DE69533485T2

DE69533485T2 - Neue polypeptide

Info

Publication number: DE69533485T2
Application number: DE69533485T
Authority: DE
Inventors: Tanjore Soundararajan Balganesh; Christine Mary Town
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1994-11-24
Filing date: 1995-06-21
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2015-06-22
Also published as: SE9404072D0; EP0792284A1; FI972215A; CN1127516C; ATE275579T1; DE69533485D1; CN1173182A; AU3088795A; FI972215A0; GB9513306D0; GB2290792A; NO972353L; EP0792284B1; HUT77487A; JPH10512439A; NO972353D0; US6027906A; WO1996016082A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die folgende Erfindung betrifft Varianten von Penicillin-Bindungsproteinen (PBP), die an der bakteriellen Peptidoglycan-Biosynthese beteiligt sind. Ebenso offenbart werden DNA-Moleküle, die für die PBP-Varianten codieren, ebenso wie Vektoren und Zellen, die solche DNA-Moleküle enthalten. Die Erfindung betrifft ebenso Verfahren zum Testen und zur Konstruktion therapeutisch geeigneter Verbindungen mit hoher Affinität zu PBP, wobei in den Verfahren die PBP-Varianten zum Einsatz kommen.
STAND DER TECHNIK
Bakterien sowie die meisten anderen einzelligen Organismen besitzen eine Zellwand, die einen als Peptidoglycan bezeichneten quervernetzten Polysaccharid-Peptid-Komplex umfaßt. Die Peptidoglycan-Biosynthese besteht aus drei Stufen: (1) der Synthese von Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) in Zytosol, (2) dem Transfer der Vorläufermoleküle durch die Membran hindurch sowie der Bildung der Polysaccharidkette und (3) der Quervernetzung einzelner Peptidoglycanstränge in der Zellwand.
In der letzteren Stufe der Peptidoglycan-Biosynthese müssen zwischen den entstehenden Glycansträngen und bestehendem Peptidoglycan neue Bindungen geknüpft werden. Die neu synthetisierten Ketten weisen eine Länge von etwa 10 Disacchariden auf und werden durch Transglycosylaseenzyme zu einem endgültigen Glycanstrang mit zwischen 100 und 150 Disaccharideinheiten verlängert. Die Quervernetzung des Peptidoglycans erfolgt durch Einwirkung von Transpeptidasen, die das terminale D-Ala eines Glycanstranges mit einer freien ε-Aminogruppe eines Diaminopimelinsäurerests auf einem benachbarten Bereich verknüpfen.
Eine Reihe von Antibiotika hemmen das Bakterienwachstum, indem sie die Bildung der Peptidoglycanschicht stören. Die Quervernetzungsreaktion ist das Ziel für die Wirkung zweier wichtiger Klassen solcher Antibiotika, der Penicilline und der Cephalosporine. Man nimmt an, daß Penicillin irreversibel mit der Transpeptidase, die die Quervernetzung katalysiert, reagiert.
Die mit Penicillin wechselwirkenden Proteine fallen in drei Gruppen: die β-Lactamasen, die niedrigmolekularen Penicillin-Bindungsproteine (PBPs), zu denen hauptsächlich die Carboxypeptidasen zählen, sowie die hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteine. Bei den Penicillin-Bindungsproteinen handelt es sich um diejenigen Enzyme, von denen gezeigt wurde, daß sie radioaktiv markiertes Penicillin G binden. In Escherichia coli werden solche Proteine beispielsweise PBP 1A und PBP 1B genannt, die beide zur Klasse der hochmolekularen PBPs gehören. PBP 1A und 1B, bei denen es sich bekanntermaßen um membrangebundene Proteine handelt, bewahren die Integrität der Zelle und steuern die Verlängerung der Peptidoglycanseitenwand während des Wachstums. Zwar wird die Inaktivierung von entweder PBP 1A oder PBP 1B von den Bakterien toleriert, doch ist die Deletion beider Gene, die mit ponA und ponB bezeichnet werden, letal (Yousif et al., 1985).
Es ist bekannt, daß es sich bei PBP 1B um ein bifunktionelles Enzym handelt, das sowohl Transpeptidase- als auch Transglycosylaseaktivität besitzt (Ishino et al., 1980). Es wird vermutet, daß PBP 1A bifunktionell ist, da es PBP 1B ersetzen kann. Die β-Lactam-Antibiotika, wie z. B. Penicillin, inhibieren lediglich die Transpeptidaseaktivität dieser Proteine.
Die Transglycosylasereaktion wird beispielsweise durch Moenomycin gehemmt, bei dem es sich um ein Phosphoglycolipid handelt, das als Wachstumspromotor in der Tierernährung verwendet wird und von dem gezeigt werden konnte, daß es eine Breitband-Bakterizidaktivität besitzt. Es konnte gezeigt werden, daß das Enzym Transglycosylase in Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium und Bacillus subtilis vorhanden ist. Dies läßt vermuten, daß eine Störung der Peptidoglycan-Biosynthese durch Hemmung der Transglycosylase ein letales Ereignis in allen klinisch wichtigen Krankheitserregern sein könnte.
Die putative Transglycosylasedomäne von PBP 1B wurde den N-terminalen 478 Aminosäuren zugeordnet (Nakagawa et al., 1987). Dieser Bereich enthält drei konservierte Aminosäureabschnitte zwischen der N-terminalen Hälfte sowohl von PBP 1A als auch 1B und könnte an der Transglycosylaseaktivität beteiligte Reste repräsentieren.
Die Präparation des Penicillin-Bindungsproteins 2A aus Staphylococcus aureus ist in der EP-A-0505151 offenbart.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es gibt eine wachsende Anzahl von Berichten über Bakterien, die gegenüber Antibiotika resistent sind. Infolgedessen besteht ein Bedarf an neuen Verbindungen, die das Bakterienwachstum mittels der Bindung von Penicillin-Bindungsproteinen hemmen. Durch die vorliegende Erfindung werden PBP-Varianten bereitgestellt, die Verfahren zum Testen und zur Konstruktion therapeutisch geeigneter Verbindungen mit hoher Affinität zu PBPs erleichtern.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptide bereitzustellen, bei denen es sich um wasserlösliche aktive Derivate von bakteriellen bifunktionellen Penicillin-Bindungsproteinen handelt, wobei die Penicillin-Bindungsproteine bei Expression in einer Bakterienzelle an die Zellmembran gebunden werden und dazu in der Lage sind, sowohl Transglycosylase- als auch Transpeptidaseaktivitäten zu zeigen und wobei den Derivaten zwar eine Membranverankerungssequenz fehlt, sie jedoch die Fähigkeit behalten, eine oder beide der genannten Enzymaktivitäten zu zeigen. Bei der oben erwähnten „Bakterienzelle" handelt es sich vorzugsweise um eine Escherichia coli-Zelle oder eine Staphylococcus pneumoniae-Zelle.
Die Transglycosylaseaktivität der erfindungsgemäßen löslichen PBP-Varianten bleibt erhalten, was darauf hindeutet, daß lösliche PBP-Varianten, denen Membranverankerungssequenzen fehlen, lipidverknüpftes Substrat erkennen und das Disaccharid zu sich wiederholenden Einheiten polymerisieren können. Somit kann angenommen werden, daß andere analoge des PBP, denen an der Membranbindung beteiligte Reste fehlen, enzymatisch funktionsfähig sein sollten.
Man könnte annehmen, daß Moleküle, die mit dem mit Penicillin wechselwirkenden Bereich löslicher PBP-Varianten wechselwirken, dazu in der Lage sind, in gleicher Weise mit Wildtyp-PBPs zu wechselwirken. Infolgedessen können die erfindungsgemäßen löslichen PBP-Varianten zur Identifizierung von Verbindungen, die mit Wildtyp-Penicillin-Bindungsproteinen wechselwirken, verwendet werden.
Weiterhin ist allgemein bekannt, daß membrangebundene Proteine sehr schwer zu kristallisieren sind. Die löslichen, enzymatisch aktiven PBP-Varianten lassen sich zur Kristallisation verwenden und erleichtern dadurch eine auf der Röntgenkristallographie beruhende rationale Konstruktion therapeutischer Verbindungen, die hochmolekulare PBPs hemmen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Polypeptiden, bei denen es sich um wasserlösliche Derivate bakterieller bifunktioneller Penicillin-Bindungsproteine handelt, wobei die Penicillin-Bindungsproteine bei Expression in einer Bakterienzelle an die Zellmembran gebunden werden und dazu in der Lage sind, sowohl Transglycosylase- als auch Transpeptidaseaktivitäten zu zeigen und wobei den Derivaten zwar die Membranverankerungssequenz fehlt, sie jedoch die Fähigkeit behalten, die Transglycosylaseaktivität zu zeigen. Bei der oben erwähnten „Bakterienzelle" handelt es sich vorzugsweise um eine Escherichia coli-Zelle.
Eine vergleichende Gegenüberstellung [alignment] von Aminosäuresequenzen der hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteine sowie die Zusammenstellung der an der Penicillinbindung von β-Lactamasen und Carboxypeptidase beteiligten Motive ließen darauf schließen, daß die C-terminale Hälfte von PBP 1A und 1B die funktionelle Domäne der Transpeptidaseaktivität darstellt und die Penicillin bindende Domäne enthält. Darüber hinaus wurde von Nakagawa et al. (1987) gezeigt, daß ein verkürztes, die N-terminalen 478 Aminosäuren von PBP 1B codierendes ponB-Gen die Transglycosylasereaktion ermöglicht.
Auf Grundlage dieser Erkenntnisse wurde vorgeschlagen, daß es sich bei den hochmolekularen PBP 1A- und 1B-Proteinen um 2-Domänen-Proteine handelt, wobei die N-terminale Hälfte die Transglycosylasedomäne und die C-terminale Hälfte die Transpeptidasedomäne bildet. Durch Computeranalyse wurde vorhergesagt, daß die beiden Domänen über einen Linker- oder Hinge-[„Gelenk"]-Bereich miteinander verbunden sind, der zur Funktion des Proteins weder strukturell noch enzymatisch beiträgt. Es wurde vorhergesagt, daß der Linker-Bereich von E. coli-PBP 1B von Position 545–559 reicht, während der für E. coli PBP 1A um Position 501 liegt.
Bei Verwendung in der Röntgenkristallographie erleichtern die erfindungsgemäßen monofunktionellen verkürzten PBP-Varianten die Gewinnung von Strukturinformationen über die Transglycosylasedomäne von Penicillin-Bindungsproteinen. Darüber hinaus erleichtert die reduzierte Größe der monofunktionellen Variante die Kristallisation.
Ein erfindungsgemäßes wasserlösliches Polypeptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die mit SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12 oder 13 im Sequenzprotokoll identisch ist.
Die Beobachtung, daß die Deletion der ponA- und ponB-Gene letal ist (Yousif et al., 1985) geht nicht auf die Frage der Essentialität der Transglycosylaseaktivität der codierten PBP 1A-Proteine ein, da die Deletion zum Verlust sowohl der Transglycosylierungs- als auch der Transpeptidierungsaktivitäten führt. Darüber hinaus geht dieses Experiment nicht auf die Möglichkeit ein, daß die Transglycosylase-Enzymaktivität von einem von PBP 1A oder PBP 1B verschiedenen Penicillin-Bindungsprotein beigesteuert werden kann. Ebenso ist es möglich, daß bisher noch nicht beschriebene Penicillin-Bindungsproteine und/oder andere Proteine existieren, die zur Transglycosylaseaktivität beitragen.
Die vergleichende Gegenüberstellung der die putative Transglycosylasedomäne von PBP 1A und 1B bildenden Aminosäuren zeigt drei Abschnitte mit 9 von 12 (Bereich 1), 9/10 (Bereich 2) und 8/10 (Bereich 3) Aminosäuren, die innerhalb der N-terminalen Hälfte dieser beiden Proteine identisch sind (Broome-Smith et al., 1985) (14). Dieselben drei Bereiche sind in identischer Weise zwischen zwei anderen kürzlich beschriebenen Proteinsequenzen konserviert; Streptococcus pneumoniae PBP 1A (Martin et al., 1992) und einem 94 kDa großen Protein aus Haemophilus influenzae (Tomb et al., 1991). Die Konservierung dieser Reste in derartig verschiedenen Spezies läßt vermuten, daß sie entweder bei der Erhaltung struktureller Aspekte des Proteins oder bei der Transglycosylierungsreaktion selbst in kritischer Weise erforderlich sind.
Die überlappenden funktionellen Transglycosylase- und Transpeptidaseaktivitäten von PBP 1A und 1B lassen ebenso darauf schließen, daß die katalytischen Zentren konserviert sind und daß Moleküle, die zur Wechselwirkung mit dem katalytischen Zentrum von PBP 1A vorgesehen sind, auch mit PBP 1B reagieren würden.
Die funktionelle Transglycosylaseaktivität des exprimierten Proteins läßt sich entweder in einem direkten in-vitro-Assay unter Verwendung entsprechender Substrate oder in einem Assay, bei dem die Fähigkeit des Proteins zur Komplementation der Deletion der entsprechenden Gene im Chromosom gemessen wird, untersuchen. Es konnte gezeigt werden, daß ein Plasmid mit einem das Wildtyp-Produkt (PBP 1A oder PBP 1B) codierenden Gen die Lebensfähigkeit der E. coli-Zelle erhalten kann (Yousif et al., 1985). Diese Transkomplementationstechnik läßt sich zur Beurteilung der Funktionsweise des mutanten Gens bzw. der mutanten Gene, das bzw. die PBPs mit Mutationen, die eine der enzymatischen (Transglycosylation- oder Transpeptidierungs-)Funktionen inaktivieren, codiert bzw. codieren, nutzen. Die Fähigkeit solcher mutanten Produkte zur trans-Komplementation der Deletion der chromosomalen ponA- und ponB-Gene würde die essentielle Notwendigkeit der individuellen enzymatischen Funktionen definieren.
Infolgedessen besteht ein Bedarf an Forschungswerkzeugen, die es ermöglichen, die Effekte einer spezifischen Inaktivierung der Transglycosylaseaktivität von Penicillin-Bindungsproteinen zu untersuchen.
Folglich wird nun ein Polypeptid offenbart, bei dem es sich um ein Transglycosylase-defizientes Derivat eines bakteriellen bifunktionellen Penicillin-Bindungsproteins handelt, wobei das Penicillin-Bindungsprotein bei Expression in einer Bakterienzelle an die Zellmembran gebunden wird und dazu in der Lage ist, sowohl Transglycosylase- als auch Transpeptidaseaktivitäten zu zeigen, und wobei dem Derivat zwar die Fähigkeit, Transglycosylaseaktivität zu zeigen, fehlt, es jedoch die Fähigkeit behält, Transpeptidaseaktivität zu zeigen. Bei der oben erwähnten „Bakterienzelle" handelt es sich vorzugsweise um eine Escherichia coli-Zelle.
Die Transglycosylase-defizienten PBP-Varianten lassen sich in vorteilhafter Weise in der Röntgenkristallographie zum Zwecke der Gewinnung von Strukturinformation über die Aktivitätszentren der PBPs verwenden. Die Strukturanalyse der Kristallform löslicher Transglycosylase-defizienter PBP-Varianten könnte die Skizzierung des katalytischen Bereichs gestatten und die Konstruktion von Molekülen, die die Transglycosylaseaktivität spezifisch hemmen können, erleichtern.
In einer bevorzugten Form handelt es sich bei dem Transglycosylase-defizienten Polypeptid um ein Polypeptid, dem aufgrund einer Mutation oder Deletion im zweiten konservierten Bereich des für das Polypeptid codierenden Gens Transglycosylaseaktivität fehlt.
In einer weiteren bevorzugten Form weist das Transglycosylase-defiziente Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die mit SEQ ID NO: 7, 8, 9 oder 10 im Sequenzprotokoll identisch ist.
Das zur Anreicherung von Penicillin-Bindungsproteinen eingesetzte herkömmliche Reinigungsverfahren bestand in der Verwendung einer „Penicillin"-Affinität. Die Bindung des Proteins an Penicillin ist kovalent und benötigt harte Bedingungen, um das gebundene Protein zu eluieren. Dies kann zu einem gewissen Maß an Inaktivierung der Enzymaktivität des Proteins führen. Folglich besteht ein Bedarf an alternativen Affinitätsmatrizes zur effizienten Reinigung der Proteine.
Folglich umfaßt die Erfindung ein Polypeptid, umfassend (a) ein erstes Polypeptid, bei dem es sich um eine erfindungsgemäße PBP-Variante handelt, und (b) ein zusätzliches Polypeptid, das die Bindung an eine Affinitätsmatrix gestattet, wobei eine Schnittstelle zwischen den Polypeptiden vorliegt.
Bei dem oben erwähnten „zusätzlichen Polypeptid" kann es sich vorzugsweise um Glutathion-S-Transferase oder um ein Polypeptid mit weitgehender Ähnlichkeit zu Glutathion-S-Transferase handeln. Ein solches zusätzliches Polypeptid ermöglicht die schnelle Reinigung des Proteins unter Verwendung einer Glutathion Sepharose^®-Affinitätsmatrix. In einer weiteren bevorzugten Form handelt es sich bei dem zusätzlichen Polypeptid um ein an Histidinresten reiches Polypeptid, wobei diese Reste dem Protein die Fähigkeit verleihen, an eine Ni-Affinitätsäule zu binden. Das zusätzliche Polypeptid kann entweder an den N-Terminus oder den C-Terminus des löslichen/membrangebundenen PBP fusioniert werden.
Die Fähigkeit der Fusionsproteine, an eine Affinitätsmatrix zu binden, gestattet die Immobilisierung des Proteins. Solche immobilisierten Proteine lassen sich zur Analyse der kompetitiven Bindung unterschiedlicher Liganden an das gebundene aktive Protein und somit zum Screening auf Verbindungen, die die interessierende enzymatische Domäne binden, verwenden.
Bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden handelt es sich um eine beliebige Sequenz aus ID No: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 oder 13, wie sie im Sequenzprotokoll gezeigt sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung isolierter und gereinigter DNA-Moleküle, die für eine beliebige der erfindungsgemäßen PBP-Varianten codierende Nukleotidsequenzen aufweisen.
Erfindungsgemäß weisen die DNA-Moleküle Nukleotidsequenzen auf, die mit SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 im Sequenzprotokoll identisch sind.
Die Erfindung umfaßt ebenso ein DNA-Molekül, dessen Nukleotidsequenz aufgrund des genetischen Codes gegenüber der für eine erfindungsgemäße PBP-Variante codierenden Nukleotidsequenz degeneriert ist. Die natürliche Degeneriertheit des genetischen Codes ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Es ist somit ersichtlich, daß die im Sequenzprotokoll gezeigten DNA-Sequenzen nur Beispiele innerhalb einer großen, jedoch definitiven Gruppe von DNA-Sequenzen, die die PBP-Varianten, deren Aminosäuresequenzen im Sequenzprotokoll gezeigt sind, codieren, darstellen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein replizierbarer Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül trägt und dazu in der Lage ist, die Expression dieses Moleküls zu vermitteln. Dabei wird unter dem Ausdruck „replizierbar" hier verstanden, daß der Vektor in einer gegebenen Art von Wirtszelle, in die er eingeführt wurde, replizieren kann. Vektoren sind beispielsweise Viren, wie z. B. Bakteriophagen, Kosmide, Plasmide und andere Rekombinationsvektoren. Nukleinsäuremoleküle werden in Vektorgenome mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren inseriert. Bei einem erfindungsgemäßen Vektor kann es sich vorzugsweise um eines der in Tabelle 1 unten aufgeführten Plasmide handeln.
Die Erfindung umfaßt ebenso eine Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet. Bei einer solchen Wirtszelle kann es sich um eine prokaryontische Zelle, eine einzellige eukariontische Zelle oder eine von einem multizellulären Organismus stammende Zelle handeln. Bei der Wirtszelle kann es sich somit beispielsweise um eine Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle handeln. Die zur Einführung des Vektors in die Wirtszelle verwendeten Verfahren sind einer mit rekombinanten DNA-Verfahren vertrauten Person allgemein bekannt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Prozeß zur Herstellung eines Polypeptids, bei dem es sich um ein Derivat des Penicillin-Bindungsproteins handelt, wobei in dem Verfahren eine erfindungsgemäße Wirtszelle in oder auf einem Kulturmedium zur Expression des Polypeptids angezogen und das Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird. Als Wirtszelle geeignet ist eine beliebige der oben erwähnten Zellarten, wobei es sich bei dem zur Anzucht der Zellen verwendeten Medium um ein für den Zweck geeignetes beliebiges herkömmliches Medium handeln kann.
Es konnte gezeigt werden, daß die hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteine an der Membran verankert sind, wobei jedoch der Hauptteil des Proteins im periplasmatischen Raum der Zelle liegt (Edelmann et al. 1987). Somit sind PBP-Derivate ohne die Membransignal/verankerungssequenzen dazu gezwungen, sich in einem heterologen Milieu, nämlich dem Zytosol, in ihren nativen Zustand zu falten. Dies führt oft zu einer Fehlfaltung, wobei der Hauptteil des exprimierten Proteins sich in eine als Einschußkörperchen bezeichnete inaktive Form zusammenlagert.
Es wurde nun überraschend festgestellt, daß sich hohe Ausbeuten einer aktiven wasserlöslichen PBP-Variante durch die regulierte Transkription des die PBP-Variante codierenden Gens erreichen läßt. Zu einer solchen regulierten Transkription gehört (i) die Verwendung einer suboptimalen Konzentration des Induktionsmoleküls Isopropylthiogalactosid (IPTG), und (ii) die Kultivierung der die PBP-Variante exprimierenden Zellen bei einer erniedrigten Temperatur. Eine kumulative Wirkung dieser Faktoren trägt zur Gesamtgewinnung des aktiven löslichen Proteins bei. Folglich führen geringere Expressionsraten, die durch die erwähnte Kombination von (i) suboptimaler Derepression von Promotorsystemen und (ii) einer verlängerten Generationszeit durch Erniedrigung der Kultivierungstemperatur erzielt werden, zu einer Verbesserung der Löslichkeit von Proteinen, denen das Membranverankerungssegment fehlt.
Ein weiterer wichtiger erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Prozeß zur Herstellung eines erfindungsgemäßen wasserlöslichen Polypeptids, bei dem Escherichia coli-Zellen kultiviert werden, die einen Expressionsvektor enthalten, in dem eine für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) induzierbaren Promotors steht, wobei die Kultivierung in Gegenwart einer für die Induktion des Promotors suboptimalen IPTG-Konzentration und bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 24°C, vorzugsweise 22°C, durchgeführt wird. Die IPTG-Konzentration kann vorzugsweise bei ungefähr 0,01 mM liegen.
Im Fall der Expression von ponAdel23, einem eine erfindungsgemäße PBP-Variante codierenden Gen, führte eine solche regulierte Transkription durch (i) gesteuerte Derepression des T7-Promotors unter Verwendung einer suboptimalen Konzentration des Induktionsmoleküls IPTG und (ii) die Reduzierung der Wachstumsrate durch Kultivierung bei 22°C zu Ausbeuten des aktiven Proteins, die fast 50% des gesamten induzierten interessierenden Proteins erreichten. Die Wachstums- und Induktionsbedingungen waren für die effiziente Gewinnung des löslichen Proteins kritisch, da ein Wachstum bei höheren Temperaturen oder einer Induktion mit höheren IPTG-Konzentrationen dazu führte, daß der überwiegende Teil des Proteins inaktiv wurde und Einschlußkörperchen formte.
Es versteht sich, daß dieses Verfahren zur gesteuerten Expression auf andere induzierbare Promotorsysteme, z. B. das tac-System, bei dem das Induktionsmolekül IPTG und der Wirt ein lac-Y-negativer Wirt ist, anwendbar ist.
Ein Weg zur Gewinnung von relevanter Strukturinformation über die Konfiguration des aktiven Zentrums eines Enzyms besteht in der Produktion und der Charakterisierung monoklonaler Antikörper, die zur Hemmung der Enzymreaktion fähig sind. Die die Aktivität hemmenden Antikörper repräsentieren Moleküle, die das Substrat beim Eintritt in die Tasche mit dem aktiven Zentrum blockieren oder mit ihm darum konkurrieren, oder können Moleküle repräsentieren, die für die katalytische Aktivität benötigte strukturelle Transitionen verhindern können. In beiden Fällen lassen sich diese Antikörper als Werkzeug zur Quantifizierung der Wechselwirkung des Zielenzyms mit der Bindung radioaktiv markierter Inhibitorverbindungen verwenden, um die Affinität der Wechselwirkung zu beurteilen, vorausgesetzt, daß die Affinität des inhibierenden Antikörpers bekannt ist. Eine weitere Verwendung zur Kartierung der von den Inhibitorantikörpern erkannten Epitope besteht in der Fähigkeit, das aktive Zentrum bildende Reste darzustellen.
Folglich besteht ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt in einem Verfahren zur Identifizierung eines zur Bindung eines bakteriellen bifunktionellen Penicillin-Bindungsproteins fähigen Antikörpers, wobei man in einem Schritt des Verfahrens ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einem Antikörper-Bindungstest einsetzt und an das Polypeptid bindende Antikörper auswählt.
Die Erfindung umfaßt ebenso monoklonale Antikörper, die gegen eine erfindungsgemäße PBP-Variante gerichtet sind. Solch ein monoklonaler Antikörper wird unter Verwendung der bekannten Hybridomtechnologie hergestellt, indem Antikörper produzierende B-Zellen aus immunisierten Tieren mit Myelomzellen fusioniert werden und die erhaltene, den gewünschten Antikörper produzierende Hybridomzellinie ausgewählt wird.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt besteht in einem Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen, bei dem man (a) ein Polypeptid, bei dem es sich um eine erfindungsgemäße PBP-Variante handelt, mit einer zu untersuchenden Verbindung in Kontakt bringt; und (b) nachweist, ob die Verbindung an die PBP-Variante bindet.
So kann man beispielsweise in einem Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen (a) erfindungsgemäße Wirtszellen kultivieren, (b) die Zellen lysieren und den Zellrohextrakt isolieren, (c) den Zellextrakt potentiellen Inhibitoren eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzen; (d) dem Zellextrakt eine bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Substanz zuführen, (e) die nicht gebundene Substanzfraktion abtrennen und (f) den Zellextrakt auf das Vorhandensein der darin verbliebenen Substanz testen.
Bei einem weiteren Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen könnte man (a) ein auf einem festen Träger immobilisiertes Polypeptid, bei dem es sich um eine erfindungsgemäße PBP-Variante handelt, einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzen, (b) eine bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Substanz dem immunisierten Polypeptid aussetzen, (c) die nicht gebundene Substanzfraktion abtrennen und (d) das immobilisierte Polypeptid auf das Vorhandensein der daran gebundenen Substanz testen.
In einer bevorzugten Form handelt es sich bei dem Verfahren um ein Testverfahren für an die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Verbindungen, bei dem man (a) die Transglycosylasedomäne eines auf einem festen Träger immobilisierten erfindungsgemäßen Polypeptids, mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Polypeptid nicht um eine Transglycosylase-defiziente PBP-Variante handelt, einem potentiellen Inhibitor der Transglycosylase-Aktivität eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) eine bekanntermaßen die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Substanz dem immobilisierten Polypeptid aussetzt, (c) die nicht gebundene Substanzfraktion abtrennt und (d) das immobilisierte Polypeptid auf das Vorhandensein der daran gebundenen Substanz testet.
Für Transpeptidase spezifische Antikörper lassen sich auf einer BIAcore-Sensor-Chipoberfläche immobilisieren. Das BIAcore-System, wobei „BIA" für „Biospecific Interaction Analysis" steht, ist bei Pharmacia Biosensor, Schweden, erhältlich. An den immobilisierten Antikörper bindendes Protein wird über das RU-Ausgangssignal nachgewiesen. Das Screening auf TP-Inhibitoren wird mittels eines kompetitiven Tests ermöglicht, bei dem lösliches Protein mit Testverbindungen vorinkubiert wird. Die Bindung einer Testverbindung an das Protein führt zu einer Abnahme der Proteinbindung an den TP-spezifischen Antikörper.
In der gleichen Weise lassen sich für Transglycosylasespezifische monoklonale Antikörper beim Screening auf TG-Inhibitoren einsetzen.
Auf ähnliche Weise kann Ampicillin oder modifiziertes Moenomycin an die Oberfläche gekoppelt werden und in einem indirekten kompetitiven Assay verwendet werden, wodurch Protein mit den Testliganden vor Einführung in das BIAcore-Gerät vorinkubiert wird.
Folglich könnte man in noch einem weiteren Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen (a) ein Polypeptid, bei dem es sich um eine erfindungsgemäße PBP-Variante handelt, einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzen, (b) das Polypeptid einer bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindenden Substanz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aussetzen und (c) die immobilisierte Substanz auf das Vorhandensein von daran gebundenem Polypeptid testen.
In einer bevorzugten Form handelt es sich bei dem Verfahren um ein Testverfahren für an die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Verbindungen, bei dem man (a) die Transglycosylasedomäne eines erfindungsgemäßen Polypeptids, mit der Maßgabe, daß es sich bei dem Polypeptid nicht um eine Transglycosylase-defiziente PBP-Variante handelt, einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) das Polypeptid einer bekanntermaßen die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindenden Substanz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aussetzt und (c) die immobilisierte Substanz auf das Vorhandensein von daran gebundenem Polypeptid testet.
Bei der oben bezeichneten „bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindenden Substanz" kann es sich beispielsweise um einen monoklonalen Antikörper oder eine markierte antibiotische Verbindung, wie z. B. [³H]-Ampicillin, handeln.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Verfahren zur Bestimmung der Proteinstruktur eines Penicillin-Bindungsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid, bei dem es sich um eine erfindungsgemäße PBP-Variante handelt, bei der Röntgenkristallographie benutzt wird.
Einige der Merkmale der bevorzugten erfindungsgemäßen PBP-Varianten sind in Tabelle 1 unten zusammengefaßt. Die in der Tabelle aufgeführten Plasmide wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Schottland, UK, hinterlegt. Das Hinterlegungsdatum ist der 28. Juni 1994.
TABELLE 1
ERFINDUNGSBEISPIELE
In den folgenden Beispielen versteht man die Ausdrücke „Standardprotokolle" und „Standardverfahren" als Protokoll und Verfahren, die in einem gewöhnlichen Laborhandbuch wie z. B. dem von Sambrook, Fritsch und Maniatis (1989) angegeben sind.
BEISPIEL 1
1.1 Konstruktion des die lösliche Form von E. coli-PBP 1A codierenden Gens
Die möglichen, am Membranverankerungsbereich von PBP 1A beteiligten Aminosäurereste wurden nach dem von Kyte & Dolittle (1982) beschriebenen Computerprogramm abgeleitet. Die vorhergesagte Hydrophobizität der 60 N-terminalen Aminosäuren ist in 1 gezeigt. Auf Grundlage dieses Hydrophobizitätsprofils wurde vorhergesagt, daß die 23 N-terminalen Aminosäuren einer starken Vermutung nach zur Membranverankerungsdomäne des Proteins beitragen, jedoch nicht vollständig die Membranverankerungsdomäne umfassen. Dieser Bereich wurde dann putativ als der an der „Membranverankerung" beteiligte Bereich bezeichnet.
Das das native ponA-Gen (codiert Wildtyp-PBP 1A) enthaltene Plasmid pBS98 wurde von Prof. B. S. Spratt, Microbial Genetics Group, School of Biological Sciences, University of Sussex, Brighton, UK erhalten. Die Konstruktion von pBS98 ist in Broome-Smith et al. (1985) beschrieben. Plasmid-DNA wurde aus pBS98 enthaltenen Zellen nach Standardprotokollen hergestellt.
Oligonukleotidprimer zur Verwendung in der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden in einem Modell 380 A-Gerät von Applied Biosystems synthetisiert. Bei dem verwendeten 5'-Oligonukleotidprimer handelte es sich um TG-82:
TG-82 beinhaltet die folgenden Kennzeichen: (1) Es erlaubt die Konstruktion eines mutanten ponA-Gens, in dessen codiertem Produkt die 24. Aminosäure (Glycin) des Wildtyp-PBP 1A die 2. Aminosäure des exprimierten mutanten Proteins wäre; und (2) es führt DNA-Sequenzen ein, die vom Restriktionsenzym NcoI erkannt werden. Dadurch wird das Codon ATG eingeführt, das der ersten Aminosäure des mutanten PBP 1A entspricht, wenn es in geeigneten Systemen exprimiert wird.
Als 3'-Oligonukleotidprimer wurde TG-64 verwendet:
TG-64 weist die folgenden Kennzeichen auf: (1) Er führt hinter der 850. Aminosäure des PBP 1A Strukturproteins ein TerminationsCodon ein; (2) er führt eine Stelle für das Restriktionsenzym BamHI ein, so daß die Klonierung in geeignete Expressionsvektoren erleichtert wird.
Unter Verwendung dieser Primer wurde die PCR mit pBS98-DNA als Matrize nach Standardprotokollen durchgeführt. Dabei wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 2,5 kb amplifiziert. Das Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym NcoI verdaut, gefolgt von Verdauung mit BamHI. Dieses 2,5 kb große NcoI-BamHI-DNA-Fragment wurde dann in den Vektor pBR329 (Covarrubias et al., 1982), der zuvor mit NcoI und BamHI geschnitten worden war, ligiert. Die Ligation der beiden DNA-Fragmente wurde unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt und das Ligationsgemisch in E. coli DH5α transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden einzelne Ampicillin-resistente Kolonien auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin getestet, da eine Insertion in den NcoI-BamHI-Bereich das Plasmid empfindlich gegenüber Chloramphenicol und Tetracyclin macht. Ein das 2,5 kb große Insert tragendes rekombinantes Plasmid wurde mit pARC0488 bezeichnet.
Das 2,5 kb große NcoI-BamHI-DNA-Fragment wurde aus pARC0488 freigesetzt und in mit NcoI und BamHI gespaltenes und gereinigtes pARC038 ligiert (2). Bei dem Plasmid pARC038 handelt es sich um ein Derivat von pET11d (Studier et al., 1990), bei dem die EcoRI- und PstI-Stellen mit T4-Exonuklease stumpfendig gemacht wurden und das 0,75 kb große EcoRI-PstI-DNA-Fragment durch eine stumpfendige Kanamyzin-Resistenz-Kassette (Pharmacia Biochemicals) ersetzt wurde. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente Zellen von E. coli BL 26 (DE3) transformiert. Der Transformationsmix wurde auf LB-Agar mit 50 μg/ml Kanamyzin ausplattiert. Aus mehreren Kanamyzin resistenten Kolonien wurde miniprep-Plasmid-DNA hergestellt und einem Screening mittels Restriktionsendonukleasekartierung unter Verwendung von Standardverfahren unterzogen.
Eine der Plasmid mit der erwarteten Struktur enthaltenden Kolonien (3) wurde pARC0558 (NCIMB 40666) genannt. Die mit ponAdel23 bezeichnete DNA-Sequenz des mutanten ponA-Gens ist als SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des löslichen PBP 1Adel23 ist als SEQ ID NO: 2 gezeigt.
1.2. Expression von ponAdel23
E. coli BL 26 (DE3)-Zellen (erhalten von Dr. J. J. Dunn, Biology Dept., Brookhaven National Lab., Long Island, NY, USA), die pARC0558 enthalten, wurden in LB in 50 μg/ml Kanamyzin angezogen, bis eine O. D. bei 600 nm von 0,6 erreicht war und dann 6 Stunden mit 0,01 mM Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert.
Nach 6stündiger Induktion wurden die Zellen geerntet und durch Hindurchleiten durch eine French-Presse aufgebrochen. Nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung von nicht aufgebrochenen Zellen und Zelltrümmern wurde die zytosolische (lösliche) Fraktion mit einem der beiden folgenden Verfahren erhalten: (1) nach einem von Page et al. (1982) beschriebenen Verfahren, bei dem das Pellet, Membran- und lösliche Proteine durch Saccharose-Gradientenzentrifugation getrennt werden; oder (2) durch 90minütiges Zentrifugieren des erhaltenen Überstands bei 200.000 × g, wonach der erhaltene Überstand als zytosolische/lösliche Proteinfraktion abgenommen wird.
1.3 Penicillinbindung von exprimiertem PBP 1Adel23
Die erhaltene zytosolische Fraktion wurde auf das Vorhandensein von mutantem PBP 1A nach dem Verfahren von Rojo et al. (1984) getestet. Bei dieser Vorgehensweise wird als das markierte Penicillin [¹²⁵I]-Cephradin verwendet, da es für PBP 1A spezifisch ist. Es ließ sich demonstrieren, daß mutantes PBP 1Adel23, das markiertes Cephradin binden kann, in der zytosolischen Fraktion vorhanden ist. Ungefähr 50% des exprimierten mutanten Proteins wurde in Form eines löslichen Proteins aufgetrennt, während die restlichen 50% in das Einschlußkörperchen und/oder in die membranassoziierten Fraktionen aufgetrennt wurden. Folglich wurden erhöhte Niveaus von aktiven mutanten PBP 1Adel23 erhalten, da die Zellen mit suboptimaler IPTG-Konzentration induziert wurden und da die Kulturen bei 22°C angezogen wurden. Das Penicillin-Bindungsprofil des löslichen PBP 1Adel23 ist in 4 gezeigt.
1.4. Reinigung des löslichen PBP 1Adel23
Das nach 6stündiger Induktion bei 22°C erhaltene Zellpellet von E. coli BL26 (DE3)/pARC0558 wurde zweimal mit Puffer A (30 mM Tris-Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 μg/ml Leupeptin; 10 μg/ml Aprotinin; 5 mM DTT) gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 1200 psi durch eine French-Presse geleitet. Das Lysat wurde 10 Minuten bei 10.000 UpM zentrifugiert und der erhaltene Überstand 45 Minuten bei 200.000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde danach mit Ammoniumsulfat auf 30% Sättigung eingestellt. Das Gemisch wurde 10 min. bei 12.000 UpM zentrifugiert und das Pellet in Puffer A mit 1 M NaCl resuspendiert. Das gelöste Pellet wurde danach mit einer Cephradin-Affigel 10 Matrix behandelt.
Cephradin wurde an Affigel 10 gemäß den Anweisungen des Herstellers (Biorad Laboratories, USA) konjugiert. Die lösliches PBP 1Adel23 enthaltene Fraktion wurde in Puffer A mit 1 M NaCl gelöst und 16 Std. bei 4°C mit Cephradin-Affigel 10 Kügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden dann mit Puffer A mit 1 M NaCl gewaschen, bis der Verlauf auf der Absorption bei 280 ungefähr 0 betrug. Die Elution von PBP 1Adel23 wurde durch Testen auf Penicillin-Bindungsaktivität in der Waschlösung überwacht. Diese Aktivität wurde unter Verwendung von wie in Rojo et al. (1984) beschrieben hergestelltem [¹²⁵I]-Cephradin gemessen. Gebundenes PBP 1Adel23 wurde von den Kügelchen unter Verwendung von 1 M Hydroxylamin (pH 8,5) 120 Minuten bei 25°C eluiert. Diese Fraktion wurde durch Ultrafiltration mit YM 30-Filtern (Amicon, USA) in Puffer A mit 0,25 M NaCl konzentriert. Die Ultrafiltration führte ebenfalls zur Abtrennung von Hydroxylamin. Die > 85% der PBP 1Adel23 entsprechenden Protein-Spezies enthaltene gereinigte Fraktion zeigte sowohl Penicillin-Bindungs- als auch Transglycosylase-Enzymaktivität. Das Proteinprofil, wie es mittels Coomassie Brilliant Blue-Färbung beobachtet werden konnte, sowie das [¹²⁵I]-Cephradin/Penicillin-Bindungsprofil der unterschiedlichen Fraktionen, erhalten während der verschiedenen Stufen der Reinigung, sind in 5 gezeigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des löslichen PBP 1Adel23 wurde durch Sequenzierung des gereinigten Proteins bestätigt.
1.5. Transglycosylaseaktivität des löslichen PBP 1Adel23
Die Transglycosylaseaktivität des löslichen PBP 1Adel23-Proteins wurde im wesentlichen unter Verwendung des von Ishino et al. (1980) beschriebenen Verfahrens gemessen. Das Substrat zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurden im wesentlichen nach den von Heijenoort et al. (1992) beschriebenen Protokollen präpariert und gereinigt. Die in Form der gebildeten Peptidoglycanmenge gemessene konzentrationsabhängige Transglycosylaseaktivität von PBP 1Adel23 wurde mit den durch unterschiedliche Konzentrationen der membrangebundenen Form von nativem PBP 1A gebildeten Peptidoglycanmengen verglichen. Wie in 6 zu sehen ist, war die Peptidoglycanpolymerisationseffizienz des mutanten löslichen PBP 1Adel23 fast identisch mit der enzymatischen Aktivität der membrangebundenen Form des Proteins.
Folglich wurde gefunden, daß die Eliminierung des 23 Aminosäurereste langen Abschnitts die Fähigkeit des Proteins, ihre zu beiden enzymatischen Aktivitäten, d. h. der Transglycosylase- und der Transpeptidaseaktivität, fähige native Struktur einzunehmen, nicht stört.
BEISPIEL 2
2.1 Konstruktion des die lösliche Form von E. coli PBP 1B codierenden Gens
Das PBP 1B codierende ponB-Gen wurde auf einem Plasmid pBS96 von Prof. B. S. Spratt, Microbial Genetics Group, School of Biological Sciences, University of Sussex, Brighton, UK erhalten. Die Konstruktion von pBS96 wird ebenso wie die Nukleotidsequenz des Wildtyp-ponB-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz in Broome-Smith et al. (1985) beschrieben.
Der Hydropathie-Graph der ungefähr 150 N-terminalen Aminosäuren, wie er unter Verwendung des Verfahrens von Kyte und Doolittle (1982) hergeleitet wurde, ist in 7 gezeigt. Die Analyse des Hydropathizitätsgraphs deutete darauf hin, daß die Aminosäuren in den Positionen 65–87 der PBP 1B-Sequenz einen Großteil zur Hydrophobizität des N-Terminus beitrugen und sich putativ der Membranverankerungsdomäne des Proteins zuordnen lassen. Darüber hinaus hatten β-Lactamase-Untersuchungen von Edelman et al. (1987) angedeutet, daß C-terminal zu Aminosäureposition 87 liegende Aminosäuren im periplasmatischen Raum der E. coli-Zelle vorhanden waren und daß N-terminal zur Position 65 von PBP 1B liegende Aminosäuren innerhalb des Zytoplasmas der Zelle lagen.
Die zur Konstruktion eines eine lösliche Form von PBP 1B codierenden mutanten ponB-Gens verwendete Strategie ist in 8 gezeigt. Zunächst wurde ein DNA-Fragment aus ungefähr 200 bp des 5'-Endes des ponB-Gens aus dem ponB-Gen auf dem Plasmid pBS96 (Broome-Smith et al., 1985) mit PCR amplifiziert. Als Oligonukleotidprimer wurden der 5'-Primer TG-77 (5'-GAA AAA CCA TGG CCG GGA ATG ACC-3'), der eine NcoI-Restriktionsenzymstelle enthält, die auch mit dem ATG StartCodon der Sequenz zusammenfällt, und der 3'-Primer TG-84 (5'-AAG TCG CGA GCC GCG TTT GCC AC-3'), der eine Stelle für das Restriktionsenzym NruI enthält und für der Position 64 der PBP-1B-Sequenz entsprechende Aminosäuren codiert, verwendet.
Schritt 1: Nach Restriktion mit den Enzymen NcoI und NruI wurde das PCR-amplifizierte Fragment in die NcoI- und NruI-Stellen des Klonierungsvektors pBR 329 (Covarrubias et al., 1982) kloniert. Ligation, Transformation und Screening wurden unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt, wobei das rekombinante Plasmid mit der erwarteten Struktur und der Bezeichnung pARC0547 erhalten wurde (8).
Ein weiteres DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 1,2 kb wurde mit PCR unter Verwendung von den Aminosäuren 87–480 entsprechenden Primersequenzen amplifiziert. Dieses DNA-Fragment codiert die C-terminale Hälfte der TG-Domäne von PBP 1B. Als Primer wurden der 5'-Primer TG-79 (5'-CGG ATA TCG ATC AAA AAA TTC GTA GCC G-3'), der die Nukleotidsequenz für die Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRV enthielt, und der 3'-Primer TG-80 (5'-GCG GAT CCT TAG TCG ACG ACC ACA ATC GCA G-3'), der die Sequenz für die BamHI-Spaltung enthielt, verwendet.
Schritt 2: Die PCR-Amplifikation dieses Fragments wurde unter Verwendung der DNA des ponB-Gens auf pBS96 (Broome-Smith et al., 1985) als Matrize durchgeführt. Das amplifizierte Fragment wurde in die EcoRV- und BamHI-Stellen von pBR 329 (Covarrubias et al., 1982) unter Verwendung von Standardprotokollen kloniert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde mit pARC0534 bezeichnet (8).
Schritt 3: Das 200 bp große, in pARC0547 klonierte NcoI-NruI-Fragment wurde als NcoI-NruI-Fragment ausgeschnitten und in den mit NcoI und EcoRV geschnittenen pARC0534 unter Erhalt von pARC0551 kloniert (8).
Das mutante ponB-Gen auf pARC0551 weist DNA-Sequenzen auf, die für die 64 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1B codieren und mit den Nukleotidsequenzen, die die Aminosäuren 88–480 codieren, fusioniert sind. Ein 1,3 kb großes PstI-BamHI-DNA-Fragment von pBS96 wurde dann mit PstI-BamHI-geschnittenem pARC0551 ligiert und das Ligationsgemisch in E. coli DH5α unter Verwendung von Standardverfahren transformiert. Einzelne Transformanten wurden danach einem Screening unterzogen und Kolonien, die das rekombinante Plasmid mit der erwarteten Struktur enthielten, identifiziert. Das Plasmid wurde mit pARC0552 bezeichnet. Ein NcoI-BamHI-Fragment aus pARC0552, das das gesamte mutante ponB-Gen umfaßt, wurde dann ausgeschnitten und mit dem T7-Expressionsvektor pARC038 unter Erhalt von pARC0559 (NCIMB 40667; 9) ligiert.
Das 3'-Ende des klonierten Fragments aus Schritt 1 weist die Nukleotidsequenz TCG (Teilsequenz der NruI-Stelle) auf, während das 5'-Ende des in Schritt 2 klonierten Fragments die Sequenz ATC (Teilschnittsequenz von EcoRV) aufweist. Die Nukleotidsequenz an der Verbindungsstelle, die das Resultat der Fusion von TCG und ATC ist, führt zur Einführung der Codons für Serin und Isoleucin. Somit codiert das mutante ponB-Gen ein PBP 1B, wobei die dem Wildtyp PBP 1B entsprechende Aminosäuresequenz 1–64 mit der Sequenz 87–844 fusioniert ist. Die zwei Abschnitte sind durch die Aminosäuren Serin und Isoleucin miteinander verbunden.
Die Nukleotidsequenz des mutanten ponB-Gens ist als SEQ ID NO: 3 gezeigt und die abgeleitete Aminosäure als SEQ ID NO: 4.
2.2 Expression von löslichem PBP 1B
Die Plasmid-DNA von pARC0559 wurde in den T7-Expressionswirt E. coli BL 26 (DE3) transformiert und das Restriktionskartenprofil des transformierten Plasmids unter Verwendung von Standardverfahren bestätigt. E. coli BL26 (DE3)/pARC0559 wurden bei 22°C angezogen und mit 0,01 mM IPTG induziert und die Zellen 6 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden danach geerntet und durch Hindurchleiten durch eine French-Presse aufgebrochen. Das Lysat wurde 10 Minuten bei 10.000 UpM zentrifugiert und der erhaltene Überstand in einer Beckman-Ultrazentrifuge 45 Minuten bei 200.000 × g zentrifugiert.
2.3 Charakterisierung des exprimierten löslichen PBP 1B
Der erhaltene Überstand, d. h. die zytosolische/lösliche Fraktion, wurde auf das Vorhandensein des mutanten PBP 1B unter Verwendung von [¹²⁵I]-Ampicillin als Radioligand getestet. Das [¹²⁵I]-Ampicillin wurde wie von Rojo et al. (1984) für die Herstellung von [¹²⁵I]-Cephradin beschrieben hergestellt. Das mutante PBP 1B wurde in der löslichen Fraktion nachgewiesen und band radioaktives Ampicillin.
Lösliches PBP 1B konnte auch unter Verwendung von Ampicillin-Affigel-Kügelchen mit einem zu dem in Abschnitt 1.4. beschriebenen analogen Verfahren gereinigt werden. Das mit Coomassie Blue-Färbung beobachtete Proteinprofil der unterschiedlichen Fraktionen sowie die Bindung von [¹²⁵I]-Ampicillin der angereicherten PBP 1B-Fraktion ist in 10 gezeigt.
Das gereinigte Protein war im Peptidoglycan-Transglycosylaseassay (Heijenoort et al., 1992) enzymatisch aktiv und band Penicillin mit einer Affinität, die mit der des membrangebundenen nativen PBP 1B vergleichbar war.
BEISPIEL 3
3.1 Konstruktion des die lösliche Form von Streptococcus pneumoniae PBP 1A codierenden Gens
Es wird vorhergesagt, daß die molekulare Architektur des PBP 1A aus S. pneumoniae ähnlich zu der des PBP 1A- und PBP 1B-Proteins aus E. coli ist und zwar darin, daß das Protein an die Membran über eine N-terminale Membranverankerungssequenz verankert ist. Die Nukleotidsequenz des natives membrangebundenes S. pneumoniae PBP 1A codierenden Gens sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Martin et al., (1992) beschrieben. Das Hydropathizitätsprofil der 100 N-terminalen Aminosäuren, wie es nach dem Graph von Kyte und Doolittle abgeleitet ist, ist in 11 gezeigt. Ein Abschnitt aus 38 Aminosäuren trug in signifikanter Weise zur Hydrophobizität dieses Bereichs bei und wurde für die mit der Membran wechselwirkende Domäne gehalten. Ein mutantes Gen von S. pneumoniae PBP 1A wurde konstruiert, indem die Nukleotidsequenz, die für die 38 N-terminalen Aminosäuren von S. pneumoniae PBP 1A codiert, deletiert wurde.
Unter Verwendung von Standard-PCR-Protokollen wurden das S. pneumoniae PBP 1A-Wildtypgen codierende Sequenzen in Form eines 2,5 kb großen DNA-Fragments aus dem Chromosom des S. pneumoniae-Stamms PM1 (erhalten von S. A. Lacks, Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York, USA) (Lacks, 1968) unter Verwendung der auf Basis der von Martin et al. (1992) angegebenen Sequenz konstruierten Primer amplifiziert und das amplifizierte Fragment in den Pneumococcen-Vektor pLS 101 (Balganesh und Lacks, 1984) kloniert.
Das eine lösliche Form von S. pneumoniae-PBP 1A codierende mutante Gen wurde konstruiert, indem als Matrize das Wildtypgen enthaltende Plasmid-DNA verwendet und ein 2,3 kb großes DNA-Fragment unter Verwendung von PCR nach Standardverfahren amplifiziert wurde. Als Primersequenzen wurden der 5'-Primer TG-24 (5'-TAC GTT ACC ATG GCT CCT AGC CTA TCC-3') und der 3'-Primer TG-25 (5'-GAC AGG ATC CTG AGA AGA TGT CTT CTC A-3') verwendet.
Der 5'-Primer TG-24 enthält die Sequenz für das Restriktionsenzym NcoI, während der 3'-Primer TG-25 die Stelle für das Restriktionsenzym BamHI enthält. Das mit NcoI und BamHI verdaute PCR-amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem NcoI-BamHI-geschnittenen pARC039 ligiert. Bei dem Plasmid pARC039 handelt es sich um ein Derivat von pET 8c (Studier et al., 1990), bei dem das für die β-Lactamase codierende Gen durch eine Kanamycin- Resistenz-Kassette ersetzt wurde.
Nach der Ligation und dem Screening unter Verwendung von Standardprotokollen wurde die Struktur des rekombinanten Plasmids durch eine ausführliche Restriktionskartierung bestätigt und in den T7-Expressionswirt E. coli BL 21 (DE3) (Studier et al., 1990) transformiert. Das rekombinante Plasmid wurde mit pARC0512 (NCIMB 40665) bezeichnet und ist in 12 schematisch dargestellt.
Die Nukleotidsequenz des mutanten PBP 1A-Gens aus S. pneumoniae-PBP 1A ist als SEQ ID NO: 5 und die abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID NO: 6 gezeigt.
3.2. Expression und Charakterisierung der löslichen Form von Streptococcus pneumoniae-PBP 1A
Das für das lösliche PBP 1A aus S. pneumoniae codierende Gen wurde mit einem zu dem in Abschnitt 1.2. beschriebenen analogen Verfahren exprimiert. Die zytosolische Fraktion von E. coli BL 21 (DE3)/pARC0512 wurde isoliert und auf das Vorhandensein der löslichen Form des PBP 1Adel38 aus S. pneumoniae getestet. Der für die Bindungsuntersuchungen verwendete radioaktive Ligand war [³H]-Benzyl-Penicillin (Amersham), das wie zuvor beschrieben hergestellt wurde. Es stellte sich heraus, daß ungefähr 50% des von dem mutanten Gen exprimierten Proteins in der löslichen Fraktion vorlagen und [¹²⁵I]-Penicillin (Rojo et al., 1984) oder [³H]-Penicillin (Amersham) banden, wenn die Kultur bei 22°C angezogen und mit 0,01 mM IPTG induziert wurde. Die Anzucht- und Induktionsbedingungen waren für die effiziente Gewinnung des löslichen Proteins kritisch, da ein Wachstum bei höheren Temperaturen oder eine Induktion mit höheren IPTG-Konzentrationen dazu führte, daß der Hauptteil des Proteins inaktiv wurde und Einschlußkörperchen formte. Optimale Niveaus von löslichem aktivem Protein wurden nach einer Induktion von 6–8 h festgestellt (13).
Das lösliche PBP 1Adel38-Protein aus S. pneumoniae konnte ebenso effizient gereinigt werden, indem im wesentlichen dem für die Reinigung des löslichen PBP 1B-Proteins aus E. coli verwendeten Protokoll gefolgt wurde.
Die Effizienz der Penicillin-Bindung des löslichen PBP 1Adel38 war mit der des nativen membrangebundenen PBP 1A aus S. pneumoniae vergleichbar.
BEISPIEL 4
4.1. Transglycosylase-defizientes E. coli-PBP 1B
Die konservierten Aminosäuren im Bereich 2 (14) wurden für stellengerichtete Mutagenese gewählt. Innerhalb dieses Abschnitts von 10 Aminosäuren wurden drei unterschiedliche Mutationen konstruiert:

(a) die Glutamine in Positionen 270 und 271 der PBP-1B-Sequenz wurden zu Alaninen geändert;
(b) die Glutamine in Position 270 und 271 der PBP-1B-Sequenz wurden zu Leucinen geändert; und
(c) eine Deletion der die Aminosäuren von Position 264 bis 271 codierenden Nukleotidsequenz.

Mutanten des ponB-Gens wurden im wesentlichen nach dem Verfahren von Kunkel et al. (1985) konstruiert. Ein 1,5 kb großes EcoRI-SalI-Fragment des ponB-Gens des Plasmids pBS96 wurde ausgeschnitten und in den EcoRI-SalI-geschnittenen M 13mp 19 nach Standardprotokollen kloniert.

(a) Als Primer zum Mutieren der für die Glutaminreste 270 und 271 codierenden Nukleotidsequenz in eine für Alaninreste codierende Sequenz wurde TG-21 verwendet:
(b) Als Primer zum Mutieren der für die Glutaminreste 270 und 271 codierenden Sequenz zu Leucinresten wurde TG-23 verwendet:
(c) Als Primer zum Erzeugen einer Deletion der die Aminosäuren in Position 264 bis 271 codierenden Nukleotide, die alle im konservierten Bereich 2 liegen, wurde TG-22 verwendet:

Nach der Mutagenese wurde die Nukleotidsequenz des mutagenisierten EcoRI-SalI-Fragments nach dem Protokoll von Sanger et al. (1977) bestimmt. Durch die Sequenzierung wurden die Nukleotidänderungen bestätigt und ebenso jegliche zusätzliche Änderungen ausgeschlossen. Jedes 1,5 kb große mutierte DNA-Fragment wurde zurück in den mit EcoRI und SalI geschnittenen pBS96 ligiert und die ligierte DNA in E. coli DH5α-Zellen nach Standardprotokollen transformiert. Kanamycin resistente Transformanten wurden auf ihre Plasmidprofile hin analysiert und das Plasmid mit der TG-21-Mutation (a) wurde pARC0438 (NCIMB 40661) genannt. Das mutante Protein wird mit PBP 1B QQ-AA (SEQ ID NO: 7) bezeichnet.
Das Plasmid mit der durch TG-23 eingeführten Mutation (b) wurde pARC0468 (NCIMB 40662) genannt. Das mutante Protein wird mit PBP 1B QQ-LL (SEQ ID NO: 8) bezeichnet.
Das Plasmid mit der unter Verwendung von TG-22 erhaltenen Deletion (c) wurde pARC0469 (NCIMB 40663) genannt. Das mutante Protein wird mit PBP 1Bdel8 (SEQ ID NO: 9) bezeichnet.
Die vier Plasmid-DNAs von pBS96, pARC0438, pARC0468 und pARC0469 wurden einzeln in E. coli ponB:spc^r-Zellen (Broome-Smith et al., 1985), in denen ein deletiertes ponB-Gen mit einem Spektinomycin resistenten Marker markiert worden war, transformiert.
E. coli ponB:spc^r-Zellen mit den individuellen Plasmiden pBS96, pARC0438 oder pARC0469 wurden angezogen und Membranpräparationen nach dem von Spratt (1977) beschriebenen Verfahren hergestellt, und das Profil der Penicillin-Bindungsproteine wurde nach der Markierung mit radioaktivem Penicillin auf einem 8% SDS-PAGE analysiert. Die mutanten Proteine wurden zunächst auf in vivo-Stabilität und Lokalisierung in die Membran unter Verwendung von gegen gereinigtes membrangebundenes natives PBP 1B produzierten anti-PBP-1B-Seren analysiert (15).
Es stellte sich heraus, daß die mutanten Proteine an die Membran lokalisiert wurden, wobei keine mit dem Antikörper reagierenden abgebauten Proteinfragmente nachgewiesen werden konnten, was darauf hindeutet, daß keine starke Instabilität vorlag. Darüber hinaus banden die mutanten Proteine Penicillin mit einer Affinität, die mit der des Wildtyp-PBP 1B vergleichbar war (15).
Nach dem Testen auf Transglycosylaseaktivität, wie in Heijenoort et al. (1978) beschrieben, konnte in den die mutanten Proteine exprimierenden Membranen keine Aktivität nachgewiesen werden, während die Membran mit dem Wildtyp-PBP 1B Transglycosylaseaktivität zeigte. Damit werden die Aminosäuren 263 bis 271 als kritisch für die Transglycosylaseaktivität definiert.
Die Fähigkeit der mutanten Proteine, Penicillin mit einer mit der des Wildtyps vergleichbaren Affinität zu binden, läßt darauf schließen, daß die Transpeptidaseaktivität der mutanten Proteine auch mit der des Wildtyps vergleichbar sein sollte. Mit dem Wissen, daß das auf einem Plasmid exprimierte bifunktionelle Protein PBP 1B die Deletionen sowohl von ponA als auch ponB in trans komplementieren kann (Yousif et al., 1985) wurde die Fähigkeit der Transglycosylase-negativen/Transpeptidase-positiven Proteine PBP 1B QQ-AA und PBP 1Bdel8 zur Komplementation der Abwesenheit von chromosomal codiertem PBP 1A und 1B getestet.
Das ponB Wildtyp- und das mutante ponB-Gen wurden in pMAK 705, einem Vektor mit niedriger Kopienzahl, kloniert (Hamilton et al., 1989). Die erhaltenen Plasmide wurden mit pARC0462 (Wildtyp-ponB, 16), pARC0463 (ponBdel8, 17) und pARC0470 (ponB QQ-AA, 18) bezeichnet. Die Plasmide wurden einzeln in E. coli del ponA (E. coli mit einer Deletion des ponA-Gens) transformiert.
E. coli del ponA/pARC0462, E. coli del ponA/pARC0463 und E. coli del ponA/pARC0470 wurden als Empfänger des P1-Phagen zur Transduktion des ponB:spc^r-Markers verwendet. Die Transduktion wurde wie von Miller (1972) beschrieben durchgeführt. Das P1-Phagenlysat wurde mit einem E. coli ponB:spc^r-Stamm hergestellt (Yousif et al., 1985). Nach der Infektion wurden die infizierten Zellen auf Spectinomycin ausplattiert. Die Integration des enthaltenden und ponB:spc^r-transduzierten DNA-Fragments in einen der Empfänger führte zur Inaktivierung des chromosomalen ponB-Gens, wodurch das Chromosom ponA^– und ponB^– wurde. Da dieser Genotyp für die Zelle letal ist, können die Spectinomycin-resistenten E. coli-Transduktanten nur dann lebensfähig sein, wenn das Plasmid codierte ponB oder die ponB-Mutante funktionell in trans komplementieren kann.
Die folgenden E. coli-Stämme wurden einer Phage-P1-Transduktionsanalyse der trans-Komplementation unterzogen: (1) E. coli AMA 1004, bei dem Wildtyp-ponA und -ponB chromosomal codiert sind; (2) E. coli AMA 1004, der ein chromosomal inaktiviertes ponB aufweist und der Wirt für die Plasmid codierten mutanten ponB-Gene ist; (3) E. coli AMA 1004-Wirt, der das das Wildtyp-ponB-Gen codierende Plasmid pARC0462 trägt; (4) E. coli AMA 1004-Wirt, der das PBP 1Bdel8 codierende Plasmid pARC0463 trägt; und (5) E. coli AMA 1004-Wirt, der das PBP 1B QQ-AA codierende Plasmid pARC0470 trägt.
Eine vergleichbare Anzahl von Transduktanten wurde für eine interne Marker:trp-Transduktion unter Verwendung des gleichen P1-Phagenlysats erhalten.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß lebensfähige Transduktanten nur mit Wildtyp-PBP 1B erhalten werden konnten, was darauf hindeutet, daß das TG^–TP⁺-Produkt, das von ponB QQ-AA oder ponBdel8 codiert wird, nicht den Verlust des chromosomal codierten PBP 1A und 1B komplementieren konnte. Da diese mutanten Proteine jedoch Penicillin binden und somit angenommen werden kann, daß sie Transpeptidaseaktivität aufweisen, muß die Unfähigkeit zur Komplementation im Fehlen der enzymatischen Transglycosylaseaktivität liegen. Diese Ergebnisse bestätigen die essentielle Charakteristik der Transglycosylaseaktivität von PBP 1A oder 1B für die Lebensfähigkeit der E. coli-Zelle.
Die beschriebenen Mutanten definieren den Bereich 2 dahingehend, daß er an der Transglycosylaseaktivität des Proteins beteiligt ist. Da dieser Aminosäureabschnitt in den vier hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteinen, nämlich E. coli PBP 1A, 1B und S. pneumoniae 1A und sowie dem 94 kDa großen Protein aus H. influenzae konserviert ist (14), darf man vernünftigerweise vermuten, daß die katalytische oder strukturelle Beteiligung dieses Bereichs in allen Transglycosylaseenzymen, die ähnliche Substrate wie die von PBP 1A und 1B aus E. coli verwendeten benutzen, ähnlich ist.
4.2. Transglycosylase-defizientes E. coli PBP 1A
Der konservierte Bereich 2 wurde für stellenspezifische Mutagenese gewählt, wobei die für Glutamin in den Positionen 123 und 124 von E. coli PBP 1A codierende Nukleotidsequenz zu einer für Alanin codierenden Sequenz mittels PCR-Mutagenese wie folgt geändert wurde. Die 5'-Hälfte des ponA-Gens wurde in Form von zwei Fragmenten amplifiziert, wobei das 5'-Fragment den Aminosäuren 1 bis 123 entsprach (Fragment A) und das 3'-Fragment den Aminosäuren 124 bis 434 entsprach (Fragment B).
Als Sequenz des für die Amplifikation des Fragments A verwendeten 5'-Primers wurde TG-93 (5'-GCG CGG ACC ATG GTG AAG TTC GTA AAG TAT-3') verwendet, während als 3'- Primer für die Amplifikation des Fragments A TG-106 (5'-CAG TGC TGC AGT AAT GGT ACT TGC CCC TTG-3') verwendet wurde.
Der 3'-Primer für die Amplifikation des Fragments A enthielt die Sequenz für das Restriktionsenzym PstI, wodurch die Umwandlung der die Glutaminreste in Position 123 und 124 codierenden Sequenz in eine für Alaninreste codierende Sequenz gestattet wurde.
Das Fragment B wurde mit dem 5'-Primer TG-107 (5'-ATT ACT GCA GCA CTG GCG AGA AAC TTC TTC-3') und dem 3'-Primer TG-108 (5'-TCG CGA GAT ATC TGG CGG ATT GAT CGA CAC-3')amplifiziert.
Der 5'-Primer zur Amplifikation des Fragments B enthielt die Sequenz für das Restriktionsenzym PstI, die die Sequenz mit der des 3'-Primers zur Amplifikation des Fragments A überlappte. Durch Ligation des 3'-Endes des Fragments A mit dem 5'-Ende von Fragment B wurde die Stelle für PstI wiederhergestellt und führte zu einer Änderung der Glutamin 123 und 124 codierenden Nukleotidsequenz zu Alanin 123 und 124. Die amplifizierten Fragmente A und B wurden jeweils einzeln in pBR 329 kloniert, wobei die entsprechenden Klone pARC0565 und pARC0566 erhalten wurden.
Die aus pARC0565 und pARC0566 erhaltenen Fragmente A und B wurden unter Erhalt von pARC0567 ligiert. Die ponA-Sequenzen wurden durch Einführung eines XhoI-BamHI-Fragments von pARC0489 (der mit pRRC0558 (3) identisch ist, mit der Ausnahme, daß er zusätzliche LacI- und Lac-Operatorsequenzen aufweist) in pARC0567 vervollständigt, so daß pARC0568 erhalten wurde. Das MluI-BglII-Fragment von pARC0568, das den von Q₁₂₃–Q₁₂₄ nach A₁₂₃–A₁₂₄ mutierten Bereich enthielt, wurde dann dazu verwendet, das ansonsten identische MluI-BglII-Fragment von pBS98 zu ersetzen, so daß das Plasmid pARC0571 (19; NCIMB 40668) erhalten wurde. Das mutante Protein wurde mit PBP 1A QQ-AA (SEQ ID NO: 10) bezeichnet.
Expressionsuntersuchungen der Mutante deuteten darauf hin, daß das mutante Protein an die Membran lokalisiert wurde (wie durch anti-PBP-1A-Antikörper nach gewiesen) und Penicillin mit einer zu der des nativen PBP 1A vergleichbaren Affinität band (20).
Ein in-vivo-Komplementationstest, ähnlich wie der im vorhergehenden Abschnitt beschriebene, wurde durchgeführt, indem die Fähigkeit des mutanten PBP-1A-Proteins zur Komplementation in trans überprüft wurde. Die in-vivo-Komplementation wurde durchgeführt, indem eine Phage-P1-Transduktion verwendet und ponB:spc^r in den E. coli-Wirt (Empfänger) del ponA, der das das mutante Protein PBP 1A QQ-AA codierende Plasmid enthielt, transduziert wurde.
Um die Komplementationsanalyse durchzuführen, wurde das Wildtyp-ponA-Gen in den Vektor mit niedriger Kopienzahl pMAK 705 (Hamilton et al., 1989) unter Erhalt von pARC0583 kloniert und das mutante, PBP 1A QQ-AA codierende ponA-Gen in pMAK 705 unter Erhalt von pARC0582 kloniert.
Die folgenden E. coli-Stämme wurden einer Phage-P1-Transduktionsanalyse der Transkomplementation unterzogen: (1) E. coli AMA 1004, der chromosomal codiertes ponA und ponB aufweist; (2) E. coli AMA 1004 ponA, der ein chromosomal inaktiviertes ponA aufweist und der Wirt für die Plasmid codierten mutanten ponA-Gene ist; (3) Wirt, der das Wildtyp ponA-Gen codierende Plasmid pARC0583 trägt; (4) Wirt, der das PBP 1A QQ-AA codierende Plasmid pARC0582 trägt.
Eine vergleichbare Anzahl von Transduktanten wurde für die interne Marker:trp-Transduktion unter Verwendung des gleichen P1-Phagenlysats erhalten.
Wie oben gezeigt, konnten mit E. coli del ponA/pARC0582 als Empfänger keine lebensfähigen Transduktanten erhalten werden, was darauf hindeutet, daß das mutante PBP 1A QQ-AA das Fehlen des chromosomal codierten PBP 1A/1B nicht komplementieren konnte. Dies deutet darauf hin, daß das Q₁₂₃ und Q₁₂₄ des Bereichs 2 von PBP 1A auch die Transglycosylaseaktivität des Proteins beeinflußt, da der Verlust der Komplementierungsfunktion den Verlust der Transglycosylaseaktivität widerspiegeln muß. Die Transpeptidaseaktivität des Proteins bleibt unbeeinflußt, wie über seine Affinität, Penicillin zu binden, getestet wurde.
Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, daß der Bereich 2 ein kritischer Abschnitt von Aminosäuren ist, die an der enzymatischen Transglycosylasefunktion beteiligt sind, und können die Erklärung für die starke evolutionäre Konservierung dieses Aminosäureabschnitts sein.
BEISPIEL 5
5.1. Verkürztes E. coli PBP 1B
Ein mutantes Gen, das das aus den 553 N-terminalen Aminosäuren bestehende verkürzte PBP 1B codiert, wurde mit PCR-Amplifikation unter Verwendung des 5'-Primers TG-77 (5'-GAA AAA CCA TGG CCG GGA ATG ACC-3') und des 3'-Primers TG-116 (5'-ATG GGA TCC TTA ATC ATT CTG CGG TGA-3') konstruiert.
Das 5'-Ende des Primers entsprach der Aminosäure 553 im Wildtyp mit dem sich daran anschließenden StopCodon und einer Stelle für das Restriktionsenzym BamHI. Ein 1,7 kb großes Fragment wurde unter Verwendung von pBS96-DNA als Matrize amplifiziert. Das PCR-amplifizierte Fragment wurde mit PstI und BamHI geschnitten und in das einer PstI-BamHI-Restriktion unterzogene pARC0555 (pARC0555 weist das als NcoI-BamHI-Fragment in den Expressionsvektor pET11d klonierte Voll-längen-ponB-Gen auf. Die NcoI-Stelle enthält das StartCodon ATG) unter Erhalt von pARC0592 (NCIMB 40669; 21) kloniert. Es konnte gezeigt werden, daß das exprimierte Protein (SEQ ID NO: 11) Transglycosylaseaktivität aufweist, womit die funktionelle Unabhängigkeit dieser Domäne bestätigt wurde.
Das lösliche verkürzte PBP 1B, d. h. PBP 1B mit den 553 N-terminalen Aminosäuren, dem jedoch die hydrophobe Membranverankerungsdomäne von 65–87 fehlt, wurde konstruiert, indem das PstI-BamHI-Fragment von pARC0559 (9) mit dem PstI-BamHI-Fragment von pARC0592 unter Erhalt von pARC0593 (NCIMB 40670; 22) ersetzt wurde. Das mutante ponB-Gen codiert die lösliche Form von PBP 1B, wobei sich herausstellte, daß das exprimierte Protein (SEQ ID NO: 12) Transglycosylaseaktivität aufweist.
5.2. Minimale Substrat-Bindungsdomäne des verkürzten E. coli PBP 1B
Eine detaillierte Computeranalyse der Anatomie der vermuteten TG-Domäne (RS 1–553) von PBP 1B deutete darauf hin, daß AS 210–368 möglicherweise für die Bindung des Lipid verknüpften Substrats und die Transglycosylasereaktion ausreichten. Dieser Aminosäureabschnitt enthält die drei konservierten Domänen Bereich I, II und III. Das den verkürzten Proteinabschnitt 210–368 codierende mutante Gen wurde wie folgt konstruiert.
Ein Fragment mit einer Größe von ca. 480 bp wurde aus pBS96 als Substrat mit dem 5'-Primer mit der Sequenz TG-154 (5'-CAA TCC ATG GGT GAG CAG CGT CTG TTT G-3') amplifiziert, wobei das ATG-StartCodon unmittelbar von der die 210. Aminosäure von PBP 1B codierenden Sequenz gefolgt wird.
Der 3'-Primer entsprach der Sequenz TG-155 (5'-T CCA GAA TTC CAG TTT TGG GTT ACG-3') wurde die Sequenz codierte die Aminosäure 368 von PBP 1B von der Nukleotidsequenz, die die Restriktionsstelle für EcoRI bereitstellte, gefolgt, wodurch die Fusion mit Sequenzen, die eine Enterokinasestelle und einen Histidinabschnitt codieren, ermöglicht wurde, wodurch eine schnelle Reinigung des Proteins auf einer Ni-Affinitätssäule gestattet wird (vgl. Abschnitt 6.2. unten).
Ein NcoI-EcoRI-Fragment wurde in das Plasmid pARC0400 kloniert, das einer Restriktion mit NcoI-EcoRI unterzogen worden war, so daß das rekombinante Plasmid pARC0392 (NCIMB 40659; 23) erhalten wurde. Das rekombinante Plasmid wurde in E. coli BL26 (DE3) transformiert und ein Protein von ungefähr 17 kDa Größe nach Induktion mit IPTG größtenteils in der löslichen Fraktion nachgewiesen.
In ähnlicher Weise könnte vorhergesagt werden, daß der Abschnitt 62–220 im Wildtyp-Protein am minimalen Substrat-Bindungsbereich von PBP 1A beteiligt ist. Die Produktion dieses Proteins als eine Fusion mit einem Histidinabschnitt gestattet eine hocheffiziente Affinitätsreinigung des exprimierten Produkts unter Verwendung der Ni²⁺-Säule. Dabei läßt sich vorwegnehmen, daß die Ergebnisse ähnlich wie die mit dem verkürzten PBP 1B erzielten sein werden.
BEISPIEL 6
6.1. N-terminale Fusion des löslichen E. coli-PBP 1A mit Glutathion-S-Transferase
Die Fusion des ponAdel23-Gens an seinem 5'-Ende im Leseraster mit Sequenzen, die für Glutathion-S-Transferase codieren, wurde wie im folgenden Abschnitt beschrieben hergestellt.
Als Vektor für die Fusionsgenkonstruktion wurde der von Pharmacia Biochemicals bezogene pGEX-3X gewählt. Um das 5'-Start-ATG von ponAdel23 im Leseraster mit dem Glutathion-S-Transferase codierenden Gen zu fusionieren, wurde eine BamHI-Stelle unter Verwendung eines PCR-Primers, dessen Sequenz die Sequenz für das Restriktionsenzym EcoRI enthielt, eingeführt. Als 5'-Primer wurde TG-115 verwendet:
Als 3'-Primer wurde TG-106, beschrieben in Abschnitt 4.2., verwendet. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment A wurde mit BamHI und PstI verdaut und in die BamHI-PstI-Stellen des Standard-Klonierungsvektors pUC8 unter Erhalt von pARC0496 kloniert. Dieses Fragment A enthält die 102 N-terminalen Aminosäuren des PBP 1Adel23-Proteins. Ein aus Fragment A erhaltenes 270 bp großes BamHI-MluI(Stelle, die im Fragment A liegt)-Fragment, ein 2,2 kb großes MluI-EcoRI-Fragment, das den Rest des aus pARC0490 erhaltenen Anteils des ponA-Gens (in pARC0490 ist das Wildtyp-ponA-klonierte Gen in die XbaI-BamHI-Stellen des Vektors mit niedriger Kopienzahl pWKS29 (Fu Wang et al., 1991) kloniert, wodurch das Ausschneiden des 3'-Endes des ponAdel23-Gens als EcoRI-Fragment erleichtert wird) enthält, sowie ein EcoRI-BamHI-geschnittenes pGEX-3X wurden zusammenligiert und in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Einzelne Transformanten wurden jeweils einem Screening auf rekombinantes Plasmid unterzogen, wobei das Plasmid mit der erwarteten Struktur mit pARC0499 (NCIMB 40664; 24) bezeichnet wurde. In dem codierten Fusionsprodukt auf pARC0499 sind die Glutathion-S-Transferasesequenzen an ihrem C-Terminus mit PBP 1Adel23-Sequenzen über eine Faktor-Xa-Spaltungserkennungssequenz verknüpft.
Nach der Induktion mit 1 mM IPTG stellte sich heraus, daß ein Fusionsprotein der erwarteten Größe induziert wurde. Das Protein band Penicillin und war im Transglycosylase-Assay aktiv. Nach der Zelllyse durch Hindurchleiten der Suspension durch eine French-Presse wurde die zellfreie Überstandsfraktion, wie ausführlich in Abschnitt 1.4. für die Reinigung von PBP-1Adel23 beschrieben, präpariert. Die Überstandsfraktion wurde durch eine Glutathion Sepharose^®-Matrix (Pharmacia Biochemicals) geleitet und das gebundene GST-PBP-1Adel123 mit Glutathion eluiert. Das eluierte Protein stellte sich als zu 80% homogen heraus. Freies Glutathion wurde durch Dialyse abgetrennt und das GST-PBP-1Adel23 mit Faktor Xa gespalten.
Es stellte sich heraus, daß das so gereinigte PBP 1Adel23 sowohl bei der Penicillin-Bindung als auch in den Transglycosylasereaktionen aktiv war.
6.2. C-terminale Fusion von löslichem E. coli PBP 1A mit einem Histidinabschnitt
Die Fusion des ponAdel23-Gens an seinem 3'-Ende im Leseraster mit Sequenzen, die einen Abschnitt aus 6 Histidinen codieren, wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Im ersten Schritt wurde das ponAdel23-Gen unter Verwendung von pBS98-DNA als Matrize mit dem 5'-Primer TG-115 (5'-TCG AGG ATC CCC ATG GGC CTA TAC CGC TAC ATC G-3') und dem 3'-Primer TTG-121 (5'-GTT AGA ATT CGA ACA ATT-CCT GTG-3') amplifiziert.
Durch den 3'-Primer wurde eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende des ponAdel23-Gens eingeführt, während das TranslationsstopCodon eliminiert wurde. Das PCR-amplifizierte modifizierte ponAdel23-Genfragment wurde mit PstI und EcoRI verdaut, so daß ein 930 bp großes 5'-Ende-Fragment freigesetzt und mit PstI-EcoRI-verdautem pBR 329 unter Erhalt des rekombinanten Plasmids pARC0467 ligiert wurde.
Im nächsten Schritt wurde ein doppelsträngiges synthetisches Oligonukleotid mit die 6 Histidine codierenden Sequenzen sowie der DNA-Sequenz, die für als die Enterokinase-Schnittstelle erkannten Aminosäuren codiert, synthetisiert und mit der neu geschaffenen EcoRI-Stelle am 3'-Ende des ponAdel23-Gens auf pARC0467 ligiert. Als synthetische Oligonukleotide wurden TG-122:
und TG 123 (5'-GAT CCT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTG TCG TCG TCG TCG-3') verwendet.
Das Plasmid pARC0467 wurde mit EcoRI linearisiert und das synthetische doppelsträngige Oligonukleotid ligiert. Nach der Ligation wurde ein PstI-BamHI (Fragment A) aus dem Ligationsgemisch freigesetzt und in die PstI-BamHI-Stellen von pARC0558 (3) kloniert, so daß pARC0400 (NCIMB 40660; 25) erhalten wurde. Das mutante ponAdel23-Fusionsgen codierte somit ein Protein, bei dem die PBP-1Adel23-Sequenz mit der Aminosäuresequenz Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, die mit His-His-His-His-His-His an ihrem C-Terminus fusioniert war, fusioniert war. Die Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Sequenz wird von der Protease Enterokinase erkannt und spaltet nach dem Lysinrest. Die 6 Histidinreste verleihen dem Protein die Fähigkeit, an das Metall Nickel zu binden.
Das rekombinante Plasmid pARC0400 wurde in E. coli BL26(DE3)-Zellen transformiert und unter Kultivierungs- und Temperaturbedingungen, die mit denen für die Reinigung von PBP 1Adel23 verwendeten identisch waren, induziert. Die Zellen wurden durch Hindurchleiten durch eine French-Presse lysiert. Das Lysat wurde 10 min. bei 10.000 UpM zentrifugiert. Der nach der Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit erhaltene Überstand wurde danach 45 min. bei 200.000 × g zentrifugiert, wobei der erhaltene Überstand die zytosolische Fraktion darstellte. Diese Fraktion enthielt das durch das Fusionsgen codierte Protein, wobei das rekombinante Fusionsprotein mit PBP 1Adel23EH bezeichnet wurde. Dieses Protein PBP 1Adel23EH band [¹²⁵I]-Cephradin und war ebenso im Transglycosylase-Assay aktiv. Die lösliche Fraktion wurde durch eine Ni-Affinitätssäule geleitet und gebundenes Protein stufenweise mit steigenden Konzentrationen von Imidazol eluiert, wobei im wesentlichen dem in „The Qia Expressionist", erhalten von der Firma QIAGEN Inc. 9259 Eton Avenue, Chateworth, CA 91311 USA, beschriebenen Verfahren gefolgt wurde. Der Hauptteil des PBP 1Adel23EH eluierte mit 250 mM Imidazol und war ungefähr 85% homogen. Es handelte sich dabei um das einzige Cephradin-Bindungsprotein, das von der Säule eluiert wurde. Somit läßt sich die Fähigkeit des Fusionsproteins, an die Ni-Säule zu binden, leicht sowohl für eine effiziente Reinigung als auch Immobilisierung des aktiven Proteins ausnutzen.
BEISPIEL 7
7.1. Verwendung von Zellextrakten für Enzym-Assays und beim Screening
Der gemäß Beispiel 6 hergestellte Zellrohextrakt läßt sich auf die Fähigkeit, Penicillin zu binden, durch Umsetzung mit gemäß Hackenbeck (1983) hergestelltem [³H]-Ampicillin analysieren. Zur Anpassung des Verfahrens an ein Screening im großen Maßstab wird eine 96-Loch-Mikrotiterplatte, die die Reaktionen enthält, verwendet, und der Test wird unter Verwendung eines Beckman Biomek-Roboters durchgeführt. Der Zellrohextrakt wird 15 min. bei 37°C mit [³H]-Ampicillin gemischt. Die Proteine im Reaktionsgemisch werden mit TCA gefällt und auf einem Glasfilter gesammelt, nicht gebundenes Ampicillin wird abgewaschen, und die Filter werden in einem Szintillationszähler gezählt. Alternativ läßt sich zum Testen des Ausmaßes der Ampicillinbindung eine Autoradiographie einsetzen.
Auf Grundlage des obigen Verfahrens kann ein kompetitiver Assay verwendet werden, um die Fähigkeit der Testverbindungen zur Bindung an die Transpeptidasestelle einer PBP-Variante zu beurteilen. Bei diesem Test wird die Testverbindung dem Rohzellextrakt 15 min. vor Zugabe des Ampicillins ausgesetzt. Ein positives Ergebnis wird durch eine Abnahme der auf dem Glasfilter vorhandenen Radioaktivitätsmenge angezeigt.
7.2. Verwendung von löslichem immobilisiertem Protein beim Screening
Ein Histidinpeptid enthaltendes Protein, das wie beschrieben gereinigt wurde, läßt sich zum Screening auf Verbindungen einsetzen, die Transpeptidaseaktivität oder Transglycosylaseaktivität hemmen. Das gereinigte Vollängen- oder verkürzte Protein wird auf einem Agarosegel, an das Ni(II) gekoppelt wurde, immobilisiert. Portionen der Kügelchen, die immobilisiertes Protein enthalten, werden dann in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte übertragen, die Testverbindungen werden in die Platte gegeben und inkubiert, bevor nicht gebundene Testsubstanz freigewaschen wird. Verbindungen, die an die Transpeptidasestelle des bifunktionellen Proteins binden, lassen sich nachweisen, indem [³H]-Ampicillin in das Reaktionsgefäß gegeben wird und im wesentlichen wie oben beschrieben fortgefahren wird. Dabei lassen sich alternativ monoklonale Antikörper, von denen man weiß, daß sie an den Transpeptidasebereich binden, verwenden. Verbindungen, die an die Transglycosylasestelle binden, lassen sich in einem kompetitiven Assay durch Verwendung monoklonaler Antikörper, die an den Transglycosylasebereich des Proteins binden, beurteilen.
BEISPIEL 8
8.1 Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen PBP 1A
Bei dem Protokoll zur Produktion von monoklonalen Antikörpern (mAbs) handelte es sich im wesentlichen um das in „Antbodies – a laboratory manual" (Hrsg. Harlow David Lane, Cold Spring Harbour, USA) beschriebene Protokoll. Als Immunogen wurde gereinigtes membrangebundenes PBP 1A verwendet. Balb-C-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden mit 50 μg gereinigtem nativem PBP 1A in Freunds Complete Adjuvant immunisiert. Eine Booster-Injektion von 20 μg PBP 1A in inkonkretem Freunds Adjuvans wurde intraperitoneal verabreicht. Zwei Wochen später wurde das Vorhandensein der Serumantikörper durch ELISA mit PBP 1A als Beschichtungsantigen überprüft. Mäuse mit im Kreislauf vorhandenen Antikörpern wurden täglich über 4 Tage mit 20 μg PBP 1A in Kochsalzlösung intraperitoneal immunisiert und danach zur Isolierung der Milzzellen zur Erzeugung der Fusionen getötet.
Bei der in den Fusionsexperimenten verwendeten Myelom-Zellinie handelte es sich um Sp 2/0-Ag 14, wobei diese Zellen mit Milzzellen aus immunisierten Mäusen in einem Verhältnis von 10 : 1 fusioniert wurden. Die Fusion wurde mit Standardprotokollen durchgeführt, wobei die Antikörperproduktion von den Klonen mittels ELISA gegen PBP 1A überwacht wurde, sobald die Zellen > 90% konfluent waren.
72 Klone mit hoher Produktion wurden in 24-Loch-Platten expandiert, und der sezenierte Antikörper wurde unter Verwendung der folgenden Screens charakterisiert: (1) ELISA gegen die membrangebundene Form von PBP 1A; (2) ELISA gegen die lösliche Form von PBP 1Adel23; (3) Dot-Blot-Analyse gegen membrangebundenes PBP 1A zur Eliminierung von monoklonalen Antikörpern, die mit dem durch Detergenz solubilisierten gereinigten PBP-1A-Protein nur aufgrund von Änderungen in der Konfiguration während der Reinigung reagieren; und (4) ELISA gegen die membrangebundene Form von PBP 1B.
Auf Grundlage dieser Screens wurde ein Satz von 5 sezernierenden Klonen ausgewählt und zweimal subkloniert, um die Monoklonalität sicherzustellen. Mit diesen Hybridomklonen wurden nach Standardverfahren Aszites produziert, und IgG wurde aus diesen Aszitesflüssigkeiten unter Verwendung einer Protein G-Sepherose^®-Affinitätschromatographie, wie von den Herstellern der Protein G-Sepherose^® (Pharmacia Biochemicals) empfohlen, gereinigt.
Diese gereinigten Antikörper reagieren spezifisch mit PBP 1A sowohl in den membrangebundenen als auch den löslichen Formen in ELISA, den Dot-Blots und im Western-Blotting. Klone wurden mit einem Klonierungsverfahren, bei dem 3 Zellen/Vertiefung eingesetzt wurden, erhalten. Um die Monoklonalität dieser Klone sicherzustellen, wurden diese in 96-Loch-Mikrotiterplatten durch limitierende Verdünnung bei einer Zelle/Vertiefung subkloniert. Die Vertiefungen, die eine Zelle erhielten, wurden unter dem Mikroskop sorgfältig bestätigt und mit Makrophagen-Feeder-Schichten so wachsen gelassen, daß eine Nachkommenschaft aus einer einzigen Hybridzelle erhalten werden konnte. Nach der Subklonierung wurde die Sekretion von mAbs gegen PBP 1A wiederum im ELISA unter Verwendung on Vollängen-PBP 1A getestet. Schließlich wurden jeweils zwei Klone von jedem Ausgangshybridom ausgewählt, wobei einer davon als Aszites in unberührten geprimten Balb/c-Mäusen expandiert wurde. Alle fünf Klone paßten sich an das Wachstum in der Bauchhöhle an und produzierten aszitische mAbs.
Die aszitischen mAbs wurden gegen gereinigtes PBP 1A im ELISA titriert. Alle aszitischen mAbs wiesen einen Titer von > 5 × 10⁵ in ELISA auf und erkannten das Vollängen-Protein in Western-Immunoblots. Die aszitischen mAbs wurden über Protein-G-Affinitätssäulen gereinigt.
Der Immunglobulin-Isotyp der mAbs wurde mit einem Maus-Ig-Isotyp mittels ELISA unter Verwendung eines von Sigma chemicals USA bezogenen Kits bestimmt. Vier monoklonale Antikörper gehörten zum IgG1- und einer zum IgG2a- Immunglobulin-Isotyp.
Die weitere Charakterisierung der mAbs wurde unter Verwendung eines membrangebundenen Vollängen-PBP 1A/1B in Western-Blots durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Spezifität der mAbs gegenüber der Transglycosylase (TG)- und der Transpeptidase (TP)-Domäne unter Verwendung verschiedener verkürzter Formen des membrangebundenen N-Terminus von PBP 1A, N-Terminus von PBP 1B und C-Terminus von PBP 1B in Western-Immunblots bestimmt. Verschiedene membrangebundene verkürzte und Vollängen-PBPs wurden exprimiert und die präparierten Membranfraktionen auf einer SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen übertragen und einer Western-Blot-Analyse mit polyklonalen E. coli-PBP-1A-Antikörpern und monoklonalen Antikörpern ausgesetzt.
Die Beurteilung des Potentials der mAbs zur Inhibition der Penicillinbindung wurde im wesentlichen nach dem von Blaauwen et al. (1990) beschriebenen Protokoll bestimmt. Die Protein-G-affinitätsgereinigten mAbs wurden mit PBP 1A vorinkubiert und anschließend mit [³H]-Benzyl-Penicillin oder [¹²⁵I]-Cephradin versetzt. Zwei mAbs hemmten kompetitiv die Bindung des radioaktiv markierten Penicillins an PBP 1A.
Für die TG-Domäne von PBP 1a spezifische monoklonale Antikörper wurden durch Screening des sezenierten Antikörpers der ursprünglichen Hybridomklone auf Reaktion mit dem die 434 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1A repräsentierenden Protein in Western-Blots gewonnen. Der Antikörper aus Klon TG-2 reagierte mit dem N-terminalen verkürzten 434-Aminosäuren-Analog von PBP 1A, hemmte jedoch auch die Transglycosylaseaktivität von PBP 1A (> 80% Hemmung). Dies deutet darauf hin, daß der Antikörper Sequenzen im Protein erkennt, die (a) an der Bindung des Substrats beteiligt sind; (b) die enzymatische Wirkung katalysieren; oder (c) die Konformation des Proteins allosterisch verändern. Bei jeder der drei Möglichkeiten würde die Identifizierung von Verbindungen, die um die Bindung von TG-2 an PBP 1A konkurrieren, Moleküle darstellen, die mit identischen Sequenzen auf PBP 1A wechselwirken. Somit könnte der kompetitive Bindungsassay als Screening-Assay zur Identifizierung der TG hemmenden Verbindung verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Hydropathizitätsprofil von E. coli-PBP 1A. Die Abbildung zeigt in erweiterter Form das Hydropathizitätsmuster der 55 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1A.
2 Schematische Darstellung des T7-Translationsfusionsexpressionsvektors pARC038.
____ Vektorsequenzen
Kanamyzin-Resistenz verleihendes Gen Km^r, den Lactose-Repressor codierendes Gen (lac I_q), Replikationsursprung (ori), T7-Lac-Operator-Promotor, Phage-T7-Terminator.
Die Transkriptionsrichtung der unterschiedlichen Gene ist durch Pfeile angedeutet. Relevante Restriktionsenzymstellen sind dargestellt. Die Ziffern neben der Restriktionsstelle repräsentieren die Nukleotidposition, wobei das Nukleotid in der oberen Zwölf-Uhr-Position den Wert Null erhält.
3 Schematische Darstellung des lösliches PBP 1Adel23 aus E. coli codierenden Vektors pARC0558.
____ Vektorsequenzen
PBP 1Adel23 codierendes mutantes Gen, Kanamyzin-Resistenz Km^r, Lactose-Repressor (lac I_q) und Replikationsursprung (ori).
4 Expression von löslichem PBP 1Adel23. Tafel A repräsentiert das Autoradiogramm des [¹²⁵I]-Cephradin-Bindungsprofils der nichtinduzierten und induzierten, pARC0558 enthaltenden Kulturen von E. coli BL 26 (DE3). Tafel B repräsentiert das Proteinprofil der Coomassie Brilliant Blue-Färbung derselben nichtinduzierten und induzierten Zellen. Spur (1): nichtinduzierte Zytosolfraktion; (2): nichtinduzierte Membranfraktion; (3): induzierte Zytosolfraktion; (4): induzierte Membranfraktion; (M): Molekulargewichtsmarker.
5 SDS-PAGE-Muster des gereinigten PBP 1Adel23. Tafel A: Coomassie Blue-Anfärbung. Tafel B: [¹²⁵I]-Cephradin-Bindungsproteinprofil. Spuren (1): E. coli BL 26 (DE3)/pARC0558, zytosolische Fraktion (200.000 g Überstand); (2): 30% Ammoniumsulfat, Überstandsfraktion; (3): 30% Ammoniumsulfat, Pelletfraktion; (4) Cephradin-Affigel-Durchbruchfraktion; (5): Molekulargewichtsmarker; (6–8): Cephradin-Affigel-Eluat.
6 Transglycosylaseaktivitätsprofil von Wildtyp-PBP 1A und mutantem PBP 1Adel23 unter Verwendung gereinigter Proteine.
(
-
) Repräsentiert die Aktivität von löslichem PBP 1Adel23;
(•-•) Repräsentiert die Aktivität von membrangebundenem PBP 1A solubilisiert mit Octyl-β-glycosid. Die X-Achse zeigt die Konzentration der verwendeten Proteine in μg. Die Y-Achse zeigt die Mengen des gebildeten Peptidoglycans.
7 Hydropathizitätsprofil von E. coli PBP 1B. Die Abbildung repräsentiert das erweiterte Hydropathizitätsprofil der 150 N-terminalen Aminosäuren von E. coli PBP 1B.
8 Schematische Darstellung der Klonierung der löslichen Transglycosylasedomäne von E. coli PBP 1B.
____ Vektorsequenzen
ponB-Genfragmente und β-Lactamase codierende Sequenzen
Das die 64 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1B codierende NcoI-NruI-Fragment wurde in die NcoI-EcoRV-Stellen von pARC0534 unter Erhalt des Plasmids pARC0551 kloniert. Dieses rekombinante Plasmid enthält das Aminosäure 1 bis 480 von PBP 1B codierende Gen mit einer internen Deletion von Aminosäure 65 bis 87.
9 Schematische Darstellung von lösliches PBP 1B codierendem pARC0559.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen des die lösliche Form von PBP 1B (solPBP 1B) codierenden mutanten ponB-Gens, des Lactose-Repressors (lac I_q), der Kanamycin-Resistenz (Km^r) und des Replikationsursprungs (ori).
Pfeile repräsentieren die Transkriptionsrichtung der Gene.
10 Reinigung von löslichem PBP 1B. Tafel A: SDS-PAGE, Coomassie Blue-Anfärbung der unterschiedlichen Fraktionen. Tafel B: [¹²⁵I]-Ampicillin-Bindungsprofil derselben Fraktionen. Spuren (1) und (2): zytosolische Fraktion der induzierten E. coli BL 26(DE3)/pARC0559-Zellen; (3): Durchbruchfraktion der Ampicillin-Affigel-Säule; (4): Molekulargewichtsmarker; (5) und (6): von der Ampicillin-Affigel-Säule eluierte Fraktion.
11 Hydropathizitätsprofil von S. pneumoniae PBP 1A. Die Abbildung zeigt das erweiterte Profil des Hydropathizitätsprofils der 100 N-terminalen Aminosäuren von S. pneumoniae PBP 1A.
12 Schematische Darstellung des die lösliche Form von S. pneumoniae PBP 1A codierenden Plasmids pARC0512.
____ Repräsentiert Vektorsequenzen
Repräsentiert Sequenzen des lösliches PBP 1A von S. pneumoniae (sPBP 1A) codierenden Gens, der Kanamycin-Resistenz Km^r und des Replikationsursprungs (ori).
13 Penicillin-Bindungsprofil von löslichem S. pneumoniae PBP 1A. Wirt: E. coli BL 21(DE3)/pARC0512. Tafel A: Coomassie Blue-Anfärbung. Tafel B: In-vivo-Markierung mit [³H]-Benzylpenicillin mit anschließender SDS-PAGE. Spuren (1) und (2): zytosolische Fraktion der 2 h bzw. 20 h bei 22°C induzierten Zellen; (3): zytosolische Fraktion der 2 h bei 30°C induzierten Zellen; (4): zytosolische Fraktion der 2 h bei 37°C induzierten Zellen; (5): Molekulargewichtsmarker.
14 Vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuren konservierter Bereiche der Transglycosylasedomäne von hochmolekularen Penicillin-Bindungsproteinen. Die Abbildung vergleicht die konservierten Reste der Bereiche 1, 2 und 3 von E. 1A (E. coli PBP 1A), E. 1B (E. coli PBP 1B), S. 1A (S. pneumoniae PBP 1A) und H. inf (Haemophilus influenzae PBP 1A). (*) deutet identische Aminosäurereste an.
15 Analyse von Membranprotein von E. coli-Zellen, die Plasmide mit mutantes PBP 1B codierenden Genen enthalten. Tafel A: [³H]-Benzylpenicillin-Bindungsprofil. Tafel B: Western-Blot mit Anti-PBP-1B-Seren. Spuren (1): Molekulargewichtsmarker; (2): Membranfraktion von E. coli JM 101/pBS96-Zellen; (3): Membranfraktion von E. coli 900521 ponB:Spc^r-Zellen (Diesem Wirt fehlt chromosomal codiertes PBP 1B); (4): Membranfraktion von E. coli 900521 ponB:spc./pARC0438-Zellen; (5): Membranfraktion von E. coli 900521 ponB:spc/pARC0469; (6): Membranfraktion von E. coli 900521 ponB:spc./pARC0468.
16 Schematische Darstellung des Wildtyp-PBP 1B codierenden Plasmids pARC0462:
____ Vektorsequenzen
Sequenzen des ponB-Gens, des Replikationsursprungs (ori), der Chloramphenicol-Acetyltransferase (cm^r) und von Teilen der lac-Z-Mehrfachklonierungsstelle.
17 Schematische Darstellung des das mutante ponB-Gen codierenden Plasmids pARC0463.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen der Mutante des PBP-1Bdel8-Aminosäuren codierenden ponB-Gens, des Replikationsursprungs (ori), der Chloramphenicol-Acetyltransferase (cm^r) und von Teilen der lac-Z-Mehrfachklonierungsstelle.
18 Schematische Darstellung des das mutante ponB-Gen codierenden Plasmids pARC0470.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen der Mutante des PBP 1B Q_271–272-A_271–272 codierenden ponB-Gens, des Replikationsursprungs (ori), der Chloramphenicol-Acetyltransferase (cm^r) und von Teilen der lac-Z-Mehrfachklonierungsstelle.
19 Schematische Darstellung von das mutante ponA-Gen enthaltendem pARC0571.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen des mutanten ponA-Gens (PBP 1A QQ-AA), der Kanamyzin-Resistenz Km^r, des Replikationsursprungs (ori).
20 [¹²⁵I]-Penicillin-Bindungsproteinprofil von Wildtyp- und mutantem E. coli-PBP 1A. Spur (I): E. coli AMA 1004 ponB:spc^r/pBS 98 (w. t. ponA); (2): E. coli BL21 (DE3) ponB:spc^r/pARC0570 (w. t. ponA); (3): E. coli AMA 1004 del ponA/pARC0571 (QQ-AA ponA); (4): E. coli AMA 1004 del ponA:/pBS 98 (w. t. ponA); (5): Molekulargewichtsmarker.
21 Schematische Darstellung des Plasmids pARC0592.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen des für die 553 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1B (hinge 1B) codierenden verkürzten ponB-Gens, der Kanamyzin-Resistenz (Km^r) und des Replikationsursprungs (ori).
22 Schematische Darstellung des Plasmids pARC0593.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen des eine lösliche Form der verkürzten 553 N-terminalen Aminosäuren von PBP 1B (lösliches hinge 1B) codierenden mutanten verkürzten ponB-Gens, der Kanamyzin-Resistenz Km^r und des Replikationsursprungs (ori).
23 Schematische Darstellung des Plasmids pARC0392.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen eines mutanten Gens, das ein die Sequenzen der Aminosäuren 210–386 darstellendes verkürztes Fragment des Proteins PBP 1B codiert und an seinem 3'-Ende im Leseraster mit einer Enterokinasestelle und einen nachfolgenden Abschnitt aus 6 Histidinen codierenden Sequenzen fusioniert ist, der Kanamyzin-Resistenz Km^r und des Replikationsursprungs (ori).
24 Schematische Darstellung des Plasmids pARC0499.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen von Sequenzen, die ein mutantes ponAdel23-Gen, das an seinem 5'-Ende im Leseraster mit Sequenzen, die Glutathion-S-Transferase codieren, fusioniert ist, codieren, der β-Lactamase amp^r und des Replikationsursprungs (ori).
25 Schematische Darstellung des Plasmids pARC0400.
____ Vektorsequenzen
Sequenzen von mutanten ponAdel23-Sequenzen, die im Leseraster an ihrem 3'-Ende mit Sequenzen, die eine Enterokinasestelle und einen anschließenden Abschnitt von 6 Histidinen codieren, fusioniert sind, der Kanamyzin-Resistenz Km^r und des Replikationsursprungs (ori).
LITERATURANGABEN

Balganesh, T. S. und Lacks, S. (1984): Gene 29, 221–230
den Blaauwen, T. et al. (1990): J. Bact. 172, 63–70
Broome-Smith, J. K. et al. (1985): Eur. J. Biochem. 147, 437–446
Covarrubias, L. & Bolivar, F. (1982): Gene 17, 79–89
Edelman, A. et al. (1987): Molecular Micobiology 1, 101–106
Fu Wang, R. und Kushner, S. R. (1991): Gene 100, 195–199
Hackenbeck et al. (Hrsg) The target of penicillin. W. de Gruyter publications, Berlin/New York 1983.
Hamilton, C. A. et al. (1989): J. Bacteriol. 171, 4617–4622
Heijenoort, Y. van, et al. (1978): FEBS Letters 89, 141–144
Heijenoort, Y. van, et al. (1992): J. Bacteriol. 174, 3549–3557
Ishino, F. et al. (1980): Biochem. Biophys. Res. Comm. 97, 287–293
Kunkel, T. A. (1985): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 488–492
Kyte und Doolittle (1982): J. Mol. Biol. 157, 105–132
Lacks, S. A. (1968): Genetics 60, 685–706
Martin, C. et al. (1992): J. Bacteriol. 174, 4517–4523
Miller, J. H. (Hrsg.) (1972): Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Publications.
Nakagawa, J. S. et al. (1984): J. Biol. Chem. 259, 13937–13946
Page, W. J. et al. (1982): J. Bacteriol. 151, 237–242
Rojo et. al. (1984): J. Antibiotics. 37, 389–393
Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989): Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
Sauger, et al. (1977): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463–5467
Spratt, B. S. (1977): Eur J. Biochem. 72, 341–352
Studier, F. W. et al. (1990): Methods in Enzymology 185, 61–89
Tomb, F. et al. (1991): Gene 104, 1–10
Yousif, S. Y. et al. (1985): J. Gen. Microbiol. 131, 2839–2845

SEQUENZPROTOKOLL
EP 0 792 284 B1 INDICTIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)
EP 0 792 284 B1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 bis)

Claims

Polypeptid, bei dem es sich um ein wasserlösliches aktives Derivat eines bakteriellen bifunktionellen Penicillin-Bindungsproteins handelt, wobei das Penicillin-Bindungsprotein bei Expression in einer Bakterienzelle an die Zellmembran gebunden wird und dazu in der Lage ist, sowohl Transglycosylase- als auch Transpeptidaseaktivität zu zeigen und wobei dem Derivat zwar eine Membranverankerungssequenz fehlt, es jedoch die Fähigkeit behält, eine oder beide der genannten Enzymaktivitäten zu zeigen, und wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12 oder 13 im Sequenzprotokoll angegeben ist, aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Bakterienzelle um eine Escherichia coli-Zelle oder eine Streptococcus pneumoniae-Zelle handelt.
Polypeptid, umfassend (a) ein erstes Polypeptid nach Anspruch 1 und (b) ein zusätzliches Polypeptid, das die Bindung an eine Affinitätsmatrix gestattet, wobei eine Schnittstelle zwischen den Polypeptiden vorliegt.
Polypeptid nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem zusätzlichen Polypeptid um Glutathion-S-Transferase oder um ein Polypeptid mit weitgehender Ähnlichkeit zu Glutathion-S-Transferase handelt.
Polypeptid nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem zusätzlichen Polypeptid um ein an Histidinresten reiches Polypeptid handelt.
Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, das eine für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 3 codierende Nukleotidsequenz aufweist.
DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei die Nukleotidsequenz mit SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 im Sequenzprotokoll identisch ist.
Replizierbarer Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül nach Anspruch 6 trägt und dessen Expression vermitteln kann.
Vektor nach Anspruch 8, bei dem es sich um den Vektor pARC0558 (NCIMB-Nr. 40666), pARC0559 (NCIMB-Nr. 40667), pARC0512 (NCIMB-Nr. 40665), pARC0438 (NCIMB-Nr. 40661), pARC0468 (NCIMB-Nr. 40662), pARC0469 (NCIMB-Nr. 40663), pARC0571 (NCIMB-Nr. 40668), pARC0593 (NCIMB-Nr. 40670), pARC0392 (NCIMB-Nr. 40659), pARC0499 (NCIMB-Nr. 40664) oder pARC0400 (NCIMB-Nr. 40660) handelt.
Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 8.
Prozeß zur Herstellung eines Polypeptids, bei dem es sich um ein Derivat des Penicillin-Bindungsproteins handelt, wobei in dem Verfahren eine Zelle nach Anspruch 10 in oder auf einem Kulturmedium zur Expression des Polypeptids angezogen und das Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird.
Prozeß zur Herstellung eines wasserlöslichen Polypeptids nach Anspruch 1, bei dem Escherichia coli-Zellen kultiviert werden, die einen Expressionsvektor enthalten, in dem eine für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines mit Isopropylthiogalactosid (IPTG) induzierbaren Promotors steht, wobei die Kultivierung in Gegenwart einer für die Induktion des Promotors suboptimalen IPTG-Konzentration und bei einer Temperatur im Bereich von 20–24°C durchgeführt wird.
Verfahren zur Identifizierung eines zur Bindung eines bakteriellen bifunktionellen Penicillin-Bindungsproteins fähigen Antikörpers, wobei man in einem Schritt der Methode ein Polypeptid nach Anspruch 1 in einem Antikörper-Bindungstest einsetzt und an das Polypeptid bindende Antikörper auswählt.
Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen, bei dem man (a) ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 7 mit einer zu untersuchenden Verbindung in Kontakt bringt und (b) nachweist, ob die Verbindung an das Penicillin-Bindungsprotein bindet.
Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen, bei dem man (a) Zellen nach Anspruch 10 kultiviert, (b) die Zellen lysiert und den Zellrohextrakt isoliert, (c) den Zellextrakt potentiellen Inhibitoren eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (d) dem Zellextrakt eine bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Substanz zuführt, (e) die nichtgebundene Substanzfraktion abtrennt und (f) den Zellextrakt auf das Vorhandensein der darin verbliebenen Substanz testet.
Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen, bei dem man (a) ein auf einem festen Träger immobilisiertes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 3 einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) eine bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Substanz dem immobilisierten Polypeptid aussetzt, (c) die nichtgebundene Substanzfraktion abtrennt und (d) das immobilisierte Polypeptid auf das Vorhandensein der daran gebundenen Substanz testet.
Testverfahren für an ein Penicillin-Bindungsprotein bindende Verbindungen, bei dem man (a) ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 3 einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) das Polypeptid einer bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindenden Substanz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aussetzt und (c) die immobilisierte Substanz auf das Vorhandensein von daran gebundenem Polypeptid testet.
Testverfahren für an die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Verbindungen, bei dem man (a) die Transglycosylasedomäne eines auf einem festen Träger immobilisierten Polypeptids nach Anspruch 1 oder 3 einem potentiellen Inhibitor der Transglycosylase-Aktivität eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) eine bekanntermaßen die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Substanz dem immobilisierten Polypeptid aussetzt, (c) die nichtgebundene Substanzfraktion abtrennt und (d) das immobilisierte Polypeptid auf das Vorhandensein der daran gebundenen Substanz testet.
Testverfahren für an die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindende Verbindungen, bei dem man (a) die Transglycosylasedomäne eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 3 einem potentiellen Inhibitor eines Penicillin-Bindungsproteins aussetzt, (b) das Polypeptid einer bekanntermaßen die Transglycosylasedomäne eines Penicillin-Bindungsproteins bindenden Substanz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aussetzt und (c) die immobilisierte Substanz auf das Vorhandensein von daran gebundenem Polypeptid testet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei es sich bei der bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindenden Substanz um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei es sich bei der bekanntermaßen ein Penicillin-Bindungsprotein bindenden Substanz um eine markierte antibiotische Verbindung handelt.
Verfahren zur Bestimmung der Proteinstruktur eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid nach Anspruch 1 bei der Röntgenkristallographie genutzt wird.