JPH04505548A - 大腸菌分泌性株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、第二のＤＮＡ配列がヒトインターロイキン−４をコードする、許請求の範囲 第１項または第２項に記載の細菌。

４、両方のＤＮＡ配列の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求の範囲第 １項から第３項までのいずれかに記載の細菌。

５、誘導プロモーターがｌａｃプロモーターである、請求の範囲第４項に記載の 細菌。

６、　ＲＺ２１．Ｒ３６３１またはＲＬ７株である、請求の範囲第１項に記載の 細菌。

７、組み換えベクターがプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１である、請求の範囲第 １項から第３項までのいずれかに記載の細菌。

８、所望のヘテロなタンパク質の産生方法であって、該方法は、（ａ）　培地中 に、生物学的に活性のあるヘテロなタンパク質を分泌することのできるＥ、　ｃ ｏｌｉ細菌の培養であって、該培養は（ｉ）　バクテリオファージＴ７による感 染に耐性かあり、培地中に十分量のベリプラズミックタンパク質を分泌する能力 のあることによって特徴づけられるＥ、　ｃｏｌｉ細菌、および （１１）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的 に連結されたベリブラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのでき るシグナルペプチドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター 、 を含み、ここで該培養は、該細菌が両方のＤＮＡ配列を発現し、培地中にヘテロ なタンパク質を分泌するような条件下で行われる。および、（ｂ）　培地中から の分泌されたタンパク質の単離を含む、上記産生方法。

９、第一のＤＮＡ配列がｏｌＩｌｐ＾シグナルペプチドをコードする、請求の範 囲第８項に記載の方法。

１０、第二のＤＮＡ配列がヒトインターロイキン−４をコードしている、請求の 範囲第８項または第９項に記載の方法。

１１、両方のＤＮＡ配列の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求の範囲 第８項から第１０項までのいずれかに記載の方法。

１２、誘導プロモーターがｌａｃプロモーターである、請求の範囲第１１項に記 載の方法。

１３、細菌がＲＺ２１．　Ｒ３６３１またはＲＬ７株である、請求の範囲第８項 に記載の方法。

１４、組み換えベクターがプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１である、請求の範囲 第１０項に記載の方法。

１５、生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物を培地中に分泌することができ るＥ、　ｃｏｌｉ細菌を作製し同定する方法であって、該方法は、（ａ）　該細 菌のＤＮＡに突然変異を引き起こすために十分量の変異誘起剤でＥ。

ｃｏｌｉ細菌を処理すること； （ｂ）ステップ（ａ）で産生された変異株から、バクテリオファージＴ７の感染 耐性と、培地中への十分量のベリプラズミックタンパク質の分泌能のために、ク ローンを選択すること； （Ｃ）　ステップ（ｂ）で選択されたひとつまたはそれ以上のクローンを、所望 のヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に連結された ベリプラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナルペ プチドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター（この組み換 えベクターは細菌内において両方のＤＮＡ配列の発現を制御することができる） によって形質転換すること：および（ｄ）　どのクローンが培地中に十分量のヘ テロなタンパク質を分泌しているかを決定するために、形質転換されたクローン を分析することを含むものである、上記方法。

１６、形質転換されたクローンの分析が、（ａ）　培養されたコロニーの一部が メンブレンの一方の側の上にトランスファーされるような条件下で、形質転換さ れ分散して培養された細菌と第一のニトロセルロースメンブレンを接触させるこ と：（ｂ）　ステップ（ａ）の第一のメンブレンのもう一方の面を、メンブレン の集合体を作製するために増殖培地と接触している第二のニトロセルロースメン ブレンと接触させること： （ｃ）トランスファーされた細菌によって分泌された生物学的に活性のあるタン パク質が第一のメンブレンから第二のメンブレンに移行するような条件下で、メ ンブレンの集合体をインキュベートすること：（ｄ）　メンブレンを分離し、ス テップ（Ｃ）の第二のメンブレンを、特異的な抗体−タンパク質複合体を形成す る条件下で、該タンパク質に特異的な第一の抗体と接触させること； （ｅ）　結合しなかった物質を除去するために、ステップ（ｄ）の第二のメンブ レンを洗浄すること； （ｆ）　洗浄したメンブレンを、第一の抗体−タンパク質複合体がメンブレン上 に存在するところにおいて、目に見える反応が起きる条件下で、目に見えるフォ ーカスを生じさせるために、第一の抗体に特異的であるラベルされた第二の抗体 と接触させること、および （ｇ）　目に見えるフォーカスを、培養している細菌のコロニーと並べて調整し 、それによって培地中に十分量のタンパク質を分泌することが可能な細菌を同定 すること を含む方法によって行われる、請求の範囲第１５項に記載の方法：１７、同定さ れた細菌コロニーが培養から単離されている、請求の範囲第１５項または第１６ 項に記載の方法。

１８、タンパク質が組み換えヒトインターロイキン−４である、請求の範囲第１ ５項から第１７項までのいずれかに記載の方法。

１９、変異誘起剤が紫外線照射である、請求の範囲第１５項から第１８項までの いずれかに記載の方法。

２０、メンブレン集合体が第二のメンブレンと増殖培地の間にさらに第三のニト ロセルロースメンブレンを含み、その上において、細菌のコロニーから分泌され たタンパク質が、ステップ（ｄ）から（ｆ）の過程を通じて検出される、請求の 範囲第１６項に記載の方法。

２１、第一の抗体が生物学的に活性のあるタンパク質特異的に結合するが、タン パク質の変性構造には結合しない、請求の範囲第１６項に記載の方法。

２２、　（ａ）　組み換えベクターの排除を引き起こす、培地中で形質転換され た細菌を培養すること、および （ｂ）　変異誘起剤にさらされていない同じ組み換えベクターで、細菌を再度形 質転換すること、 をさらに含む、請求の範囲第１５項から第２１項までのいずれかに記載の方法。

２３、プラスミドｐＧＲＴ８５７−１１゜２４、　ＲＺ２１．Ｒ３６３１＊タハ ＲＬ７Ｑアル、Ｅ　、ｃｏｌｉ　１ｍｍ。

明細書 大腸園分泌性株 本発明は組み換えベクターによって形質転換され、ヘテロな組み換えタンパク質 を培地中に分泌することのできる大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）変異株と、そのよう な株を産生じ、同定する方法に関する。本発明はまた、正しい立体構造をとり生 物学的に活性のあるヘテロな組み換えタンパク質を産生ずるための、そのような 形質転換体の使用方法に関する。

発明の背景 組み換えＤＮＡ技術の手法によって、比較的大量の生物学的に重要なポリペプチ ドおよびタンパク質の産生が可能になってきた。この仕事の多くの領域で、細菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（大腸菌）は組み換えベクターの発現用の 宿主生物として用いられてきたが、この細菌の利用は非常に限定されている。そ の物理的構造のため、組み換えポリペプチドまたはタンパク質の遺伝子を発現し ているＥ、ｃｏＬｉ細菌は一般に、物理的、化学的または酵素的手段によって、 組み換え産物が単離され得る前に破壊されてしまう。

Ｅ、　ｃｏｌｉおよびその他のグラム陰性細菌は、タンパク質が合成される細胞 質中心部および複雑な細胞膜構造比よって特徴づけられる。脂質がリンクされた 多数のオリゴ糖が結合している外膜が存在する。病原性グラム陰性細菌が動物に 感染すると、これらの表面オリゴ糖に特異的な抗体の産生は疾病の経過の決定１ ：重要となり得る。

外膜の内側は、主な細胞の浸透性のある障壁である細胞膜である。この膜は、あ る種の栄養とその他の化合物を、その他のものを排除する一方で、細胞の中へま たは外へ通過させるタンパク質を含んでいる。

外膜と細胞膜の間はべりプラズミック領域またはべりプラズム（周辺質）である 。この領域は外膜と接しており、高度に交差結合した壁様タンパク質複合体であ るペプチドグリカンと、細胞に剛性を与えるオリゴ糖を含んでいる。

Ｅ、　ｃｏｌｉによって合成されるタンパク質の多くは細胞質中に残っているが 、ペリプラズムで見いだされるものもある。細胞質中からペリプラズムに輸送さ れるタンパク質は“シグナルペプチド”を含んでおり、これは、タンパク質のア ミノ末端１こペプチド結合によって共有結合されており、細胞膜を通過する輸送 を促進する。Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるいくつかのペリプラズムのタンパク質の例 を挙げると、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼおよびある種の核酸分 解酵素、ペプチド分解酵素およびタンパク質分解酵素である。ペリプラズムのタ ンパク質のシグナルペプチドは、一般に輸送の過程でいくつかのポイントで切断 され、ペリプラズムに“成熟した”構造のタンパク質を残す。

Ｅ、　ｃｏｌｊを利用した組み換えタンパク質の産生の過程で、ヘテロな、また は外来の遺伝子の発現産生物は一般に細胞質ゾル中に集積する。このようなタン パク質はしばしば沈澱し不溶性の“封入体（１ｎｃｌｕｓｉｏｎ）”または“屈 折体”を形成する。このような形態となった組み換えタンパク質は、本来の構造 をとっておらず生物学的に活性はないｌ：Ｍｉｔｒａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９０　（１９８９））。

有用な形態にあるそのようなタンパク質を単離するためには、細菌は破壊されな ければならず、そして不溶性画分にあるタンパク質は、清浄剤または尿素やグア ニジン−ヒドロクロリドといったカオトロピック剤を用いて可溶化させなければ ならない。このようにして可溶化されたタンパク質はその本来の構造を保ってい ないため、それらはＢｕｉｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（欧州特許公開第１１４５０ ６号）によって記載されているような、比較的複雑な方法によって正しい構造に 再び戻さなくてはならない。

細胞質細胞封入体中に蓄積しないヘテロなタンパク質の産生に組み換えＤＮＡ法 を利用しようとする企てにおいて、ＶｉｌｌａＪｏｍａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：３７２７　（１９７８））はＥ、　ｃｏｌｉ のβ−ラクタマーゼ遺伝子中にラットのプレプロインスリン遺伝子を挿入した。

すでに言及したように、ｂ−ラクタマーゼはペリブラズミック酵素で、前駆体の 形状ではシグナルペプチドを持っている。β−ラクタマーゼ／プレプロインスリ ン融合遺伝子の発現によって生じる融合タンパク質は上述した輸送機構によって ペリプラズムＪこ輸送される。

同様に、Ｇ１１ｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、（欧州特許公開第００６６９４号）は 、ペリプラズムにあるタンパク質のシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ塩 基配列と融合された、所望の外来タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮ Ａ塩基配列の発現による、遺伝学的に作製された融合タンパク質の産生を開示し ている。

本来の輸送過程をわずかにさらに利用して、５ｉｌｈａｖｙ　ｅｔ　ａｌ、（米 国特許第４．３３６．３３６号）は細菌の外膜へ輸送される融合タンパク質の産 生法を記載している。

この方法は、細胞質にある細菌タンパク質をコードする遺伝子と、非細胞質担体 タンパク質の遺伝子との融合、およびそれによって外膜に輸送される融合タンパ ク質を産生ずることを含んでいる。５ｉｌｈａｖｙ　ｅｔ　ａｌ、はまた、この 方法は外来遺伝子（例えば真核生物のタンパク質をコードしている遺伝子）をす でに構築された融合遺伝子中に挿入するのに利用され得ると開示している。

しかしながら前述のｉ！！程では、所望の組み換えタンパク質は、細胞の外膜を 越えて輸送されてはいない。どの場合も、タンパク質を回収するためにやはり細 胞は破壊されなければならない。その結果、無数の細菌のタンパク質もまた放出 され、所望のタンパク質の単離をさらに困難で複雑なものにしている。そのうえ 細菌のタンパク質に融合された産物を産生ずる過程では、その産物は通常、所望 のタンパク質を産生ずるために切断されなければならない。この過程は複雑にな り。

変性条件の利用を伴い、完全な生物活性を持ったタンパク質の回収を困難にし得 る。

さらに最近では、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｗ、５２：２６６９　（１９８８）〕はＥ、　ｃｏｌｔ発現ベクター吊 で顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）をコードしている 遺伝子へのｏａｐＡシグナル配列をコードしているＤＮＡ配列の融合を報告して いる。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、発現した後、あるＧＭ−Ｃ３ Ｆが培地中に分泌されることが見いだされている。

培地中に様々なベリブラズミック酵素を漏出するＥ、　ｃｏｌｉ変異株が作製さ れている。例えばＬｏｐｅｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１０９ ＋５２０（１９７２））はニトロソグアニジンのような変異誘起物質でＥ、ｃｏ ｌｉ細胞を処理し、リボヌクレアーゼ１１エンドヌクレアーゼ■およびアルカリ ホスファターゼを分泌する“ベリプラズミック漏出性”変異株を産生じた。同様 にＡｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４０：３５ １　（１９７９）］　とＬａｚｚａｒｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、１４５：１３５１　（１９８１））は免疫沈降または５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動を用いて、ベリプラダミック漏出性変異株の解析におい て、分泌されたベリプラズミックタンパク質の検出を行っている。

このような変異株の漏出は、浸透性を増加させる細菌外膜の正常な構成要素の欠 落を反映していると信じられている。培地中に組み換えタンパク質を分泌するこ とを目的として作製された漏出性変異株はない。代わりに、細菌の表面膜の構造 と機能および、膜構造中にある様々な酵素の局在の解析することで、それらの構 築は行われてきたようにみえる。

さらに最近では、Ｚｉｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（米国特許第４．５９５．６５ ８号）は細菌中で合成されたタンパク質の外部への放出を促進する方法を開示し ている。この方法は、プラスミドまたは細菌の染色体へ、ｆｌバクテリオファー ジの遺伝子ＩＩＩの全てまたは一部を導入することを伴っている。遺伝子の発現 によって産生されたｆｌバクテリオファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質は細菌外膜 を乱し、細胞からのベリブラズミックタンパク質の漏出を引き起こす。

Ｚｉｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、はさらに、彼らの漏出性変異株は、所望のタンパク 質をコードしている遺伝子を、ベリブラズミック空間へ該タンパク質を輸送する ことのできるリーダーをコードしているＤＮＡ配列へ融合する方法によって、遺 伝学的に作製された融合タンパク質の産生に利用され得ることを開示している。

Ｚｉｎｄｅｒｅｔ　ａｌ、は、しかしながら、どのようにしてそのような融合を 行うかについての教示および、その方法が仮ｔどおりに実際に働くことを示す例 を提供していない。実際に示されていることの全ては、変異株において本来のβ −ラクタマーゼが周囲の培地中に細胞から漏出されているということである。

誤ったアミノ酸鎖の折り畳みとタンパク質の変性は、細胞質中で成熟した組み換 えタンパ１質と関連していて、細胞外に運び出されたタンパク質には普通生じな いため、Ｅ、　ｃｏｌｉ分泌性株を作製し利用するための信頼性のある方法が必 要である。

発明の概要 本発明は、生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物を培地中に分泌することの できるＥ、　ｃｏｌｉ細菌を提供し、以下のものを含んでおり：（ａ）　バクテ リオファージＴ７による感染に耐性があり、培地中に十分量のベリプラズミック タンパク質を分泌する能力をもつＥ、ｃｏｌｉ細菌、および（ｂ）　所望のヘテ ロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に連結されたベリブ ラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナルペプチド をコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター、 この細菌は両方のＤＮＡ配列を発現することができる。

本発明はさらに以下のものを含む、所望のタンパク質を産生ずるための方法を提 供する： （ａ）　培地中に、生物学的に活性のあるヘテロなタンパク質を分泌することの できる、以下のものを含むＥ、ｃｏｌｊ細菌の培養（１）バクテリオファージＴ ７による感染に耐性があり、培地中に十分量のベリプラズミックタンパク質を分 泌する能力をもつＥ、ｃｏｌｉ細菌、および（ｉｉ）　所望のヘテロなタンパク 質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に連結されたベリブラズミック空 間へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナルペプチドをコードして いる第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター、 ここで、上記培養は、該細菌が両方のＤＮＡ配列を発現し、培地中にヘテロなタ ンパク質を分泌するような条件下で行う：および（ｂ）　培地中からの分泌され ｈタンパク質の単離。

本発明はさらに、生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物を培地中に分泌する ことのできる、以下のものを含むＥ、　ｃｏｌｉ細菌を作製し同定するための方 法を提供する： （ａ）　Ｅ、ｃｏｌｉ細菌を、該細菌のＤＮＡに突然変異を引き起こすために十 分量の変異誘起剤で処理すること； （ｂ）　ステップ（ａ）で産生された変異株から、バクテリオファージＴ７の感 染耐性と、培地中への十分量のベリブラズミックタンパク質の分泌能ために、ク ローンを選択すること： （Ｃ）　ステップ（ｂ）で選択されたひとつまたはそれ以上のクローンを、所望 のヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に連結された ベリプラズミック！間へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナルペ プチドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター（この組み換 えベクターは細菌内において両方のＤＮＡ配列の発現を制御することができる） によって形質転換すること、および（ｄ）　形質転換されたどのクローンが培地 中に十分量のヘテロなタンパク質を分泌しているかを決定するために分析するこ と。

好適な態様では、形質転換されたクローンの分析は以下のことを含む方法によっ て行われる： （ａ）　培養されたコロニーの一部がメンブレン（膜）の一方の側の上にトラン スファーされるような条件下で、形質転換され分散して培養された細菌と第一の ニトロセルロースメンブレンを接触させること：（ｂ）　ステップ（ａ）の第一 のメンブレンのもう一方の面を、メンブレンの集合体を作製するために増殖培地 と接触している第二のニトロセルロースメンブレンと接触させること； （ｃ）トランスファーされた細菌によって分泌された生物学的に活性のあるタン パク質が第一のメンブレンから第二のメンブレンに移行するような条件下で、メ ンブレンの集合体をインキュベートすること：（ｄ）　メンブレンを分離し、ス テップ（Ｃ）の第二のメンブレンを、特異的な抗体−タンパク質複合体を形成す る条件下で、該タンパク質に特異的な第一の抗体と接触させること； （ｅ）　結合しなかった物質を除去するために、ステップ（ｄ）の第二のメンブ レンを洗浄すること： （ｆ）　洗浄したメンブレンを、第一の抗体−タンパク質複合体がメンブレン士 に存在する所において、目に見える反応が起きる条件下で、目に見えるフォーカ スを生じさせるために、第一の抗体に特異的であるラベルされた第二の抗体と接 触させること；そして （ｇ）　目に見えるフォーカスを、培養している細菌のコロニーと並べて調整し くａｌｉｇｎｉｎｇ）、それによって培地中に十分量のタンパク質を分泌するこ とが可能な細菌を同定すること。

好適には、第一の抗体が生物学的に活性のあるタンパク質に特異的に結合し、変 性した（すなわち誤って折り畳まれた）形態のタンパク質に結合しないことが望 ましい。

図面の簡単な説明 本発明は付随する図面を参照することで更に容易に理解されることができる。

ここにおいて： 図１は、分析的なニトロセルロースメンブレンの写真で、目に見えるフォーカス を示しており、そこでは分泌されたインターロイキン−４が存在していた。イン ターロイキン−４は、タンパク質に特異的な多価抗血清を用いたメンブレンの最 初の処理と、次に抗−インターロイキン−４抗血清に特異的なラベルされた抗血 清を用いた処理によって可視化された。矢印は、クローニングおよび更なる評価 のために選択された、分泌性コロニーを示す特に強いスポットを指している。

図２はプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１の構造を図式的に示している。

発明の説明 当業者によって通常利用される組み換えＤＮＡ技術の方法の多くはＣｏｈｅｎ　 ｅｔｌ、（米国特許第４．２３７．２２４号）　、Ｃｏ１１ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ 、　（米国特許第４．３０４．８６３号）およびＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ 、（Ｍｏｌｅｃｕｌｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　＾　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ、１９ｇ２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ）によって記述されている。これらおよびここで引用されるその他あ 全ての参考文献はこれによって参考文献にそのまま組み入れられる。

本発明は、Ｅ、　ｃａｌｆを、培地中に直接ヘテロなタンパク質を分泌するよう に修正し得るという驚くべき発見に基づいている。ここで用いたように、用語“ ヘテロなタンパク質”は、哺乳動物のタンパク質のように通常はＥ、ｃｏｌｉに よって作られないタンパク質を意味している。本発明により、通常行われる細胞 の破壊および／またヘテロなタンパク質を単離する過程における清浄剤またはカ オトロピック剤を用いた抽出の必要がな（なった。

この結果は二つの主要な進展によってもたらされた。まず第一に、組み換えＤＮ Ａ方法論が、ペリブラズミック空間への、またはそれを越えて、タンパク質の輸 送を媒介することのできるシグナルペプチドに融合された、所望のへテロなタン パク質を産生ずることに用いられてきた。第二に、細菌の膜が、タンパク質を透 過できるように、細菌のＤＮＡの突然変異によって、変化させられてきた。

分泌性の細菌と本発明の方法を用いて産生されたタンパク質は完全な生物学的活 性を持っており、正しく折り畳まれた構造をとっていると信じられている。従っ て、従来技術によってＥ、　ｃｏｌｉから生物学的に活性のある組み換えタンパ ク質を得るために一般に必要とされた操作は除去されている。

広範な種類のＥ、　ｃｏｌｉ株が本発明で用いることができ、Ｃ６００，Ｗ３１ １０．　ＡＢ１１５７．　Ｐ６７ｇ、　Ｃ５１１，ＨＢｌｏｌ、　ＭＭ２９４． 　ＪＭ８３およびＴＢＩを含むがこれらに限定されてはいない。以下に示す実施 例では、突然変異に先立ち、商業的に入手可能な１１Ｍ２９４株がストレプトマ イシン耐性株に転換された（２９４Ｓと称する）が、それは、本発明とは全く関 係しない理由による。しかし、ＭＭ２９４株またはその他の入手可能なＥ、　ｃ ｏｌｉ株の多くを、代わりに用いることができる。

細菌の変異誘起はいかなる標準的な公知技術によっても行うことができる。以下 に示す実施例では、変異誘起源として紫外線照射を用いているが化学的作用剤も 同様に使用可能である。例えば、Ｌｏｐｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ、また はＬａｚｚａｒｏｎｉ！！彬ユ、　、　５ｕｐｒａ、に記載されているように、 Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンも使用できる。

本発明における使用に適したＥ、　ｃｏｌｉ変異株は二つの重要な基準で特徴づ けられる〜バクテリオファージＴ７による感染耐性と、変異株が増殖している培 地中への十分量のベリプラズミックタンパク質の分泌能である。Ｔ７による感染 耐性の分析はＢｒａｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４ ：１４６２（１９８３））による記述に従って従来法で行うことが可能であり、 以下に述べられている。

ペリプラズミックタンパク質の透過性の増大の分析は、マーカーとしてのいかな る既知のベリブラズミックタンパク質と、選択されたタンパク質のための容易に 可視化できる適切な方法を用いて行うことが可能である。以下に示す実施例では 、ペリプラズムからのりボヌクレアーゼＩの分泌は、分泌された酵素が酵母ＲＮ Ａを含んでいる寒天中に“ハロ”または透明な区域を生み出すことができる能力 を観察することによって検出される。もし、アンピシリン耐性Ｅ、　ｃｏｌｉ株 が用いられる場合は、分泌されたβ−ラクタマーゼの分析は、Ｚｉｎｄｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ。

による記述などによって行うことが可能である。

多くのヘテロなタンパク質は本発明の方法によって産生され得る。ヒトインター ロイキン−４は、以下に本発明を説明するために用いられているが、原則として タンパク質をコードするＤＮＡ配列に従っていかなるタンパク質も作製すること が可能であり、得ることが可能である。そのようなりＮＡ配列は例えば、タンパ ク質を産生じていることが分かっている細胞から単離したｍＲＮＡから用いてｃ ＤＮ＾を作製する標準的なりローユング法を行うことによって、容易に作製する ことができる。そのようなｃＤＮ＾から構築されるライブラリーは標準的な方法 によって作製し、プローブを用いて検索することが可能である。

実際、ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆおよび可溶性ガンマインターフェロン受容体は本発明の 分泌性株を利用して産生されている。どちらも高いレベルの生物学的活性を示し ている。

必要とされる方法論は例えばＯｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、　［Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、ｇ：１６１（１９８２）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５ ４＋３（１９８７））　、Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｍｏ１．　 Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　８：２８３７　（１９８８））およびＧｕｂｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 　（Ｇｅｎｅ　２５：２６３　（１９８３））によって記述されている。ｃＤＮ ＾クローニング法のレビューとしてはＫｉｍｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ 。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、μｉ２：３０７（１９８７）を参照のこと。標準的な化学的合 成法による遺伝子の作製も、もしヌクレオチドの配列が既知であれば、行うこと が可能である。

Ｅ、　ｃｏｌｉの細胞質内で合成きれたタンパク質はべりブラズムへの輸送のた めにアミノ末端にシグナルペプチドを融合させなければならない。既知のＥ、　 ｃｏｌｉのベリプラズミック膜タンパク質または外膜タンパ１質のシグナルペプ チドの多くはこの目的に用いることが可能である。例えば、Ｔａｌｍａｄｇｅ　 ｅｔ　ａｌユ、、　［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ）酸はβ−ラクタマーゼのシグナル配列 を含んでいる。ｐＫＴ２８７のＰｓｔＩサイト（部位）にフレームを合わせて遺 伝子が挿入されると、発現の間にシグナルペプチドを含んだ融合タンパク質が産 性されるであろう。プラスミドｐＫ７２８７はＭａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、 ５ｕｐｒａによって４２８ページに示されている。

同様に、５ｉ１ｈａｖｙはＥ、ｃｏｌ、ｉのｏｍｐＦシグナルペプチド（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ。

ｐｐ、４２９−４３０）をコードする遺伝子を含む９ＭＨ６２１を称されるプラ スミドを調製し配列を挿入するとｏｍｐＦのシグナルペプチドを含む融合タンパ ク質が産生されるであろう。以下に述べる実施例では、別のｏｍｐシグナルペプ チドである。　ａｍｐ＾ペプチドが使用された。

ｏｍｐ＾およびｏｍｐＦはＥ、　ｃｏｌｉの外膜タンパク質のためのシグナルペ プチドである。

これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列はＰｏ１ｌｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　０ｕｔｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ａｓ　Ｍｏｄｅ ｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　１９８７．　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ　（ｅｄ）、　Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ@＆　５ｏｎｓ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１１７−１３９によって開示されている。Ｗａｔｓ ｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２５１４５（１９８４）］は ２７７以上の原核および真核細胞生物のシグナル配列の一次構造がいまや知られ ていることを開示している。このような原核生物のシグナル配列を持っているオ リゴヌクレオチドは、ホスフォトリエステルまたはその他の既知の方法（固相系 が望ましい）を用いて、本発明において使用するために化学的に合成され、適切 な発現ベクター中に挿入されることができる。

アミノ酸配列は異なっていても、細菌のシグナルペプチドは３つの共通領域を保 持しているようである。アミン末端にはひとつまたはそれ以上のリジンあるいは アルギニン残基を含む数個の親水性残基からなる領域がある。この塩基性領域に 続いて、中心部にはＬｅｕ、　ＡｌａおよびＶａｌが多い、約８から１５の疎水 性残基を含む疎水性の核がある。疎水性領域のカルボキシル側はべりプラズムま たは外膜において成熟したタンパク質を産生ずるための過程で切断される領域が 存在する。

切断は通常、疎水性領域から約４から８残基のところで起きる。

以下に示す実施例では、ａｍｐ＾シグナルペプチドの切断は、成熟したヒトイン ターロイキン−４の完全長のアミノ酸配列を含むタンパク質を産生ずるが、これ はＥ、　ｃｏｌｉにおける細胞質内での発現時にタンパク質にしばしば付加され る余分なアミノ末端のＭｅｔ残基を持たない。

Ｅ、　ｃｏｌｉシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と所望のヘテロなタン パク質は、Ｅ、　ｃｏｌｉ内で自律的に複製および発現が可能な多くの既知のベ クターにフレームを合わせて作用的に結合することが可能であり、このようなベ クターはｐＢＲ３２２゜［）ＢＲ３２５，ｐＵＣ８，ｐＨｃ９．　ｐＵｃ１８． １）ＵＣｌ３．１）ＡＨ３，ｐＫＧＴ２６９−２およびｐＲＧＴ８５７−１１　 を含■■ いるがこれらに限定されてはいない。二つのＤＮＡ配列は互いに連結することが 可能で、それからベクター内に挿入され、あるいは、単独のペプチドをコードす る配列を含むように最初に調製され得る。それから、いかなるヘテロなりＮＡ配 列も、所望の融合配列を作製するためにシグナルペプチドサイトに挿入され得る 。

好適には、挿入された、いかなる与えられたヘテロな遺伝子も正しいフレームで 読まれるように、シグナルペプチドをコードするベクターが３つ調製されること が望ましい。

シグナルペプチドをコードするヘテロな遺伝子の本来の核酸配列を利用すること も可能である。例えば、Ｔａｌｍａｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ　２ ９４：１７６（１９８１）］は通常ブロイ〉スリンと関係しているシグナル配列 はまた、Ｅ、ｃｏｌｉにおいてプロインスリンを分泌させるために機能している ことを報告している。

本発明で用いられる組み換えベクターはｔｒｐ、　ｌａｃまたはλｐＬプロモー ターといったよく知られた制御可能なプロモーター／オペレーター（ｐｏ）系の 制御下にあることが望ましい。多（のｐｏ系は温度感受性リプレッサーの制御下 にあることが知られている；培養温度を上昇させると抑制が解除され、発現を制 御することができる。その他のものは化学的な誘導剤〔例えばインドリル酢酸（ ｔｒｐ）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、　１ａｃ ））を用いて制御することが可能である。

本発明を説明するために以下に特異的な組み換えプラスミドが記述されているが 、それらは、単に、代わりに用いることのできる多くの組み換えプラスミドをの 代表するものであることを強調しておかなくてはならない。

組み換えベクターは、構築後、標準的な方法（例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　 ａｌ、　、　５ｕｐｒａ。

２５０ページ参照）によって細菌変異株に形質転換され、その形質転換体は適当 な培地中でクローン化することが可能である。

与えられた形質転換体クローンが生物学的に活性のあるタンパク質を分泌してい るかどうかの決定は、標準的な免疫化学的または生物学的分析法によって行うこ とができる。インターロイキン−２あるいはインターロイキン−４といったリン ホカインが分泌された培地の一部は、例えばＤｅｖｏｓ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：４３０７　（１９ｇ３）：ｌによっ て記述されたようにＴ細胞成長因子活性に関して分析され得る。そのような分析 の最終部分は放射性標識または発色によって測定することが可能である［Ｍｏｓ ｍａｎｎ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、６５：５５　（１９８３））　ｏ インターフェロン生物活性分析は例えばＤｅＣｈｉａｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（米 国特許第４．８１６．５６６号）などによって記述されているように行うことが 可能である。

分泌性クローンの更に迅速なスクリーニングは、免疫沈降または酵素結合した免 疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）によって行うことができる。所望のタンパク質に対 する抗体は、通常の方法によって調製することが可能である。モノクローナル抗 体が望ましいが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　［Ｎａｔｕｒｅ　２５ ６：４９５（１９７５）；　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、６：５１１　（１９７６））の方法によって簡便に調製することができる。

モノクローナル抗体の作製時にはミエローマ細胞と融合するための抗体産生体細 胞を得るために、所望のタンパク質はマウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウ サギなどの動物を免疫するのに用いられる。

抗体を産生能力のある体細胞、とりわけＢ細胞は、ミエローマ細胞系統と融合す るのにふされしい。これらの体細胞は免疫された動物のリンパ節、膵臓細胞、末 梢血液から派生する。本発明の典型的な態様ではラット膵臓細胞が使用されてい るが、その理由の一部として、これらの細胞がマウスミエローマ細胞系との安定 した融合を比較的高い割合で起こすことが挙げられる。しかしながら代わりに、 マウス、ラビット、カエルまたはその他の細胞を使用することも可能であろう。

特殊化したミエローマ細胞系はハイブリドーマ産生融合法で使用するためにリン パ腫から開発された（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　１ｌｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．６：５１１　（１９７６）；　Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９（１９７８）；　Ｙｏｌｋ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　S２：２２０　（１ ９８２））。これらの細胞系少なくとも３つの理由から開発された。最初に、融 合していないハイブリドーマと、同様に無期限に自己増殖するミエローマ細胞か らの、融合したハイブリドーマの選択の促進が挙げられる。通常、ミニローマは 酵素に欠陥があり、ハイブリドーマの増殖を支えるある種の選択培地中で生育で きないことを利用して、選択を行う。第二の理由はそれ自身の抗体を産生ずる、 リンパ腫細胞に固有の縫方の起因している。モノクローナル技術を用いる目的は 無限に増殖する融合ハイブリッド細胞系を得て、ハイブリドーマの体細胞構成部 分の遺伝的制御のもとて所望の単独の抗体を産生ずることにある。ハイブリドー マによる腫瘍細胞の抗体産生を除去するために、イムノグロブリンの軽鎖または 重鎮を産生できない、あるいは抗体産生機構に欠陥があるミエローマ細胞系を利 用する。

これらの細胞系を選択する３つめの理由は融合に適切で、頻度が高いことが挙げ られる。

多くのミエローマ細胞系は融合細胞ハイブリッドの産生に用いることができ、例 えば、Ｐ３Ｘ６３−＾ｇ８．　Ｐ３／Ｎ５Ｉ−＾ｇ４−１．５ｐ２１０−Ａｇ１ ４および５１９４１５．　ＸＸＯ，Ｂｕ、　１．を含んでいる。Ｐ３Ｘ６３−Ａ ｇ８およびＰ３／Ｎ５１−Ａｇ４−１細胞系はＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓ ｔｅｉｎ　ＣＥｕｒ、　Ｊ、　ＩｎＤＩＬｌｌｌｏｌ、　６＋５１１　（１９７ ６））によって記述されている。Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎａｔｕｒｅ 　２７６：２６９　（１９７８））はＳｐ２１０−Ａｇ１４ミエローマ細胞系を 開発した。５１９４１５．　ＸＸ０Ｂｕ、　１細抱系はＴｒｏｖｂｒｉｄｇｅに よって報告されているＣ１．　Ｅｘｐ、　１ｌｅｄ、　１４８：３１３　（１９ ７９））　。本発明の実施例では、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞系（ＡＴＣ ＣＣＲＬ　１５８０）が用いられている。

抗体を産生ずる膵臓またはリンパ節細胞とミエローマ細胞のハイブリッドの作製 法は通常、細胞膜の融合を促進するひとつまたはそれ以上の作用剤（化学的、ウ ィルス性あるいは電気的な）の存在下で、１０：１の割合で体細胞とミエローマ 細胞をそれぞれ混合する（割合は約２０：１から約１＝１まで変化してもよい） 。融合法はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、５ｕｐｒａ、Ｇｅｆｔｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　３：２３P　（１ ９７７））および　Ｙｏｌｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ１，Ｖｉｒｏｌ、　４２：２２ ０　（１９８２））によって記述されている。これらの研究者に用いられた融合 促進剤は、センダイウィルスおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

本発明の融合法の実施例はＰＥＧを用いている。

融合法では非常に低頻度（例えば膵臓が体細胞として用いられた場合、大まかに 見積もって１ｘ１０５個の膵臓細胞に対してたったひとつのハイブリッドが得ら れる）で生育可能なハイブリッドが産生されるため、融合したハイブリッド細胞 を残りの融合していない細胞、とりわけ融合していないミエローマ細胞から選択 する手段を有することが重要である。所望の抗体産生ハイブリドーマをその他に 生じた融合ハイブリッド細胞から検出する方法もまた必要である。

一般的には、融合ハイブリッド細胞の選択は、ハイブリドーマの生育を助けるが 通常無限に分裂を続ける融合していないミエローマ細胞の成長を妨げる培地中で 、細胞を培養することによって行う。融合に用いた体細胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで の培養では長時間生育することはなく、従って問題を提起しない。本発明の実施 例では、ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠いている（Ｈ ＰＲＴ陰性）ミエローマ細胞を用いている。これらの細胞に対する選択はヒポキ サンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地で行うがこの培地は膵臓細 胞のＨＰＲＴ陽性という遺伝子型によって融合ハイブリッド細胞は生存する。異 なった遺伝的欠損（薬剤感受性など）を持つミエローマ細胞も、遺伝型で競合し ているハイブリッドの生育を助ける培地中で選択が可能であれば、使用すること が可能である。

融合ハイブリッド細胞を選択的に培養するには数週間を要する。この期間の初期 には、どのハイブリッドをクローン化し増殖させるか決定するために、所望の抗 体を産生ずるハイブリッドを同定する必要がある。一般には得られたハイブリッ ドの１０％前後は所望の抗体を産生ずるが、約１％から約３０％までの領域とな る場合もないわけではない。抗体を産生ずるハイブリッドの検出は、いくつかの 標準的な分析方法〔文献（例えばＫｅｎｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　（ｅｄｉｔｏｒ ｓ）、　１ｌｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｂｙｂｒｉ ｄｏｍａｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ａｎａｌｙｓｅｓ、　ｐｐ、@３７６−３８４゜ Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ　（１９８０）参照〕に記述 されている酵素結合免疫分析および放射性免疫分析〕のうちのどれを用いても行 うことができる。

ひとたび所望の融合ハイブリッド細胞が選択され各抗体産生細胞系クローン化さ れると、各細胞系は標準的な二つの方法のうちのどちらかによって増殖させられ ることになる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は組織適合性動物に注入され得る。

注入された動物は、それから、融合ハイブリッド細胞から産生される特異的なモ ノクローナル抗体を分泌する腫瘍を増大させる。血清または腹水といった動物の 体液は、高濃度でモノクローナル抗体を供給するために抜き取られる。代わりに 、各細胞系は実験室培養容器内でｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖させることもできる。

単独の特異的モノクローナル抗体を高頻度で含む培地は容器を傾けるか、ろ過す るか、遠心によって集めることが可能である。

モノクローナル抗体は正しく折り畳まれ、生物学的に活性のある、望みのタンパ ク質に特異的に結合し、変性したタンパク質に結合しないことが望ましい。この ような抗体は、タンパク質に対する抗体を分泌する大量のハイブリドーマクロー ンを産生じ、ハイブリドーマが望む抗体を産生しているかどうかを見いだすため に、活性のあるタンパク質と変性したタンパク質の両方に対して、ハイブリドー マの培地をスクリーニングすることによって得ることが可能である。タンパク質 の非活性型はタンパク質試料をタンパク質を変性させるためにドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）で処理することによって容易に調製することが可能である。

活性のあるタンパク質のみを認識する抗体の利用によって、さらに時間を浪費す る生物学的分析の必要がなくなる。このような特異性を持たない抗体は、しかし ながら、迅速なスクリーニングには用いることが可能である。このようなスクリ ーニングで陽性となったクローンは、それから生物学的活性について分析される ことが可能である。

好適な態様では、分泌性クローンのスクリーニングはニトロセルロースメンブレ ンの集合体を用いて行われる。第一のニトロセルロースメンブレンは分散して培 養している形質転換体の表面と接するように持ってくる。このメンブレンは、接 したためにその面に培養しているコロニーの一部が移ることになるが、それから 増殖培地と接している第二のニトロセルロースメンブレンの上に直接おかれ、メ ンブレン集合体が形成される。この集合体はそれから、形質転換された細菌の変 異株が分泌するヘテロなタンパク質が、第一のメンブレンを通じて二つ目のメン ブレンに到達するような条件下で、インキュベートされる。これらのメンブレン はインキュベーションの後に分離され、第二のメンブレン上のタンパク質はタン パク質と結合し、抗体−タンパク質複合体を形成する特異的な抗体を用いて検出 される。

結合していない物質を除去するために第二のメンブレンを洗浄した後に、タンパ ク質−抗体複合体は、メンブレン上の第一の抗体を認識するラベルされた２つめ の抗体を用いて検出される。例えば、タンパク質に特異的な抗体がネズミのモノ クローナル抗体である場合には、ラベルされた抗−マウス−イムノグロブリン抗 体が用いられる。これら第二の抗体は、ローダミンの様に特有の波長に対して蛍 光を発する化合物あるいは、望ましくは、目に見える化学的反応を触媒する酵素 で標識されることが可能である。様々なペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ ーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリフォスファターゼはこの目的に使用 することの可能な酵素である。標識された第二の抗体の使用を通じて、メンブレ ン上で分泌されたタンパク質が存在しているところでは、目に見えるフォーカス が現れるであろう。

このようなフォーカスを含む代表的なメンブレンを図１に示しているが、ここで は、矢印が、さらなるなる評価のために選択されたコロニーであることを示す強 いスポットを指している。

第二のメンブレンに結合したタンパク質の位置を目でみることができるようにな った後は、培養しているコロニーと第二のメンブレンを並べて比較し、タンパク 質を分泌している形質転換されたコロニーに目で見えるフォーカスを重ね合わせ る。このようにして分泌しているコロニーは同定され、培養から移動され、適当 な増殖培地または、発酵培養液中でサブカルチャーされる。

いくつかの例では、メンブレン集合体において第三のニトロセルロースメンブレ ンを用いることが望ましいことがある。このメンブレンは第二のメンブレンと増 殖培地の間に置かれ、上述したインキュベーションの間、形質転換されたコロニ ーから分泌されたタンパク質は第二および第三のメンブレンの両方に到達する。

メンブレンの分離に続いて、上述したように第三のメンブレン上に生じたタンパ ク質のフォーカスの免疫化学的検出によって、第二のメンブレン上で観察された どんな陰性反応も誤った陰性反応ではないことを確かめる。第二のメンブレンの 解析に用いられた第一の抗体は生物学的に活性のある、正しく折り畳まれた構造 のタンパク質のみに特異的であることのみが望ましいが、第三のメンブレンに対 して用いられた第一の抗体はどんな形態の、変性または非変性のタンパク質に対 して結合していてもよい。

変異誘起剤にさらすことで細菌ＤＮＡにおけるのと同様に、発現プラスミド中に も変異による変化が起き得るため、最初にプラスミドを選択されたクローンから 除き、変異誘起剤にさらされたことのない別の細胞に置き直すことによって、選 択されたクローンを“治療”する必要がある。この治療は標準的な方法によって 容易に行うことが可能である。

例えば、１ｌａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｔ、（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８ １６７９　（１９６１））によって記述されているように、アクリジンオレンジ の存在下で細胞を培養することによってプラスミドを除くことが可能である。そ の他の方法としては、形質転換体を単離するために用いた選択マーカーが存在し ない条件で単に細胞を培養する方法がある。

以下に述べる実施例では形質転換された細胞は、プラスミドが抗生物質を分解す る酵素の発現を制御しているということだけのために、アンピシリン存在下で生 育することが可能である。培地中にアンピシリンが存在すると、その他の感受性 宿主細胞に対して、プラスミドを保持するように選択圧がかけられる：アンピシ リン非存在下ではプラスミドは細胞の生存に不必要であり、したがって自然に失 われる。

本発明を説明するために以下にほんの数種のＥ、　ｃｏｌｉ分泌性クローンにつ いてのみ詳細に記述しているが、規定どおりに用いられる方法では有益な分泌変 異株が十分量産生される。変異誘起剤にさらされた約１０１１の細胞のうちで、 Ｔ７による感染に耐性であるコロニーが約３００−５００産生される。これらの 抵抗性コロニーのうちで３分の１から半分もまた、培地中に十分量のベリブラズ ミックタンパク質を分泌する。

本発明における分泌性株は、長期の培養に安定であること、および一般的な細胞 性分解によって望むヘテロなタンパク質を漏出しているわけではないことを確か めるために、更に評価することが好ましい。

選択した株が安定であることを確かめるために、何世代かにわたってサブカルチ ャーし、自然発生した溶解の様な変質の証拠がないか観察することが望ましい。

所望のヘテロなタンパク質が単に細胞が変質したために培地中に現れていないこ との証拠は、代表的なＥ、　ｃｏｌｉ細胞質細胞質タンパ培質中に存在するかを 分析することによって得ることが好ましい。もし細胞が構造的に損なわれていな ければ十分量のこのようなタンパク質はもちろん培地中に存在しない。このよう な分析はグルコース−６−ホスフニイトデヒドロゲナーゼの様な筒便な分析を行 うことのできるいかなる細胞質タンパク質に関しても行うことが可能である。

多くの場合、更に効果的に分泌する株は、上述の方法によって得られた株をサブ クローニングして培養し、細胞を更に１回あるいはそれ以上変異誘起剤処理し、 クローニングし選択することによって産生され得る。

同定されたＥ、ｃｏｌｉ分泌性株は、シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ 配列と所望のヘテロなタンパク質をコードする配列の両方が発現している条件下 で培養される。細菌細胞はそれから培地から分離され、標準的な技術によってタ ンパク質が単離される。タンパク質の単離に利用することのできる方法は例えば 、酸または塩による沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、金属キレートクロマ トグラフィー、ゲルろ過、高分解能液体クロマトグラフィー、作製済ディスクゲ ル、またはカーテン電気泳動、等電点フォーカシング、低温有機溶媒フラクショ ネイション、向流分配、および免疫親和性クロマトグラフィーを含んでいる。

分泌性株と本発明の方法を用いて得られた、ヘテロなタンパク質分泌の量と質の 両方はこれまでの方法で得られた結果よりも優れたものになり得る。例えば、Ｌ ｕｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、［Ｊ、　Ｉｎｄ、　１ｌｉｃｒｏｂｉｌｏ、、　ｉ ｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｓ）はｏｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列 を組み換えベクター中でヒトインターロイキン−４遺伝子と融合させている。変 異誘起していないＥ、　ｃｏｌｉ２９４株において、　ＩＰＴＧを用いてＤＮＡ の発現を誘導すると、Ｌｕｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌユ、は約３０−５０％の処理 されたインターロイキン−４が培地中に分泌されることを見いだしている。

対照的に、処理されたインターロイキン−４の実質的に全てのものが本発明の変 異株によって培地中に分泌される。更に、Ｌｕｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌユ、の培 地から回収した分泌されたインターロイキン−４を続いて解析すると、その生理 化学的および、生物学的な性質は本発明の方法で作製されたリンホカインの性質 と異なっていることが明らかになった。

まず第１にＥ、　ｃｏｌｉ　２９４株から回収されたインターロイキン−４活性 の量は、本発明の分泌性株のひとつのほぼ同じ数の細胞から得られた量よりもず っと少ない。第二に、Ｌｕｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、の系によって産生されたイ ンターロイキン−４は、高度に活性を持つインターロイキン−４に特異的なモノ クローナル抗体（以下の抗体の使用１１Ｂ４参照）によって認識されない。第三 にＬｕｎｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、の系の培地から回収されたインターロイキン− ４は本発明のＥ、　ｃｏｌｉ変異株によって分泌されたインターロイキン−４を 保持するクロマトグラフィーカラムに結合しない。

非変異細菌によって分泌されたインターロイキン−４の活性が低いことおよび物 理的性質が異なることは、タンパク質が異なっており、活性の低い構造であり得 ることを示唆している。

！應豊 以下の実施例において、固体の固体混合物に、液体の液体に、及び固体の液体に 対する百分率は、特に示さない限り、それぞれ、ｖｔ／ｗｔＳｖｏ１／ｖｏｌ、 及びｌｌｔ／ｖｏｌに則っている。細胞培養中は、滅菌状態に維持している。０ ．Ｄ、波長は全てナノメーターで示す。

ヒトインターロイキン−４に対する抗体の調製オスのＬｅｗｉｓラットを、完全 フロインドアジュバント（ＣＦ＾）１ｆｆ１１で乳化したヒトインターロイキン −４溶液１ｍｌを用いて腹腔内（ｉ、　ｐ、　）免疫した。この溶液は、ＣＯ３ 細胞で発現され、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、Ｑ、５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７， ４中１４μｇ／ｍｌ濃度で１０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇの比活性を有するグリコジル 化された組換えヒトインターロイキン−４を含んでいた。

最初の免疫から２週間後、ＣＦＡ１ａ＋１で乳化したヒトインターロイキン−４ 溶液１ｍｌを再びラットにｉ、　Ｉ）、注射した。二回目の注射から三ケ月後、 タンパク１５μｇを含むヒトインターロイキン−４溶液１ｍｌを静脈内注射する ことによりラットに追加免疫を施した。追加免疫注射より４日後、ラットを殺し 、血液を回収し、膵臓を融合用に採取した。

牌細胞をマウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　 １５８０）と、ＰＥＧを使用して１：１の比率で融合させた。ＨＡＴ培地に懸濁 した細胞液（３，５ｘｌＯ５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６−ウェルプレート４０枚 に分注した。１０日後、ハイブリドーマ上清を、マイクロタイタープレートに直 接固定したヒトインターロイキン−４に対する（間接ＥＬＩＳＡ）　、あるいは 固定されているウサギポリクローナル抗ヒトインターロイキン−４１ｇＧ画分に 結合しているヒトインターロイキン−４に対するその結合能についてテストした 。結合した抗体を、標準的な方法に従い、ペルオキシダーゼ結合抗ラット免疫グ ロブリンによって検出した。インターロイキン−４と反応する抗体を分泌するハ イブリドーマを、限界希釈によってクローン化した。ＩＣ１，１１Ｂ４．６は、 これらの手順により選択されたこのようなハイブリドーマの一つである。ＩＣ１ ，１１Ｂ４．６より得た抗体（抗体１１Ｂ４と名付けられた）は、ＩｇＧ、、ア イソタイプであると決定され、生物学的に活性なヒトインターロイキン−４に対 して特異的であることがわかった。

この特異性は、１１Ｂ４モノクローナル抗体を免疫用インターロイキン−４、及 びＬａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）の記載に従って 変性ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動したインターロイキン−４と反応さ せることにより確認した。この抗体は、前者のインターロイキン−４のみを認識 し、リンホカインを０．０４％ＳＯ３という低濃度で、室温で５分間前処理する だけで、十分抗体による認識が不可能となった。

ハイブリドーマは１０％ＤＭＳＯ（ノメチルスルフォキンド）を含む培養培地中 に一７０℃で保存し、標準的な哺乳類細胞培養技術（ＲＰＭＩ　１６４０．１ｍ Ｍグルタミン及び５ＱｍＭ２−メルカプトエタノールを添加した、１０％胎生牛 血清を含む培地）を利用して培養した。

ＳＤＳ変性した組換えヒトインターロイキン−４に対する多価抗血清は、標準的 な技術を利用して、リンホカインサンプルを前述したようにＳＤＳポリアクリル アミド電気泳動して、ゲルからバンドを切り出し、そのように回収したタンパク 質でウサギを免疫することによって作製した。インターロイキン−４は、Ｋｉｍ ｍｅｎａｄｅｅｔ　ａｌ、　［Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７３：１０ ９（１９８８）］の記載に従って大腸菌発現システムにおいて生産されていた。

プラスミドｐｌ？ＧＴ８５７−１１の構築ヒトインターロイキン−４発現プラス ミドｐＡＢ３及びｐＫＧＴ２６９−２、及びｐＵｃ１９の桐生スケールのプラス ミドＤＮＡ単離を行った。この方法により、分析を目的として細菌培養液から少 量のＤＮＡを単離することが可能である。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　 ５ｕｐｒａ、９０ページの記載に従い、大量のプラスミド囲Ａを調製した。プラ スミドＤＮＡを制限酵素で切断して生じた特定の制限酵素断片を、０．８％アガ ロース中で準備しておいた電気泳動を行うことにより単離した。ゲルに、トリス −ホウ酸緩衝液中で４時間１５０ボルトで流しくＭａｎｉａｔｉｓ蛙り１．、靭 以＝ａ、　１５６ページ）、それからケルをエチジウムプロミドで染色しＤＮＡ を視覚化した。適当なゲル部分を切断し、１５０ポルトで６０分間エレクトロエ ル−ジョンを行った。その後、ＤＮＡをエタノール２倍容量を用いて沈澱させて 濃縮した。

制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー　フラグメント（ｋｌｅｎａｖ　 ｆｒａｇｍｅｎｔ））及びＴ４ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ（７）製品であり、これらの酵素の使用 方法及び条件は、製造業者が示しているものと根本的に同じであった。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーションは、４℃で最低２４時間行った。一本 鎖ＤＮＡ末端のクレノーフラグメントによる平滑末端化は、ｌｏｍｌＪ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ、　ｐＦ１７゜５、２．５ｍＭ　ｄＧ７Ｐ、ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰと ｄＴＴＰ、及び１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で行った。

ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、根本的にはＬａｅｍｍｌｉ、　５ｕ ｐｒａ、の記載に従って行った。１５％のＳｅｐｒａｇｅｌ　（登録商標；　Ｉ ｎｔｅｇｒａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｈｙｄｅ　Ｐ ａｒｋ、　ＭＡ）を使用し、溶菌液に含まれる全タンパク質を、クーマシーブリ リアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染 色して視覚化シタ。インターロイキン−４は、Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ｍｏｄｅ１丁Ｅ５０丁ｒａｎｓｐｈｏｒ　（登録商標）電気泳動ユニット を使用して、電気泳動じて分離したタンパク質をニトロセルロースシートにトラ ンスファーした後、後述するように特異的抗体を用いて免疫化学的に視覚化した 。

この実施例で用いられているｐＲＧＴ８５７−１１を構築するために、ｐＡＨ３ をＡｖａｌで切断した。この酵素により生じた５゛突出分を大腸菌ポリメラーゼ Ｉのクレノーフラグメントを用いて埋め、そのＤＮＡをＰｖｕＩで切断した。イ ンターロイキン−４と鴇９１領域を含む５．８ｋｂ断片を、ｐｌＪｃの複製オリ ジンを含む、ｐｌＪｃ１９の１．４ｋｂ椰ＩＩず恕ｒ断片にライゲーションした 。次に大腸菌２９４を形質転換して、ｐＲＧＴ８３９−２と名付けた、ｐＵＣ複 製オリジンを持つアンピシリン耐性インターロイキン−４発現プラスミドを単離 した（第２図）。

プラスミドｐＲＧＴ８５７−１１及びｐＫＧＴ２６９−２をその後〜哄ＩＩ及び ハラＩＩで切断した。１１４とＬａｃｊ領域を含む、ｐＲＧＴ８３９−２の６． ７ｋｂ断片を、ｐＫＧ７２６９−２由来の、クロラムフェニコール耐性をコード するｌｋｂ断片にライゲーションした。大腸菌２９４を形質転換には、ライゲー ション混合液を直接使用した。プラスミドｐＲＧＴ８５７−１１を含む形質転換 体を単離した。

大腸菌の分泌性株の調製と選択 ＴＹＥブロースＥ２０ｇ／ｌバクトドリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／］バク ト酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌＮａＣ１］を細菌株の規定の培 養、プレート実験、ある種の発酵に使用した。発酵の大部分は改変したＧＣ培地 ［２０ｇ／　１グリセロール、３０ｇ／ｌカサミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４，Ｉｇ／＋ＭｇＳ○４・７Ｈ２０］中でパンフルの付いた振蒼フラ スコを用いて３０℃で行われた。必要な場合は、アンビンリンやクロラムフェニ コール（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯより 入手）をそれぞれ１００μｇ／ｍ１．１０μｇ／ｍＩで加えた。

貯蔵株は４０％グルセロール中で一２０℃で保存した。接種培養は１０ｍ１のＴ ＹＥブロースを含む試験管にグリセロールストックを加えることにより調製した 。３０℃で一晩培養した後、細胞を５００ｍ１のバッフルの付いたエルレンマイ ヤ−（Ｅｒ　ｌｅｎｍｅｙｅｒ）振蓋フラスコ（Ｂｅｌ　ｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａ ｎｄ、ＮＪ）中のＴＹＥ培地１００ｍ１に、Ａａ６ｏ＝０．　２となるように接 種した。

そのフラスコを二ニー・ブルンスウィック・コンドロールド・エンバイロンメン ト・インキュベーター−シェーカー（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｙｉｃｋ　Ｃｏｎｔｒ ｏｌｌｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏ＋ｎ＋＋ｅｎｔ　Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ　５ｈａｋｅｒ ）を使用して２５０ｒｐｍの振蓋速度で３０℃で培養した。Ａｇ３゜＝１．０に なったところで、ＩＰＴＧを０．２５ｍＭになるように加え、発酵を４または１ ８時間続けた。

マニアティス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、前述、２５０頁に記載されて いるようにして、様々な大腸菌株の形質転換が行われた。

大腸菌ＰＡＭ１６３［ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎ、Ｒｅｓ、３０： 　２７３　（１９７７）］上で増殖させておいたバクテリオファージＰ１　ｃｍ ｌ。

ｃｌｒｌｏｏ［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ。

１ｅＣｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９７２．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙコをＭＭ２９４株に形質導入することによって 大腸菌のストレプトマイシン耐性型が作成され、２９４Ｓと名付けられた。大腸 菌株ＭＭ２９４は受託番号ＡＴＣＣ３３６２５でアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションから入手することができる。

大腸菌２９４Ｓを滅菌水中で殺菌用の紫外線ランプを使用して１０インチの距離 から４０秒間照射した。トリプトン　酵母エキストラクト、塩化ナトリウム（２ ０：１０：５）を含む栄養豊富なＴＹＥブロース上にプレートして決定したとこ ろ、この処理により、９９．９％の細胞が死んだ。この突然変異を起こした細胞 の懸濁液を栄養豊富なＴＹＥブロースを使って１・５に希釈して最終体積を約５ ０ｍ１にし、２５０ｍ１フラスコ中で振蒼しながら暗所で３７℃で３時間インキ ュベートした。

外膜に変化が生じた突然変異体を選択するため、インキュベーション後、野生型 バクテリオファージＴ７を１０８プラーク形成単位／ｍｌの濃度で加えた。この フラスコを溶菌が観察されるまで３７℃で振蓋しく約３０分）、その後４℃で１ ０分間、１０．０００ｘｇで遠心することによってＴ７耐性細胞を回収した。

そのベレットを新鮮なブロース１ｍｌに再懸濁した。

その細胞をＴＹＥ［トリプトン６酵母エキストラクト、塩化ナトリウム（２０， １０・５）］寒天プレート上にまき、３７℃でインキュベートした。２４時間後 、各プレートは約３０−５０コロニーを含んでいた。これらのコロニーヲ外膜の 損傷について更に調べた。使用した一つの方法は、培地中へのりボヌクレアーゼ 　の漏出の増加を観察することであった。

Ｔ７バクテリオフアージ耐性の単一コロニーを、１％酵母ＲＮＡ　（Ｓ　ｉ　ｇ ｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）を含むｐＨ７のＴＹＥ寒天寒天４奢ｌ層した、新鮮なＴ ＹＥ寒天プレー１−にひいた。３７℃で一部インキユベートした後、そのプレー トをｌＮＨＣｌで満たした。ハロの大きさを利用して、培地中にリボヌクレアー ゼ活性を漏出した株を決定した［ウェイガント（Ｗｅｉｇａｎｄ）ら、Ｊ、Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、よλ５　：　３４０　（１９７６）］。

大腸菌の外膜の損傷を知る別の指標は、マツコンキー寒天［ハンコック（Ｈａｎ ｃｏｃｋ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３８＋２３７　（１９８４ ）］上で増殖できないことである。マツコンキーに特別な感受性を示し、相当量 の周辺細胞質のりボヌクレアーゼ　を放出しつる、約３０のＴ７耐性コロニーの 内２つが単離され、ＲＬ７．ＲＺ２１と名付けられた。

大腸菌ＲＬ７．ＲＺ２１をプラスミドｐＡＨ３（図２）で形質転換し、ＲＺ２１ ／ｐＡＨ３，ＲＬ７／ｐＡＨ３株を作成した。プラスミドｐＡＨ３はシグナルペ プチドを生産し、インターロイキン４の輸送を指示して内膜を横切らせ周辺細胞 質へと向かわせる。両方の形質転換体を改変したＧＣ培地中で発酵させた。両方 の形質転換体において使用した培地を、ヒトのインターロイキン４に対するウサ ギポリクローナル抗血清を使用したウェスタンプロット分析によって、漏出性に 対してスクリーニングした。

より多（の量のインターロイキン４を分泌する株を作成するため、ＲＺ２１／ｐ ＡＨ３を前記のようにして紫外線照射により突然変異を起こさせた。暗所で最低 ２時間増殖させた後、照射した細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の入っ たＴＹＥ寒天プレート上にまき、３０℃で一部インキユベートした。そのコロニ ーを、分泌性コロニーのもとでより強く発色することにより示されるような、イ ンターロイキン４の放出増加に対する（ポリクローナル抗血清を使用した）二重 膜免疫検定法によってスクリーニングした。

突然変異を起こさせた細胞を希釈し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴ ＹＥ寒天プレート（直径１４２ｍｍ）上に巻いた（０．１ｍｌ／プレー１−）。

３０℃で一部インキユベートした後、プレートには直径１ｍｍのコロニーが約５ ００−２０００個含まれていた。次にそのプレートに０．４５μの孔径の１３７ ｍｍ＝３７ｍｍニトロセルロースｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｅｌｌ）を被せた 。

円盤は、徐々にかつ一様に濡れるよう、一端より静かに被せた。その円盤を、コ ロニーの一部が寒天プレートからニトロセルロース円盤上に移るように、即座に 一気に剥がした。その円盤を、予め滅菌した寒天プレートの表面に置いておいた 別のニトロセルロース円盤の上に置いた。これを３０℃で一部インキユベートし た。

培養後、底の円盤をコロニーをつけた円盤から離した。その２つのフィルターを 、１０ｍＭ　トリス、ｐＨ８，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，領　０５％（ｖ　／　ｖ 　）ツウイン−２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸；Ｂｉｏ− Ｒａｄ、酵素免疫検定純度）（ＴＢＳＴ）に１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン ）を加えたものの中で、室温で６０分、インキュベートした。次に、このフィル ターを、ウサギポリクローナル抗血清（ＴＢＳＴ／ＢＳＡで１　：１５００に希 釈、全インターロイキン４の決定に使用）、モノクローナル抗体（１１Ｂ４抗体 ）（ＴＢＳＴ／ＢＳＡでハイブリドーマの培養液の上清を１１０に希釈：本来の 構造をとっているインターロイキン４の決定に使用）のいずれかの−次抗体とと もに室温で３０分、インキュベートした。

フィルターをＴＢＳＴで３回洗い、使用した一次抗体に特異的なアルカリフォス ファターゼを架橋した二次抗体とともに３０分、インキュベートした。フィルタ ーをＴＢＳＴで３回洗い、アルカリホスファターゼの基質（ＰｒｏｍｅｇａＢｉ ｏｔｅｃのＰｒｏｔｏＢｌｏｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）で染色した。現れた目ニミえる フォーカスを元のプレートにアラインさせ、ヒトインターロイキン４特異的な染 色が増加したコロニーを選択した。

選択したコロニーを非選択培地（アンピシリンを含まない）に連続的に移すこと によりプラスミドを落とし、次いで非選択ＴＹＥプレート上にひいた。アンピシ リンプレート上での増殖に対しネガティブとされたコロニーを、プラスミドを持 っていないことを確認した上で再びｐＡＨ３で形質転換した。

ｐＡＨ３をもったＲＺ２１由来のクローンを１００μｇ／ｍｌのアンビンリンの 入ったＴＹＥで培養した。これらのクローンを、１０ｍ１試験管での発酵から得 られたブロース全体をドツトイムノプロットすることによってリンホカインの放 出増加に対してスクリーニングした。コロニーを、上記のように、ヒトインター ロイキン４に対する１１Ｂ４モノクローナル抗体とアルカリホスファターゼをつ ないだヤギ抗ラットＩｇＧとを使用して評価した。

ＲＺ２１に更に突然変異を起こさせて作成し、高生産性株として選択されたある 株を、Ｒ８６３１と名付けた。

本発明中の株の高められた分泌能力と、反復突然変異誘発および選択の効果を示 すため、各々プラスミドｐＡＨ３を持つ、突然変異のない株２９４Ｓ、単一突然 変異株ＲＺ２１．二重突然変異株Ｒ５６３１を培養し、上記のように２０：１０ ：５ＴＹＥ培地で発酵させた。次いで１ｍＭ　ＩＰＴＧを加えることによって発 現を誘導した。誘導してから六時間後に、２ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０：１０： ５ＴＹＥ培地でＩＯＸの細胞濃度で種々の形質転換体を３７℃で一時間、インキ ュベーションすることによって放出されたインターロイキン−４の量を決定した 。培地中のインターロイキン４はヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｐｒｏｃ。

て分析し、その結果を表１に示した。

表１ インターロイキン−４の生産 生理活性零 大腸菌株　（ユニット／ｍ１） ２９４Ｓ／ｐＡＨ３２，００５ ＲＺ２１／ｐＡＨ３２１，７９８ Ｒ８６３１／ｐＡＨ３９７，０１０ ＊活性値は、同数の細胞による分泌を比較するため、Ｏ，Ｄ、６６０＝３０に対 して補正されている。１マイクログラムの純粋なヒトインターロイキン−４は使 用した分析においては約２０．０００の活性値を示す。

表１のデータは、単−突然変異分泌株ＲＺ２１が突然変異のない株２９４Ｓに比 べて１０倍量のインターロイキン−４を培地中に生産したことを示している。

また、二重突然変異株Ｒ５６３１ではＲＺ２１に比べ、更に５倍の活性が生み出 突然変異大腸菌株ＲＺ２１．Ｒ８６３１，ＲＬ７はアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、受託番号はそれぞれ、ＡＴ ＣＣ５３９５１，５３９５３，５３９５４である。プラスミドｐＡＨ３，ｐＫＧ Ｔ２６９−２をもつ大腸菌株２９４ＳはＡＴＣＣに寄託されており、受託番号は それぞれ、ＡＴＣＣ６８１３６，６８１３７である。モノクローナル抗体１１Ｂ ４を生産するハイブリドーマＩＣ１，１１Ｂ４．６はＡＴＣＣに寄託されており 、受託番号はＨＢ９８０９である。これらの寄託のすべては、特許手続上の微生 物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとで行われた。

当業者にとって明らかであるだろうが、本発明の意図および範囲を離れずに、多 くの改変や変法をなすことができる。ここで記載された特定の態様は、実施例の みによって提供されるものであり、本発明は付随の請求の範囲によってのみ制限 される。

Ｆｉｊｌ、　１ にν・２ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） ＴＪ　４工。□３０２１■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的に活性があるヘテロな遺伝子産物を培地中に分泌することのできる Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）細菌であって、該細菌は、（ａ）バクテリオファージＴ ７による感染に耐性と、培地中に十分量のペリプラズミックタンパク質を分泌す る能力とによって特徴づけられるＥ．ｃｏｌｉ細菌、および （ｂ）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に 連結されたペリプラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのできる シグナルペプチドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター、 を含み、両方のＤＮＡ配列を発現することが可能である、上記Ｅ．ｃｏｌｉ細菌 。 ２．第一のＤＮＡ配列がｏｍｐＡシグナルペプチドをコードする、請求の範囲第 １項に記載の細菌。 ３．第二のＤＮＡ配列がヒトインターロイキン−４をコードする、許請求の範囲 第１項または第２項に記載の細菌。 ４．両方のＤＮＡ配列の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求の範囲第 １項から第３項までのいずれがに記載の細菌。 ５．誘導プロモーターが１ａｃプロモーターである、請求の範囲第４項に記載の 細菌。 ６．ＲＺ２１，ＲＳ６３１またはＲＬ７株である、請求の範囲第１項に記載の細 菌。 ７．組み換えベクターがプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１である、請求の範囲第 １項から第３項までのいずれかに記載の細菌。 ８．所望のヘテロなタンパク質の産生方法であって、該方法は、（ａ）培地中に 、生物学的に活性のあるヘテロなタンパク質を分泌することのできるＥ．ｃｏｌ ｉ細菌の培養であって、該培養は（ｉ）バクテリオファージＴ７による感染に耐 性があり、培地中に十分量のペリプラズミックタンパク質を分泌する能力のある ことによって特徴づけられるＥ．ｃｏｌｉ細菌、および （ｉｉ）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的 に連結されたペリプラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのでき るシグナルペプチドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター 、 を含み、ここで該培養は、該細菌が両方のＤＮＡ配列を発現し、培地中にヘテロ なタンパク質を分泌するような条件下で行われる；および、（ｂ）培地中からの 分泌されたタンパク質の単離を含む、上記産生方法。 ９．第一のＤＮＡ配列がｏｍｐＡシグナルペプチドをコードする、請求の範囲第 ８項に記載の方法。 １０．第二のＤＮＡ配列がヒトインターロイキン−４をコードしている、請求の 範囲第８項または第９項に記載の方法。 １１．両方のＤＮＡ配列の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求の範囲 第８項から第１０項までのいずれかに記載の方法。 １２．誘導プロモーターがｌａｃプロモーターである、請求の範囲第１１項に記 載の方法。 １３．細菌がＲＺ２１，ＲＳ６３１またはＲＬ７株である、請求の範囲第８項に 記載の方法。 １４．組み換えベクターがプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１である、請求の範囲 第１０項に記載の方法。 １５．生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物を培地中に分泌することができ るＥ．ｃｏｌｉ細菌を作製し同定する方法であって、該方法は、（ａ）該細菌の ＤＮＡに突然変異を引き起こすために十分量の変異誘起剤でＥ．ｃｏｌｉ細菌を 処理すること： （ｂ）ステップ（ａ）で産生された変異株から、バクテリオファージＴ７の感染 耐性と、培地中への十分量のペリプラズミックタンパク質の分泌能のために、ク ローンを選択すること； （ｃ）ステップ（ｂ）で選択されたひとつまたはそれ以上のクローンを、所望の ヘテロなタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ配列に作用的に連結されたペ リプラズミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナルペプ チドをコードしている第一のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター（この組み換え ベクターは細菌内において両方のＤＮＡ配列の発現を制御することができる）に よって形質転換すること；および（ｄ）どのクローンが培地中に十分量のヘテロ なタンパク質を分泌しているかを決定するために、形質転換されたクローンを分 析することを含むものである、上記方法。 １６．形質転換されたクローンの分析が、（ａ）培養されたコロニーの一部がメ ンブレンの一方の側の上にトランスファーされるような条件下で、形質転換され 分散して培養された細菌と第一のニトロセルロースメンブレンを接触させること ；（ｂ）ステップ（ａ）の第一のメンブレンのもう一方の面を、メンブレンの集 合体を作製するために増殖培地と接触している第二のニトロセルロースメンブレ ンと接触させること； （ｃ）トランスファーされた細菌によって分泌された生物学的に活性のあるタン パク質が第一のメンブレンから第二のメンブレンに移行するような条件下で、メ ンブレンの集合体をインキュベートすること；（ｄ）メンブレンを分離し、ステ ップ（ｃ）の第二のメンブレンを、特異的な抗体−タンパク質複合体を形成する 条件下で、該タンパク質に特異的な第一の抗体と接触させること； （ｅ）結合しなかった物質を除去するために、ステップ（ｄ）の第二のメンブレ ンを洗浄すること： （ｆ）洗浄したメンブレンを、第一の抗体−タンパク質複合体がメンブレン上に 存在するところにおいて、目に見える反応が起きる条件下で、目に見えるフォー カスを生じさせるために、第一の抗体に特異的であるラベルされた第二の抗体と 接触させること；および （ｇ）目に見えるフォーカスを、培養している細菌のコロニーと並べて調整し、 それによって培地中に十分量のタンパク質を分泌することが可能な細菌を同定す ること を含む方法によって行われる、請求の範囲第１５項に記載の方法；１７．同定さ れた細菌コロニーが培養から単離されている、請求の範囲第１５項または第１６ 項に記載の方法。 １８．タンパク質が組み換えヒトインターロイキン−４である、請求の範囲第１ ５項から第１７項までのいずれかに記載の方法。 １９．変異誘起剤が紫外線照射である、請求の範囲第１５項から第１８項までの いずれかに記載の方法。 ２０．メンブレン集合体が第二のメンブレンと増殖培地の間にさらに第三のニト ロセルロースメンブレンを含み、その上において、細菌のコロニーから分泌され たタンパク質が、ステップ（ｄ）から（ｆ）の過程を通じて検出される、請求の 範囲第１６項に記載の方法。 ２１．第一の抗体が生物学的に活性のあるタンパク質特異的に結合するが、タン パク質の変性構造には結合しない、請求の範囲第１６項に記載の方法。 ２２．（ａ）組み換えベクターの排除を引き起こす、培地中で形質転換された細 菌を培養すること、および （ｂ）変異誘起剤にさらされていない同じ組み換えベクターで、細菌を再度形質 転換すること、 をさらに含む、請求の範囲第１５項から第２１項までのいずれかに記載の方法。 ２３．プラスミドｐＧＲＴ８５７−１１。 ２４．ＲＺ２１，ＲＳ６３１またはＲＬ７である、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌。