CN107868770B

CN107868770B - 基于c-di-GMP合成相关基因的抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株构建及应用

Info

Publication number: CN107868770B
Application number: CN201710217175.1A
Authority: CN
Inventors: 钱国良
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-04-05
Also published as: CN107868770A

Abstract

本发明公开了c‑di‑GMP合成相关基因在构建抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株中的应用，以及一种抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产工程菌株的构建方法，即敲除原始菌株中10个c‑di‑GMP的合成相关基因，无任何标记基因带入。该工程菌株产生抗真菌和卵菌活性物质HSAF的能力是野生型的3倍，为HSAF的产业化发酵奠定了基础。

Description

基于c-di-GMP合成相关基因的抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株构建及应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株的构建及其应用。

背景技术

溶杆菌属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)，溶杆菌属(Lysobacter)，是一类环境友好、但较难分离的革兰氏阴性细菌。这类细菌以产生结构多样的小分子抗菌(真菌、细菌等)物质而闻名，是一类新型抗菌代谢产物的重要来源，但未完全开发的生防细菌。截止2014年，国际上报道的溶杆菌属细菌已达到34个种，其中产酶溶杆菌(L.enzymogenes)是溶杆菌属的一个典型种，也是目前研究较多的一种重要的生防细菌(Christensen&Cook,1978)。该菌能产生丰富的胞外水解酶和小分子抗菌产物，对农作物重要病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫具有显著的拮抗作用(Palumbo et al.,2003；Qian et al.,2009)。

HSAF(Heat Stable Anti-fungal Factor，热稳定抗真菌因子)是产酶溶杆菌中最近报道的一种结构和作用方式新颖的小分子抗菌物质，它具有热稳定性、广谱抗真菌卵菌活性以及低毒性(>5mg/mL才对人体肝脏细胞有毒性)等特点。HSAF的分子量为513.2959，由一个独特的大环内酰胺体系、一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架组成(Lou et al.,2011)，这一新颖结构不同于目前市场上任何一种杀真菌剂。除结构新颖外，HSAF对病原真菌的作用方式也与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，它主要是通过抑制病菌神经酰胺合成酶活性,改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成(鞘脂是真核细胞膜和细胞分子必不可少的组成成分)，从而影响真菌菌丝的极性生长(Li et al.,2006)。同时，产酶溶杆菌体内合成HSAF的机制也是新颖独特的：HSAF结构中的2条聚酮链是由同一个聚酮合酶(PKS)同时负责合成，然后通过单个非核糖体肽酶(NRPS)将鸟氨酸与这两条聚酮链结合，最终合成HSAF的关键结构--大环内酰胺(Lou et al.,2011)。综上所述，HSAF可以代表一类结构和作用方式新颖、生物合成机制独特，对环境友好的生物杀菌剂或抗菌药物。

然而，HSAF在产酶溶杆菌中产量低(仅为1.8μg/mL)，是将其开发为生物农药或抗菌药物所面临的一个瓶颈问题。除常规的细菌育种和发酵条件优化外，提高HSAF的产量至少还有三种途径：第一，HSAF合成基因基因簇的异源表达；第二，HSAF的人工合成；第三，基因遗传改良。但考虑到HSAF合成基因簇大--29kb(Lou et al.,2011)，难以通过现有的大肠杆菌或芽孢杆菌等表达系统实现其异源表达；且由于HSAF结构的复杂性，也很难通过化学合成的方法得到。因此，通过研究产酶溶杆菌调控HSAF的合成机制，阐明其遗传调控网络，从而对网络中的关键调控因子进行改良(如负调控因子的突变和正调控因子的过量表达等)，是目前实现HSAF产量提升的一个有效手段。

发明内容

本发明目的之一在于提供c-di-GMP合成相关基因在构建抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产工程菌株中的应用。

c-di-GMP是近年来被发现的细菌中的新型第二信使，能够调控细菌的多种生理生化功能。在细菌中，c-di-GMP由鸟苷酸环化酶(diguanylatecyclases，DGC)催化合成，且不同细菌中，DGC个数从几个到几十个不等。发明人发现利用外源质粒在产酶溶杆菌菌株OH11中表达一个合成细胞内信号分子c-di-GMP的基因slr，会导致HSAF产量大幅下降，表明c-di-GMP抑制HSAF的生物合成。

本发明的目的之二在于提供一种抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产工程菌株的构建方法，即连续敲除原始菌株中10个c-di-GMP的合成相关基因。

发明人对产酶溶杆菌全基因组进行扫描，共发现10个c-di-GMP合成酶(鸟苷酸环化酶)的编码基因，分别为：Lys2762、Lys0082、Lys0067、Lys0901、Lys0155、Lys2996、Lys2826、Lys3688、Lys3460、Lys3756；其中：Lys2762序列如SEQ ID No.1所示，Lys0082序列如SEQ ID No.2所示，Lys0067序列如SEQ ID No.3所示，Lys0901序列如SEQ ID No.4所示，Lys0155序列如SEQ ID No.5所示，Lys2996序列如SEQ ID No.6所示，Lys2826序列如SEQ IDNo.7所示，Lys3688序列如SEQ ID No.8所示，Lys3460序列如SEQ ID No.9所示，Lys3756序列如SEQ ID No.10所示。

发明人通过连续敲除原始菌株中合成c-di-GMP的10个相关基因降低了产酶溶杆菌细胞内c-di-GMP的含量，构建了一个无任何外源标记引入的工程菌株，将HSAF的产量提高了3倍，同时有效避免了通过含有外源质粒的工程菌株来降低细胞内c-di-GMP的含量所存在的一系列问题，如：携带的质粒上往往含有抗生素抗性编码基因，导致这类工程菌株在田间应用存在一定的风险，如抗性基因可能会水平转移，也可能会破坏土壤或植物根围的微生物群落组成；在发酵过程中，为了保证工程菌株的稳定遗传，也会在发酵体系中添加相应的抗生素，这些添加的抗生素不仅增加了产业化发酵成本，发酵残渣也会对环境造成污染。

作为一种具体方案，抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株的构建方法，是连续敲除原始菌株OH11中以下10个基因所获得的工程菌株(命名为OH1-CDG10)：Lys2762、Lys0082、Lys0067、Lys0901、Lys0155、Lys2996、Lys2826、Lys3688、Lys3460和Lys3756；其中：Lys2762序列如SEQ ID No.1所示，Lys0082序列如SEQ ID No.2所示，Lys0067序列如SEQID No.3所示，Lys0901序列如SEQ ID No.4所示，Lys0155序列如SEQ ID No.5所示，Lys2996序列如SEQ ID No.6所示，Lys2826序列如SEQ ID No.7所示，Lys3688序列如SEQ ID No.8所示，Lys3460序列如SEQ ID No.9所示，Lys3756序列如SEQ ID No.10所示。本发明按顺序依次敲除原始菌株中上述10个基因后，所获得的工程菌株，HSAF的产量提高了3倍。

本发明采用的基因敲除方法，可以为基因工程领域的任何基因敲除方法，本发明优选采用无标记基因定向敲除技术。

本发明所述的无标记基因定向敲除技术，是指扩增要敲除目的基因的上游片段和下游片段，片段双酶切后用连接酶连接于同样经双酶切的pEX18GM载体上，重组载体扩增后转化入产酶溶杆菌中，涂布于含有庆大霉素(Gm)的LB固体平板上，培养，形成第一次同源重组的转化子，转化子继续培养后，挑取单菌落，同时在LB+庆大霉素平板以及LB平板划线，选择只能够在LB平板上生长的转化子，即发生第二次同源重组的转化子，即目标工程菌株。其中庆大霉素的优选浓度为150μg/mL。

扩增要敲除目的基因上游片段和下游片段所用的引物选自：

扩增基因Lys2762上游片段所用引物为：

2762F1：CCCAAGCTTCTCGGACAACAGGGGAAGAG(SEQ ID No.11)；

2762R1：GGGGTACCGCCGACCCAGACGAAACCGT(SEQ ID No.12)；

扩增基因Lys2762下游片段所用引物为：

2762F2：GGGGTACCTCAAGCAATGGCAGCCGCCG(SEQ ID No.13)；

2762R2：GCTCTAGAGCCCTGCCGTTCGTAGTAGC(SEQ ID No.14)；

扩增基因Lys0082上游片段所用引物为：

0082F1：CCCAAGCTTGCGGCTACTTCTGGCGGGTG(SEQ ID No.15)；

0082R1：CGGAATTCTAGCCCCAGTGCGAGAGGTG(SEQ ID No.16)；

扩增基因Lys0082下游片段所用引物为：

0082F2：CGGAATTCCGGTTGGGGGAGGTTTGAGC(SEQ ID No.17)；

0082R2：GCTCTAGAGGCTGGGGGGTGTTGAGAGG(SEQ ID No.18)；

扩增基因Lys0067上游片段所用引物为：

0067F1：CCCAAGCTTTGGGCGATGTTGGCGTAGGT(SEQ ID No.19)；

0067R1：GGGGTACCACCCACTCGGCGCTGTTGGC(SEQ ID No.20)；

扩增基因Lys0067下游片段所用引物为：

0067F2：GGGGTACCGCCGCCGACGCCTGAAACCG(SEQ ID No.21)；

0067R2：GCTCTAGAAAAACCTCGTCGCCGTGCCG(SEQ ID No.22)；

扩增基因Lys0901上游片段所用引物为：

0901F1：CCCAAGCTTCCTTCATCCTGCCGACCAGT(SEQ ID No.23)；

0901R1：GGGGTACCATGTCGTCGTAGGCGCTCTC(SEQ ID No.24)；

扩增基因Lys0901下游片段所用引物为：

0901F2：GGGGTACCCGCCTGGTTGCCGACGAGGG(SEQ ID No.25)；

0901R2：GCTCTAGACGGCAGCGGGAAACTCAGGC(SEQ ID No.26)；

扩增基因Lys0155上游片段所用引物为：

0155F1：CCCAAGCTTCGCAGCAGATGGGCAGCTAT(SEQ ID No.27)；

0155R1：GGGGTACCGCGGCGACTTCATTCCACCT(SEQ ID No.28)；

扩增基因Lys0155下游片段所用引物为：

0155F2：GGGGTACCCGCAGTTGCCTTGAGTCGAG(SEQ ID No.29)；

0155R2：GCTCTAGAGCTGTTGTTCGTCTCCACCC(SEQ ID No.30)；

扩增基因Lys2996上游片段所用引物为：

2996F1：CCCAAGCTTCTTCATCGCCACCACCATCG(SEQ ID No.31)；

2996R1：GGGGTACCGTTTCCTTGACGCTGCCGCC(SEQ ID No.32)；

扩增基因Lys2996下游片段所用引物为：

2996F2：GGGGTACCACCTGTCGCGGCTGCTGCGC(SEQ ID No.33)；

2996R2：GCTCTAGAGGCGGCAGCGTCAAGGAAAC(SEQ ID No.34)；

扩增基因Lys2826上游片段所用引物为：

2826F1：CCCAAGCTTAAGGCGGTCGGCGTGGTGAT(SEQ ID No.35)；

2826R1：GGGGTACCCACCGCCATCACCAGCAAGC(SEQ ID No.36)；

扩增基因Lys2826下游片段所用引物为：

2826F2：GGGGTACCGCTTCTGATACGGCTCCTGC(SEQ ID No.37)；

2826R2：GCTCTAGAGATGGCGGCGAACTGGCGAT(SEQ ID No.38)；

扩增基因Lys3688上游片段所用引物为：

3688F1：CCCAAGCTTATCAGGTTGTAGCGGCAGCG(SEQ ID No.39)；

3688R1：GGGGTACCCGGGAGTCGGAGGTTTTTGC(SEQ ID No.40)；

扩增基因Lys3688下游片段所用引物为：

3688F2：GGGGTACCGAGTGGTGCTGGCCGAGACG(SEQ ID No.41)；

3688R2：GCTCTAGACTACGAGCAGGCCGACGAAC(SEQ ID No.42)；

扩增基因Lys3460上游片段所用引物为：

3460F1：CCCAAGCTTTCCAGCAGCAGCGACACGAT(SEQ ID No.43)；

3460R1：GGGGTACCTCTCGGTCTGCGTCTCGATG(SEQ ID No.44)；

扩增基因Lys3460下游片段所用引物为：

3460F2：GGGGTACCGAAAGCGGACCAGGCGATGT(SEQ ID No.45)；

3460R2：GCTCTAGACGAAAGGCGAGAGCGGCATC(SEQ ID No.46)；

扩增基因Lys3756上游片段所用引物为：

3756F1：CCCAAGCTTCGCCGCCCCCTGTCGTTTTT(SEQ ID No.47)；

3756R1：GGGGTACCTCGTCGCCACCGCCCACAAC(SEQ ID No.48)；

扩增基因Lys3756下游片段所用引物为：

3756F2：GGGGTACCAGCGAGAGCGAACACGAGGT(SEQ ID No.49)；

3756R2：GCTCTAGACCAGGCAGCGGTAGACGAAT(SEQ ID No.50)。

本发明目的之三在于提供上述方法所构建的HSAF高产工程菌株OH11-CDG10，经鉴定为产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，该菌株目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏日期为2017年03月06日，保藏编号为CGMCCNO.13722。菌株OH11-CDG10分类地位与野生型菌株OH11一致，即为产酶溶杆菌。OH11-CDG10除了基因组中缺失10个c-di-GMP合成相关基因，其他生物学特性与野生型菌株OH11相一致。

本发明目的之四在于提供所构建的工程菌株在合成HSAF中的应用。

本发明还提供了菌株OH11-CDG10在合成HSAF中的应用。

本发明提供的工程菌株可显著提高HSAF产量，并且无外源抗性基因引入，确保了其作为产业化发酵菌株的高效性、稳定性及环保性，为进一步实现HSAF产业化发酵和田间应用奠定了坚实的基础。

附图说明

图1产酶溶杆菌OH11中10个c-di-GMP合成酶示意图；

图2基因定向缺失策略示意图；

图3基因敲除载体的双酶切验证图；

图4突变体缺失顺序及电泳验证图；

图5突变体HSAF产量检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。

以下实施例中所用的大肠杆菌菌株DH5α购置大连宝生物公司(TaKaRa)。产酶溶杆菌OH11由发明人分离并保存(专利申请号为：200710190998.6，菌株保藏号为CGMCCNo.1978)。载体pEX18GM由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠，也可以购买获得。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基(可以购买获得)，培养温度为37℃，液体培养的转速为225rpm/min。产酶溶杆菌的培养使用LB培养基，培养温度为28℃，液体培养的转速为225rpm/min。抗生素庆大霉素(Gm)、卡那霉素(Km)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、蔗糖均购置南京助研生物公司，引物合成由苏州金唯智公司完成。

经过对产酶溶杆菌菌株OH11全基因组进行扫描，共得到10个鸟苷酸环化酶基因，如图1所示。本发明实施例基因敲除的方法可以为基因工程中的常用方法，本实施例选用的为无标记基因定向敲除技术，其原理如图2所示。

实施例1 敲除载体的构建

1)基因Lys0082敲除载体的构建

以OH11菌株的基因组DNA为模板，利用引物0082F1：CCCAAGCTTGCGGCTACTTCTGGCGGGTG(下划线为酶切位点HindIII)和0082R1：CGGAATTCTAGCCCCAGTGCGAGAGGTG(EcoRI)PCR扩增目的基因Lys0082的上游片段583bp(附表1)；利用引物0082F2：CGGAATTCCGGTTGGGGGAGGTTTGAGC(EcoRI)和0082R2：GCTCTAGAGGCTGGGGGGTGTTGAGAGG(XbaI)PCR扩增目的基因Lys0082的下游片段485bp(附表1)。片段经HindIII和XbaI双酶切后，用T4连接酶连接于经HindIII和XbaI双酶切的pEX18GM载体上，连接产物经热激转化入大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有Gm 25μg/mL和X-gal 100μg/mL的LB固体平板上，37℃培养24小时后挑选白色转化子，以引物0082F1和0082R2进行PCR验证，正确的转化子能够得到1068bp的条带。

2)其余9个目的基因均按照此方法构建敲除载体。所需引物序列及相关信息见表1。

表1 产酶溶杆菌OH11中10个c-di-GMP合成酶编码基因上下游片段的扩增信息

实施例2 实施例1构建的敲除载体的双酶切验证

对实施例1中验证正确的转化子，扩增培养后提取质粒，质粒提取用Omega公司的细菌质粒提取试剂盒完成。以0082-pEX18载体为例，用HindIII和XbaI同时对该质粒进行双酶切，凝胶电泳检测时得到两个条带，一个是大小约为5800bp的pEX18GM，另一条带大小为Lys0082的上下游片段之和，1068bp。其余9个敲除载体也用双酶切的方法进行了进一步的验证。结果如图3所示。

实施例3 工程菌株的构建

1)产酶溶杆菌电转化感受态的制备

挑取产酶溶杆菌OH11单菌落于20mL LB液体培养基中28℃过夜培养，以1:50的比例转接于新鲜的50mL LB液体培养基中继续培养至OD₆₀₀＝1.0；6000rpm，4℃离心，收集菌体；用预冷的灭菌的10％甘油溶液悬浮菌体，冰上放置20min；6000rpm，4℃离心，收集菌体；重复上一步骤2次；用2mL 10％甘油溶液悬浮菌体并分装于2mL灭菌的离心管中，每管100μL,用液氮速冻后保存于-80℃备用。

2)同源重组获得突变体的方法

将双酶切验证正确的重组载体通过电击转化(2.1kv，5.4ms)入产酶溶杆菌电转感受态细胞中，涂布于含有Gm 150μg/mL的LB固体平板上，28℃培养72h，载体上的同源片段和基因组的同源片段发生同源重组后，重组载体将插入基因组中，从而可以在含有Gm的平板上生长，长出的转化子即为发生了一次同源重组的菌株。挑取转化子于800μL液体LB培养基中，28℃振荡培养6h后，涂布于含有10％蔗糖的LB固体平板上，28℃培养72h，理论上长出的单菌落即为发生了第二次同源重组的菌株，发生二次交换的转化子则不再具有Gm抗性。进一步用灭菌牙签挑取单菌落，同时在LB+Gm 150μg/mL平板以及LB平板划线，选择只能够在LB平板上生长的转化子，用目的基因的F1引物和R2进行PCR验证，正确突变体将得到上游片段+下游片段长度的条带，而野生型将得到上游片段+目的基因+下游片段长度的条带。

3)工程菌株的获得

本实施例中产酶溶杆菌OH11中10个鸟苷酸环化酶的敲除是按照随机顺序进行的，敲除顺序详见图4。

第一个敲除的基因是Lys2762，用步骤2)所述方法获得二次交换子，其二次交换子用2762F1和2762R2进行PCR验证，正确突变体得到Lys2762上游片段+下游片段长度的条带，即1080bp，而野生型得到上游片段+目的基因+下游片段长度的条带，即5434bp。成功得到的第一个突变体用罗马数字命名为OH11-CDG1。

以OH11-CDG1为出发菌株，按照步骤1)所述方法做成电转感受态，将另一个构建好的重组载体同样用步骤2)所述方法电转进去，经过两次筛选得到的突变体命名为OH11-CDG2；再以OH11-CDG2为出发菌株，敲除下一个基因，以此类推，最终得到10个鸟苷酸环化酶全部缺失的突变体，命名为OH11-CDG10(图4)。

以产酶溶杆菌OH11野生型为对照，突变体OH11-CDG1至OH11-CDG10在10％TSB(可商业购买)中进行液体培养，培养2天后，用乙酸乙酯萃取培养上清5mL，之后蒸干乙酸乙酯，并用100μL甲醇溶解，然后进行高效液相色谱HPLC定量检测。检测结果如图5所示。突变体OH11-CDG10合成HSAF产量高于野生型，产量约为野生型的3倍。从结果看，无标记HSAF高产菌株构建成功。

本发明把产酶溶杆菌菌株OH11中所有合成c-di-GMP的基因进行定向无标记缺失，构建零c-di-GMP背景、无标记、稳定遗传、HSAF高产菌株。从而做到既提升了抗真菌和卵菌活性物质HSAF的产量，又不会引入抗性编码基因对环境造成威胁，为后期工业发酵奠定基础。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 基于c-di-GMP合成相关基因的抗真菌和卵菌活性物质HSAF高产菌株的构建及其应用

<130> 2017

<160> 50

<170> Patent In version 3.5

<210>1

<211> 4566

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 1

ttgaccgccg tcctgatcgc cctgctgtcg tgcgcggcgg cgtggccgca gcgcgtggcg 60

gcggcgaccc gcgatttcta cttctcgcgc ctgggcagcg agctgggcct gagccagaac 120

tcggtcaccg ccttcgccca ggacgcgcac ggtttcgtct gggtcggcac ccagggcggc 180

ctgcaccgct acgacggcca gcgctacctc gcctaccgcc acgatccgcg cgacccggcc 240

agcctgcccg acagctacgt caccgcgctg gcgctggacg gccagcgcgc gctgtgggtc 300

ggcacgcatt cggagtacct ggcgcggctg gacctggcca gcggcagcat ccaccgctac 360

ggcgcgcccg agtcgcaggc cggacgccag gtggtgtcgc tgctgccgtg gcgcgagcag 420

gtgctgatcg gcaccctcgc cgggctggaa cggctggacc cgcagaccgg tacccgcgag 480

cttttgttgg cgctgcccgg cgaggccacc cgtccggcgc cgtggcaggg cctggccgaa 540

ggccgcgacg gcagcgcctg gttcgccagc gccgccggcc tgcaccgcat ccgcgtcgac 600

ggccgggtcg agcgcgtcgg cgcggcgatc gcgctgcgca gcgtgctgat cgaccaccgc 660

ggcgtgcttt gggccggcgg cggcgacggc ctgtaccggc tcgacggccg caccggcgtg 720

ctggtcaaga tcgaggacga agccctggcc ggcctgcgcg acgcgcgcgc cctgaccgag 780

gcgcccgacc accgcctgtg gatcgccggt ttcggcaccg gcctgtaccg ctacgacccg 840

cagaccggcc acagccagcg cgtccacgcc gagcccggag tcgaggccag cctgccggaa 900

gacaccgtcg atgcgctgat gatcgaccac ggcggcctgc tgtgggccgg cggcgtcttc 960

cgcggcgtgg ccgtggccga tccgcgcggc acccgtttca gctacgtgct cgacctggag 1020

gacgcgcgcc cggaccgcgc cgccgccgac gccagcatcc gcgccctggc ccaggacgac 1080

agcggcgcga tctggatcgg caccgacaac gcccacctgc gccgctacga cctgtccggc 1140

gaccgcttcc aggacatgac ttcgctgctg ccggcgaacg cccgccaggt cgcggcgatc 1200

gcgcgccagc ccgaaaccgg gcccgccgac gcggccgcgg cgaccgccgg cgccgcggcc 1260

aagccggtgc cgccgggccg gctgtggctg gccacctccg gcggcctgct gcggctggac 1320

ccgggcaccg gccggatcga gccggtcgac ctgcgcggct acaaggacgc cgccctgcgc 1380

agcctgcgct tcgcccgcga cggcagcctg tggctgggca gcgaagacat cggcgcgctc 1440

cactacctgc ccgacagcgg cgtgctggtg cgctatgcct accgcgaggg cgaccccaag 1500

ggcctgagcc atccgcgcgt caacgcgatc ctggaagacc gcaacggccg catctggttc 1560

ggcaccggcg acggcctgga cctgctcgat cccaagaccg gctacctgcg ccattaccgc 1620

catgtcaccg accaggccga cagcctgccc ggcaacgtgg tgcgcgcgct gcaccagtcc 1680

gccgacggct cgatctgggt cggcaccccg gccgggctga gccgggtggt ggaattcggc 1740

gacggccgca tccgcttcga acacccgctg gccgaagtgc tcggcgacca tccggtgccg 1800

gtggtgttca ccatcgccga acgccccgac ggccgactgt ggctgggcac cgacaccggc 1860

atcctgcgct tcgacccggg cgcctcgctg gtgcgccgct acggcctggc cgacggcttg 1920

caggacctgg aattcaacgc cggcgcggtc gccgcgctgg ccgacgggcg cctggccttc 1980

ggcggcgtgc gcgggctcaa cctgttcgat ccggcgcgca tcgccgactc gcgctacacc 2040

ccgccggtgc gcctgctcgg cgcctggatc ggctcggaca ccagcgccgg ttccagcgcg 2100

ctgtggcagt cgtccaagct cgaaatcccc gacggcgccg gcatcctgcg cctgcgcatc 2160

ggcgcgctcg acttcggccc caacagcggc atccgctatc gctaccgcat ggacggattc 2220

gaccgcgact ggatcgacaa cggcccgcgc caggacatca cctacacccg cctgccgccg 2280

ggacgctatc tgttccgcgc ccagtcgacc aaccgcgacg gggtctggaa cacccaggaa 2340

ctgaccatcc cggtcggcgt ggatccgccg ctgtggcggc acccgctggc gatcgccgcc 2400

ctggcgctgg ccgcgctcgg cctgctgctg agcttcggct ggcgctggca tcgcgcgcgc 2460

cagcgcgaac gcggctattt cacccagatc cgcgaacgcg aagaacgcct gaaactggcg 2520

ctgtgggcgt ccggcgaaca gttctgggac tacgacctca agcgccgcga actgcaccgc 2580

atgcgcgtgg acgaccacaa cgcgcaatcg cccgagatcg gcgtgcaggc cgacatcgcc 2640

gacgatcacg agatccatcc cgacgacctg ccgcgggtcg ccgaactgct gcgcaagcac 2700

ctcaagggcg acgccgcgct gttcctgtcc gagcaccgca tgcgcacgcc caagggcgac 2760

tggggctggg tgcgggcgcg cggccgggtg gtcgagcgcg acggcgaagg ccatccggtg 2820

cgcgtggcag gcaccggccg cgacgtcacc gcggtgcgca gcgccgaacg cgaacgccgc 2880

atcgccagcg aagtgctgcg ctcgatggcc gaggcggtgg cggtgttcga ccgcgacttc 2940

gtgttcgtct cgatcaaccc cgcgttctcg cgcatgaccg gctatcccga gggcgaggtc 3000

atcggccaga ccaccggcct gctcgacagc cgccagcacg atccggagtt ctactcggac 3060

atgcgcgacg aactgcagcg cagcggccgc tggtcgggcg agatctggca gcagcgcaag 3120

gacggcaacg agttcctgtg ctggctgcag gcgtccatcg tgctcgacag cagcggccag 3180

cgcggccact acgtcgcggt gctgaccgac atcaccgacc agaagcgcgc cgagcaggaa 3240

ctgcgctacc tggccaacta cgacaccctc accagcctgc ccaaccgcac cctgctgtcg 3300

gagcggctgt cgcgggcgat cgtgcgcgcg cgccgccacg gccaccgcat cgccctgctg 3360

ttcctcgacc tggaccggtt caaggacatc aacgattcgc tcggccacgc cgccggcgac 3420

cgcatcctgc gcgcggccgc ggtgcggctg caggaaaccg tcggcgccga acacaccgtg 3480

gcgcggctgg gcggcgacga attcaccgtg gtgctggaaa acctggacac gcccgagcag 3540

gccgaggacg tggcccggcg catcatcaag gcgttcgaat cgccgctgga cttcgacgag 3600

cgccacgacg tggcgatctc gccgtcgatc ggcatcagcg tctatcccga ccacgcccag 3660

gtgccgaccg acctgctcaa gcacgccgac accgcgatgt accaggccaa ggccgccggc 3720

cggcgcacct tcatgcgcta caccgaggcg atggacatcg agatccgcca gcgcgcgacc 3780

atctccgcgg cgctgcgcaa ggtgctcgac cgcaacgaac tgcggctggt gttccagccg 3840

cggctgtcgc tgccggaagc gcgcatcacc ggcgtggaag cgctgctgcg ctggcaaagc 3900

gcggagtacg gcaacatccc gccgacccag ttcatcccgc tggccgagga aagcgggctg 3960

atcctggaga tcggcgagtg ggcgatgcgc gaggcctgca gccgcctgcg ccagtggcgc 4020

cagcacgggc tcgaccagct gtcggtgtcg gtcaacgtct cggcgatcca gctgctgcgc 4080

ggcgacctgc cgaagatggt cgcccgcgcg ctcagcgaaa gcggcatccc gccgtggcgg 4140

ctggagctgg aactgaccga aagcgtggtc atgtccaacg ccgcgcacac ctccaacacc 4200

atgcaggcgc tgcgcgaact cggcgtggcg ctggcggtgg acgacttcgg caccggctat 4260

tcgtcgctcg cgtatctcaa gcgcctgccg atcaacacgc tgaagatcga caaggaattc 4320

atcagcgacc tgacccgcga tcccgacgac gaagccatca ccaccaccgt catcaccatg 4380

gcccactcgc tgggcctgaa cgtggtcgcc gaaggcgtcg aactggaaga gcagatggaa 4440

ttcctgcgcg cgcacggctg cgacgagatc cagggctact ggctggccaa gccgctggaa 4500

gccgacgcct gcctggcctt catcaagcaa tggcagccgc cgcagaacgt gcgcgccgcg 4560

ttctga 4566

<210>2

<211> 1671

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 2

atgaaacccg gcgcgctgtc gatcgcgttg cgcgtcggcg cggcgctggc cgcggccgcg 60

ctgaccgcgc tgctgaccgt cagcggcgcc agctggcggc tcgacgattt cctctacgac 120

ctgcacctct cgcactgggg ctacccgccc gacggcgacg tggtggtggt cgccatcgac 180

gaccgcagcc tcaacgaact cggccaatgg ccgtggccgc gcgacatcca cgcgcagatg 240

ttcgaccgcc tgggctacgc cggcgtgcgc ggcgtcgccc tggacctggt cctggccgaa 300

cccgaccgca acggcgacga acgcgaccgc accctggccg cggcgatgcg ccggctcggc 360

cgcgtcgccc tgccggtggt gaccgcgccg ctgcggcaga acgcgccgcc ggtggaagtg 420

ctgccgacgc cggcgatcgc cgccgccgcc agcacgctcg gccacaccga catcgaactc 480

gacgccgaag gcaccgcgcg cggcctctac ctcaaggccg gcctcggcga cgcgcgctgg 540

ccggcgctgg gcctggcgct gatcggcctg gaccggcggg cgtcggccga aagcgccgcg 600

catggaccgc tgccgggcct gcgccgcccc gtctccgaac ccggctcgcc gtatctgtgg 660

acgcgcgacc attacgtgcg catccgctac gccggcccgc ccgacacctt cagccaggtc 720

tcctacgccg acgtgctcgg cggccaggtg ccggtggaac tgctgcgcga ccgctgggtg 780

gtgatcggcg tgaccgcgac cggcctggcg ccgcgctatc tcacgccgat gtccgacgac 840

gtgcgtatgc acggcgccga gtaccaggcc aacgtgatcg agatgctgct gcaccaccgc 900

gcgatcgtgc cgctggcgcc gctgtggcag gcgctgctgg ccgcggccat gctgctggcg 960

gtggtgctgg cgatgctgca cccgcgcctg cagcgtcccg gcctggtcgc cggcagcgcc 1020

gccttgctgg ccctggccgg cagcgtcgcc ctgctgcgcc tgaccgacct gtggttcccg 1080

cccgccgcga ccttgatgat gatcggcgcg gcgtatctgg cctggctgat cggccacctg 1140

cgccactggc ggcgcgaagc caacctcgac accctgaccc agctcggcaa ccgccgccgc 1200

ttcgaccacg tcctgcagcg cgaactcgcc agcgcccgcc gcacccgcgc gccgctgtcg 1260

ctggcgctga tcgacgtcga ccacttcaag gcctacaacg acgcccacgg ccaccgcgcc 1320

ggcgacaaac tgctgcagaa gatcgccgcc gtgatcgcct cccacgcccg ccgcccgcgc 1380

gacctgcccg cccgcttcgg cggcgacgaa ttcgcggtga tcctgcccga cacccacgtc 1440

gaaggcgccg cccgcgtcgc cgacgccatc ctcgccgacc tgcgcaaact cgacgcccgc 1500

tacggcgcgc gcgaagacca gcgcgtgagc ctgagcgtgg gcttgtacac ctgcgtgccg 1560

gggccgcata cgcatgcgcg cacggtgttc gacggggccg acgccgcgtt gtaccgggcc 1620

aaggagaacg ggcgggatcg gcgggaggtt acgcggttgg gggaggtttg a 1671

<210>3

<211> 1770

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 3

ttggcccagc cctcgccgcc cgcgtccccc accccgccgc cgccgtcgcg gctggtctcg 60

cgctatcgcg cctaccggct gccggcgttc gtgctggcgg cgacgctgct ggccgcggtc 120

ggcgtggcga ccgtggccgg cctgcgcagc ttcgccaaca gcgccgagtg ggtcgagcac 180

tcctatcagg tcatcgccga gatcgaatcg accctggccg cgacccgcac ggtcgaatcc 240

agcgcgcgcg gctaccgcct gaccgaccgc ccctccctgc acgccgaata cctgaccagc 300

attcccgcgg cgctgagcca ttccagcgcg ctgatcgcgc tgacccgcga caacccgcgc 360

cagaaccgcc tcgcccgcga cgtcgagcgg cgggtgcgcc agcgcctggc cgagatcgac 420

cggctgctgg aaatgcacat gcgcgacccg cagcaggccc ggctcagcag ccagaccagc 480

cacggcgccg aacagatgcg cgcgctgacc gccgtcgccg acgccatgcg cgagtacgag 540

cgcgccctgc tcagcgcgcg cgacgcgcgc accgagcgca acgccaccct gctgaccgcg 600

ctggtgatcg gcggcctgct gctggcgctg ggcctgctgg ccctgctgat gctgaacctg 660

tggcaggaga acaagcgcag ccgcgcgctg gaacgcgaga gccggcaggc gctggccgaa 720

ctggaagcct ccgccgccga acgccagcgc ctgaccgagc gccatcgcag cctgagccac 780

tacgccggcc tgctgcagag ctgccagacc ctgcaggaag cgatggacat gaccgcccac 840

gccatcgccg acctgatccc ggaattcggc ggccgctgct acatcctgcg cgcctcgcag 900

aacctggccg agaccgcggc gcgcttcggc cgcgaagcca tcgccagcgc cgacctgctg 960

catcccgacg attgctgggc gctgcgccgc ggccgcatcc accgcagcca ggcccacgac 1020

ggcggcgtgc gctgcgccca cctcgcccgc gccgaggccg gcgccgacag cggcggcgac 1080

ccgcgctgga gcctgtgcgt gccgctgatg gcgcagaaca cctcgctcgg cctgctgtgc 1140

ctgagcggcg agcggccgcc gcgcgaggcc gacctggcgc tgatccagtc catcgccgaa 1200

cagctcagcc tggccgtggt caacctgcaa ctgcgcgaga ccctgcgcgt gcagtcgctg 1260

cgcgacccgc tgaccgggct gttcaaccgc cgctacctgg aagagaacct gcagcgcgaa 1320

ctgctgcgtt gccagcggcg caagctgccg ctgtcggtgc tgatgctcga cgtcgaccac 1380

ttcaagcgct tcaacgacac ccacggccac gccgccggcg acgcgctgct ggcgcgggtc 1440

gggcaattgc tgcaggaact ggtgcgcaac gaggacatcg cctgccgtta cggcggcgag 1500

gaattcaccg tcgtcctgcc cgaggccgac gccgcgacgg cgatgcagcg cgccgagcag 1560

atccgcgcgg cgatcgcggc gaccaccatc gtccatctgc gccagacctt cggcccggcg 1620

acctgctcga tcggcctggc cacgtccgtc ggcgaccgcg aaacgccgca gcagttgctg 1680

caggccgccg atgccgcgct gtaccgggcc aaggccgagg gccgcgaccg ggtcgtcgac 1740

ggcaacaagc ccgcggccgc cgacgcctga 1770

<210>4

<211> 1095

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 4

atggtgcccg atccgccgcc gcccacgccg gccgacgaga ccgcgcggct gctcgcgctg 60

gacgcctacg gcctgctcga cagcgtcgcc gagagcgcct acgacgacat cgtccgcctc 120

gccgcgaccc tgtgcgacac gccgggcgcg gcgctggccc tgctcgaccg cgagcgggtc 180

tggttcaagg cgcgcatcgg cgtggcgccg agcgagctgc cgcgctcgca ttcgatctgt 240

tcggagctga tctggcagtc gcaactgggc cgcttgctga ccatcgacga cgtcgccggc 300

gatccgcgct tcgctccgct cgggctgagc ctggaggacg gccgcgcctt gcgcttctac 360

gccggcgcgc cgctgtggac gcccgacggc catccgctcg gcacggtgtg cgtgctcgac 420

gcggtgccgc ggcaactgcg cccggcccaa gccgagggcc tggcggcgct ggggcggcag 480

acccagcacc tgttcgaact gcgccgctac gcgctggaac agcgccgcct gctgtccgag 540

cgcgaggctt tcgccttgca gatggaacgc gcccaggccg acctggtgcg gcgcaacgag 600

caactgcagc acagcgccag ccacgacgcg ctgaccggcc tgctcaaccg cagcgcgctg 660

gcgcagctgc agggcagccc ggacaccgtg caccggctcg gccgcgcggc ctacacgctg 720

atgctgatcg acgtggatca tttcaagcgg gtcaacgacc gccacggcca cctgctcggc 780

gatcgcgcgc tgcgcgcggt cgccgatgcg gtggccgcct cgatccgcga cgacgatgtc 840

gccatccgct acggcggcga ggaattcctg gtggtgctgc cgggcacgcg cctggccgac 900

gcggccgagg tcggcgagcg catccgccgg cgggtggcgc gttcgtcgct gccgttcgcg 960

ctgaccgtgt cgatcggcat ggccgccggc gagcccggcc gcgacgggcc cgagcaggtg 1020

ttcgaccgcg ccgaccaggc gctgtaccgg gccaaggccg gcggccgcga ccgcctggtt 1080

gccgacgagg gctga 1095

<210>5

<211> 2145

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 5

atgaagtcgc cgcgcggcct gcaggccaag ttcctgtcga tcatgggcct ggccctgctg 60

gtggtggcgg tgctgatcac cttgctgctg ctgcgccagg agcggatcca gagcgcggtg 120

gtcggggtca gccgcgacgc gatgcgcgac agcttcgtcg ccagcctgcg ccgccacggc 180

gagggcgagg tggcccagct cgccggttcg ctgaccaatc cgctgtacta cttcgacctg 240

gacgcgatcg gcgaactcgg ccgcgcggcg atgaccaacc ccggcgtgcg ctacgtcgtg 300

gtctacgaca acgacggcaa catcgtccac gacggcagcg aggcgattcc cagctacggc 360

aagcgcatgg acgatgcgat ggcggcgcgg atcgtcgcct cgcagcgcct gctcgggcag 420

tgggacgaga acaccttcga cgtgtccgcg ccgatcaaga tcggccagca gcgcctgggc 480

ggggtgcgcg tgggctacga cctcaaggcc atgcgcgcct accaggacag cgcgctggac 540

gaactgcgcc agcgcctgga cgcgctcggc cggctgcagt tgctgtgggt ggggctgctg 600

agcctgggcc tgctggcgct gggcgcggcg atgctgtggc tgatccagcg ctggctggtg 660

cggccgatcc gcgagctggc cgaggccgcg cacgcgatcg aggacggccg cttcggccag 720

ttcgacgatt ccgacgcggc ccgccacaac gacgaagtcg gcgacctgat gcgcgccttc 780

agccgcatga gccagtcgct ggcgcgccac gaccgcgaca tccggcgcat ggcctacacc 840

gattcgctga ccgggctggc caaccggctg gcgttccgcg aggcgctgga ccggcgcctg 900

cagcagctcg acggcggccg cggccagctg gcgctgctgt tcgccgacat cgacgacttc 960

aagcgggtca acgacaccct cggccacgac gccggcgacg aggtgctgct gcagtgcgcg 1020

cagcgcatcg ccgccacggt cgagcgggtc ggcggcgacg gcgcgttgct ggcgcgcttc 1080

ggcggcgacg agttcgtcat gctggtgcag ggccgcggcg aggccggccg gcccgacgcc 1140

gcgcgcgaag ccgccacccg cctggccgag gcgctggtgg ccgagctcgg ccagccgatc 1200

gcggtgcacg agcgccaggt gttcctgggc acgtccatcg gcgtgaccct gtatccggaa 1260

gacgccgccg gcgcgacctc gctgatgaag aacggcgaca tcgcgatgta ccaggccaag 1320

gtcgccggca agaactgcta ccgcttctac agccgcgcca tggaccaggc ggtggagcgg 1380

cgggtgcagc tcgaacacgc gctgcgcggc gcctgggacc gcggcgaact gagcctggcc 1440

taccagccgg tgtaccggct cggcgacggc gccatggtcg gcgccgaggc cttgctgcgc 1500

tggaagcatc ccgagcaggg cctgatcgcg ccgtcggtgt tcatcgacgt ggccgagcag 1560

agcgggcaga tcgagaccct gggcccgcag gtgctgcgcg cggcctgcga ggacgcggtg 1620

tcgtggcagc gcgcgcgccc cgacgccgaa ccgctgttcg tctcggtcaa cgtctccccg 1680

cgccagctgc gcaacggcga cctgcccaac gtggtcgccg cctgcctgca ggaaacccgg 1740

ctgccgccgt ggcggctgca cctggagctg accgagaccg cggtgatcgg cgacgaagtc 1800

cacgccagcg ccttgctgtc gcggctgcgc gcgagcgggg tcaaggtctg gctggacgac 1860

ttcggcaccg gcttctccgg cctgagccat ctgcgccggg tgccggtgga cggggtcaag 1920

atcgaccgca gcttcatcgc cgacgtgctg cgcgaccccg acgacctggc cctgaccacg 1980

gccatcatcg ccatggccca ttcgctgggc gtgaccgtgg tggccgaagg cgtggagaag 2040

gaaggccagt acgcggtgct gcgcgagcgc ggctgcgatc tggcgcaggg ctattggctc 2100

ggccatccgg tgccggcggc ggagtttctg gcgcagttgc cttga 2145

<210>6

<211> 1116

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 6

atgcgcagcg tgctgatcgc gctgctggcg cggccggacg aaatcatgct cgagatcggc 60

gccggcggcg aactgctggt ggcgcggctg cgtgcggtgc tggcggcgat gctgctgctg 120

ttgccgttgt tcaacgcgct cggcggcggc agcgtcaagg aaaccctgat cggcctgggc 180

ggggcggtgt tcgtcaacgt gttctcgcag ttgtggctgg cgctggcgcg gcgccagcgc 240

cgctaccgct ggctgccgtt ctgcaccgcc gccttcgacg tcaccgccac caccgcggtg 300

ctggcgatgc tggcggtgca gcacctgccg gccgggctca acagcctgat cgtgtggtgc 360

ggctacctgc tggcgatcct gatgaccgcg ctgcgcagcg acggccgggt gaccctgttc 420

gccggggtgc tggcgttgct gcagtacggg ctgctggtgc tgtgggtgtt cgccgtcgcc 480

ggctcgcccg aagacctgat gtccagcgac tacggcgcgg tcaccgtcgg cagccagacc 540

cagcgcctgc tgttgctggc gatgatgacc ctggcgacct cgatggtggt ctaccgcatg 600

cagcggctga tcgagatgtc cggcaccgac ggcctgaccc ggctgccgaa ccggacctgg 660

ctgacccacc ggattccgcg tttgttcgac gcggtgcgcc gcgacggcgg cagcctgacc 720

ctggcgctga tcgacctgga ccacttcaag cgcatcaacg acgactacgg ccaccgcctc 780

ggcgaccgca gcctgcgcca cctggtggcg gtgctgcgcg agcaggccga gcccagcgaa 840

tggctggtgc ggctgtccgg cggcgagttc ctgctggtga tgcgcaagcc gctgggcacc 900

gcgttcgagg aagtcgacgc gatccgccgc accgtcgccg agcgcccgtt cgagcccggc 960

cgcggcgccg agccgctgtg gctgagcttc agcgccgggc tggtgacctt tccgcaggaa 1020

ggcggcgacc tgtcgcggct gctgcgccgc gccgacctgc gcctgcagcg ggccaagcaa 1080

tccggccgca accgggtggt ggcgcgcgat ctttga 1116

<210>7

<211> 1650

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 7

gtgcagcctg cggtgcagcg cgggctgtat cgccagttcc tgcgcttgct ggtgatggcg 60

gtggtgctgc cgagcctggc gttcggcgcg gcgatggtgt tgagccgcta tcgctcggag 120

ctggcgcaga tcgatgcgca caccgtcgcc agcgccgaca tcctcgccca cgagctcgac 180

cagagcctgg tcgcgttgcg cgccagcctg cacgtgctgg cctcggccgg cgagcgccat 240

cgcctggact ggaaccgcga actggccggg ctgcaacggc gctatccgcc gatcctgacc 300

ctgatcgtca ccgacgcgcg cggccgcgtg gtcggcgcgg cgccggcgtc cgcggtcgcg 360

cgcgcgatcg ggctcgacgt cgccgaccgc gcttacttcc aggtgccggc gcgcagcggc 420

cgcgattatg tctccgacgc gttcgtcggc cgtggcatcg gccgcgatcc gctggtggtg 480

gtgtcggtgc cgcgttatcg cgacggcgcg ttcgagggcg tgatcgaggc ctcgctgagc 540

ccgagccagc tgtacgacga cagcggccac ggcgactacg agaccgtgct gctcgaccgc 600

ggcgatcggg tgatccatgc cagcggcggg atggaactgg cgttcatgca gcgcgccgcc 660

gacaccggct tcggcgcggc gctgggcgcg ctcgacagcg cccaggcgcg cggctcgctg 720

ccggtgatgc cgggcggcgc gcgcgccttc gtcgcccgcg cgcgcaccgc cgacggctgg 780

agcctgtatg cggtggcgcc gcgcgagcgc gccgagcgcg gcgcgttcga gcgggcgatg 840

cagatgagcc agttgctgtt gctggcggtg ttcggcgcgg cgctggcgtt cgtgtggtac 900

gcgcgggtgc tggcgcgcgc cgcttcgtcg ctgctgctgc gcctgcgcgc gctggccagc 960

ggcgcggggc ccgagccggg cgcgcacgcc gccgacgcgc cgatgcccga ggaactgcag 1020

ccggtgctcg acgccatcgt cgagctgtcc ggccggctcg aacacgccca tgccgagctg 1080

cgccagagcc tggccgagcg cgaggacgag gtggtgcaac gcaccgcgca gctgcgcgag 1140

gccttgcgcg aactcgaccg ggtggcctgc accgatcctt tgaccggcgc gctcaaccgc 1200

cgcggccgcg acgagttcgt gcgcgcgctg gcggcgcagg gcgcgcgcct gggcagcgtg 1260

gcggtgctgc tgatcgatgt cgatcacttc aaggcctaca acgaccgcta cggccatcga 1320

gccggcgacg aggccttgcg cgcggcggtg gcggcgatcc gcgccgaagt gcgcgaaggc 1380

gccgacgcgg tggtgcgcac cggcggcgag gaattctgcg tgctgatccc cggcgtcggc 1440

cgggcgcggg tgctcaacac cgcccgcgcg atcctgctcg gcatgtatcg ccgcgacatc 1500

gagcatcgcg acagcgaaca cgggcggctg agctgcagca tcggcgtggc gatggcctat 1560

gccgtggacg aattggaagc ggcgatggac cgcgccgacg aagcgctgta ccgggccaag 1620

cggcgcgggc gcaacggcta ttgcttctga 1650

<210>8

<211> 1092

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 8

gtgcaaaaac ctccgactcc cgccaacgaa gcccagcgcc tgcaggcgct gcgcagctac 60

gacatcctcg acaccccgcc ggagcgcgac ttcgacgacc tggtggcgat cgccgcggcg 120

gtgtgcgacg cgccgatcgc gttggtcagc ctgatcgacg agcagcgcca gtggttcaag 180

gcccgtaccg gcctggccgc ggcccagacg ccgcgcgagc tggcgttctg cgcccacgcc 240

atcctgcgtc cggagcagac cctggtggtg cccgacgcgc gcgacgacgc gcgcttcgcc 300

ggcaatccgc tggtgctcga cgatcccaac atccgcttct acgccggcgc gccgctggtg 360

acgccggacg gccacgcgct gggtaccttg tgcgtgatcg ataccaagcc gcgcgacctc 420

gccgacaagc agcaccaggc cttgaccgcg ctgtcgcggc aggcatctcg cgcgatggaa 480

ctgcgccggg tgggccgcgc gctggcgcga caactgcagg agagcgagtg gtacgagcgt 540

cgcttgctgc agtaccagtc cgaactggag gcgagcaacg cggcgctgga ggccagcaac 600

gccgatctgg ccgcgttgac ccgcaccgat ccgctgaccg gcctgcccaa ccggcgtgcg 660

ttcgcgctgg cgctggagca ggcggtggcg cgcagccacg cggccgcgcc gctgcaggtg 720

gcgctgctcg acatcgacca cttcaagacc atcaacgatg tccacggcca tgccgagggc 780

gaccgggtgc tgctcgcggt cgccgacgcg ctgcggttgt acgcggccgg gccgggcagc 840

gtggcgcgtt acggcggcga ggagttcctg ctgctgttcg aggcgccgca gccgcaggcg 900

caactgcaat gcgagttcgt gcgcgaggcg atcgccaatt tgccgctggg cctgccgctg 960

acggtgagca tcggcctggc cgcgtatcgc accggcgagg aacccgccgc gaccttcgcc 1020

cgcgccgacc aggcgctgta cgcggccaag cgcggcggac gcaaccgagt ggtgctggcc 1080

gagacggagt ga 1092

<210>9

<211> 1017

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 9

atgaacatgc aggaaccgaa gctgcaggcg ttctccgagc gcttgttgaa agtcatcgag 60

acgcagaccg agatcgcccg cctgggcttg gacctgggcg gcgtcatggc gttggtggcg 120

catcgcgcgc agggcctcac cggcgcggtc ggcgccgtgg tcgagctggc cgaaggcgag 180

gacatggtct atcgggccgc cgccggcatc gccgaatcca gcctgggcat gcgcctgcgc 240

cgcgccgcca gcctgtcggg ccattgcgtg gccgaagggc ggccgctgaa ttgcgaggac 300

tcggaaaccg acgaccgggt cgaccgcgag gcctgccgcg cggtcggcct gcgctcgatg 360

atcgtggtgc cgctcaagca ccacgacacc gtggtcggcg tgctcaaggt catgtcgcgc 420

gaaccggccg cgttcggcga cgacgacctg cgcgtgctcg acatgatgtc gggcctgatc 480

gccgcggcga tgtaccacgc cgccaagtac gagaccaacg aactgttcta ccaggccacc 540

cacgacgcgc tgaccggcct gcccaaccgc gcgctgttct acgaccggct gcgccacaac 600

ctggcccagg cgcatcgcga atcgcgccgc gtgggcatcc tcaatctcga catggacgga 660

ctcaagccgg tcaacgacaa cctcggccac cgcgccggcg acgccgccat ccgcgagttc 720

gccgagcgca tgaagctcag cgcgcgcgcc ggcgacacgg tggcgcgggt cggcggcgac 780

gagttcgcgg tgatcctgcc gcgcatcgag catcgcgaag gcgccatcgc ccaggtgcag 840

cggctggcgc aggcgctgcg cttcggtttc gaattcgaac gacggccgat cgcgctggac 900

gccagcatcg gttgcgcggt gtatcccgac gacggcgagg acctgggcga actgctggag 960

aaagcggacc aggcgatgta cgacgtcaag cggttgaaga agaacccgcg cgactga 1017

<210>10

<211> 1842

<212> DNA

<213> 产酶溶杆菌

<400> 10

atggccgtgc tcgcgttgtg ggcggtggcg acgatcgcgt cggcgcagtc catcgtcctg 60

cctccggtcg ccgcgatgtc cgcggccgct gcgtcggccg gcgcgggcgt gcccgcgcgc 120

gcgccggcgt ccgaaccgct cgccgccagg ccgctcatgt ccgcggcgct ggccgtcgcc 180

gccgcgccgc cctccgccgc gcaggccgcg cgcgaagcct tcgatcccat cggctaccgc 240

gcgccgtcgc tgagcctgtc gcggctggcc cagggcgacc cggtgccggc gcgggtcctg 300

gccggcgagt tcgacggccg tttcgaggcg gtgtccggca acctggtctg gggcagcaag 360

ggcgagccgc gctggtggcg gatcgtggtc aaccaggacg tggaccccgc gatcgccccg 420

caactcacca tcgaccggcc ctcgcggcgc gagatcgaac tgtggcggcc cggcgacgaa 480

ctgccgctgc ggcgctcgat ctacggcccc gacatcgatc tcaaccactc cacccggatg 540

atcgtgttcc cgctgcccaa ggggctgcgc aagggcgacg cgctgtacct gcgcatgctc 600

gccgcggacg tgctgtcttc gcaggtggag gtcgagccgc tggccaaggt ccagcgcgag 660

gacatgatgc acgtcggcct gcgcagcgtg gtgctgaccg cgatgggcgt ggtcgcggtg 720

ctggcgttcg gtttctggat cggcctgcgc gagcgcggct acgcctacct cgggctcacc 780

ctgatcctgc agatcctgac cttgacctcc gacggcggcg agatgcgggt ggtgccgtgg 840

ctcaaggaca tcgccccgga cacccgcacc aacatcgtgt tgaccacggc cgcggtgctg 900

gcgagcatcc gcttcctgat cttcttcctc ggcctgcgca cgacccagcc gcgcgtgacc 960

cgggcgctgg actggtgcag ctactcgctc ggcgcgctga tcgtggtgag cctgttccgc 1020

acctggaagt acagcgcgct gtacggcaac ctcaacctgc tgctggtgct cgcgctgatc 1080

ctctacgcga ccgtggtggc ggtgtggcgg cgccaacgcg aggcctactt cctgctgctg 1140

gcgtggctgc cgctgatggt gttgctggtg atcctggtcg gcgccaacca cgagtggtgg 1200

ccggagttcg cctggctcga atacaccttc ccggtgggcc tcgcgttcgg cggcctgggc 1260

ctgctgctgg gcctgacctc gaagctgcaa cagctgcgtc gcgaccgcga caccgccaac 1320

cgcctggcca cctacgacag cctgaccgga gcgatgaccc gcgcggcgat ctcgcagagc 1380

ctgcgcagcg cggtggagag tgcgcaccgc tcgcagcggc cgctgtcggt ggtgttcttc 1440

gacatcgacc atttcaagcg catcaacgac gagcacggcc atcgcgtcgg cgacgagacc 1500

ctgcgcatcg tcgccctgcg cacgcgcaac cgcctgcgcg cctacgacct gttcggccgc 1560

tacggcggcg acgaggtgct ggtggtgctg gccgacacct acctgcgcga cgcggcgcgg 1620

gtggccgagc acctgcgcga atcggtcagc ggcagcccgc tgtcgatcga cggccgcctg 1680

ctgccggtca gcctgagcct gggcgtggcc gaactgcagc cgggcgagac gccggagcaa 1740

ctgctcgaac gcgccgacgc ggccttgtac gcgagcaagt ccgccggccg cgaccgggtc 1800

accgcgcacg gcagcgagag cgaacacgag gtggtctctt ga 1842

<210>11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

cccaagcttc tcggacaaca ggggaagag 29

<210>12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

ggggtaccgc cgacccagac gaaaccgt 28

<210>13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400>1 3

ggggtacctc aagcaatggc agccgccg 28

<210>14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

gctctagagc cctgccgttc gtagtagc 28

<210>15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

cccaagcttg cggctacttc tggcgggtg 29

<210>16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

cggaattcta gccccagtgc gagaggtg 28

<210>17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 17

cggaattccg gttgggggag gtttgagc 28

<210>18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 18

gctctagagg ctggggggtg ttgagagg 28

<210>19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 19

cccaagcttt gggcgatgtt ggcgtaggt 29

<210>20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 20

ggggtaccac ccactcggcg ctgttggc 28

<210>21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 21

ggggtaccgc cgccgacgcc tgaaaccg 28

<210>22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 22

gctctagaaa aacctcgtcg ccgtgccg 28

<210>23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 23

cccaagcttc cttcatcctg ccgaccagt 29

<210>24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 24

ggggtaccat gtcgtcgtag gcgctctc 28

<210>25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 25

ggggtacccg cctggttgcc gacgaggg 28

<210>26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 26

gctctagacg gcagcgggaa actcaggc 28

<210>27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 27

cccaagcttc gcagcagatg ggcagctat 29

<210>28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 28

ggggtaccgc ggcgacttca ttccacct 28

<210>29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 29

ggggtacccg cagttgcctt gagtcgag 28

<210>30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 30

gctctagagc tgttgttcgt ctccaccc 28

<210>31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 31

cccaagcttc ttcatcgcca ccaccatcg 29

<210>32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 32

ggggtaccgt ttccttgacg ctgccgcc 28

<210>33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 33

ggggtaccac ctgtcgcggc tgctgcgc 28

<210>34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 34

gctctagagg cggcagcgtc aaggaaac 28

<210>35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 35

cccaagctta aggcggtcgg cgtggtgat 29

<210>36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 36

ggggtaccca ccgccatcac cagcaagc 28

<210>37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 37

ggggtaccgc ttctgatacg gctcctgc 28

<210>38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 38

gctctagaga tggcggcgaa ctggcgat 28

<210>39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 39

cccaagctta tcaggttgta gcggcagcg 29

<210>40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 40

ggggtacccg ggagtcggag gtttttgc 28

<210>41

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 41

ggggtaccga gtggtgctgg ccgagacg 28

<210>42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400>42

gctctagact acgagcaggc cgacgaac 28

<210>43

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 43

cccaagcttt ccagcagcag cgacacgat 29

<210>44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 44

ggggtacctc tcggtctgcg tctcgatg 28

<210>45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 45

ggggtaccga aagcggacca ggcgatgt 28

<210>46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 46

gctctagacg aaaggcgaga gcggcatc 28

<210>47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 47

cccaagcttc gccgccccct gtcgttttt 29

<210>48

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 48

ggggtacctc gtcgccaccg cccacaac 28

<210>49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 49

ggggtaccag cgagagcgaa cacgaggt 28

<210>50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 50

gctctagacc aggcagcggt agacgaat 28

Claims

1.c-di-GMP合成相关基因在构建抗真菌和卵菌活性物质HSAF生产菌株中的应用，其特征在于，所述c-di-GMP合成相关基因为：Lys2762、Lys0082、Lys0067、Lys0901、Lys0155、Lys2996、Lys2826、Lys3688、Lys3460和Lys3756；其中：Lys2762序列如SEQ ID No.1所示，Lys0082序列如SEQ ID No.2所示，Lys0067序列如SEQ ID No.3所示，Lys0901序列如SEQ IDNo.4所示，Lys0155序列如SEQ ID No.5所示，Lys2996序列如SEQ ID No.6所示，Lys2826序列如SEQ ID No.7所示，Lys3688序列如SEQ ID No.8所示，Lys3460序列如SEQ ID No.9所示，Lys3756序列如SEQ ID No.10所示。

2.一种抗真菌和卵菌活性物质HSAF生产菌株的构建方法，其特征在于连续敲除原始菌株中以下基因所获得的工程菌株：Lys2762、Lys0082、Lys0067、Lys0901、Lys0155、Lys2996、Lys2826、Lys3688、Lys3460和Lys3756；其中：Lys2762序列如SEQ ID No.1所示，Lys0082序列如SEQ ID No.2所示，Lys0067序列如SEQ ID No.3所示，Lys0901序列如SEQ ID No.4所示，Lys0155序列如SEQ ID No.5所示，Lys2996序列如SEQ ID No.6所示，Lys2826序列如SEQID No.7所示，Lys3688序列如SEQ ID No.8所示，Lys3460序列如SEQ ID No.9所示，Lys3756序列如SEQ ID No.10所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于具体方法如下：扩增要敲除的目的基因的上游片段和下游片段，片段双酶切后用连接酶连接于载体上，重组载体扩增后转化入产酶溶杆菌中，进行两次同源重组形成目标工程菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于具体方法如下：扩增要敲除的目的基因的上游片段和下游片段，片段双酶切后用连接酶连接于同样经双酶切的pEX18GM载体上，重组载体扩增后转化入产酶溶杆菌中，涂布于含有庆大霉素的LB固体平板上，培养，形成第一次同源重组的转化子，转化子继续培养后，挑取单菌落，同时在LB+庆大霉素平板以及LB平板划线，选择只能够在LB平板上生长的转化子，即发生第二次同源重组的目标工程菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于扩增目的基因上游片段和下游片段所用的引物选自：

扩增基因Lys2762上游片段所用引物为：

2762F1：如SEQ ID No.11所示；2762R1：如SEQ ID No.12所示；

扩增基因Lys2762下游片段所用引物为：

2762F2：如SEQ ID No.13所示；2762R2：如SEQ ID No.14所示；

扩增基因Lys0082上游片段所用引物为：

0082F1：如SEQ ID No.15所示；0082R1：如SEQ ID No.16所示；

扩增基因Lys0082下游片段所用引物为：

0082F2：如SEQ ID No.17所示；0082R2：如SEQ ID No.18所示；

扩增基因Lys0067上游片段所用引物为：

0067F1：如SEQ ID No.19所示；0067R1：如SEQ ID No.20所示；

扩增基因Lys0067下游片段所用引物为：

0067F2：如SEQ ID No.21所示；0067R2：如SEQ ID No.22所示；

扩增基因Lys0901上游片段所用引物为：

0901F1：如SEQ ID No.23所示；0901R1：如SEQ ID No.24所示；

扩增基因Lys0901下游片段所用引物为：

0901F2：如SEQ ID No.25所示；0901R2：如SEQ ID No.26所示；

扩增基因Lys0155上游片段所用引物为：

0155F1：如SEQ ID No.27所示；0155R1：如SEQ ID No.28所示；

扩增基因Lys0155下游片段所用引物为：

0155F2：如SEQ ID No.29所示；0155R2：如SEQ ID No.30所示；

扩增基因Lys2996上游片段所用引物为：

2996F1：如SEQ ID No.31所示；2996R1：如SEQ ID No.32所示；

扩增基因Lys2996下游片段所用引物为：

2996F2：如SEQ ID No.33所示；2996R2：如SEQ ID No.34所示；

扩增基因Lys2826上游片段所用引物为：

2826F1：如SEQ ID No.35所示；2826R1：如SEQ ID No.36所示；

扩增基因Lys2826下游片段所用引物为：

2826F2：如SEQ ID No.37所示；2826R2：如SEQ ID No.38所示；

扩增基因Lys3688上游片段所用引物为：

3688F1：如SEQ ID No.39所示；3688R1：如SEQ ID No.40所示；

扩增基因Lys3688下游片段所用引物为：

3688F2：如SEQ ID No.41所示；3688R2：如SEQ ID No.42所示；

扩增基因Lys3460上游片段所用引物为：

3460F1：如SEQ ID No.43所示；3460R1：如SEQ ID No.44所示；

扩增基因Lys3460下游片段所用引物为：

3460F2：如SEQ ID No.45所示；3460R2：如SEQ ID No.46所示；

扩增基因Lys3756上游片段所用引物为：

3756F1：如SEQ ID No.47所示；3756R1：如SEQ ID No.48所示；

扩增基因Lys3756下游片段所用引物为：

3756F2：如SEQ ID No.49所示；3756R2：如SEQ ID No.50所示。

6.权利要求2-5任一项所述方法构建的工程菌株。

7.一株HSAF生产菌株OH11-CDG10，保藏编号为CGMCC NO.13722。

8.权利要求2-5任一项所述方法构建的工程菌株或权利要求7所述菌株OH11-CDG10在合成HSAF中的应用。