
3、准确性(添加回收率)的测定
在不含有青霉素的脱脂牛奶中添加一定量的青霉素，添加终浓度为5、10、20ng/mL，然后用实施例3方法检测样品中青霉素的含量，每个样品做6个平行样(n＝6)。测定结果表明，此方法具有很好的精密度及回收率，牛奶中添加浓度为5ng/mL时，回收率平均达到94.4％±6.32％；添加浓度为10ng/mL时，回收率平均达到93.8％±5.72％；添加浓度为20ng/mL时，回收率平均达到93.4％±5.24％；在添加浓度为0ng/m L中，没有出现假阳性，也没有假阴性(表1)。
表1：准确性(添加回收率)的测定

Claims (3)

1.一种青霉素结合蛋白在检测青霉素残留中的应用，其特征在于，所述青霉素结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种检测青霉素残留的方法，其是用如SEQ ID NO:2所示的青霉素结合蛋白与样品中的青霉素结合，并检测结合的结果。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述蛋白与标准品中的青霉素结合，建立标准曲线，根据标准曲线确定样品中青霉素的含量。
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