HU214828B

HU214828B - Eljárás heterológ proteinek táptalajba való kiválasztására képes E. coli törzsek előállítására és heterológ proteinek termelésére

Info

Publication number: HU214828B
Application number: HU9201411A
Authority: HU
Inventors: Charles A. Lunn; Satwant K. Narula; Richard L. Reim
Original assignee: Schering Corp.
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1998-06-29
Also published as: NO921674L; EP0497757A1; HK185296A; EP0497757B1; FI921874A0; NO305253B1; AU651059B2; JP2660095B2; DE68916444D1; FI104499B; FI921874A; JPH04505548A; DE68916444T2; AU4644789A; WO1991006655A1; HUT64597A; NO921674D0; HU9201411D0; KR960013134B1

Abstract

A találmány rekőmbináns vektőrőkkal transzfőrmált őlyan műtáns E. cőlitörzsek előállítására vőnatkőzik, amelyek heterőlóg rekőmbinánsprőteinek táptalajba való kiválasztására képesek. A rek mbináns vektőregy, a kívánt heterőlóg prőtein periplazmatikűs térbe valótranszpőrtját közvetíteni képes szignálpeptidet kódőló DNS-szekvenciáttartalmaz a heterőlóg prőteint kódőló DNS-szekvenciáhő fűziőnálva. Atalálmány szerinti eljárásőkkal az említett műtáns E. cőli törzsekkela baktériűm rőncsőlása nélkül jelentős mennyiségű heterőlógrekőmbináns prőtein állítható elő, helyesen felgőmbőly dőtt, aktívfőrmában. ŕ

Description

A találmány rekombináns vektorokkal transzformált olyan mutáns E. coli törzsek előállítására vonatkozik, amelyek heterológ rekombináns proteinek táptalajba való kiválasztására képesek, továbbá olyan eljárásokra, amelyekkel az ilyen törzsek termelése és azonosítása keresztülvihető. A találmány a transzformált törzsek felhasználásának módszereit is ismerteti, amelyekkel heterológ rekombináns proteinek helyesen felgombolyodott, biológiailag aktív formái állíthatók elő.

A rekombináns DNS-technológia eljárásai lehetővé tették a biológiailag fontos polipeptidek és proteinek viszonylag nagy mennyiségben való előállítását. A munkák nagy részénél Escherichia coli baktériumot használnak gazdaszervezetként a rekombináns vektorok kifejeződéséhez, de a baktérium használatának jelentős korlátái vannak. A rekombináns polipeptideket vagy proteineket meghatározó géneket kifejező E. coli baktériumokat fizikális szerkezetük miatt teljesen el kell roncsolni fizikai, kémiai vagy enzimes módszerekkel, mielőtt a rekombináns termékeket izolálhatjuk.

Az E. colit és a többi Gram negatív baktériumot centrális citoplazma - ebben szintetizálódnak a proteinek - és komplex sejtmembrán szerkezet jellemzi. Ezek a baktériumok külső membránnal rendelkeznek, amelyhez számos, lipidhez kapcsolt oligoszacharid van kötve. Amikor patogén Gram negatív baktériumok megfertőznek egy állatot, az ezen felületi oligoszacharidokra specifikus antitestek képződése fontos lehet a betegség lefolyásának a meghatározásában.

A külső membránon belül van a plazmamembrán, amely a sejt permeabilitásának fontos korlátja. Ez a membrán olyan proteineket tartalmaz, amelyek bizonyos tápanyagok és más kémiai anyagok számára a sejtbe való belépést és a sejt elhagyását biztosítják, míg másokat a sejtből kizárnak.

A külső membrán és a plazmamembrán között helyezkedik el a periplazmatikus tér vagy periplazma. Ez a régió a külső membránnal érintkezik, és egy peptidoglikánt tartalmaz. A peptidoglikán proteinekből és poliszacharidokból álló, erősen térhálós, falszerű komplex, mely a sejt merevségét biztosítja.

Az E. coli által szintetizált legtöbb protein a citoplazmában marad, de néhány a periplazmában található. A citoplazmából a periplazmába szállított proteinek „szignálpeptid”-eket tartalmaznak, amelyek kovalens peptidkötéssel kapcsolódnak a proteinek aminoterminális végéhez, és ezek könnyítik meg a plazmamembránon keresztül történő transzportot. Megemlítjük az E. coli néhány periplazmatikus proteinjét. Ilyen például a β-laktamáz, alkalikus foszfatáz, bizonyos nukleázok, peptidázok és proteázok. A periplazmatikus proteinek szignálpeptidjei a transzportfolyamat során bizonyos ponton lehasadnak, s így a proteinek „érett” formája marad a periplazmában.

Az E. coli felhasználásával történő rekombináns protein termelése folyamán a heterológ vagy idegen gének expressziós termékei általában a citoszolban halmozódnak fel. Az ilyen proteinek gyakran kicsapódnak, és oldhatatlan „zárványok”-at vagy „fénytörő testek”-et képeznek. Ezekben a zárványokban a rekombináns proteinek biológiailag nem aktívak, és konformációjuk nem természetes [Mitraki et al., Bio/Technology, 7, 690 (1989)]. Annak érdekében, hogy az ilyen proteineket használható formában izoláljuk, a baktériumokat el kell roncsolni, és az oldhatatlan frakcióban lévő proteineket oldhatóvá kell változtatni detergens vagy egy kaotróp anyag - például karbamid vagy quanidinhidroklorid - használatával. Minthogy az így szolubilizált proteinek konformációja nem természetes, viszonylag komplex eljárások segítségével el kell végezni újbóli helyes felgombolyításukat. Ilyen eljárást írnak le például Builder és mtsai (114 506 számú európai szabadalmi bejelentés).

Villa-Komaroff és mtsai [Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 3727 (1987)] kísérletet tettek, hogy rekombináns DNSmódszerekkel olyan heterológ proteineket termeljenek, amelyek nem halmozódnak fel a citoplazmatikus zárványokban. Egy ilyen kísérletben patkány preproinzulin gént építettek be az E. coli β-laktamáz génbe. Mint már megjegyeztük, a β-laktamáz egy periplazmatikus enzim, amelynek a prekurzor formája egy szignálpeptidet hordoz. A fuzionált β-laktamáz/preproinzulin gén expressziója olyan fúziós proteint eredményezett, amely a fent leírt transzportmechanizmus révén a periplazmába szállítódon.

Hasonló eljárást ismertettek Gilbert és mtsai (4,336,336 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A feltalálók génmanipulációval előállított fúziós proteineket termeltek olyan DNS-szekvenciák kifejezése révén, amelyek a kívánt idegen proteint kódoló gént egy periplazmatikus protein egy szignálpeptidjét kódoló DNS-szekvenciához füzionálttal tartalmazták.

A természetes transzportfolyamatok további kutatása alkalmával Silhavy és mtsai (4,336,336 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) eljárást írtak le olyan fúziós proteinek termelésére, amelyek a baktérium külső membránjához szállítódtak. Ez az eljárás abból áll, hogy egy citoplazmatikus bakteriális proteint kódoló gént egy nem citoplazmatikus hordozó proteinnel fuzionálnak, ezáltal egy olyan fúziós proteint termelnek, amely a külső membránhoz szállítódik. Silhavy és mtsai azt is közölték, hogy ezt a módszert fel lehet használni egy ismerteden génnek (például egy eukarióta proteint kódoló génnek) egy már megszerkesztett fúziós génbe való beépítéséhez.

Azonban egyik előbb említett eljárásban sem jutottak a kívánt rekombináns proteinek a sejtek külső membránján túlra. A sejteket mindegyik esetben még el kellett roncsolni, hogy megkapják a proteineket. Ennek következtében számtalan bakteriális protein szintén felszabadul, ami a kívánt proteinek izolálását sokkal munkaigényesebbé és összetettebbé teszi. Ezenkívül, ahol az eljárások bakteriális proteinekhez fúzionált termékeket eredményeznek, a termékeket általában el kell hasítani a kívánt protein előállítása érdekében. Egy ilyen eljárás feltehetően komplikált, és denaturáló feltételekkel járhat együtt, ami megnehezíti, hogy teljes biológiai aktivitással rendelkező proteineket kaphassunk.

Legújabban Sakaguchi és mtsai [Agric. Bioi. Chem., 52, 2669 (1988)] közölték, hogy egy ompA szignál

HU 214 828 Β szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát granulocitamakrofág telep stimuláló faktort (GM-CSF = granulocyte-macrophage colony stimulating factor) kódoló génhez fuzionáltak E. coli expressziós vektorban. Miután ezzel E. coli HD101 sejteket transzformáltak, és megtörtént a kifejeződés, azt találták, hogy bizonyos mennyiségű GM-CSF kiválasztódott a táptalajba.

Kutatók olyan E. coli mutánsokat állítottak elő, amelyekből különböző periplazmatikus enzimek szivárogtak a táptalajba. Lopes és mtsai [J. Bacteriol., 109, 520 (1972)] például E. coli sejteket mutagén anyaggal például nitrozo-guanidinnel - kezeltek olyan periplazmatikus „szivárgó” („periplasmic leaky”) mutánsok előállítása céljából, amelyek ribonukleáz I-et, endonukleáz I-et és alkalikus foszfatázt választanak ki. Hasonlóképpen Anderson és mtsai [J. Bacteriol., 140, 351 (1979)] és Lazzaroni és mtsai [J. Bacteriol., 145, 1351 (1981)] periplazmatikus szivárgó mutánsok tanulmányozása során, szekretált periplamzatikus proteineket mutattak ki immunprecipitációval vagy SDS políakrilamid gél elektroforézissel.

Az ilyen mutánsok szivárgása valószínűleg arra mutat, hogy a bakteriális külső membránból hiányzik egy normál alkotórész (hiányoznak normál alkotórészek), s ez megnöveli a permeabilitást. Egyetlen szivárgó mutáns előállításának sem az volt a célja, hogy rekombináns proteinek táptalajba való kiválasztását valósítsák meg. Ezeket azért szerkesztették, hogy a bakteriális burok szerkezetét és funkcióját, valamint a membránstruktúrán belül a különböző enzimek helyzetét vizsgálj ák.

Legújabban Zinder és mtsai (4,595,658 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) ismertettek egy olyan módszert, amely megkönnyíti a baktériumokban szintetizált proteinek externalizációját. A módszer arra vonatkozik, hogy hogyan lehet egy fi bakteriofág gén III egészét vagy részét egy plazmidba vagy bakteriális kromoszómába bevezetni. Úgy tudjuk, hogy az fi bakteriofág gén III protein, amely a gén kifejeződése révén termelődik, a külső bakteriális membránt megbontja, aminek az lesz a következménye, hogy a periplazmatikus proteinek elszivárognak a sejtből.

Zinder és mtsai a továbbiakban azt állították, hogy szivárgó mutánsaikat fel lehet használni genetikailag manipulált fúziós proteinek előállítására egy olyan eljárásban, amelyben a kívánt proteint kódoló gént és e proteint a periplazmatikus térbe való transzportálásra képes vezérszekvenciát kódoló DNS-szekvenciával fuzionálják. Zinder és mtsai azonban nem adnak felvilágosítást arra nézve, hogy hogyan lehet az ilyen fúziókat kivitelezni, és olyan példát sem közölnek, amely bemutatná, vajon az eljárás a feltételezés szerint ténylegesen működik-e. Amit valóban bemutattak, mindössze az volt, hogy a mutánsok természetes β-laktamáza a sejtekből a környező közegbe szivárgott.

Minthogy a lánc helytelen felgombolyodottsága és a protein denaturáltsága a citoplazmán belüli rekombináns proteinek érését kísérő olyan jelenség, amely általában nem fordul elő azoknál a proteineknél, amelyek a sejten kívülre szállítódnak, igény mutatkozik olyan eljárások iránt, amelyekkel szekretáló E. coli törzseket lehet előállítani és alkalmazni.

A találmány olyan E. coli baktériumokra vonatkozik, amelyek biológiailag aktív heterológ gén termékeket képesek a táptalajba kiválasztani. A találmány szerinti E. coli baktérium

a) T7 bakteriofág fertőzéssel szemben rezisztens, és periplazmatikus proteinek jelentős mennyiségét képes a táptalajba kiválasztani,

b) tartalmaz továbbá egy rekombináns vektort, amely egy protein periplazmatikus térbe való transzportját közvetíteni képes szígnálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát tartalmaz, mely funkcionálisan kapcsolódik a kívánt heterológ proteint kódoló egy második DNS-szekvenciához, s a szóban forgó baktérium mindkét DNS-szekvenciát képes kifejezni.

A jelen találmány tárgyát képezik a kívánt heterológ proteinek előállítására szolgáló eljárások, melyek a következő lépésekből állnak:

(i) mutáns E. coli baktériumot tenyésztünk, amely biológiailag aktív heterológ proteineket képes a táptalajba kiválasztani,

- az említett E. coli baktérium T7 bakteriofág fertőzéssel szemben rezisztens és periplazmatikus proteinek jelentős mennyiségét képes a táptalajba kiválasztani,

- tartalmaz továbbá egy rekombináns vektort, amely egy protein periplazmatikus térbe való transzportját közvetíteni képes szígnálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát tartalmaz, mely funkcionálisan kapcsolódik a kívánt heterológ proteint kódoló egy második DNS-szekvenciához, s a tenyésztést olyan körülmények között végezzük, amelyekben a baktérium mindkét DNS-szekvenciát kifejezi és a heterológ proteint a táptalajba kiválasztja; és (ii) a kiválasztott proteint a táptalajból izoláljuk.

A találmány ezenkívül biológiailag aktív géntermékeket a táptalajba kiválasztani képes E. coli baktériumok előállítását és azonosítását szolgáló eljárásokat ismertet. Ezek az eljárások a következő lépésekből állnak:

(i) az E. coli baktériumokat megfelelő mennyiségű mutagén anyaggal kezeljük, hogy mutációs változások következzenek be a baktériumok DNSében;

(ii) az (i) lépésben kapott mutáns sejtek közül olyan kiónokat szelektálunk, amelyek T7 bakteriofág fertőzéssel szemben rezisztensek, és periplazmatikus proteinek jelentős mennyiségét képesek a táptalajba kiválasztani;

(iii) az (ii) lépésben szelektált kiónt vagy kiónokat olyan rekombináns vektorral transzformáljuk, amely egy protein periplazmatikus térbe való transzportját közvetíteni képes szígnálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát hordoz, mely funkcionálisan kapcsolódik a kívánt heterológ proteint

HU 214 828 Β kódoló egy második DNS-szekvenciához, s ez a rekombináns vektor képes mindkét DNS-szekvencia expresszióját irányítani a baktériumban;

(iv) a transzformált kiónok közül kiválasztjuk a táptalajba jelentős mennyiségű heterológ proteint szekretáló kiónokat.

A találmány egy előnyös változatában a transzformáit kiónok analízisét az alábbi lépéseket tartartalmazó eljárással végezzük el:

(i) a transzformált baktériumok diszpergált tenyészetével egy első nitrocellulóz membránt érintkeztetünk olyan módon, hogy a tenyészetben lévő telepek egy része átkerüljön a membrán egyik oldalára;

(ii) az (i) lépés első membránjának másik oldalát egy második nitrocellulóz membránnal hozzuk érintkezésbe táptalaj jelenlétében, s így egy membránszereléket hozunk létre;

(iii) a membránszereléket olyan feltételek mellett inkubáljuk, hogy a rávitt baktériumok által kiválasztott biológiailag aktív protein az első membránon keresztül átjusson a második membránra;

(iv) a membránokat szétválasztjuk és az (iii) lépés második membránját egy, a proteinre specifikus első antitesttel hozzuk össze olyan körülmények között, hogy specifikus antitest-protein komplexek képződjenek;

(v) az (iv) lépés második membránját mossuk, hogy a kötetlen anyagokat eltávolítsuk;

(vi) a mosott membránt egy, az első antitestre specifikus jelzett második antitesttel hozzuk össze olyan feltételek mellett, hogy ahol az első antitest-protein komplexek vannak jelen a membránon, ott látható helyek keletkezzenek;

(vii) a látható helyeket a tenyészet baktériumtelepeihez illesztjük, s így azonosíthatjuk azokat a baktériumokat, amelyek a protein jelentős mennyiségeit képesek a táptalajba kiválasztani.

Előnyös, ha az első antitest specifikusan kötődik a biológiailag aktív proteinhez, de nem köti a protein denaturált (azaz helytelenül felgombolyodott) formáit.

Az alábbiakban az ábra rövid leírása következik.

A találmány könnyebb megértését szolgálja a csatolt ábra.

1. ábra: a pRGT857-l 1 plazmid szerkesztésének vázlatos rajza.

Cohen és mtsai (4,237,224 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), Collins és mtsai (4,304,863 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és Maniatis és mtsai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory] a rekombináns DNS-technológia számos eljárását írták le. Az említett eljárásokat a gyakorlott szakemberek rutinszerűen használják. Az említett leírásokat és a többi itt idézett referenciát ez a leírás teljes egészében referenciákként tekinti.

Ez a találmány egy meglepő felfedezésen alapul, ugyanis az E. coli úgy módosítható, hogy a heterológ proteineket közvetlenül a táptalajba válassza ki. Ebben a leírásban a „heterológ proteinek” kifejezés olyan proteineket jelent, amelyeket rendes körülmények között nem állít elő az E. coli, ilyenek például az emlős proteinek. A találmány értelmében a heterológ proteinek izolálásának szokásos előfeltételei, azaz a sejtek roncsolása és/vagy detergenssel vagy kaotróp anyagokkal való extrahálása kiküszöbölődik.

Ezt az eredményt két fontos fejlesztés révén éljük el. Először: rekombináns DNS-metodológiát alkalmazunk szignálpeptidekhez fuzionált kívánt heterológ proteinek előállítására. Az említett szignálpeptidek a protein transzportját a periplazmatikus térhez vagy azon túlra képesek közvetíteni. Másodszor: a baktériumok membránjait a bakteriális DNS-ben létrehozott mutációs változással úgy módosítjuk, hogy a proteinek számára átjárhatóvá váljanak.

A szekretáló baktériumok és a találmány szerinti eljárások felhasználásával előállított proteinek teljes biológiai aktivitással rendelkeznek, és úgy véljük, hogy konformációjukat a hibátlan felgombolyodottság jellemzi. Tehát azok a manipulációk, amelyek a tudomány mai állása szerint általában szükségesek a biológiailag aktív rekombináns proteinek E. coliból való előállításához, kiküszöbölődtek.

Ebben a találmányban az E. coli törzsek széles változatát használhatjuk, többek között, de nem kizárólag a következőket: C600, W3110, AB 1157, P678, C511, HB101, MM294, JM83 és TB1. Az alábbi példában a kereskedelemben kapható MM294 törzset sztreptomicin rezisztens 294S jelű törzzsé konvertáltuk a mutagenezis előtt olyan okokból, amelyek egyáltalán nem voltak összefüggésben ezzel a találmánnyal. Egyébként ehelyett az MM294 vagy számos más hozzáférhető E. coli törzs is használható.

A baktériumok mutációját a szakterület bármely ismert standard módszerével elvégezhetjük. Az alábbi példában ultraibolya-besugárzást használunk a mutagén hatás eléréséhez, de kémiai hatóanyagok szintén használhatók. Használhatunk például N-metil-N’-nitro-Nnitrozo-quanidint Lopes és mtsai (lásd fent) vagy Lazzaroni és mtsai (lásd fent) szerint.

A találmány szerinti eljárás során való felhasználásra alkalmas E. coli mutánsok két lényeges jellemző tulajdonsággal rendelkeznek: rezisztensek T7 bakteriofág fertőzéssel szemben és egy periplazmatikus protein jelentős mennyiségét képesek abba a táptalajba kiválasztani, amelyben a mutánsok növekednek. A T7 fertőzéssel szembeni rezisztencia vizsgálatát Branes és mtsai [J. Bacteriol., 154, 1462 (1983)] szerint könnyen elvégezhetjük, mint alább bemutatjuk.

A periplazmatikus proteinek számára kialakult megnövekedett permeabilitás vizsgálatát bármelyik ismert periplazmatikus protein markerként való felhasználásával és a proteint láthatóvá tévő módszer alkalmazásával végezhetjük el. Az alábbi példában a ribonukleáz I periplazmából való kiválasztását mutattuk ki. Megfigyeltük, hogy a kiválasztott enzim udvart vagy feltisztult területet képez élesztő RNS-t tartalmazó agarban. Ha ampicillin rezisztens E. coli törzset használunk, szekretált β-laktamázra vizsgálhatunk a Zinder és mtsai, valamint mások által leírtak (lásd fent) szerint.

HU 214 828 Β

A találmány szerinti eljárásokkal nagy mennyiségű heterológ protein termelhető. Bár a humán interleukin-4-et használjuk a találmány bemutatására, elvileg bármelyik proteint előállíthatjuk, ha a proteint kódoló DNS-szekvencia kézben van. Ilyen DNS-szekvenciákat könnyen előállíthatunk például standard klónozó módszerek alkalmazásával úgy, hogy azokból a sejtekből, amelyekről tudjuk, hogy a proteint termelik, mRNS-t izolálunk, melyből cDNS-t állítunk elő. E cDNS-ekből gyűjteményeket készíthetünk, amelyeket standard módszerekkel szondázunk.

Ténylegesen humán GM-CSF-et és szolubilis gamma-interferon receptort is termelünk a találmány szerinti szekretáló törzsek felhasználásával. Mindkettő magas biológiai aktivitást mutatott.

A szükséges metodológiát az alábbi szerzők közölték: Okayama és mtsai [Mól. Cell. Bioi., 2, 161 (1982); Meth. Enzymol., 154, 3 (1987)], Margolskee és mtsai [Mól. Cell. Bioi., 8, 2837 (1988)] és Guber és mtsai [Gene, 25,263 (1983)]. A cDNS klónozó módszerekről Kimmel és mtsai [Meth. Enzymol, 152, 307 (1987)] adtak összefoglalást. Standard kémiai szintetikus módszereket szintén használhatunk gének előállítására, ha ismerjük a gének nukleotid-szekvenciáját.

Az E. coli citoplazmájában szintetizált proteineket a periplazmába való transzportjuk érdekében egy szignálpeptidhez kell fuzionálni aminoterminális végüknél. Az E. coli periplazmatikus vagy külső membrán proteinjeinek több ismert szignálpeptidje használható erre a célra. Például Talmadge és mtsai [Proc. Natl. Asad. Sci., 77, 3369 (1980)] egy pKT287 elnevezésű vektor szerkesztését ismertették, amely a pBR322 bla génjét tartalmazza. A bla által kódolt első 23 aminosav foglalja magában a β-laktamáz szignál-szekvenciát. Ha a pKT287 szerkezetébe a PstI helyen egy gént építünk be, a kifejeződés folyamán egy olyan fúziós protein képződik, amely a szignálpeptidet tartalmazza. A pKT287 plazmidot Maniatis és mtasi (lásd fentebb: 428. oldal) mutatták be.

Ugyanígy Silhavy egy pMH621 jelű plazmidot készített, amely az E. coli ompF szignálpeptidet kódoló gént tartalmazza (Maniatis, et al., lásd fentebb: 429-430 oldal). Ha a kívánt proteint kódoló heterológ DNS-szekvenciát beépítjük a pMH621 BglII helyére, a plazmid az ompF szignálpeptidet kódoló fúziós proteint fogja termelni. Az alábbi példában egy másik omp szignálpeptidet, az ompA peptidet használtuk.

Az omp A és ompF az E. coli külső membrán proteinjeinek a szignálpeptidje. E szignálpeptidek aminosavszekvenciáit Polliit és mtsai [Bacterial Outer Membranes as Model Systems (1987); szerk.: M. Inouye; John Wiley and Sons, New York, 117-139. oldal] ismertették. Watson [Nucleic Acids Rés., 12, 5145 (1984)] megállapította, hogy már több mint 227 prokarióta és eurkarióta szignálszekvencia primer szerkezete ismert. Ilyen prokarióta szignálszekvenciákkal rendelkező oligonukleotidok kémiai úton - a foszfotriészter vagy más ismert módszerek segítségével, előnyösen szilárd fázisú rendszerben - szintetizálhatok a jelen találmányban való felhasználáshoz, és egy alkalmas expressziós vektorba beépíthetők.

Bár a szignálpeptidek aminosav-szekvenciái különbözőek, úgy tűnik, hogy három közös szakaszt tartalmaznak. Az aminoterminális végnél számos hidrofilcsoportból álló szakasz van, amely egy vagy több lizinvagy arginincsoportot tartalmaz. E bázikus szakaszt követően egy centrális hidrofób mag található, mely körülbelül 8-15 hidrofób csoportból, túlnyomóan Leu-, Alá- és Val-csoportból áll. A hidrofób szakasz karboxiloldalán lévő szakasz lehasad, amikor a periplazmában vagy a külső membránban végbemegy az érett protein képződése. A hasadás rendszerint a hidrofób szakasztól körülbelül négy-nyolc csoporttal távolabbi helyen történik meg.

Az alábbi példában az ompA szignálpeptid úgy hasad le, hogy az érett humán interleukin-4 teljes aminosav-szekvenciáját tartalmazó protein az oda nem tartozó aminoterminális Met-csoport nélkül keletkezik. E. coliban a citoplazmában történő kifejeződés folyamán a Met gyakran hozzáadódik a proteinekhez.

Egy E. coli szignálpeptidet és a kívánt heterológ proteint kódoló DNS-szekvenciákat mesterségesen be lehet kapcsolni több olyan ismert vektor szerkezetébe, amelyek autonóm replikációra és E. coliban kifejeződésre képesek, ilyenek például a pBR322, pBR325, pUC8, pUC9, pUC19, pAH3, pKTG269-2 és pRGT857-ll. A két DNS-szekvenciát ligáljuk, ezután beépítjük egy vektorba, vagy pedig előnyösen egy olyan vektort készítünk, amely a szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazza. Ezután bármilyen heterológ DNS-szekvenciát beépíthetünk a szignálpeptid helyénél, hogy a kívánt fúziós szekvenciát megkapjuk. Előnyös, ha a szignálpeptidet kódoló vektorból hármat készítünk el, hogy ezek közül egyikben a helyes leolvasási keretbe legyen beépítve bármelyik adott heterológ gén.

Az is lehetséges, hogy egy heterológ gén természetes nukleotidszekvenciáját használjuk a szignálpeptid kódolásához. Talmadge és mtsai [Natúré, 294, 176 (1981)] például közölték, hogy a proinzulinnal normál körülmények között társult szignálszekvencia E. coliban is működik, és lehetővé teszi a proinzulin kiválasztását.

Előnyös, ha a találmány szerinti eljárásnál használt rekombináns vektorok szabályozható promoter/operátor (po) rendszer - ilyen a jól ismert trp, lac vagy apL promoter - irányítása alatt vannak. A szakterületen sok olyan po rendszer ismeretes, amelyek hőérzékeny represszorok szabályozása alatt állnak; ha emeljük az inkubálás hőmérsékletét, a rendszer a represszió alól felszabadul, és megindul a szabályozott expresszió. Mások kémiai induktorokkal szabályozhatók [például: indolil-ecetsav (trp) és izopropil^-D-tiogalaktozid (IPTG, lac)].

Jóllehet a következőkben speciális rekombináns plazmidokat ismertetünk a találmány szemléltetésére, hangsúlyoznunk kell azonban, hogy ezeket csupán példákként ismertetjük, és helyettük sok más rekombináns plazmid is használható.

HU 214 828 Β

Szerkesztés után a rekombináns vektorokkal standard módszerek alkalmazásával - transzformáljuk a mutáns baktériumokat (lásd például: Maniatis et al., lásd fentebb, 250. oldal), és a transzformált sejteket megfelelő táptalajon klónozzuk.

Standard immunkémiai módszerek és bioassayk használatával határozhatjuk meg, hogy az adott transzformáit klón kiválasztja-e a biológiailag aktív proteint. A táptalajból, amelybe egy limfokin - például interleukin-2 vagy interleukin-4 - kiválasztódott, alikvot mennyiségeket veszünk ki, s a mintákat T-sejt növekedési faktor aktivitásra vizsgáljuk, például Devos és mtsai [Nucleic Acids Rés., 11, 4307 (1983)] szerint. Az ilyen vizsgálatokat radioizotóp vagy kolorimetriás mérésekkel fejezhetjük be [Mosmann, J. Immunoi. Meth., 65, 55 (1983)]. Az interferon bioassayt például DeChiara és mtsai módszerével (4,816,566 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) végezhetjük el.

A szekretáló kiónokat sokkal gyorsabban szűrhetjük immunprecipitációval vagy enzim-immunassayvel (ELISA). A kívánt protein elleni antitesteket standard módszerekkel állíthatjuk elő. Előnyösek a monoklonális antitestek. Ezeket könnyen előállíthatjuk Köhler és Milstein [Natúré, 256, 495 (1975); Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1976)] módszerével.

A monoklonális antitestek előállításánál a kívánt proteinnel állatokat — például egereket, patkányokat, lovakat, birkákat, disznókat, nyulakat stb. - immunizálunk, hogy antitesttermelő szomatikus sejteket kapjunk a mielomasejtekkel való fúzióhoz.

A potenciálisan antitesteket termelő szomatikus sejtek, főként a B-sejtek, alkalmasak mieloma-sejtvonallal való fúzióra. Ezek a szomatikus sejtek az immunizált állatok nyirokmirigyeiből, lépéből és perifériás véréből származhatnak. E találmányban leírt példában részben patkány lépsejteket használunk, mivel ezek a sejtek viszonylag nagy százalékban stabilan fuzionálnak egér mieloma-sejtvonalakkal. Használhatók azonban ezek helyett egér, nyúl, béka vagy más sejtek.

Hibridóma előállítására szolgáló eljárások céljára specializált mieloma-sejtvonalakat fejlesztettek ki limfocitás tumorokból [Köhler és Milstein, Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1976); Shulman et al., Natúré, 276, 269 (1978); Volk et al., J. Virol., 42, 220 (1982)]. E sejtvonalak előállításának legalább három indítéka volt. Először: meg kellett könnyíteni a fuzionált hibridómák elválasztását a nem fuzionált és korlátlanul szaporodó mielomasejtekből. Ez rendszerint enzimhiányos mielomasejtek használatával érhető el. Az enzimhiány bizonyos szelektív táptalajban, mely a hibridómák növekedését fenntartja, a mielomasejtek növekedését megakadályozza. A második indítékot az szolgáltatta, hogy a limfocitás tumorsejtek saját antitestek termelésére képesek. A monoklonális technikák használatának az a célja, hogy olyan korlátlan élettartamú fuzionált hibrid sejtvonalakat kapjunk, amelyek a kívánt egyedi antitestet a hibridóma szomatikus sejt komponensének genetikai irányítása alatt termelje. Hogy a hibridómák tumorsejt antitesteket termelő képességét kiküszöböljék, olyan mieloma-sejtvonalakat választottak, amelyek nem képesek könnyű vagy nehéz immunglobulin láncok termelésére, vagy pedig elégtelen az antitest szekréciós mechanizmusuk. E sejtvonalak kiválasztásának harmadik oka az, hogy alkalmasak a fúzióra, és jó hatásfokkal fuzionálhatok.

Számos mieloma-sejtvonal használható fuzionált sejthibridek előállítására. Ilyenek például a következők: P3X63-Ag8, P3/NSl-Ag4-l, Sp2/O-Agl4 és S194/5.XXO.Bu.l. A P3X63-Ag8 és a P3/NSl-Ag4-l sejtvonalat Köhler és Milstein [Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1967)] írták le. Shulman és mtsai [Natúré, 276, 269 (1978)] fejlesztették ki az Sp2/O-Agl4 mielomasejtvonalat. Az S194/5.XXO.Bu.l vonalat Trowbridge [J. Exp. Med., 148, 313 (1979)] ismertette. A jelen találmány példájában a P3X63-Ag8.653 vonalat (ATTCC CRL 1580) használjuk.

Antitesttermelő lép- vagy nyirokmirigy-sejtekből és mielomasejtekből képződő hibridek előállítása során a szomatikus sejteket 10:1 arányban (ez az arány 20:1-től 1:1-ig változhat) keveqük össze a mielomasejtekkel olyan anyag vagy anyagok (kémiai, virális vagy elektromos) jelenlétében, amelyek a sejtmembránok fúzióját előmozdítják. Fúziós módszereket a következő szerzők ismertettek: Köhler és Milstein (lásd fentebb), Gefter et al. [Somatic Cell Génét., 3, 231 (1977)] és Volk et al. [J. Virol., 42, 220 (1982)]. Az említett kutatók Sendai vírust és polietilénglikolt (PEG) használtak a fúzió elősegítésére. A találmány szerinti példában a fúzióhoz PEG-et használtunk.

Minthogy a fúziós eljárásban igen kis gyakorisággal keletkeznek élő hibridek (például ha lépsejteket használunk szomatikus sejtekként, minden l*10⁵ lépsejtből körülbelül csak egy hibridet kapunk), lényeges, hogy módunk legyen a fuzionált sejthibrideknek a megmaradt nem fuzionált sejtektől való elválasztására. Az is szükséges, hogy ki tudjuk mutatni a kívánt antitestet termelő hibridómákat a többi fuzionált sejthibrid közül.

A fuzionált sejthibrideket általában úgy szelektáljuk, hogy a sejteket olyan táptalajban tenyésztjük, amely a hibridomasejtek növekedését fenntartja, de megakadályozza a nem fuzionált mielomasejtek növekedését, mivel osztódásuk normál körülmények között végtelenségig folytatódna. A fúzióhoz használt szomatikus sejtek életképessége in vitro tenyészetben nem tart hosszú ideig, és így ez nem jelent problémát. A találmányban szereplő példában olyan mielomasejteket használunk, amelyek nem termelnek hipoxantinfoszforibozil-transzferázt (HPRT-negatív sejtek). Ezekkel a sejtekkel szemben hipoxantin/aminopterin/timidin (HAT) táptalajban történik a szelektálás. Ebben a táptalajban a fuzionált sejthibridek túlélők lesznek, a lépsejtek HPRT-pozitív genotípusának megfelelően. Különböző genetikai hiányossággal rendelkező (gyógyszerérzékenység stb.) mielomasejteket is használhatunk, ezeket a genotípusuk szerint kompetens hibridek növekedését fenntartó táptalajjal szemben szelektálhatjuk.

A fuzionált sejthibridek szelektív tenyésztéséhez több hét szükséges. Ez idő alatt legelőször azokat a hibrideket szükséges azonosítani, amelyek a kívánt an6

HU 214 828 Β titestet termelik, hogy ezután ezeket lehessen klónozni és szaporítani. A kapott hibrideknek általában körülbelül a 10%-a termeli a kívánt antitestet, de nem ritka a körülbelül 1%-tól 30%-ig teijedő tartomány sem. Az antitesttermelő hibridek kimutatását a számos standard vizsgáló módszer bármelyikével elvégezhetjük, többek között enzim-immunassayvel és radio-immunassayvel. Ezeknek a technikáknak a leírása a szakirodalomban megtalálható [lásd például: Kennet et al. (szerk.), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 376-384. oldal, Plenum Press, New York (1980)].

Mihelyt a fuzionált sejthibrideket szelektáltuk, és beklónoztuk egyedi antitestet termelő sejtvonalakba, a sejtvonalakat két standard eljárás valamelyikével szaporíthatjuk. A hibridoma sejt szuszpenzióval hisztokompatíbilis állatot olthatunk. A beoltott állatban ezután tumorok képződnek, s ezek a fuzionált sejthibrid által termelt specifikus monoklonális antitestet szekretálják. Az állat testfolyadékainak — ilyen a szérum vagy az ascites folyadék - a pungálásával magas koncentrációban kaphatjuk meg a monoklonális antitesteket. Egy másik módszer szerint az individuális sejtvonalakat in vitro, laboratóriumi edényekben szaporíthatjuk. Az egyetlen specifikus monoklonális antitestet magas koncentrációban tartalmazó táptalajt dekantálással, szűréssel vagy centrifugálással arathatjuk le.

Előnyös, ha olyan monoklonális antitesteket használunk, amelyek specifikusan kötődnek a kívánt protein helyesen felgombolyodott, biológiailag aktív formájához, de nem kötődnek a protein denaturált formáihoz. Ilyen antitestekhez úgy juthatunk, hogy nagyszámú olyan hibridoma kiónt állítunk elő, amelyek a protein elleni antitestet termelik, majd a hibridomák táptalaját mind az aktív, mind a denaturált proteinnel szűrjük, hogy a kívánt antitestet termelő hibridomákat felleljük. A proteinek inaktív formáit könnyen elkészíthetjük oly módon, hogy a protein egy mintáját nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kezeljük a protein denaturálása céljából.

Az olyan antitestek alkalmazása, amelyek csak az aktív proteint ismerik fel, kiküszöbölik a sokkal hosszadalmasabb bioassayk használatát. Gyors szűrésre azonban felhasználhatók azok az antitestek, amelyeknek nincs ilyen specifitásuk. Az ilyen szűrésnél talált pozitív kiónokat ezután bioaktivitásra vizsgáljuk.

Egy előnyös kiviteli forma szerint a szekretáló kiónokat nitrocellulóz membránszerelék használatával szűrjük. Az első nitrocellulóz membránt a transzformált sejtek szélesztett tenyészetének felületével hozzuk érintkezésbe. Ezt a membránt, amelyre a tenyészetben lévő telepek egy része átkerült a kontaktus következtében, egy második membrán tetejére helyezzük tápoldattal érintkezésbe, s így képezzük a membránszereléket. A szereléket ezután a táptalajon inkubáljuk olyan körülmények között, hogy az átkerült mutáns baktériumsejtek által kiválasztott heterológ protein az első membránon keresztül átjusson a másodikra. Az inkubálás után a membránokat szétválasztjuk, és a második membránon lévő proteint olyan specifikus antintestekkel mutatjuk ki, amelyek kötődnek a proteinhez, s így antitest-protein komplexek keletkeznek.

A második membránt a kötetlen anyagok eltávolítása végett mossuk, majd a protein-antitest komplexeket egy, az első antitest elleni második, jelzett antitest használatával mutatjuk ki a membránon. Például, ha a proteinre specifikus antitest egér monoklonális antitest volt, jelzett anti-egér immunglobulin antitestet használunk. A második antitestet olyan vegyülettel jelezhetjük, amely egy adott hullámhossznál fluoreszkál, ilyen például a rodamin, vagy előnyösen látható kémiai reakciót katalizáló enzimet használunk a jelzéshez. Az erre a célra használható enzimek közül megemlítjük a különböző peroxidázokat, a glükóz-oxidázt, β-galaktozidázt és az alkalikus foszfatázt. A jelzett második antitest használata révén, ahol a kiválasztott proteinek vannak jelen a membránon, látható foltok jelennek meg.

Egy ilyen foltokat tartalmazó reprezentatív membránt mutattunk be az 1. ábrán, amelyen egy nyílhegy egy intenzívebb foltra mutat. A folt által képviselt telepet választottuk ki a további értékelésekhez.

Miután a második membránon megkötött proteineket láthatóvá tettük, a tenyészetet és a második membránt olyan módon illesztjük egymáshoz, hogy a látható foltok fölé kerüljenek a proteint szekretáló transzformáit telepek. Az így azonosított szekretáló telepeket ezután eltávolítjuk a tenyészetből és megfelelő táptalajon vagy fermentációs levesben tenyésztjük.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet, hogy egy harmadik nitrocellulóz-membránt alkalmazzunk a membránszerelékben. Ezt a membránt a második membrán és a táptalaj között helyezzük el úgy, hogy a fent említett inkubálás folyamán, az átkerült telepek által kiválasztott protein mind a második, mind a harmadik membránon keresztülmenjen. A proteinfoltok immunkémiai kimutatását a harmadik membránon a fent leírtak szerint végezzük, majd a membránok szétválasztása annak megerősítését szolgálja, hogy a második membránon észlelt negatív reakciók nem hamis negatívok. Előnyös, ha a második membrán analíziséhez használt első antitest csak a protein biológiailag aktív, helyesen felgombolyodott: formájára specifikus, míg a harmadik membránon használt első antitest a protein bármilyen formáját megköti, akár denaturált, akár nem.

Minthogy a mutagén anyag hatására mutációs változások következhetnek be mind az expressziós plazmidban, mind a bakteriális DNS-ben, előnyös, ha a kiválasztott kiónokat „kikúráljuk”, mégpedig úgy, hogy először eltávolítjuk belőlük a plazmidokat, majd olyanokkal helyettesítjük, amelyek soha nem voltak kitéve a mutagén hatásnak. A kúra standard módszerekkel könnyen elvégezhető.

Például: a píazmidot úgy lehet kiűzni, hogy a sejteket akridin-oranzs jelenlétében tenyésztjük, Watanabe és mtsai [J. Bacteriol., 81, 679 (1961] leírása szerint. Egy másik módszer szerint a sejteket egyszerűen a transzformált sejtek izolálásához használt szelekciós marker távollétében tenyésztjük. Az alábbi példában a transzformált sejtek csak azért képesek ampicillin jelenlétében növekedni, mivel a plazmid egy olyan enzim

HU 214 828 Β expresszióját irányítja, amely az antibiotikumot elbontja. Amikor ampicillin van a tenyészetben, szelektív nyomás nehezedik a másként érzékeny gazdasejtekre, hogy visszatartsák a plazmidot; az ampicillint nem tartalmazó tenyészetben a plazmid szükségtelen a sejt túléléséhez, s így spontán elvész.

Jóllehet alant csak néhány szekretáló E. coli kiónt írunk le részletesen a találmány bemutatása céljából, a használt eljárásokkal jelentős számú használható szekretáló mutáns sejt állítható elő rutinszerűen. Ha körülbelül 10¹¹ sejtet teszünk ki mutagén hatásnak, körülbelül 300-500 olyan telep képződik, mely túléli a T7fertózést. E rezisztens telepek körülbelül egyharmadafele jelentős mennyiségű periplazmatikus proteint is kiválaszt a táptalajba.

Előnyös, ha a találmány szerinti szekretáló törzseket további vizsgálatnak vetjük alá annak ellenőrzésére, hogy hosszabb tenyésztés esetén stabilak maradnak-e, továbbá, hogy a sejtek általános degeneráltsága miatt esetleg nem képesek a kívánt heterológ proteint szivárogtatni.

A kiválasztott törzsek stabilitásáról úgy győződünk meg, hogy néhány generáción keresztül tenyésztjük őket, és figyeljük a degeneráció, például a spontán lízis jeleit. Ha a kívánt heterológ protein nem jelenik meg a táptalajban egyszerűen azért, mert a sejtek degeneráltak, ezt előnyösen úgy bizonyítjuk, hogy egy reprezentatív E. coli citoplazmatikus protein jelenlétére analizáljuk a táptalajt. Ha a sejt szerkezetileg ép, az ilyen proteinekből jelentős mennyiség természetesen nem lehet jelen a táptalajban. Ilyen vizsgálatot minden olyan citoplazmatikus proteinnel végezhetünk, amelyekre nézve megfelelő vizsgálati módszer áll rendelkezésre, ilyen például a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz.

Számos esetben még több hatékonyan szekretáló törzset nyerhetjünk, ha fenti módszerekkel kapott törzseket szubklónozzuk, tenyésztjük, majd a sejteket egy vagy több további menetben mutagenizáljuk, klónozzuk és szelektáljuk.

Az azonosított E. coli szekretáló törzseket olyan feltételek mellett tenyésztjük, amelyek mellett mind a szignál peptidet kódoló DNS-szekvencia, mind a kívánt heterológ proteint kódoló szekvencia kifejeződik. A baktériumsejteket ezután elválasztjuk a táptalajtól, és a proteint a táptalajból standard technikákkal izoláljuk. A proteinizolálásra használt eljárások magukban foglalják például a savval vagy sóval való kicsapást, ioncserélő kromatográfiát, fém-kelát kromatográfiát, gélszűrést, a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiát, a preparatív korong vagy függöny gél elektroforézist, alacsony hőmérsékleten szerves oldószerekkel való frakcionálási, az ellenáramú szétválasztást és az immunaffinitás kromatográfiát.

E találmány szekretáló törzseinek és eljárásainak a használatával kapott heterológ protein mennyisége is és minősége is felülmúlja a mai technika eljárásaival kapott eredményeket. Például: Lundell és mtsai (J. Ind. Microbiol., nyomdában) ompA szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciát fuzionáltak humán interleukin—4 génnel egy rekombináns vektorban. Lundell és mtsai azt találták, hogy a nem mutáns E. coli 294 törzsben a DNS

IPTG-vel való indukcióját követően a feldolgozott interleukín-4 mintegy 30-50%-a szekretálódott a táptalajba.

Ezzel szemben a jelen találmány szerinti mutáns törzsek lényegében az összes feldolgozott interleukin-4-et kiválasztották a táptalajba. Ezenfelül a Lundell et al. féle táptalajból izolált szekretált interleukin-4 további analízise kimutatta, hogy fizikokémiai és biológiai tulajdonságai különböznek a jelen találmány eljárásaival előállított limfokinéitól.

Először: az E. coli 294 törzsből kapott interleukin—4 aktivitása sokkal alacsonyabb volt, mint amit a találmány szerinti egyik szekretáló törzs körülbelül azonos számú sejtjéből kaptunk. Másodszor: a Lundell et al. rendszerben termelt interleukin-4-et nem ismerte fel egy nagy aktivitású interleukin-4-re specifikus monoklonális antitest (lásd alább a 11B4 antitest alkalmazását). Harmadszor: a Lundell et al. rendszer táptalajából kapott interleukin-4 nem kötődött azokhoz a kromatografáló oszlopokhoz, amelyek a jelen találmány szerinti mutáns E. coli törzsek által kiválasztott interleukin-4-et visszatartották. A nem mutáns baktériumok által kiválasztott interleukin-4 alacsonyabb aktivitása és eltérő fizikai tulajdonságai arra engednek következtetni, hogy ennek a proteinnek a konformációja más, és aktivitása kisebb.

Az alábbi példában a szilárd anyagok keverékében lévő szilárd anyagok, a folyadékokban lévő folyékony anyagok és a folyadékokban lévő szilárd anyagok százalékát tömeg/tömeg, térfogat/térfogat és tömeg/térfogat bázison adjuk meg, ha másként nem jelezzük. A sejtek tenyésztését steril körülmények között végezzük. Az O.D. hullámhosszakat nanométerben adjuk meg.

1. példa

Humán interleukin-4 elleni antitestek előállítása

Hím Lewis-patkányt immunizálunk 1 ml komplett Freund-adjuvánsban (CFA = complete Freund’s adjuvant) emulgeált 1 ml humán interleukin-4 oldattal, intraperitoneális (i.p.) oltással. Az oldat COS-sejtekben kifejeződött glükozilezett rekombináns humán interleukín-4-et tartalmazott, melynek specifikus aktivitása 210⁷ egység/mg, koncentrációja 14 pg/μΙ volt, oldószere 10 mM tris-HCl, 0,5 M NaCl; pH = 7,4.

Az első immunizáló oltás után két héttel a patkányt i.p. újraoltjuk 1 ml CFA-val emulgeált humán interleukin-4 oldattal. A második injekció után 3 hónappal a patkányt intravénásán újraoltjuk (emlékeztető oltás) 15 μg proteint tartalmazó 1 ml humán interleukin-4 oldattal. Az emlékeztető oltás után négy nappal a patkányt leöljük, vérét összegyűjtjük és lépét fúzió céljára kivesszük.

A lépsejteket egér P3X63-Ag8.653 mielomasejtekkel (ATCC CRL 1580) 1:1 arányban fuzionáljuk PEG használatával. A HAT táptalajban készített sejtszuszpenziót (3,5-10⁵ sejt/ml) 40 darab 96 tartályos lemezre osztjuk szét. Tíz nap múlva a hibridóma felülúszókat arra vizsgáljuk, hogy képesek-e kötődni a mikrotitráló lemezekre közvetlenül immobilizált humán interleukin-4-hez (indi8

HU 214 828 Β rekt ELISA) vagy egy nyúl anti-humán interleukin—4 immobilizált poliklonális IgG frakcióhoz kötött humán interleukin-4-hez. A kötött antitestet peroxidázzal konjugált kecske anti-patkány immunglobulinnal mutatjuk ki, standard eljárás szerint. A hibridomák által kiválasztott interleukin-4-gyel reagáló antitesteket határhígításos módszerrel klónozzuk. Ezzel az eljárással szelektáltuk az 1C1.11B4.6 hibridomát. Az 1C1.11B4.6 eredetű antitest (jele: 11B4 antitest) izotípusa IgG2a és a bilógiailag aktív humán interleukin—4-re specifikus.

Specificitását úgy állapítottuk meg, hogy a 11B4 monoklonális antitestet az immunizálásnál használt interleukin-4-gyel reagáltattuk és egy olyan interleukin-4-gyel, amelyet a Lemmli [Natúré, 227, 680 (1970)] által leírt denaturáló SDS-poliakrilamid gélben elektroforetizáltunk. Az antitest csak az előbbi interleukin—4-et ismerte fel, és a limfokin előkezelése kis mennyiségű, azaz 0,04% SDS-sel szobahőmérsékleten 5 percig, elégséges volt ahhoz, hogy az antitest már ne ismerje fel.

A hibridomát -70 °C-on, 10% DMSO (dimetilszulfoxid) tartalmú tápoldatban tároljuk, és tenyésztését standard emlős sejt tenyésztő technikákkal végezzük (RPMI 1640 tápoldat 10% fetális marhaszérummal, mM glutaminnal és 50 mM 2-merkapto-etanollal kiegészítve).

Az SDS-denaturált rekombináns humán interleukin—4 elleni polivalens antiszérumot úgy állítjuk elő, hogy a limfokin egy mintáját SDS-poliakrilamid gélben elektroforetizáljuk - mint fent leírtuk -, a sávot a gélből kivágjuk, és az izolált proteinnel nyulat immunizálunk standard technikákkal. Az interleukin-4-et E. coli expressziós rendszerben állítjuk elő Kimmenade és mtsai [Eur. J. Biochem., 173, 109 (1988)] szerint.

A pRGT857-l 1 plazmid szerkesztése:

A pAH3 és pKTG269-2 humán IL^I expressziós plazmid és a pUC19 plazmid (2. ábra) szerkesztését Lundell és mtsai és Yanisch-Perron és mtsai [Gene, 33, 103 (1985)] írták le.

A plazmid DNS kis mennyiségeit telített egyéjszakás tenyészetekből izoláljuk Maniatis és mtsai (lásd fent: 368. oldal) eljárása szerint. Ez az eljárás kis mennyiségű DNS baktériumtenyészetekből való előállítását teszi lehetővé analízis céljára. Nagyobb mennyiségű plazmid DNS-t a Maniatis és mtsai (lásd fent: 90. oldal) által leírtak szerint állítunk elő. A pecifikus restrikciós enzimes fragmentumokat, amelyek a plazmid DNS hasítása révén keletkeznek, 0,8%-os agarózban végzett preparatív elektroforézissel izoláljuk. A futtatást 150 V mellett 4 órán át, trisz-borát pufferben (Maniatis et al., lásd fent: 156. oldal) végezzük, majd etidium-bromiddal festjük a géleket a DNS láthatóvá tételére. A megfelelő géldarabokat kivágjuk, és 150 V mellett 60 percen át elektroeluáljuk. A DNS-t ezután térfogat etanollal való kicsapással koncentráljuk.

A restrikciós enzimek, DNS-polimeráz I (Klenowfragment) és T4 DNS-ligáz a New England Biolabs (Beverly, MA., USA) termékei. Az enzimek használatával kapcsolatos módszereket és feltételeket lényegében az előállítóktól vettük át.

A t4 DNS-ligálást legalább 24 órán át 4 °C-on végezzük. Az egyszáíú DNS-végek tompa végekké alakítását Klenow-fragment segítségével végezzük a következő összetételű pufferben: 10 mM tris-HCl (pH = 7,5), 2,5 mM dGTP, dCTP és dTTP és 10 mM magnéziumklorid.

Az SDS-poliakrilamid gél elektroforézist lényegében a Laemmli- (lásd fentebb) féle módszerrel végezzük. Tizenöt százalékos SepragelM (Integrated Separation System; Hyde Park, MA., USA) használunk, és a teljes lizátum-proteint Coomassie Brilliant Blue R-250 festéssel (BioRad Laboratories) tesszük láthatóvá. Az interleukin-4-et immunkémiai módszerrel tesszük láthatóvá, az alább leírt specifikus antitestek használatával, miután az elektroforézissel elválasztott proteineket Hoefer Scientific Model Te 50 Transphor^Relektroforetizáló egység alkalmazásával átvittük nitrocellulóz-membrán lapokra.

Annak érdekében, hogy a példában használt pRGT857-l 1-et megszerkesszük, a pAH3-at Aval-gyel emésztjük. Az enzim hatására keletkezett 5’ túlnyúló részt E. coli polímeráz I Klenow-fragmentje segítségével töltjük be, és a DNS-t Pvul-gyel emésztjük. Az 5,8 kb fragmentumot, mely az interleukin-4 és laá szakaszt hordozza, a pUC19 egy 1,4 kb PvuII-PvuI fragmentumával - mely a pUC replikációs origóját tartalmazza - lígáljuk. Az E. coli 294 transzformálása után egy pUC replikációs origót tartalmazó, ampicillin rezisztens interleukin—4 expressziós plazmidot izoláltunk, melynek jele: pRGT839-2 (2. ábra).

Ezután mind a pRGT839-2, mind a pKGT269-2 plazmidot AatlI-vel és Pvul-gyel eszmétjük. Az IL-4 és laci szakaszokat hordozó pRGT839-2 egy 6,7 kb fragmentumot a kloramfenikol rezisztenciát kódoló pKTG269-2 egy 1 kb fragmentumával ligáljuk. A ligációs keveréket közvetlenül használjuk az E. coli 294 transzformálására. Egy pRGT857-l 1 jelű transzformáit plazmidot izoláltunk.

Szekretáló E. coli törzsek készítése és szelektálása:

TYE-levest [20 g/1 Bactotryptone (Difco), 10 g/1 Bacto Yeast Extráét (Difco) és 5 g/1 NaCl] használunk a baktériumtörzsek rutin tenyésztéséhez, lemezes kísérletekhez és néhány fermentációhoz. A fermentációk nagy részét módosított GC-táptalajban [20 g/1 glicerin, 30 g/1 casamino-acid (Difco), 30 g/1 élesztőkivonat (Difco), 5 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát és 1 g/1 magnéziumszulfát-víz (1/7)] végezzük 30 °C-on, terelőlappal ellátott rázott palackokban. Szükség szerint ampicillint vagy kloramfenikolt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. USA) adunk néha a tápoldathoz 100 gg/ml, illetve 10 μg/ml koncentrációban.

Az alap törzseket -20 °C-on 40%-os glicerinben tároljuk. Az inokulum tenyészetek készítésekor 0,1 ml glicerines szuszpenziót mérünk 10 ml TYE-levest tartalmazó kémcsövekbe. A sejteket egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk, majd a 100 ml TYE-táptalajt tartalmazó 500 ml-es terelőlapos, rázott Erlenmeyer-lombikokba (Bellco, Vineland, NJ., USA) oltjuk A₆₆₀ = 0,2 érték eléréséig. A lombikokat 30 °C-on inkubáljuk 250 ford/perc rázás közben New Brunswick Controlled

HU 214 828 Β environment incubator Shaker berendezésben. Ha elérjük az A₆₆₀ = 1,0 értéket, IPTG-t adagolunk 0,25 mM-ig, és a fermentációt tovább folytatjuk 4 vagy 18 órán át.

A különböző E. coli törzsek transzformálását Maniatis és mtsai (lásd fent: 250. oldal) szerint végezzük.

Egy 294S jelzésű, sztreptomicin rezisztens E. colit kapunk, ha az MM294 törzset a Pl cml clrlOO bakteriofággal [Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] - melyet E. coli ΡΑΜΙ 63 sejteken tenyésztünk [Johnson, Gén. Rés., 30, 273 (1977)] - transzdukció révén mutagenizáljuk. Az E. coli MM294 törzs megkapható az American Type Culture Collection intézménytől (ATCC 33625 letéti szám).

E. coli 294S sejtek besugárzását steril vízben 40 másodpercen át - 25,4 cm (10 inch) távolságból Germicid ultraibolya lámpa alkalmazásával végezzük. Ez a kezelés a sejtek 99,9%-ának a pusztulását okozta, melyet Tryptone: élesztőkivonat: nátrium-klorid (20:10:5) tartalmú TYE-levesre való leoltással határoztuk meg. A mutált sejtszuszpenziót a fenti TYE-levessel 1:5 arányban körülbelül 50 ml-re meghígítottuk, és órán át 37 °C-on sötét helyen, 250 ml-es rázott palackban inkubáltuk.

A módosult külső membránnal rendelkező mutáns sejtek szelektálása céljából az inkubálás után vad típusú T7 bakteriofágot adunk a sejtszuszpenzióhoz 10⁸ plakkképző egység (pfü)/ml koncentrációban. A palackot addig rázzuk 37 °C-on, amíg sejtlízist nem észlelünk (körülbelül 30 perc), majd ezután a T7 rezisztens sejteket centrifugálással 10000 g; 10 perc; 4 °C gyűjtük össze, és az üledéket 1 ml friss levesben reszuszpendáljuk.

A sejteket TYE [Tryptone: élszetőkivonat: nátriumklorid (20:10:5)] agarlemezekre szélesztettük, és 37 °Con inkubáltuk. Huszonnégy óra elteltével minden lemez 30-50 telepet tartalmazott. Ezeket a telepeket tovább vizsgáltuk a külső membrán sérülése szempontjából, s az alábbi módszerrel figyeltük, hogy a ribonukleáz I táptalajba való szivárgása növekszik-e.

A T7 bakteriofág rezisztens klónokból egyedi telepeket kenünk ki friss TYE agarlemezekre, amelyekre ml 1% élesztő RNS-t (Sigma Chemical) tartalmazó TYE agart (pH = 7) rétegezünk. Egy éjszakán át 37 °Con való inkubálás után a lemezeket 1 M sósavval árasztjuk el. Az udvar nagyságát használjuk fel a táptalajba szivárgott ribonukleáz aktivitásának a meghatározásához [Weigand et al., J. Bacteriol., 725, 340 (1976)].

A membrán sérülésének egy másik indikátora az, hogy az E. coli nem képes növekedni McConkeyagaron [Hancock, Ann. Rév. Microbiol., 38, 2.3Ί (1984)]. A körülbelül 30 T7 rezisztens telep közül két olyan telepet izoláltunk, amelyek különösen érzékenynek mutatkoztak McConkey-agarral szemben, és jelentős mennyiségű periplazmatikus ribonukleáz I táptalajba való kiválasztására voltak képesek. Ezeket a telepeket RL7, illetve RZ21 jelzéssel láttuk el.

Az E. coli RL7 és RZ21 sejteket pAH3 plazmiddal (2. ábra) transzformáltuk, s így kaptuk az RZ21/pAH3 és RL7/pAH3 törzset. A pAH3 által termelt szignálpeptid az interleukin-4 transzportját irányítja a belső sejtmembránon keresztül a periplazmába. Mindkét transzformált sejtet módosított GC-táptalajba fermentáltuk. A két transzformált sejt által használt táptalajokat Western biot analízissel szűrtük szivárgás szempontjából humán interleukin-4 elleni nyúl poliklonális antiszérum használatával.

Annak érdekében, hogy egy olyan törzset állítsunk elő, amely nagyobb mennyiségű interleukin-4-et választ ki, az RZ21/pAH3 törzset, úgy mint előbb, ultraibolya besugárzással mutagenizáljuk. A sötét helyen legalább 2 órás tenyésztés után besugárzott sejteket ampicillinnel (100 pg/ml) kiegészített TYE agarlemezekre szélesztjük, és egy éjszakán át inkubáljuk. A telepeket a kétmembrános immunassayvel (poliklonális antiszérumot használva) szűrjük az interleukin-4 kiválasztás növekedése szempontjából, amelyet a szekretáló telepek alatti intenzívebb szín kifejlődése jelez.

A mutagenizált sejteket hígítjuk, és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó TYE agarlemezekre (átmérő: 142 mm) szélesztjük (0,1 ml/lemez). Egy éjszakán át 30 °C-on való inkubálás után a lemezek körülbelül 500-2000 1 mm átmérőjű telepet tartalmaznak. A lemezeket ezután 137 mm-es, 0,45 μ pórusnagyságú nitrocellulóz korongokkal (Schleicher és Schüll) fedjük. A korongot óvatosan helyezzük fel az egyik szélétől elkezve, hogy biztosítsuk a fokozatos és egyenletes átnedvesedését. A korongot egy mozdulattal rögtön lehámozzuk a lemezről úgy, hogy a telepek egy részét az agarlemezről a nitrocellulóz korongra emeljük. A korongot egy másik nitrocellulóz korongra helyezzük, amelyet előzőleg egy steril agarlemezre helyeztünk. A korongokat ezután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk.

Inkubálás után az alsó korongot elválasztjuk a telepeket hordozó korongtól. A szűrőket ezután 10 mM trisz (pH = 8), 150 mM nátrium-klorid és 0,05% (térf/térf) Tween 20 (polioxietilén-szorbitán-monolaureát); BioRad, enzim-immunassay tisztaságú (TBST), valamint 1% BSA (bovin szérum albumin) tartalmú oldatban inkubáljuk szobahőmérsékleten 60 percig. A szűrőket ezután az első antitesttel inkubáljuk - szobahőmérséklet, 30 perc -, ami vagy nyúl poliklonális antiszérum (1:1500 hígítás TBST/BSA-val; össz-interleukin—4 meghatározásához), vagy monoklonális antiszérum (11B4 antitest) (hibridóma tenyészet felülúszója 1:10 arányban hígítva TBST/BSA-val; a natív konformációjú interleukin-4 meghatározásához) lehet.

A szűrőket háromszor mossuk TBST-vel, majd alkalikus foszfatázzal konjugált második antitesttel inkubáljuk 30 percig, mely specifikus az első antitestre. A szűrőket háromszor mossuk TBST-ben, ezután megfestjük egy alkalikus foszfatáz szubsztrátummal (ProtoBlot System; Promega Biotec.). A látható helyeket - megjelenésük után - az eredeti lemezekhez illesztjük, és azokat a telepeket választjuk ki, amelyek erősebb interleukin-4 specifikus festődést mutatnak.

A kiválasztott telepeket plazmidmentessé tesszük. A telepeket folyamatosan átvisszük nem szelektív

HU 214 828 Β (ampicillinhiányos) táptalajra, majd kikenjük nem szelektív TYE-lemezekre. Azokat a telepeket, amelyeknek a növekedése ampicillinlemezeken negatívnak bizonyulnak, a plazmid hiánya szempontjából ellenőrizzük, majd újratranszformáljuk pAH3-mal.

Az RZ21-ből származó, pAH3-at magukban foglaló kiónokat 100 pg/ml ampicillintartalmú TYE-táptalajban tenyésztjük. Ezeket a kiónokat a megnövekedett limfokinelválasztás szempontjából szűrjük olyan módon, hogy a 10 ml-es kémcsövekben kapott teljes fermentleveket dót immunoblotting segítségével vizsgáljuk. A telepeket úgy értékeljük ki, mint fent, a 11B4 humán interleukin-4 elleni monoklonális antitest és alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-patkány IgG használatával. Az RZ21 további mutagenizálásával előállított egyik törzs, melyet mint megnövekedett termelőképességű törzset szelektáltunk, RS631 elnevezést kapott.

A nem mutáns és az egyszer és kétszer mutagenizált E. coli humán interleukin-4 termelésének összehasonlítása.

A találmány szerinti törzsek fokozott szekréciós képességének és az ismételt mutagenezisek és szelekciós hatásának bemutatására a 294S nem mutáns törzset és a pAH3 plazmidot tartalmazó egyszer (RZ21 törzs) és kétszer (RS631 törzs) mutagenizált E. coli sejteket a fent leírtak szerint 20:10:5 TYE-táptalajban fermentáltuk. Az expressziót 1 ml IPTG-vel indukáltuk. Az indukció után 6 órával meghatároztuk a kiválasztott interleukin-4 mennyiségét olyan módon, hogy a különböző transzformált sejtek 10-szeres sejtkoncentrációját 2 mM EDTA-tartalmú 20:1:5 TYE-táptalajban inkubáltuk 1 órán át 37 °C-on. A táptalajban lévő interleukin-4-et Yokota és mtsai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894 (1986)] módszerével vizsgáltuk, s az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Interleukin-4-termelés

E. coli törzs	Bioaktivitás* (egység/ml)
294S/pAH3	2,005
RZ21/pAH3	21,798
RS631/pAH3	97,010

* Az aktivitásértékeket O.D._6S0 = 30,0 értékre korrigáljuk, hogy azonos mennyiségű sejtek szekrécióját hasonlítsuk össze. Az alkalmazott vizsgálatban 1 mikrogramm tiszta humán interleukin-4 körülbelül 20 000 egységaktivitásnak felel meg.

Az 1. táblázat adatai mutatják, hogy az egyszer mutagenizált szekretáló RZ21 törzs több mint tízszeres mennyiségű interleukin-4-et termel a táptalajba, mint a nem mutáns 294S törzs. A kétszer mutagenizált RS631 törzs majdnem ötször aktívabb a táptalajban, mint az RZ21 törzs.

Letétbe helyezett tenyészetek:

A mutáns RZ21, RS631 és RL7 E. coli törzseket a következő letéti számokon helyeztük letétbe az American Type Culture Collection intézményben (ATCC): ATCC 53951, 53953, illetve 53954. A pAH3 és pKTG269-2 plazmidokat tartalmazó 294S E. coli törzset szintén az ATCC intézményben helyeztük letétbe, ATCC 68136, illetve 68137 letéti számokon. A 11B4 monoklonális antitestet termelő IC1.11B4.6 hibridomát szintén az ATCC-nél helyeztük letétbe ATCC HB 9809 letéti szám alatt. Ezeket a letéteket a szabadalmi eljárások céljára letétbe helyezett mikroorganizmusok nemzetközi elismerésével foglalkozó Budapesti Egyezmény rendelkezései szerint hajtottuk végre.

Az ezen szakterületen gyakorlott szakemberek számára magától értetődik, hogy a találmányt sokféleképpen módosíthatják és változtathatják anélkül, hogy szellemétől és tartalmától eltérnének. Az itt leírt megvalósítási formák csak mint példák foghatók fel, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. A találmányt csak a csatolt szabadalmi igénypontok korlátozzák.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás táptalajba kiválasztott, biológiailag aktív heterológ protein előállítására E. coli-ban, azzal jellemezve, hogy (i) egy T7 bakteriofággal szemben rezisztens és periplazmatikus proteineket a táptalajba kiválasztani képes mutáns E. coli baktériumot, amely egy periplazmatikus transzportot közvetítő szignálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát és egy ehhez funkcionálisan kapcsolódó, a kívánt biológiailag aktív heterológ proteint kódoló másik DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns expressziós vektort tartalmaz, megfelelő körülmények között tenyésztünk, és (ii) a kiválasztott proteint a táptalajból izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első DNS-szekvencia egy ompA szignálpeptidet kódol.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második DNS-szekvencia a humán interleukin—4-et kódolja.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mindkét DNS-szekvencia kifejeződését egy indukálható promoter irányítja.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az indukálható promoter egy lac promoter.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktérium az RZ21, az RS631 vagy az RL7 törzs.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns vektor a pRGT857-l 1 plazmid.
8. Eljárás biológiailag aktív heterológ protein táptalajba kiválasztására képes E. coli baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) E. coli baktériumokat megfelelő mennyiségű mutagén anyaggal kezeljük;

(ii) az (i) lépésben kapott mutáns sejtek közül szelektáljuk a T7 bakteriofág fertőzéssel szemben rezisztens és a proteinek jelentős mennyiségét a táptalajba kiválasztani képes kiónokat;

HU 214 828 Β (iii) az (ii) lépésben szelektált kiónt vagy kiónokat olyan rekombináns expressziós vektorral transzformáljuk, amely egy protein periplazmatikus térbe való transzportját közvetíteni képes szignálpeptidet kódoló első DNS-szekvenciát tartalmaz, amely funkcionálisan kapcsolódik egy, a kívánt heterológ proteint kódoló második DNS-szekvenciához; és (iv) a transzformált kiónok közül kiválasztjuk a táptalajba jelentős mennyiségű heterológ proteint szekretáló kiónokat.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált kiónok kiválasztását az alábbi lépésekből álló módszerrel végezzük:

(i) egy első nitrocellulóz membránt a transzformált baktériumok diszpergált tenyészetével érintkeztetve a tenyészetben lévő telepek egy részét a membrán egyik oldalára visszük fel;

(ii) az (i) lépés első membránjának másik oldalát érintkeztetjük egy második nitrocellulóz membránnal táptalaj jelenlétében, s így létrehozunk egy membránszereléket;

(iii) a membránszereléket a rávitt baktériumok által kiválasztott biológiailag aktív proteinnek az első membránon keresztül a második membránra való átjutását biztosító körülmények között inkubáljuk;

(iv) a membránokat szétválasztjuk és az (iii) lépés második membránját egy, a proteinre specifikus első antitesttel érintkezésbe hozva specifikus antitest-protein komplexeket hozunk létre;

(v) az (iv) lépés második membránját mosva a kötetlen anyagokat eltávolítjuk;

(vi) a mosott membránt egy, az első antitestre specifikus jelzett második antitesttel érintkeztetjük; és (vii) a jelzett helyeket a tenyészet baktériumtelepeihez illesztve azonosítjuk azokat a baktériumokat, amelyek a protein jelentős részét képesek a táptalajba kiválasztani.
10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az azonosított baktériumtelepeket a tenyészetből izoláljuk.
11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protein a rekombináns humán interleukin-4.
12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutagén hatást ultraibolya besugárzással éljük el.
13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránszerelék egy harmadik nitrocellulóz membránt is tartalmaz a második membrán és a táptalaj között, amelyen a baktériumtelepek által kiválasztott proteint az (iv)-(vi) lépésekben leírtak szerint mutatjuk ki.
14. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első antitest specifikusan kötődik a biológiailag aktív proteinhez, de nem kötődik a protein denaturált formájához.
15. A 8-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még az alábbi kiegészítő lépéseket hajtjuk végre:

(i) a transzformált baktériumokat ismételten megfelelő mennyiségű mutagén anyaggal kezeljük;

(ii) a kezelt baktériumokat megfelelő közegben tenyésztve a rekombináns vektort belőlük eltávolítjuk;

(iii) a baktériumokat ugyanolyan, mutagén hatásnak nem kitett rekombináns vektorral újratranszformáljuk; és (iv) a transzformált kiónok közül kiválasztjuk a táptalajba jelentős mennyiségű heterológ proteint szekretáló kiónokat.