CN113583900A

CN113583900A - 一组基因组合理简约化的伯克氏菌突变株与底盘菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN113583900A
Application number: CN202110820845.5A
Authority: CN
Inventors: 卞小莹; 刘嘉琪; 张友明
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-11-02

Abstract

本发明公开了一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株及其构建方法和其在β‑变形菌纲来源的天然产物的高效异源表达中的应用。其中所述基因组合理简约化的突变株是DT8，DT9和DT10，是连续删除转座酶、前噬菌体、基因组岛等细胞生长非必需基因，并在此基础上继续删除在该菌中本底表达的生物合成基因簇后获得。同时本发明通过在DT8，DT9和DT10基因组上定点插入phiC31attB位点构建了一组基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株DT8‑attB，DT9‑attB和DT10‑attB，并实现了将所述底盘菌株应用于β‑变形菌纲中天然产物如埃博霉素的产量优化及隐秘生物合成基因簇的高效异源表达。有力扩展了革兰阴性菌异源宿主底盘菌，促进了细菌中新型天然产物的挖掘。

Description

一组基因组合理简约化的伯克氏菌突变株与底盘菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一组基因重组的伯克氏菌及其构建与应用，尤其涉及一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株及其构建方法，和其在β-变形菌纲来源的天然产物的高效异源表达中的应用，属于微生物基因工程与生物化学领域。

背景技术

细菌是活性天然产物的重要来源。细菌基因组中含有大量的隐秘或“沉默”天然产物生物合成基因簇，其编码产物代表着生物活性代谢物的大量未勘探资源。受益于大型生物合成基因簇的克隆和组装策略的快速发展，生物合成基因簇的异源表达不仅成为优化目标化合物产量的有效方式，且是从基因组中挖掘隐秘次级代谢产物的优选策略。而对于革兰阴性细菌中的生物合成基因簇，缺乏高效的底盘菌仍然是实现基因簇异源表达的重要限制因素。

革兰阴性菌比如假单胞菌，粘细菌和伯克氏菌中的天然产物，被认为是一种具有生物活性潜力的新兴的、丰富的且尚未开发的化合物来源。充分开发革兰阴性细菌变形菌中丰富的生物合成潜力，需要构建一株具有稳健的生长特性、简便的遗传操作、较低的代谢背景和高产等特性的理想底盘菌株。

β-变形菌纲的细菌DSM 7029近期被重新分类为伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea DSM7029)，已作为异源宿主以相对较高的产量表达粘细菌来源的非核糖体多肽/聚酮类天然产物，如埃博霉素(epothilone)和vioprolide。且这株菌具有关键的生物合成元件4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(4′-phosphopantetheinyl transferase)，并能够产生重要的聚酮延伸单元甲基丙二酰辅酶A(methylmalonyl-CoA)来高效合成聚酮类和非核糖体多肽类天然产物，因此具有成为β-变形菌纲来源的天然产物的异源宿主的巨大潜力，且前期已在该菌中建立了基于自身重组酶表达载体的高效遗传操作系统。但在之前的研究中，伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029在发酵的早期即会出现明显的细胞自溶现象，显著影响了生物量并限制了目标化合物的异源表达产量。在培养基中添加大量蔗糖能够在一定程度上延缓细胞死亡并延长发酵周期，但是对于该菌中细胞自溶的机制与相关调节因子还没有得到研究。经检索，有关利用伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的高效遗传操作系统，结合Cre/loxP位点特异性重组系统与SacB反向筛选系统对该菌进行合理基因组简约化，删除一些细胞生长假定调节基因和/或导致细胞裂解的自溶相关调控基因以延缓细胞自溶并提高生物量，以将伯克氏菌DSM7029优化为一株β-变形菌纲来源的生物合成基因簇高效异源表达宿主的文献还未见报道。

发明内容

针对现有革兰阴性菌中异源表达宿主的缺乏，本发明的目的是对伯克氏菌DSM7029基因组进行简约化，构建一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株，和该底盘菌株在β-变形菌纲来源的天然产物产量优化方面与在β-变形菌纲来源的隐秘基因簇高效异源表达方面的应用。

本发明所述的一组基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029突变株，其特征在于：所述突变株是以野生型伯克氏菌DSM 7029为出发菌，删除其基因组Tn1区域、Tn2区域、Tn34区域、Tn5-GI3区域、Tn6-GI1区域、Prophage 1区域、Prophage2-GI7区域和生物合成基因簇5制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5突变株，命名为DT8，该突变株删除了4.7％的基因组非必需区域；其中所述Tn1区域为46,274bp，是GenBank：CP011371.1，399,555-445,828bp；所述Tn2区域为30,979bp，是GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp；所述Tn34区域为64,539bp，是GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp；所述Tn5-GI3区域为27,328bp，是GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp；所述Tn6-GI1区域为36,134bp，是GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp；所述Prophage 1区域为24,197bp，是GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp；所述Prophage2-GI7区域为59,887bp，是GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp；所述生物合成基因簇5为BGC5，17.308bp，是GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp；或是以DT8基因组简约化突变株为出发菌，继续删除其生物合成基因簇6制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔPropha ge2-GI7ΔBGC5ΔBGC6突变株，命名为DT9，该突变株删除了4.8％的基因组非必需区域；其中所述生物合成基因簇6为BGC6，3,373bp，是GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp；或是以DT9基因组简约化突变株为出发菌，继续删除其生物合成基因簇7制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6ΔBGC7突变株，命名为DT10，该突变株删除了4.9％的基因组非必需区域；其中所述生物合成基因簇7为BGC7，7,588bp，是GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp。

上述删除区域在基因组上的位点如表1和图1所示。

表1.基因组删除区域的详细信息以及构建的基因组简化突变株

本发明所述基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029突变株的构建方法，包括基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶的遗传操作系统，还包括结合多组学分析对伯克氏菌DSM 7029基因组上非必需基因的确定、Cre/loxP位点特异性重组系统以及SacB反向筛选系统的基因组简约化方法的建立，实现DSM 7029基因组上多个非必需区域的无抗性筛选标记连续删除；具体的，本发明所述一组基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029突变株的构建方法是：

1)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT1的构建：

基于已发表在PNAS杂志的伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km(Wang,X.,et al.,Discovery of recombinases enables genomemining of cryptic biosynthetic gene clusters in Burkholderialesspecies.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 2018,115,E4255-E4263.)介导的重组系统，删除伯克氏菌DSM 7029野生型中的Tn1区域，其中所述Tn1区域为46,274bp，是GenBank：CP011371.1，3 99,555-445,828bp；具体的，以发表于Iscience杂志的质粒pR6K-genta-loxM-FleQ(Yin,J.,et al.,Single-Stranded DNA-Binding Protein and Exogenous RecBCD Inhibitors Enhance Phage-Derived Homologous Recombination in Pseudomonas.Iscience 2019,14,1-14.)为模板，利用引物Tn1-del-F，Tn1-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn1，见图2a，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；

利用引物RK2-Apra-1，sacB-Apra-2和sacB-1进行PCR获得Apra-SacB片段，与线性化的pRK2-BAD-Cre-cm质粒获得PRK2-BAD-Cre片段通过线线重组构建核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn1区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含有浓度为5％、7％、10％或15％蔗糖的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，以消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c，经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1突变株，命名为DT1突变株；

2)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT2的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT1突变株出发，删除基因组中的Tn2区域(30,979bp，GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp)。利用引物Tn2-del-F，Tn2-del-R，Tn2-check-F，Tn2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行目的区域Tn2的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用Tn2-check-F，Tn2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn2区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2突变株，命名为DT2突变株。

3)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT3的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，从DT2突变株出发，删除基因组中的Tn34区域(64,539bp，GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp)。利用引物Tn3Tn4-del-F，Tn3Tn4-del-R，Tn3Tn4-check-F，Tn3Tn4-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域Tn34的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用Tn3Tn4-check-F，Tn3Tn4-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn34区域的伯克氏菌DSM7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34突变株，命名为DT3突变株。

4)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT4的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT3突变株出发，删除基因组中的Tn5-GI3区域(27,328bp，GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp)。利用引物Tn5-del-F，Tn5-del-R，Tn5-check-F，Tn5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域Tn5-GI3的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物Tn5-check-F，Tn5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn5-GI3区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3突变株，命名为DT4突变株。

5)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT5的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT4突变株出发，删除基因组中的Tn6-GI1区域(36,134bp，GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp)。利用引物Tn6-del-F，Tn6-del-R，Tn6-check-F，Tn6-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域Tn6-GI1的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物Tn6-check-F和Tn6-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn6-GI1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn 34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1突变株，命名为DT5突变株。

6)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT6的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT5突变株出发，删除基因组中的Prophage1区域(24,197bp，GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp)。利用引物Pro1-del-F，Pro1-del-R，Pro1-check–F，Pro1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域Prophage1的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物Pro1-check-F，Pro1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Prophage1区域的伯克氏菌DSM7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1突变株，命名为DT6突变株。

7)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT7的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT6突变株出发，删除基因组中的Prophage2-GI7区域(59,887bp，GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp)。利用引物Pro2-del-F，Pro2-del-R，Pro2-check–F，Pro2-check–R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域Prophage2-GI7的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物Pro2-check-F，Pro2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Prophage1区域的伯克氏菌DSM7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7突变株，命名为DT7突变株。

8)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT8的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT7突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇5(BGC5，17.308bp，GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp)。利用引物C5-del-F，C5-del-R，C5-check-F，C5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域BGC5的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物C5-check-F，C5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC5的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5突变株，命名为DT8突变株。

9)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT9的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的重组系统，从DT8突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇6(BGC6，3,373bp，GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp)。利用引物C6(3k)-del-F，C6(3k)-del-R，C6(3k)-check-F，C6(3k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域BGC6的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用引物C6(3k)-check-F，C6(3k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC6的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6突变株，命名为DT9突变株。

10)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT10的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA7029–Km介导的重组系统，从DT9突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇7(BGC7，7,588bp，GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp)。利用引物C7(7k)-del-F，C7(7k)-del-R，C7(7k)-check-F，C7(7k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行区域BGC6的删除与菌落PCR鉴定。接着利用Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并利用C7(7k)-check-F，C7(7k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。最后，在成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子中继续消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC7的伯克氏菌DSM7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6ΔBGC7突变株，命名为DT10突变株。

本发明公开了一组基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029底盘菌株，其特征在于：所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT8出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT8突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT8-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT9突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT9-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT10突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT810-attB。

上述基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029底盘菌株的构建方法，步骤是：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA7029–Km介导的高效遗传操作系统，利用引物C11-attB-genta-loxM-F，C11-attB-genta-loxM-R通过PCR获得两端带有～80bp同源臂、lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记与attB位点特异性整合酶识别位点的基因盒，通过同源重组取代DT8突变株基因组上生物合成基因簇11中如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域，并利用引物C11-attB-out-1，C11-attB-out-2，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定，得到基因组简约化底盘菌株DT8-attB；

或以同样方法和基因盒，在基因组简约化突变株DT9中通过同源重组取代DT9突变株基因组上生物合成基因簇11中如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域，得到基因组简约化底盘菌株DT9-attB；

或以同样方法和基因盒，在基因组简约化突变株DT10中通过同源重组取代DT10突变株基因组上生物合成基因簇11中如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域，得到基因组简约化底盘菌株DT10-attB。

本发明还公开了一组基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029底盘菌株，其特征在于：所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT6出发，在DT6中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT6-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT7出发，在DT7中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT7-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT8出发，在DT8中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT8-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，在DT9中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT9-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，在DT10中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT10-pf。

上述基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea)DSM 7029底盘菌株的构建方法，步骤是：

基于伯克氏菌DSM 7029重组酶表达质粒pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km，利用引物GBA7029::apra-F和GBA7029::apra-R通过PCR扩增带有～50bp同源臂的apra-sacB片段，利用同源重组发生线环重组构建核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒；将该竞争质粒pBBR1-SacB-apra分别电转化至基因组简约化突变株DT6，DT7，DT8，DT9和DT10中，在含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上筛选正确的转化子，并利用pBBR1-SacB-apra质粒的内部引物sacB-apra-ins-check-1,sacB-apra-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；鉴定正确的转化子挑入含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG液体培养基中连续少量转接2～3次，在最后一次转接培养结束后，取100μL菌液三区划线于带有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上，并挑取单克隆利用引物GBA7029-ins-check-1，GBA7029-ins-check-2进行菌落PCR验证重组酶质粒已消除；最后利用SacB反向筛选，在含有浓度为5％、7％、10％或15％蔗糖的液体培养基中少量多次连续转接上述已验证正确的转化子，30℃，950rpm培养，以消除引入的竞争质粒pBBR1-SacB-apra，即可分别得到基因组合理简约化伯克氏菌DSM7029无重组酶表达质粒的底盘菌株DT6-pf，DT7-pf，DT8-pf，DT9-pf和DT10-pf。

上述公开的底盘菌中，优选是基因组合理简约化底盘菌株DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB。

本发明还公开了一组与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子或细胞自溶相关的调控因子，其特征在于：所述与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子分别为编码基因长度为651个碱基对的TetR/AcrA家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS20450，4,852,481-4,853,131)，及编码基因长度为930个碱基对的LysR家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26400，6,187,137-6,188,066)；所述与伯克氏菌DSM7029细胞自溶相关的调控因子为编码基因长度为480个碱基对的裂解酶(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS19980，4,741,451-4,741,930)，及编码基因长度为246个碱基对的XRE家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26360，6,176,723-6,176,968)。

上述与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子或细胞自溶相关的调控因子初步鉴定的方法是：

1)根据生物信息学与转录组分析，申请人确定了基因组合理简化过程中删除的7个非必需区域中转录水平较高的16个转录调节因子/裂解酶相关基因，见表2；

表2；假定生长相关的调控基因或细胞自溶相关的调控基因单敲除

2)基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶介导的同源重组，对上述16个转录调节因子在野生型伯克氏菌DSM 7029中进行单敲除实验，分别构建了16个突变株，具体的：通过伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，从带有重组酶质粒的野生型伯克氏菌DSM 7029出发，对上述16个转录调节因子/裂解酶相关基因在野生型伯克氏菌DSM 7029中分别进行单敲除实验，所述1～16个转录调节因子/裂解酶如表2(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS01950，AAW51_RS08255,AAW51_RS08295,AAW51_RS08365,AAW51_RS20290,AAW51_RS20310,AAW51_RS20335,AAW51_RS20380,AAW51_RS29450,AAW51_RS266360,AAW51_RS26400,AAW51_RS19695,AAW51_RS19715,AAW51_RS19800,AAW51_RS19965/AAW51_RS19970/AAW51_RS29400,AAW51_RS19980)所示。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组获得16个单敲除突变株，并利用菌落PCR进行鉴定，将上述16个突变株分别命名为DSM 7029Δ1～DSM 7029Δ16。

3)对上述16个突变株DSM 7029Δ1～7029Δ16与野生型伯克氏菌DSM 7029进行生长曲线分析培养与CYMG液体48小时，72小时和96小时下扫描电镜检测，鉴定了一组与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子和细胞自溶相关的调控因子，其中，所述与伯克氏菌DSM7029生长相关的调控因子分别为编码基因长度为651个碱基对的TetR/AcrA家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS20450，4,852,481-4,853,131)，及编码基因长度为930个碱基对的LysR家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26400，6,187,137-6,188,066)；所述与伯克氏菌DSM 7029细胞自溶相关的调控因子为编码基因长度为480个碱基对的裂解酶(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS19980，4,741,451-4,741,930)，及编码基因长度为246个碱基对的XRE家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26360，6,176,723-6,176,968)。

本发明所述基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株或基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌底盘菌株在对β-变形菌纲来源天然产物的产量优化中的应用。

其中：所述底盘菌株优选是底盘菌DT8-attB，DT9-attB或DT10-attB；所述β-变形菌纲来源天然产物为粘细菌Sorangium cellulosum So ce90中的NRP/PK类天然产物epothilones；所述应用方法是：将构建的埃博霉素生物合成基因簇的表达质粒pBAC-cm-phiC31-apra-P11-epothilone通过电转化与phiC31整合酶介导的位点特异性重组，分别将所述基因簇整合到三株基因组合理简化底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB以及野生型伯克氏菌DSM 7029中，评价epothilones在各个菌中的异源表达产量。

实验证实：底盘菌DT8-attB，DT9-attB或DT10-attB对上述β-变形菌纲Sorangiumcellulosum So ce90来源的epothilones的异源表达产量与野生型伯克氏菌DSM 7029相比有不同程度的提高。

1)对于上述epothilones在基因组合理简约化底盘菌DT8-attB中的异源表达产量，通过HPLC/MS分析发酵产物发现，DT8-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高2.7倍，见图4。

2)对于上述epothilones在基因组合理简约化底盘菌DT9-attB中的异源表达产量，通过HPLC/MS分析发酵产物发现，DT9-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高3倍，见图4。

3)对于上述epothilones在基因组合理简约化底盘菌DT10-attB中的异源表达产量，通过HPLC/MS分析发酵产物发现，DT10-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高5倍，见图4。

本发明所述基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株在对β-变形菌纲来源的隐秘基因簇的高效异源表达中的应用，其中：所述底盘菌株优选是底盘菌DT8-attB，DT9-attB或DT10-attB；所述应用方法是：利用ExoCET介导的直接克隆技术和Red/ET重组工程对Chitinimonas koreensis DSM 17726中的隐秘基因簇chm进行直接克隆，启动子替换及phiC31整合酶插入，构建异源表达载体p15A-phiC31-amp-Papra-chm，通过电转化/接合转移与phiC31整合酶介导的位点特异性重组，分别将该基因簇整合到三株基因组合理简化底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB以及野生型伯克氏菌DSM 7029中，评价在各个菌中是否有新化合物异源表达。

实验证实：通过HPLC/MS分析发酵产物，发现DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB中都产生一系列信号峰，野生型伯克氏菌DSM 7029中只能够产生部分信号峰，而阴性对照中完全不存在这些信号峰，通过对这些差异峰对应的化合物进行分离纯化与结构解析，鉴定了一系列化合物，其荷质比分别为m/z 944.3776[M+H]⁺,m/z 1114.4467[M+H]⁺,m/z1184.5240[M+H]⁺，和m/z 1241.5286[M+H]⁺，命名为chitinimide A-D，见图5c。

1)对于上述chm基因簇在基因组合理简约化底盘菌DT8-attB中的异源表达，计算944.4±0.5(10.7分钟)和1114.5±0.5(10.5分钟)的相对峰面积发现，DT8-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM 7029和DSM 17726高5倍和10倍，DT8-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高6.3倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生，见图5b。

2)对于上述chm基因簇在基因组合理简约化底盘菌DT9-attB中的异源表达，计算944.4±0.5(10.7分钟)和1114.5±0.5(10.5分钟)的相对峰面积发现，DT9-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM 7029和DSM 17726高2.6倍和6.3倍，DT9-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高2.8倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生，见图5b。

3)对于上述chm基因簇在基因组合理简约化底盘菌DT10-attB中的异源表达，计算944.4±0.5(10.7分钟)和1114.5±0.5(10.5分钟)的相对峰面积发现，DT10-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM 7029和DSM 17726高8.4倍和18倍，DT10-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高13.7倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生，见图5b。

本发明对伯克氏菌DSM 7029基因组进行简约化，构建一组基因组合理简约化突变株DT8，DT9和DT10；从基因组简化突变株DT6，DT7，DT8，DT9和DT10突变株出发，分别消除重组酶表达质粒，构建了一组基因组合理简约化的无重组酶表达质粒伯克氏菌DSM7029底盘菌株DT6-pf，DT7-pf，DT8-pf，DT9-pf和DT10-pf；从基因组合理简约化突变株DT8，DT9和DT10出发，分别在基因组上定点整合phiC31 attB位点，构建了一组基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029底盘菌株DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB，以及利用这一组底盘菌株提供其在β-变形菌纲来源的天然产物产量优化方面与在β-变形菌纲来源的隐秘基因簇高效异源表达方面的应用。与现有革兰阴性底盘菌相比，本发明具有创新点体现在：1)理性设计并联合删除S.brevitalea DSM 7029中的前噬菌体、转座酶、基因组岛、生物合成基因簇等基因组非必需区域；2)结合S.brevitalea DSM 7029自身重组酶介导的高效遗传操作系统、Cre/loxP位点特异性重组和SacB反向筛选建立了无抗性筛选标记连续删除的基因组简化方法，该方法为首次报道；3)构建了一组基因组合理简化伯克氏菌，该组基因组合理简约化S.brevitalea DSM 7029突变株DT8,DT9和DT10为首次报道；4)通过S.brevitalea DSM7029自身重组酶介导的同源重组分别在基因组上插入phiC31 attB位点，利用phiC31整合酶介导的位点特异性重组，构建了一组促进β-变形菌纲中生物合成基因簇高效异源表达的基因组合理简约化底盘菌，该组基因组合理简约化S.brevitalea DSM 7029底盘菌DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB为首次报道。

与现有革兰阴性底盘菌与野生型伯克氏菌DSM 7029相比，本发明的技术效果和显著优点是：

(1)基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029突变株DT8，DT9和DT10，与野生型伯克氏菌DSM 7029相比具有明显提高的生长速度和生物量，其中，所述DT8,DT9和DT10突变株的最大生物量达到了OD₆₀₀＝10～12，见图3a所示；

(2)DT8，DT9和DT10突变株的细胞自溶现象较野生型相比具有显著延迟与减轻，见图3b所示，且由于细胞自溶延迟与减轻导致的24小时，48小时和72小时的活菌数均高于野生型1～2个数量级，见图3c所示。

(5)DT8，DT9和DT10突变株表现出的生物量明显提高与细胞自溶的显著延缓，与群体感应系统和细胞自溶相关调控因子的调节有关，包括在本发明中得到鉴定的：TetR/AcrA家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS20450，4,852,481-4,853,131)，及编码基因长度为930个碱基对的LysR家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26400，6,187,137-6,188,066)；所述与伯克氏菌DSM 7029细胞自溶相关的调控因子为编码基因长度为480个碱基对的裂解酶(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS19980，4,741,451-4,741,930)，及编码基因长度为246个碱基对的XRE家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26360，6,176,723-6,176,968)，见图7所示。

(6)相较于野生型伯克氏菌DSM 7029，本发明提供的DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB基因组合理简约化底盘菌具有更加清晰的代谢背景，便于对未知化合物进行代谢谱分析。

(7)相较于广泛应用的两株革兰阴性底盘菌大肠杆菌GB05-MtaA和恶臭假单胞菌KT2440，以及野生型伯克氏菌DSM 7029，本发明所述的T8-attB、DT9-attB和DT10-attB基因组合理简约化底盘菌具有更加高效的生物合成基因簇异源表达能力，有力促进了β-变形菌纲中目标化合物的产量优化及新型天然产物的挖掘，具有较为广阔的应用前景。

附图说明

图1：基因组简化突变株构建流程图。

其中：左环型基因组图谱代表野生型伯克氏菌DSM 7029基因组，目标删除的生物合成基因簇区域用黑色的加粗短线表示，目标删除的转座酶、基因组岛、前噬菌体用黑色的两个相对三角形表示。该基因组合理简化路径代表顺序删除Tn1区域(46,274bp，GenBank：CP011371.1，399,555-445,828bp),Tn2区域(30,979bp，GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp)，Tn34区域(64,539bp，GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp)，Tn5-GI3区域(27,328bp，GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp)，Tn6-GI1区域(36,134bp，GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp)，Prophage 1区域(24,197bp，GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp)，Prophage2-GI7区域(59,887bp，GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp)，顺序得到DT1～DT7基因组简约化突变株，在DT7突变株的基础上继续删除生物合成基因簇5(BGC5，17.308bp，GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp)、生物合成基因簇6(BGC6，3,373bp，GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp)以及生物合成基因簇7(BGC7，7,588bp，GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp)，顺序得到DT8～DT10基因组简约化突变株。

图2：伯克氏菌DSM 7029中基因组简约化方法的建立。

其中：Genta：庆大霉素抗性基因；Km：卡那霉素抗性基因；Apra：阿卜拉霉素抗性基因；Redγ-Redαβ7029：pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km；P_BAD：阿拉伯糖诱导型启动子；lox66，lox71：Cre位点特异性重组酶识别位点；lox72：lox66和lox71位点发生重组后形成的疤痕序列，不可被Cre酶识别。a.glidobactin生物合成基因簇(glb，BGC5)的无抗性筛选标记删除，然后将Cre位点特异性重组酶表达质粒转入已鉴定正确的glbC-glbF删除株中，利用Cre/loxP位点特异性重组酶移除庆大霉素抗性基因。b.通过多次添加L-(+)-阿拉伯糖诱导Cre位点特异性重组酶表达，并在液体培养基中连续转接2-3次，消除基因组上的庆大霉素抗性基因。c.利用SacB反向筛选，在添加不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中连续转接已消除庆大霉素抗性基因的转化子，以消除Cre位点特异性重组酶表达质粒。

图3：基因组简化突变株的生理表型鉴定。

其中：a.野生型伯克氏菌DSM 7029和基因组合理简约化突变株DT1～DT10的生长曲线测定。n＝3，SD，标准偏差。b.野生型伯克氏菌DSM 7029和基因组合理简约化突变株DT1～DT10在CYMG液体培养基中培养48小时，72小时和96小时时扫描电子显微镜下的细胞形态。c.野生型伯克氏菌DSM 7029和基因组合理简约化突变株DT1～DT10在CYMG液体培养基中培养24小时，48小时和72小时的活菌数。n＝3，SD，标准偏差。

图4：β-变形菌纲来源的天然产物epothilones在野生型伯克氏菌DSM 7029、DT8-attB、DT9-attB、DT10-attB以及两株应用广泛的革兰阴性菌中异源表达的相对产量。

其中，WT：野生型伯克氏菌DSM 7029；GB05：大肠杆菌E.coli GB05-MtaA；P.putidaKT2440：恶臭假单胞菌KT2440；DT8:DT8-attB；DT9：DT9-attB；DT10:DT10-attB。n＝3，SD，标准偏差。

图5：Chitinimonas koreensis DSM 17726中chm基因簇在基因组合理简约化底盘菌中的异源表达与化合物chitinimide A-H的挖掘。

其中：a.通过ExoCET介导的直接克隆技术与Red/ET重组工程介导的同源重组构建chm基因簇的表达载体p15A-phiC31-P_apra-chm。其中，用黑色表示的chm基因簇位于灰色表示的P_apra组成型启动子的控制下。b.chitinimides(A和B)在DSM 17726原始菌、野生型伯克氏菌DSM 7029、DT8-attB、DT9-attB、DT10-attB以及两株应用广泛的革兰阴性菌中异源表达的相对产量，n＝3，SD，标准偏差。其中，DSM 17726：Chitinimonas koreensis DSM 17726原始菌；WT：野生型伯克氏菌DSM 7029；GB05：大肠杆菌E.coli GB05-MtaA；KT2440：恶臭假单胞菌P.putida KT2440；DT8:DT8-attB；DT9：DT9-attB；DT10:DT10-attB。c.chitinimideA-H的结构解析(1-8)。

图6：伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT1～DT10构建过程中的菌落PCR凝胶电泳图，上方箭头标注的是鉴定正确的转化子，目标条带的分子量标注在条带附近。

图7：伯克氏菌DSM 7029中假定细胞生长调节基因与自溶相关调节基因的单敲除。

其中：a.野生型伯克氏菌DSM 7029和16个假定细胞生长调节基因/自溶相关调节基因的单敲除突变株DSM 7029Δ1～DSM 7029Δ16。其中，在生长曲线测定初始均一OD₆₀₀值，在CYMG液体培养基中培养每隔8小时测定一次OD₆₀₀值。n＝3，SD，标准偏差。b.野生型伯克氏菌DSM 7029和六个单敲除突变株DSM 7029Δ16，DSM 7029Δ10，DSM 7029Δ7，DSM7029Δ8，DSM 7029Δ9，DSM 7029Δ11在CYMG液体培养基中培养48小时，72小时和96小时时扫描电子显微镜下的细胞形态。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。本发明的基本思想是通过建立伯克氏菌DSM 7029中基因组简约化方法，利用生长表型优良的底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB实现β-变形菌纲中丰富的天然产物生物合成基因簇的高效异源表达。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中所使用的材料、菌株、质粒、试剂、培养基等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

本实施例中试剂主要为分子生物学实验试剂，单链核苷酸是从上海生工生物技术有限公司合成，PrimeSTAR Max DNA聚合酶购买自日本Takara生物技术公司，双链DNA纯化试剂盒购买自北京天根生化科技公司，限制性内切酶和DNA标记来自新英格兰生物公司(New England Biolabs)，抗生素从上海生工生物技术有限公司购买，发明中涉及的大肠杆菌：GB05-dir,GB08-red,和带有pSC101-BAD-ETgA-tet质粒的GB05RedTrfA均购自德国基因桥公司(GeneBridges),GB05-MtaA为前期构建并已发表在ChemBioChem杂志(Bian,X.etal.Direct cloning,genetic engineering,and heterologous expression of thesyringolin biosynthetic gene cluster in E.coli through Red/ETrecombineering.ChemBioChem.13,1946–1952(2012))；本发明中涉及的菌株：Schlegelella brevitalea DSM 7029和Chitinimonas koreensis DSM 17726均购买自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。

进行重组的电转化细胞的制备：

大肠杆菌感受态细胞和伯克氏菌DSM 7029的感受态按照之前文献报道流程进行制备。对大肠杆菌、伯克氏菌DSM 7029及其基因组合理简约化底盘菌DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB采用电转化的方法对外源DNA进行转化，恶臭假单胞菌KT2440采用接合转移的方法对外源DNA进行转化，转化方法根据已公开文献报道的流程进行。

重组子发酵及化合物提取的方法：

对伯克氏菌DSM 7029及其基因组合理简约化底盘菌重组子进行CMYG液体培养基发酵及化合物的提取，对大肠杆菌、恶臭假单胞菌重组子进行LB液体培养基发酵及化合物的提取，化合物提取与HPLC/MS检测方法按照已公开文献报道的流程进行。

化合物chitinimide A-D(1-4)的纯化方法：

1.CYMG液体发酵(20L)2天后加入2％XAD-16树脂加，30℃，200rpm继续培养2天；

2.收集树脂XAD-16并用双蒸水反复洗涤，然后用MeOH(15L)萃取。

3.将粗提物硅胶成分加入到正相硅胶柱中进行不同浓度梯度的洗脱分离。(二氯甲烷，80:1的二氯甲烷和甲醇，50:1的二氯甲烷和甲醇，20:1的二氯甲烷和甲醇，15:1的二氯甲烷和甲醇，10:1的二氯甲烷和甲醇，8:1的二氯甲烷和甲醇，5:1的二氯甲烷和甲醇，3:1的二氯甲烷和甲醇，2:1的二氯甲烷和甲醇，1:1的二氯甲烷和甲醇，甲醇)，共得到60个馏分；

4.将收集的不同组分通过旋转蒸发仪进行蒸干后，加入一定体积的甲醇(7-10ml)将不同组分进行溶解后分装入不同的试管中，并进行HPLC/MS检测。检测条件同上。

5.对于目标化合物3和4，将馏分(Fr.36-Fr.43)浓缩并通过Sephadex LH-20柱，使用各添加0.1％甲酸的甲醇和双蒸水作为流动相。然后，将含有目标化合物3和4的馏分用于半制备型反向HPLC纯化柱(Agilent ZORBAXSB-C18，9.4×250mm，5μm，DAD＝210nm)。反相HPLC参数如下：溶剂A，含0.3％三氟乙酸(TFA)的双蒸水；溶剂B，甲醇；以3mL/min流速进行制备，0-5min，48％B；5-35min，48％B；35-45min，100％B；45-50min，48％B的梯度得到chitinimide C(3)和D(4)混合物(15毫克)，保留时间为41.5分钟。

6.对于化合物1和2，将馏分(Fr.44-Fr.60)浓缩并通过Sephadex LH-20柱，使用各添加0.1％甲酸的甲醇和双蒸水作为流动相。然后，将含有目标化合物1和2的馏分用于半制备型反向HPLC纯化柱(Agilent ZORBAXSB-C18，9.4×250mm，5μm，DAD＝210nm)。反相HPLC参数设置如下：溶剂A，含0.2％三氟乙酸(TFA)的双蒸水；溶剂B，甲醇；以3mL/min流速进行制备，0-5min，32％B；5-25min，32％B；25-35min，100％B；35-45min，32％B的梯度得到chitinimide A(1)30mg和B(2)7.6mg，保留时间分别为21分钟和23分钟。

7.将分离纯化的chitinimide A-D(化合物1-4)分别进行HPLC-MS检测，然后蒸干后进行NMR鉴定。

实施例1：Schlegelella brevitalea DSM 7029基因组上目标删除区域的生物信息学分析与基因组简约化方法的构建

1)目标删除区域和基因组简约化路线的确定。

细胞正常生命过程非必需的基因包括一些内源性的生物合成基因簇，以及一些编码转座酶、插入序列元件和噬菌体相关蛋白的基因作为靶标删除的基因，但是它们大多数分布在基因组的不同位点。通过基因组、转录组和代谢组分析，利用antiSMASH、DEG 10(Database of Essential Genes)和PHAST分别对该菌的内源性生物合成基因簇、必需基因与前噬菌体区域进行确定。基因组注释显示该菌编码44个转座酶、2个前噬菌体区域和7个基因组岛。申请人经实验测试及转录分析后显示转座酶或基因组岛附近的基因转录水平较低，大多数编码假定蛋白或是DEG 10数据库预测属于该菌正常生命过程非必需的基因。此外，鞭毛合成是一个非常耗能的过程，且在生物反应器中这类细胞表面结构是无用的。因此，在基因组合理简约化的目标删除区域中，包含因聚集在基因组的七个不同区域的大多数转座酶、前噬菌体、鞭毛相关的区域以及它们相邻的非必需基，以及在该菌中具有一定程度本底表达的生物合成基因簇5,6和7(表1，图1)，即：Tn1区域(46,274bp，GenBank：CP011371.1，3 99,555-445,828bp),Tn2区域(30,979bp，GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp)，Tn34区域(64,539bp，GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp)，Tn5-GI3区域(27,328bp，GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp)，Tn6-GI1区域(36,134bp，GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp)，Prophage 1区域(24,197bp，GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp)，Prophage2-GI7区域(59,887bp，GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp)，生物合成基因簇5(BGC5，17.308bp，GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp)，生物合成基因簇6(BGC6，3,373bp，GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp)，生物合成基因簇7(BGC7，7,588bp，GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp)。上述删除区域在基因组上的位点如表1和图1所示。这条路线旨在逐步删除这七个非必需的基因组区域来尝试提高突变株的鲁棒性并在一定程度上缓解细胞的早期自溶现象，以及在删除3个内源性生物合成基因簇后降低其本底的代谢背景。

2)基因组合理简约化方法与突变株的构建。

2.1)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT1的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，删除伯克氏菌DSM 7029野生型中的Tn1区域(46,274bp，GenBank：CP011371.1，399,555-445,828bp)。以发表于Iscience杂志的质粒pR6K-genta-loxM-FleQ(Yin,J.,etal.,Single-Stranded DNA-Binding Protein and Exogenous RecBCD InhibitorsEnhance Phage-Derived Homologous Recombination in Pseudomonas.Iscience 2019,14,1-14.)为模板，利用引物Tn1-del-F，Tn1-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn1，见图2a，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着线性化pRK2-BAD-Cre-cm质粒获得PRK2-BAD-Cre片段，利用PCR扩增apra-SacB片段，通过线线重组构建核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn1区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1，命名为DT1突变株。

上述突变株DT1构建过程中涉及的引物如下：

Tn1-del-F：5’-GCCGCTTTGCAGTGGAAGCAGAGATTTGTGTCGACAAGGTCCGGGCGCCCCAGATGCCAATCAGGTAGGCTGGTGCCATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Tn1-del-R：5’-CCAGACGGTTCCACACTCAGATTGGCCGTTTGTCCTTCTGTGTCGACCTGGCGGTCGTACATCCCGATGCACGCGGCACCGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Tn1-check-F：5’-AGTTCTGTGGCGAATCTTC-3’

Tn1-check-R：5’-CTCTAAGGCGGTAGGTAGGC-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

RK2-Apra-1：5’-TTGGGGTATCTTTAAATACTGTAGAAAAGAGGAAGGAAATAATAAGTGCAATACGAATGGCGAAAAG-3’

sacB-Apra-2：5’-AGAAAATATCATAATATCTCATTTCACTAAATAATAGTGAACTCAGCCAATCGACTGGCGAGC-3’

sacB-1：5’-GTTCACTATTATTTAGTGAAATGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.2)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT2的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT1突变株出发，删除基因组中的Tn2区域(30,979bp，GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Tn2-del-F，Tn2-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn2，见图2a，并利用引物Tn2-check-F，Tn2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn2区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用Tn2-check-F，Tn2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn2区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2，命名为DT2突变株。

上述突变株DT2构建过程中涉及的引物如下：

Tn2-del-F：5’-TCTTAAGGCTGCCTGCAACTGTTGAGTCGTGTTCATTTCGGTGAGCGTCGCCGTTGACGCCTTGACATCAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Tn2-del-R：5’-GATCTTGACAGCGTTCAAATCGACCACTAGAGTGGACTTAACACTGTTCAAATTGAATGCCACCGCCATGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Tn2-check-F：5’-TCTGGGAGCATGAGAGACAG-3’

Tn2-check-R：5’-TCCGGCTATCGGGTCTGCAT-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.3)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT3的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT2突变株出发，删除基因组中的Tn34区域(64,539bp，GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Tn3Tn4-del-F，Tn3Tn4-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn34，见图2a，并利用引物Tn3Tn4-check-F，Tn3Tn4-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn34区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Tn3Tn4-check-F，Tn3Tn4-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn34区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34，命名为DT3突变株。

上述突变株DT3构建过程中涉及的引物如下：

Tn3Tn4-del-F：5’-AGGCAGCCGCGCAAGTCGGAGGCTCGACCGTGTATATTTATCCAGTGTTCTCGCCAAGGGAGGCGACGTGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Tn3Tn4-del-R：5’-CTGCGCAATTCAATCCACCGCCTTTGGTCCGGAAATCTTTATCAATATAGTTTTCTGAACGCGTCGGCAGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Tn3Tn4-check-F：5’-AGCCATCATGTCCCACATCAAC-3’

Tn3Tn4-check-R：5’-AAGGTCACATAGACCATCCTC-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.4)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT4的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，从DT3突变株出发，删除基因组中的Tn5-GI3区域(27,328bp，GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Tn5-del-F，Tn5-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn5-GI3，见图2a，并利用引物Tn5-check-F，Tn5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn5-GI3区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Tn5-check-F，Tn5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn5-GI3区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3，命名为DT4突变株。

上述突变株DT4构建过程中涉及的引物如下：

Tn5-del-F：5’-ACGTGTCGTGGTCCAATCTTGATGGACACCTTGATAGGGGATTCACCCCGAAGAGGACCAAACAGAGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Tn5-del-R：5’-TCGGCCCCCGGGGAACACGAAGCGAGGGCGCGAGGCCCTCACGACGAACCAGCCGCGCACAACGCGCGGCGCGTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Tn5-check-F：5’-AGTCGTGGTTTCCTCCTGAGAG-3’

Tn5-check-R：5’-TGGAGCAACGGGGACGAGTC-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.5)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT5的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT4突变株出发，删除基因组中的Tn6-GI1区域(36,134bp，GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Tn6-del-F，Tn6-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn6-GI1，见图2a，并利用引物Tn6-check-F，Tn6-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn6-GI1区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Tn6-check-F和Tn6-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn6-GI1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1，命名为DT5突变株。

上述突变株DT5构建过程中涉及的引物如下：

Tn6-del-F：5’-ACCAAGGCAACGGCAGTCGGGCATATCGATCAAGGGCCGAACGATCTGAATCGTACCGGTCAGGCCGCAATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Tn6-del-R：5’-ACCCGCCACAACCGTCAACGGCCGACCGGCAGGAGCGGCTCGACGCTGCCCGGTTCGCCGGACGGCGTGCCGCTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Tn6-check-F：5’-AAGCACCCCGAAGAGGGAAG-3’

Tn6-check-R：5’-TCGCGGTTAGAGGACGCTC-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.6)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT6的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从DT5突变株出发，删除基因组中的Prophage1区域(24,197bp，GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Pro1-del-F，Pro1-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Prophage1，见图2a，并利用引物Pro1-check–F，Pro1-check–R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Prophage1区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Pro1-check-F，Pro1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Prophage1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1，命名为DT6突变株。

上述突变株DT6构建过程中涉及的引物如下：

Pro1-del-F：5’-AGTTGTGCAAGCTTGCGTGGGAGTGGCCGGGCGTCAACGCGGGGTACTTCGCCCCGACGTACCCGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Pro1-del-R：5’-GTCGCCCGGCACATCTCAGCGGTAGTGACAAACGGGTCGATCTTGAGGTCGTCGGTCTTGATCCCGGTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Pro1-check–F：5’-ATGTGGTCGACGCCGGTATC-3’

Pro1-check–R：5’-TCTGCGTCGAGCTGGTCATAC-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.7)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT7的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，从D6突变株出发，删除基因组中的Prophage2-GI7区域(59,887bp，GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Pro2-del-F，Pro2-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Prophage2-GI7，见图2a，并利用引物Pro2-check-F，Pro2-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Prophage2-GI7区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物Pro2-check-F，Pro2-check–R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失Prophage1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7，命名为DT7突变株。

上述突变株DT7构建过程中涉及的引物如下：

Pro2-del-F：5’-TTGGGGATTTAGAGCAAGATCGGCCGCCGACAGTCGGGACCGCTCAACTCGAAGCCGGATGACCCTAGATAAATCAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Pro2-del-R：5’-ACCCCCTCTGGCGACTGCGTTACGAGGAGCCCTCAATGCTCGGCTCAGCAGGGGCTGCAAGCGACCTTGCTCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Pro2-check–F：5’-TGATCGCGGAAAGAACTGCTAG-3’

Pro2-check–R：5’-ACTGTCTCCGGCGGGTTAAGA-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.8)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT8的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km介导的重组系统，从D7突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇5(BGC5，17.308bp，GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物C5-del-F，C5-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域BGC5，见图2a，并利用引物C5-check-F，C5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代BGC5的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用引物C5-check-F，C5-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC5的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5，命名为DT8突变株。

上述突变株DT8构建过程中涉及的引物如下：

C5-del-F：5’-TTGAACCCTGCGTCCAGCGCGCAACCCACCTGACCCATTCATCGATCGAGAACCGGAATCGACCACCGTGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

C5-del-R：5’-GTGTTGGGTCAGCAGCAGCACAGATGTCATCGTCAGCTTTCCTCTGTCTGGGGGTTGGGCGCCGGCCTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

C5-check-F：5’-ATTTGCTGTGCGGTTTCCAC-3’

C5-check-R：5’-CGGGAGTGGTGAATACAGAT-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.9)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT9的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的重组系统，从D8突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇6(BGC6，3,373bp，GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物C6(3k)-del-F，C6(3k)-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及ox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域BGC6，见图2a，并利用引物C6(3k)-check-F，C6(3k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代BGC6的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用菌落PCR进行鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC6的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6，命名为DT9突变株。

上述突变株DT9构建过程中涉及的引物如下：

C6(3k)-del-F：5’-ACCGACACCGCGCGGCGCGAGCGCCGACCTGCAACCGATCCAAGGAACCCTGCCCGTGAACATGACCGACCTGTTGGCCCTGCTGGACGCCCGCGGCCTCCCAACCGCGTGGCACAACAA-3’

C6(3k)-del-R：5’-ATCTGGGCCAGGAACCACAGCCGCTGCTGCGCCGGCGACAAAGGCAAGGGGGCGCTCCGATCGGCGGCCTCGATGGCGGCCTGCAGCGCCCGCTCCTCGCCAACTTAAATGTGAAAGTGG-3’

C6(3k)-check-F：5’-GCCGATGTGAGCCAGTTGTTCA-3’

C6(3k)-check-R：5’-GCGCTGGCTCAGCGTCTTCAA-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

2.10)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化突变株DT10的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的重组系统，从D9突变株出发，删除基因组中的生物合成基因簇7(BGC7，7,588bp，GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp)。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物C7(7k)-del-F，C7(7k)-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域BGC7，见图2a，并利用引物C7(7k)-check-F，C7(7k)-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定。

接着利用本发明构建的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代BGC7的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，并留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，见图2b，并利用菌落PCR进行鉴定。

最后，将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含不同浓度梯度蔗糖(5％，7％，10％，15％)的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，见图2c。经过这一轮基因组简化方法制得缺失BGC7的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6ΔBGC7，命名为DT10突变株。

上述突变株DT10构建过程中涉及的引物如下：

C7(7k)-del-F：5’-TGGGAGACGTTCAGGTCCGGTTTCAAGGGGTCTCCTGTTCCAGTGCGTCCAGCAGTTCGGTCATGGCGGCGAGTGGATCGTTGTCAGACGGCGCAGGCGCGGCGGCCAACCGCGTGGCACAACAA-3’

C7(7k)-del-R：5’-TCGTTCGACCAATTGCTTGCCGGAATGGAGTGATCCCCTTGGCCCCCTCTCTGCAGTCTGCGCCCGCCGCCCGCCCGCCACGCCGCAAGGCCGACATCGTCGGCATCCAACTTAAATGTGAAAGTGG-3’

C7(7k)-check-F：5’-AGCGCGGTGCAGATGTTGTA-3’

C7(7k)-check-R：5’-AGGTCGCTTTCAACTACCT-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

sacB-ins-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-ins-2：5’-TGTGCCCTTATTCCTGATTTG-3’

实施例2：对一组基因组合理简约化的突变株DT8至DT10进行生理表型的测定

1)生长曲线的测定。

野生型伯克氏菌DSM 7029、基因组合理简化突变株DT1至DT10的生长曲线在无抗CYMG液体培养基中进行测定，30℃，转速200rpm培养，在生长曲线测定初期均一初始OD₆₀₀，每个样品的OD₆₀₀值由UV 600nm下的紫外吸收确定。在培养的前12小时每隔6小时测定OD₆₀₀值，在12至48小时间每隔4小时测定OD₆₀₀值，在48至72小时每隔8小时测定一次OD₆₀₀值。通过绘制72小时的生长曲线，发现多个转座酶、基因组岛和其他非必需基因连续删除的DT1至DT10突变株具有较为经典的生长曲线，含有典型的指数期和稳定期，并且表现出显著提升的细胞生长和生物量，突变株DT8至DT10的最高OD₆₀₀值达到了10～12，见图3a，n＝3，SD，标准偏差。

2)细胞自溶现象的观察与活菌数测定

由于在基因组合理简化的伯克氏菌DSM 7029突变株DT1至DT10中观察到细胞生长方面具有较为显著的差异，利用扫描电子显微镜分别观察野生型伯克氏菌DSM 7029、DT1至DT10突变株在液体培养24小时，48小时和72小时的细胞形态，见图3b，DT1突变株的细胞生长略优于比野生型，野生型伯克氏菌DSM 7029细胞从培养24小时即出现细胞自溶，DT2至DT5突变株具有比野生型相对延缓的细胞自溶，但是在72小时的细胞仍然收到了较为严重的损伤，而移除前噬菌体相关基因的突变株DT6至DT10能维持较为完整的细胞形态，在整个培养的72小时没有出现可检测的细胞自溶。与细胞自溶现象的鉴定结果相一致，突变株DT6至DT10在72小时的活菌数与野生型伯克氏菌DSM 7029相比高约两个数量级，见图3c，n＝3，SD，标准偏差。

经过测定伯克氏菌DSM 7029基因组合理简约化突变株DT1～DT10的生理表型，确定了生物量提高，细胞自溶现象显著延缓且代谢背景降低的突变株DT8，DT9和DT10作为β-变形菌纲异源表达底盘菌株的选择。

实施例3：一组基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029底盘菌DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB的构建

所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT8出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT8突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT8-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT9突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT9-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT10突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT810-attB。

所述基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029底盘菌株DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB的构建方法是：

1)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化底盘菌株DT8的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的高效遗传操作系统，利用引物C11-attB-genta-loxM-F，C11-attB-genta-loxM-R通过PCR获得两端带有～80bp同源臂、lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记与attB位点特异性整合酶识别位点的基因盒，通过同源重组取代DT8突变株基因组上生物合成基因簇11中如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域，并利用引物C11-attB-out-1，C11-attB-out-2，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定，得到基因组简约化底盘菌株DT8-attB；

2)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化底盘菌株DT9的构建：

基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的重组系统，从基因组合理简约化突变株DT9出发，首先利用引物C11-attB-genta-loxM-F，C11-attB-genta-loxM-R通过PCR获得两端带有～80bp同源臂、lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记与attB位点特异性整合酶识别位点的基因盒，然后利用同源重组取代DT9基因组上生物合成基因簇11中的2789bp区域(GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp)，并利用引物C11-attB-out-1，C11-attB-out-2，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定，所得插入phiC31 attB位点的基因组合理简约化突变株即为DT9-attB底盘菌株。

3)伯克氏菌DSM 7029基因组简约化底盘菌株DT10的构建：

以1)或2)同样方法和基因盒，在基因组简约化突变株DT10中通过同源重组取代DT10突变株基因组上生物合成基因簇11中如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域，得到基因组简约化底盘菌株DT10-attB。

上述底盘菌株DT8-attB、DT9-attB或DT10-attB构建过程中涉及的引物如下：

C11-attB-genta-loxM-F：5’-AGGCGCTTGCGGCTGCTCCTGCACCGACGGCACGCTGTATCGATAGTTCAGCAGCGCCGTGGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

C11-attB-genta-loxM-R：5’-AGCCGTACCCGCAGGAGATGCTGGTGCATGAGCTGTTCGAAGCGCAAGTGCAGCGCAGCCCACAGGCGCTGGCGTTGGTGTGCGAGGGCCAGCAGCTGTTAAATGTGAAAGTGGGTCT-3’

C11-attB-out-1：5’-ACCCGCAGATCCTCGGGATAT-3’

C11-attB-out-2：5’-TACGCCAGCACCTTGTTTGAA-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

实施例4：一组基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029底盘菌DT6-pf、DT7-pf,DT8-pf,DT9-pf和DT10-pf的构建

所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT6出发，在DT6中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT6-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT7出发，在DT7中利用核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT7-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT8出发，在DT8中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT8-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，在DT9中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT9-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，在DT10中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT10-pf。

所述基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea)DSM7029底盘菌株DT6-pf、DT7-pf,DT8-pf,DT9-pf和DT10-pf的构建方法是：

基于伯克氏菌DSM 7029重组酶表达质粒pBBR1-Rha-RedG-BA7029-Km，利用引物GBA7029::apra-F和GBA7029::apra-R通过PCR扩增带有～50bp同源臂的apra-sacB片段，利用同源重组发生线环重组构建核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒；将该竞争质粒pBBR1-SacB-apra分别电转化至基因组简约化突变株DT6，DT7，DT8，DT9和DT10中，在含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上筛选正确的转化子，并利用pBBR1-SacB-apra质粒的内部引物sacB-apra-ins-check-1,sacB-apra-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；鉴定正确的转化子挑入含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG液体培养基中连续少量转接2～3次，在最后一次转接培养结束后，取100μL菌液三区划线于带有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上，并挑取单克隆利用引物GBA7029-ins-check-1，GBA7029-ins-check-2进行菌落PCR验证重组酶质粒已消除；最后利用SacB反向筛选，在含有浓度为5％、7％、10％或15％蔗糖的液体培养基中少量多次连续转接上述已验证正确的转化子，30℃，950rpm培养，以消除引入的竞争质粒pBBR1-SacB-apra，即可分别得到基因组合理简约化伯克氏菌DSM7029无重组酶表达质粒的底盘菌株DT6-pf，DT7-pf，DT8-pf，DT9-pf和DT10-pf。

上述底盘菌株DT6-pf，DT7-pf，DT8-pf，DT9-pf和DT10-pf构建过程中涉及的引物如下：

GBA7029::apra-F：5’-AGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACTCGAGTTGGCAGCATCACCC-3’

GBA7029::apra-R：5’-TCCTTCTCGAACTGAGCGACCAGTCGGGCAAAGGTCATGAGGTCGTCTTCGAGAGCTTGGATTCAGCCAATCGACTGGCGAGC-3’

GBA7029-ins-check-1：5’-AGGATCTCCTGTCATCTCACCT-3’

GBA7029-ins-check-2：5’-AGACTGGAATGACCATCAATC-3’

sacB-apra-ins-check-1：5’-ATCAACGGTGTAGAGGATTAT-3’

sacB-apra-ins-check-2：5’-AAGTGCGCTGTTCCAGACTAT-3’

上述基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的Schlegelella brevitalea DSM7029突变株可以应用为底盘菌，但最优选的基因组合理简约化底盘菌株为DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB。

实施例5：与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子或细胞自溶相关的调控因子的初步鉴定

1)根据生物信息学与转录组分析，申请人确定了基因组合理简化过程中删除的7个非必需区域中转录水平较高的16个转录调节因子/裂解酶相关基因，见表2。

2)基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶介导的同源重组，对上述16个转录调节因子在野生型伯克氏菌DSM 7029中进行单敲除实验，分别构建了16个突变株，具体的：通过伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，从带有重组酶质粒的野生型伯克氏菌DSM 7029出发，对上述16个转录调节因子/裂解酶相关基因在野生型伯克氏菌DSM 7029中分别进行单敲除实验，所述1～16个转录调节因子/裂解酶如表2(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS01950，AAW51_RS08255,AAW51_RS08295,AAW51_RS08365,AAW51_RS20290,AAW51_RS20310,AAW51_RS20335,AAW51_RS20380,AAW51_RS29450,AAW51_RS266360,AAW51_RS26400,AAW51_RS19695,AAW51_RS19715,AAW51_RS19800,AAW51_RS19965/AAW51_RS19970/AAW51_RS29400,AAW51_RS19980)所示。以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组获得16个单敲除突变株，并利用菌落PCR进行鉴定，将上述16个突变株分别命名为DSM7029Δ1～DSM 7029Δ16。

上述16个单敲除突变株构建过程中涉及的引物及序列按顺序如下：

Δ1-R：5’-AGCGTCTCGAGCATTGCCATCAAGCCGCCTGCAGTTCCTCGCTTGCGGATCCAGGCTCCATTCCCGCTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ1-F：5’-ATTGAAGCTGTACGGGTTTCAGAATGCCAGCGTCCGTCCCGACATCTTTCGGGACTTACCGGTCAATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ1-out-check R：5’-GTACGACCTGCAAGAATGTG-3’

Δ2-R：5’-GGACGGGCGGGTTGCCGGGGTGGGCGGGCATTCATCTGATGTTCCGCCCGCGCTGAACGCCCCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ2-F：5’-AAGCGGGCCATCACCCGTACACTCGACTGTGAAACCTCAAGTGGCTTGAGATACAAGGGGGCAGGCGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ2-out-check R：5’-CACAACACATCACAGGATG-3’

Δ3-R：5’-ATGCAGTCGATGCCATCCTCGATCAGTGGCGTCGGGAGCGGCCGGATCTGGATCTCGGTCCGATGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ3-F：5’-TCGCCGCTGCACGCCGCGGGTGGGACTGGATGCGCGGTGGTCGACGACCGACGGCCGCGCCGACGTCAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ3-out-check F：5’-GCGGCCAGAAAGGTTCTCAT-3’

Δ4-R：5’-ACCGGGGCGGTGAGGGCGGGGCCCAGCCGGCGGAGGTCCGTGCGTGCGCCGACACCGTCTCCGGCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA

Δ4-F：5’-AGTGTTAAGTCCACTCTAGTGGTCGATTTGAACGCTGTCAAGATCCCCGGTAAACTTCCGCCATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ4-out-check R：5’-AGCCTGTGATCAAACGATTT-3’

Δ5-R：5’-ACGAGCAAGGACTGCCGTTGGCCCCTTGTTAGCGGTCTTGAGAGGCCGGTCGCCGCCGTCTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ5-F：5’-AACAAGCTCTGCGCGATTCACCGCGTGTCGCCATAGCGCCGTACACGCCAATCCCATTCGACGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ5-out-check R：5’-TCCGGAGCTGCTTTGAGTTC-3’

Δ6-R：5’-AAGTATCTGGAAGCATTGAGGACCGACTCCCACAGGCGACACGATACGGTCGTTTTGAGATAGGTTCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ6-F：5’-TCGCCGTCCTCGAATTCACAGCGGCGCAGATAATATGAAACTTCATTCACATTGTGAATTCGCATTCGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ6-out-check R：5’-GGGAGAGCAGAATGAATGAG-3’

Δ7-R：5’-TGGAGCGCGCAAAGCTGCCGCTCGGACCCGCCCCCAGCCCCCTGTCGAGTGCCGGCAGCGGAGGGCACTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ7-F：5’-TGATGGGGTTCACTGTAGGCATCATTGCGGACAGATTCCGCCCTCGATGTGAGCTAGAGTGCGGCGCATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ7-out-check R：5’-GCGAAACCATCGAGATTGCT-3’

Δ8-R：5’-TCCGCGGGCCGCCCGAAGATCTGGCAGCTGCGTCCGGATCTGTAGCGCCGCGGCGCTTGCTCCCGGATGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ8-F：5’-TGTGCCGCCAGGACCACAGCCTAAGAGGCCGGCTTCCGGGTGTATTGGAAATTTTTTTCGGCACGGTTCAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ8-out-check F：5’-CCTCGTCTCGACACTGACGT-3’

Δ9-R：5’-TTCCGCGTCAGATATCGAGCTCTGGACCGCCAAGCTCCGCGCGTTCGGCCATCAGACGCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ9-F：5’-ATCAAAGTCGCAACGGCGCAGATAATATGAAAGTTCATTCACATTGTGAATTCGCATTCTTTGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ9-out-check F：5’-GACCGTCATCAGAACGCTCA-3’

Δ10-R：5’-TCGTCGTTTTGCAAGAACGAATGTCGCTTTCGACTATCACTTTGTTGCTCGGGACTCTCGATGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ10-F：5’-ATTGCGGCGGAGCTACTCAGGATCGAACTCCTAACCCAAGAGTGGCACGCCCGCCGATGCTAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ10-out-check R：5’-CCGCGTGCGTTCATAACTAG-3’

Δ11-R：5’-AAGGCGAGCGACCTGTCTCAAACGAGATTTGGTCAGCTAAGATGAATTGAACTCATGTGACGCCCCATGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ11-F：5’-TTGGCGTATGGCAATGCGAAGTGTCGCGCCCGGCCCCGGGCAGGGGCTCCAGCGGCGCGCGACGTCAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ11-out-check F：5’-GCGATGACCTGGGTCGTATG-3’

Δ12-R：5’-TTCGCTGACCGGATCAAGACTTCGAATGGCCCGAACGCAAATCACAACCTAGGAGTTGCATAGTTGGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ12-F：5’-ATGATCCTCTGGGTTCAGCATATCGGCATTCGAACCACGAGTCGGTTTTCGAGGGGTACTGCCGGGTTAGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ12-out-check F：5’-TGAAGGGGACTCGTATAGCA-3’

Δ13-R：5’-AATGAGCCGCCCAGGGCGGCTCTTCTTGCTCGCCATTGGACGCTGTCGTTCTTTCCCTGGCAGCTCAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ13-F：5’-ATCGAGTCCCCCGCACCGAGGGCAAGGCAGCAGGGCCAAGACGCCGGCAACCCGACTTGAACTAGCATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ13-out-check F：5’-ATAGCACCAGAAGCCGTATT-3’

Δ14-R：5’-AGCCCGCTCTGCCCCCCGGGGGCCCGCCACAACCCGCTATTTCCCGCTGTGGTTCCGGGCTAGCGAAACGACCTGCAACTTA-3’

Δ14-F：5’-AGCGCGAGATCGTTCGCCGCATCGGCGAGCGGCTGTACGGCAAGGGAGGACAGCGCGATGGCTGAGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ14-out-check F：5’-TCGTAACTCTCTACACGTGC-3’

Δ15-F：5’-TCTGACCCTTTTCACTCTCACCCCAACCCGAACCCGCCCGAGTGGCGGTTCTTTCATTTGAAGACCACCGATGGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ15-out-check R：5’-CACTGTCTCCGGCGGGTTAA-3’

Δ16-F：5’-TGCGCGCCGCTTCGGTGTGTCGCCGACGCAGGTCGGCTTGATCAAACGGGGCAAGCGATGGGCGCACTTGTGATCGAATTACATTCCCAACCGCG-3’

Δ16-out-check R：5’-CTGGCCAAGTTCAGGATCGA-3’

genta-ins-check-1：5’-CATTCGCACATGTAGGCTCG-3’

genta-ins-check-2：5’-TTGGCCTCATGCTTGAGGAG-3’

3)对上述16个突变株DSM 7029Δ1～7029Δ16与野生型伯克氏菌DSM 7029进行生长曲线分析培养与CYMG液体48小时，72小时和96小时下扫描电镜检测，鉴定了一组与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子和细胞自溶相关的调控因子，其中，所述与伯克氏菌DSM7029生长相关的调控因子分别为编码基因长度为651个碱基对的TetR/AcrA家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS20450，4,852,481-4,853,131)，及编码基因长度为930个碱基对的LysR家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26400，6,187,137-6,188,066)；所述与伯克氏菌DSM 7029细胞自溶相关的调控因子为编码基因长度为480个碱基对的裂解酶(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS19980，4,741,451-4,741,930)，及编码基因长度为246个碱基对的XRE家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26360，6,176,723-6,176,968)。如图7所示，n＝3，SD，标准偏差。

实施例6：基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029底盘菌DT8-attB,DT9-attB和DT10-attB在高效异源表达β-变形菌纲来源的埃博霉素生物合成基因簇及隐秘基因簇挖掘方面的应用

1)对于来源于粘细菌Sorangium cellulosum So ce90中的NRP/PK类天然产物epothilone，构建异源表达载体pBAC-cm-phiC31-apra-P11-epothilone，通过电转化/接合转移与phiC31整合酶介导的位点特异性重组将该基因簇分别整合到三株基因组合理简化底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB，野生型伯克氏菌DSM 7029和两株应用广泛的革兰阴性底盘：大肠杆菌(E.coli GB05-MtaA)和恶臭假单胞菌(P.putida KT2440)中。然后将发表于Acs Synthetic Biology杂志上的甲基丙二酰辅酶A(MMCoA)和稀有tRNA过表达质粒pRK2-amp-MMCoA-tRNA(Ouyang,Q.,et al.,Promoter Screening FacilitatesHeterologous Production of Complex Secondary Metabolites in BurkholderialesStrains.Acs Synthetic Biology 2020,9,457-460.)电转化至携带埃博霉素基因簇的DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB中。通过HPLC/MS分析发酵产物，并计算478.3±0.5(15.5分钟)和492.3±0.5(16.1分钟)的相对峰面积发现，

DT8-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高2.7倍；DT9-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高3倍；DT10-attB中epothipone C和D的产量平均比野生型伯克氏菌DSM 7029高5倍,而大肠杆菌GB05-MtaA和恶臭假单胞菌KT2440均不能产生epothilones，见图4。

2)通过antiSMASH分析革兰阴性菌Chitinimonas koreensis DSM 17726(β-变形菌纲)的shotgun基因组序列，发现其基因组序列是不完整的，对该菌进行全基因组重测序并重构了这个43.7kb的完整chm基因簇(GenBank序列号：MW160162)。这个chm基因簇属于detoxin/rimosamide生物合成基因簇家族，具有一个杂合NRPS/PKS基因(detG/romI)和一个tauD-like(detJ/rmoL)基因。对chm基因簇进行直接克隆、强启动子替换与转移元件整合，构建chm基因簇表达质粒pBAC-cm-phiC31-amp-Papra-chm，并通过电转化/接合转移与phiC31attB介导的位点特异性重组，引入野生型伯克氏菌DSM 7029-attB、基因组合理简约化的突变株DT8-attB、DT9-attB和DT10-attB，以及两株应用广泛的革兰阴性底盘菌：大肠杆菌GB05-MtaA和恶臭假单胞菌KT2440。通过HPLC/MS分析发酵产物，发现DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB中都产生一系列信号峰，野生型伯克氏菌DSM 7029中只能够产生部分信号峰，而大肠杆菌GB05-MtaA、恶臭假单胞菌KT2440与阴性对照中完全不存在这些信号峰，计算944.4±0.5(10.7分钟)和1114.5±0.5(10.5分钟)的相对峰面积发现，DT8-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM 7029和DSM 17726高5倍和10倍，DT8-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高6.3倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生；DT9-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM7029和DSM 17726高2.6倍和6.3倍，DT9-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高2.8倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生；DT10-attB中chitinimide A的产量分别比野生型伯克氏菌DSM 7029和DSM 17726高8.4倍和18倍，DT10-attB中chitinimide B的产量比野生型伯克氏菌DSM 7029高13.7倍，DSM 17726中无法检测到chitinimide B的产生。通过对这些差异峰对应的化合物进行分离纯化与结构解析，鉴定了一系列化合物，其荷质比分别为m/z 944.3776[M+H]⁺,m/z 1114.4467[M+H]⁺,m/z1184.5240[M+H]⁺，和m/z1241.5286[M+H]⁺，命名为chitinimide A-D，见图5a-c所示。

序列表

<110>山东大学

<120>一组基因组合理简约化的伯克氏菌突变株与底盘菌株及其构建方法和应用

<141>2021-07-19

<160>2

<210>1

<211>7524

<212> DNA

<213>人工序列

<221> Cre位点特异性重组酶表达质粒pRK2-BAD-Cre-apra-SacB的核苷酸序列

<400> 1

gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc 60

gctaacggat tcaccactcc aagatgcata atgtgcctgt caaatggacg aagcagggat 120

tctgcaaacc ctatgctact ccgtcaagcc gtcaattgtc tgattcgtta ccaattatga 180

caacttgacg gctacatcat tcactttttc ttcacaaccg gcacggaact cgctcgggct 240

ggccccggtg cattttttaa atacccgcga gaaatagagt tgatcgtcaa aaccaacatt 300

gcgaccgacg gtggcgatag gcatccgggt ggtgctcaaa agcagcttcg cctggctgat 360

acgttggtcc tcgcgccagc ttaagacgct aatccctaac tgctggcgga aaagatgtga 420

cagacgcgac ggcgacaagc aaacatgctg tgcgacgctg gcgatatcaa aattgctgtc 480

tgccaggtga tcgctgatgt actgacaagc ctcgcgtacc cgattatcca tcggtggatg 540

gagcgactcg ttaatcgctt ccatgcgccg cagtaacaat tgctcaagca gatttatcgc 600

cagcagctcc gaatagcgcc cttccccttg cccggcgtta atgatttgcc caaacaggtc 660

gctgaaatgc ggctggtgcg cttcatccgg gcgaaagaac cccgtattgg caaatattga 720

cggccagtta agccattcat gccagtaggc gcgcggacga aagtaaaccc actggtgata 780

ccattcgcga gcctccggat gacgaccgta gtgatgaatc tctcctggcg ggaacagcaa 840

aatatcaccc ggtcggcaaa caaattctcg tccctgattt ttcaccaccc cctgaccgcg 900

aatggtgaga ttgagaatat aacctttcat tcccagcggt cggtcgataa aaaaatcgag 960

ataaccgttg gcctcaatcg gcgttaaacc cgccaccaga tgggcattaa acgagtatcc 1020

cggcagcagg ggatcatttt gcgcttcagc catacttttc atactcccgc cattcagaga 1080

agaaaccaat tgtccatatt gcatcagaca ttgccgtcac tgcgtctttt actggctctt 1140

ctcgctaacc aaaccggtaa ccccgcttat taaaagcatt ctgtaacaaa gcgggaccaa 1200

agccatgaca aaaacgcgta acaaaagtgt ctataatcac ggcagaaaag tccacattga 1260

ttatttgcac ggcgtcacac tttgctatgc catagcattt ttatccataa gattagcgga 1320

tcctacctga cgctttttat cgcaactctc tactgtttct ccatacccgt ttttttgggc 1380

tagcaggagg aattcaccat gtccaattta ctgaccgtac accaaaattt gcctgcatta 1440

ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga tggacatgtt cagggatcgc 1500

caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg tttgccggtc gtgggcggca 1560

tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac ctgaagatgt tcgcgattat 1620

cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta tccagcaaca tttgggccag 1680

ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa gtgacagcaa tgctgtttca 1740

ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg gtgaacgtgc aaaacaggct 1800

ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac tcatggaaaa tagcgatcgc 1860

tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt ataacaccct gttacgtata 1920

gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta ctgacggtgg gagaatgtta 1980

atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag gtgtagagaa ggcacttagc 2040

ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct ctggtgtagc tgatgatccg 2100

aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg ccgcgccatc tgccaccagc 2160

cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa ctcatcgatt gatttacggc 2220

gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg gacacagtgc ccgtgtcgga 2280

gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg agatcatgca agctggtggc 2340

tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaacc tggatagtga aacaggggca 2400

atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag cccagcccgc ctaatgagcg ggcttttttt 2460

tgaacaaaat gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg 2520

gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc 2580

gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca 2640

cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc 2700

cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt 2760

tcccacagat gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg 2820

gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca 2880

gatgaggggc gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt 2940

gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac 3000

caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc 3060

cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctctcgagtt ggcagcatca 3120

cccataattg tggtttcaaa atcggctccg tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa 3180

acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat 3240

tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg 3300

aaggaaataa taagtgcaat acgaatggcg aaaagccgag ctcatcggtc agcttctcaa 3360

ccttggggtt acccccggcg gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta gcgtccggcc 3420

cctcgaagat gggccacttg gactgatcga ggccctgcgt gctgcgctgg gtccgggagg 3480

gacgctcgtc atgccctcgt ggtcaggtct ggacgacgag ccgttcgatc ctgccacgtc 3540

gcccgttaca ccggaccttg gagttgtctc tgacacattc tggcgcctgc caaatgtaaa 3600

gcgcagcgcc catccatttg cctttgcggc agcggggcca caggcagagc agatcatctc 3660

tgatccattg cccctgccac ctcactcgcc tgcaagcccg gtcgcccgtg tccatgaact 3720

cgatgggcag gtacttctcc tcggcgtggg acacgatgcc aacacgacgc tgcatcttgc 3780

cgagttgatg gcaaaggttc cctatggggt gccgagacac tgcaccattc ttcaggatgg 3840

caagttggta cgcgtcgatt atctcgagaa tgaccactgc tgtgagcgct ttgccttggc 3900

ggacaggtgg ctcaaggaga agagccttca gaaggaaggt ccagtcggtc atgcctttgc 3960

tcggttgatc cgctcccgcg acattgtggc gacagccctg ggtcaactgg gccgagatcc 4020

gttgatcttc ctgcatccgc cagaggcggg atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc 4080

gattggctga gttcactatt atttagtgaa atgagatatt atgatatttt ctgaattgtg 4140

attaaaaagg caactttatg cccatgcaac agaaactata aaaaatacag agaatgaaaa 4200

gaaacagata gattttttag ttctttaggc ccgtagtctg caaatccttt tatgattttc 4260

tatcaaacaa aagaggaaaa tagaccagtt gcaatccaaa cgagagtcta atagaatgag 4320

gtcgaaaagt aaatcgcgcg ggtttgttac tgataaagca ggcaagacct aaaatgtgta 4380

aagggcaaag tgtatacttt ggcgtcaccc cttacatatt ttaggtcttt ttttattgtg 4440

cgtaactaac ttgccatctt caaacaggag ggctggaaga agcagaccgc taacacagta 4500

cataaaaaag gagacatgaa cgatgaacat caaaaagttt gcaaaacaag caacagtatt 4560

aacctttact accgcactgc tggcaggagg cgcaactcaa gcgtttgcga aagaaacgaa 4620

ccaaaagcca tataaggaaa catacggcat ttcccatatt acacgccatg atatgctgca 4680

aatccctgaa cagcaaaaaa atgaaaaata tcaagttcct gagttcgatt cgtccacaat 4740

taaaaatatc tcttctgcaa aaggcctgga cgtttgggac agctggccat tacaaaacgc 4800

tgacggcact gtcgcaaact atcacggcta ccacatcgtc tttgcattag ccggagatcc 4860

taaaaatgcg gatgacacat cgatttacat gttctatcaa aaagtcggcg aaacttctat 4920

tgacagctgg aaaaacgctg gccgcgtctt taaagacagc gacaaattcg atgcaaatga 4980

ttctatccta aaagaccaaa cacaagaatg gtcaggttca gccacattta catctgacgg 5040

aaaaatccgt ttattctaca ctgatttctc cggtaaacat tacggcaaac aaacactgac 5100

aactgcacaa gttaacgtat cagcatcaga cagctctttg aacatcaacg gtgtagagga 5160

ttataaatca atctttgacg gtgacggaaa aacgtatcaa aatgtacagc agttcatcga 5220

tgaaggcaac tacagctcag gcgacaacca tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga 5280

taaaggccac aaatacttag tatttgaagc aaacactgga actgaagatg gctaccaagg 5340

cgaagaatct ttatttaaca aagcatacta tggcaaaagc acatcattct tccgtcaaga 5400

aagtcaaaaa cttctgcaaa gcgataaaaa acgcacggct gagttagcaa acggcgctct 5460

cggtatgatt gagctaaacg atgattacac actgaaaaaa gtgatgaaac cgctgattgc 5520

atctaacaca gtaacagatg aaattgaacg cgcgaacgtc tttaaaatga acggcaaatg 5580

gtatctgttc actgactccc gcggatcaaa aatgacgatt gacggcatta cgtctaacga 5640

tatttacatg cttggttatg tttctaattc tttaactggc ccatacaagc cgctgaacaa 5700

aactggcctt gtgttaaaaa tggatcttga tcctaacgat gtaaccttta cttactcaca 5760

cttcgctgta cctcaagcga aaggaaacaa tgtcgtgatt acaagctata tgacaaacag 5820

aggattctac gcagacaaac aatcaacgtt tgcgcctagc ttcctgctga acatcaaagg 5880

caagaaaaca tctgttgtca aagacagcat ccttgaacaa ggacaattaa cagttaacaa 5940

atacctagat gtggcgcaac gatgccggcg acaagcagga gcgcaccgac ttcttccgca 6000

tcaagtgttt tggctctcag gccgaggccc acggcaagta tttgggcaag gggtcgctgg 6060

tattcgtgca gggcaagatt cggaatacca agtacgagaa ggacggccag acggtctacg 6120

ggaccgactt cattgccgat aaggtggatt atctggacac caaggcacca ggcgggtcaa 6180

atcaggaata agggcacatt gccccggcgt gagtcggggc aatcccgcaa ggagggtgaa 6240

tgaatcggac gtttgaccgg aaggcataca ggcaagaact gatcgacgcg gggttttccg 6300

ccgaggatgc cgaaaccatc gcaagccgca ccgtcatgcg tgcgccccgc gaaaccttcc 6360

agtccgtcgg ctcgatggtc cagcaagcta cggccaagat cgagcgcgac agcgtgcaac 6420

tggctccccc tgccctgccc gcgccatcgg ccgccgtgga gcgttcgcgt cgtctcgaac 6480

aggaggcggc aggtttggcg aagtcgatga ccatcgacac gcgaggaact atgacgacca 6540

agaagcgaaa aaccgccggc gaggacctgg caaaacaggt cagcgaggcc aagcaggccg 6600

cgttgctgaa acacacgaag cagcagatca aggaaatgca gctttccttg ttcgatattg 6660

cgccgtggcc ggacacgatg cgagcgatgc caaacgacac ggcccgctct gccctgttca 6720

ccacgcgcaa caagaaaatc ccgcgcgagg cgctgcaaaa caaggtcatt ttccacgtca 6780

acaaggacgt gaagatcacc tacaccggcg tcgagctgcg ggccgacgat gacgaactgg 6840

tgtggcagca ggtgttggag tacgcgaagc gcacccctat cggcgagccg atcaccttca 6900

cgttctacga gctttgccag gacctgggct ggtcgatcaa tggccggtat tacacgaagg 6960

ccgaggaatg cctgtcgcgc ctacaggcga cggcgatggg cttcacgtcc gaccgcgttg 7020

ggcacctgga atcggtgtcg ctgctgcacc gcttccgcgt cctggaccgt ggcaagaaaa 7080

cgtcccgttg ccaggtcctg atcgacgagg aaatcgtcgt gctgtttgct ggcgaccact 7140

acacgaaatt catatgggag aagtaccgca agctgtcgcc gacggcccga cggatgttcg 7200

actatttcag ctcgcaccgg gagccgtacc cgctcaagct ggaaaccttc cgcctcatgt 7260

gcggatcgga ttccacccgc gtgaagaagt ggcgcgagca ggtcggcgaa gcctgcgaag 7320

agttgcgagg cagcggcctg gtggaacacg cctgggtcaa tgatgacctg gtgcattgca 7380

aacgctagac gctcagtgga acgaggttca tgtgcagctc catcagcaaa aggggatgat 7440

aagtttatca ccaccgacta tttgcaacag tgccgttgat cgtgctatga tcgactgatg 7500

tcatcagcgg tggagtgcaa tgtc 7524

<210> 2

<211> 6017

<212> DNA

<213>人工序列

<221> pBBR1-SacB-apra

<400> 2

ctcgagttgg cagcatcacc cataattgtg gtttcaaaat cggctccgtc gatactatgt 60

tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta aggttttaga 120

atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg ggtatcttta 180

aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata agtgcaatac gaatggcgaa aagccgagct 240

catcggtcag cttctcaacc ttggggttac ccccggcggt gtgctgctgg tccacagctc 300

cttccgtagc gtccggcccc tcgaagatgg gccacttgga ctgatcgagg ccctgcgtgc 360

tgcgctgggt ccgggaggga cgctcgtcat gccctcgtgg tcaggtctgg acgacgagcc 420

gttcgatcct gccacgtcgc ccgttacacc ggaccttgga gttgtctctg acacattctg 480

gcgcctgcca aatgtaaagc gcagcgccca tccatttgcc tttgcggcag cggggccaca 540

ggcagagcag atcatctctg atccattgcc cctgccacct cactcgcctg caagcccggt 600

cgcccgtgtc catgaactcg atgggcaggt acttctcctc ggcgtgggac acgatgccaa 660

cacgacgctg catcttgccg agttgatggc aaaggttccc tatggggtgc cgagacactg 720

caccattctt caggatggca agttggtacg cgtcgattat ctcgagaatg accactgctg 780

tgagcgcttt gccttggcgg acaggtggct caaggagaag agccttcaga aggaaggtcc 840

agtcggtcat gcctttgctc ggttgatccg ctcccgcgac attgtggcga cagccctggg 900

tcaactgggc cgagatccgt tgatcttcct gcatccgcca gaggcgggat gcgaagaatg 960

cgatgccgct cgccagtcga ttggctgaat ccaagctctc gaagacgacc tcatgacctt 1020

tgcccgactg gtcgctcagt tcgagaagga actgcggaag gaggcagcat gaacccatca 1080

catatacctg ccgttcacta ttatttagtg aaatgagata ttatgatatt ttctgaattg 1140

tgattaaaaa ggcaacttta tgcccatgca acagaaacta taaaaaatac agagaatgaa 1200

aagaaacaga tagatttttt agttctttag gcccgtagtc tgcaaatcct tttatgattt 1260

tctatcaaac aaaagaggaa aatagaccag ttgcaatcca aacgagagtc taatagaatg 1320

aggtcgaaaa gtaaatcgcg cgggtttgtt actgataaag caggcaagac ctaaaatgtg 1380

taaagggcaa agtgtatact ttggcgtcac cccttacata ttttaggtct ttttttattg 1440

tgcgtaacta acttgccatc ttcaaacagg agggctggaa gaagcagacc gctaacacag 1500

tacataaaaa aggagacatg aacgatgaac atcaaaaagt ttgcaaaaca agcaacagta 1560

ttaaccttta ctaccgcact gctggcagga ggcgcaactc aagcgtttgc gaaagaaacg 1620

aaccaaaagc catataagga aacatacggc atttcccata ttacacgcca tgatatgctg 1680

caaatccctg aacagcaaaa aaatgaaaaa tatcaagttc ctgagttcga ttcgtccaca 1740

attaaaaata tctcttctgc aaaaggcctg gacgtttggg acagctggcc attacaaaac 1800

gctgacggca ctgtcgcaaa ctatcacggc taccacatcg tctttgcatt agccggagat 1860

cctaaaaatg cggatgacac atcgatttac atgttctatc aaaaagtcgg cgaaacttct 1920

attgacagct ggaaaaacgc tggccgcgtc tttaaagaca gcgacaaatt cgatgcaaat 1980

gattctatcc taaaagacca aacacaagaa tggtcaggtt cagccacatt tacatctgac 2040

ggaaaaatcc gtttattcta cactgatttc tccggtaaac attacggcaa acaaacactg 2100

acaactgcac aagttaacgt atcagcatca gacagctctt tgaacatcaa cggtgtagag 2160

gattataaat caatctttga cggtgacgga aaaacgtatc aaaatgtaca gcagttcatc 2220

gatgaaggca actacagctc aggcgacaac catacgctga gagatcctca ctacgtagaa 2280

gataaaggcc acaaatactt agtatttgaa gcaaacactg gaactgaaga tggctaccaa 2340

ggcgaagaat ctttatttaa caaagcatac tatggcaaaa gcacatcatt cttccgtcaa 2400

gaaagtcaaa aacttctgca aagcgataaa aaacgcacgg ctgagttagc aaacggcgct 2460

ctcggtatga ttgagctaaa cgatgattac acactgaaaa aagtgatgaa accgctgatt 2520

gcatctaaca cagtaacaga tgaaattgaa cgcgcgaacg tctttaaaat gaacggcaaa 2580

tggtatctgt tcactgactc ccgcggatca aaaatgacga ttgacggcat tacgtctaac 2640

gatatttaca tgcttggtta tgtttctaat tctttaactg gcccatacaa gccgctgaac 2700

aaaactggcc ttgtgttaaa aatggatctt gatcctaacg atgtaacctt tacttactca 2760

cacttcgctg tacctcaagc gaaaggaaac aatgtcgtga ttacaagcta tatgacaaac 2820

agaggattct acgcagacaa acaatcaacg tttgcgccta gcttcctgct gaacatcaaa 2880

ggcaagaaaa catctgttgt caaagacagc atccttgaac aaggacaatt aacagttaac 2940

aaagtataca ttgactaccg gaagcagtgt gaccgtgtgc ttctcaaatg cctgaggcca 3000

gtttgctcag gctctccccg tggaggtaat aattgacgat atgatcattt attctgcctc 3060

ccagagcctg ataaaaacgg tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc 3120

gaggtggccc ggctccatgc accgcgacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg 3180

gcgaggcggc tacagccgat agtctggaac agcgcactta cgggttgctg cgcaacccaa 3240

gtgctaccgg cgcggcagcg tgacccgtgt cggcggctcc aacggctcgc catcgtccag 3300

aaaacacggc tcatcgggca tcggcaggcg ctgctgcccg cgccgttccc attcctccgt 3360

ttcggtcaag gctggcaggt ctggttccat gcccggaatg ccgggctggc tgggcggctc 3420

ctcgccgggg ccggtcggta gttgctgctc gcccggatac agggtcggga tgcggcgcag 3480

gtcgccatgc cccaacagcg attcgtcctg gtcgtcgtga tcaaccacca cggcggcact 3540

gaacaccgac aggcgcaact ggtcgcgggg ctggccccac gccacgcggt cattgaccac 3600

gtaggccgac acggtgccgg ggccgttgag cttcacgacg gagatccagc gctcggccac 3660

caagtccttg actgcgtatt ggaccgtccg caaagaacgt ccgatgagct tggaaagtgt 3720

cttctggctg accaccacgg cgttctggtg gcccatctgc gccacgaggt gatgcagcag 3780

cattgccgcc gtgggtttcc tcgcaataag cccggcccac gcctcatgcg ctttgcgttc 3840

cgtttgcacc cagtgaccgg gcttgttctt ggcttgaatg ccgatttctc tggactgcgt 3900

ggccatgctt atctccatgc ggtagggtgc cgcacggttg cggcaccatg cgcaatcagc 3960

tgcaactttt cggcagcgcg acaacaatta tgcgttgcgt aaaagtggca gtcaattaca 4020

gattttcttt aacctacgca atgagctatt gcggggggtg ccgcaatgag ctgttgcgta 4080

cccccctttt ttaagttgtt gatttttaag tctttcgcat ttcgccctat atctagttct 4140

ttggtgccca aagaagggca cccctgcggg gttcccccac gccttcggcg cggctccccc 4200

tccggcaaaa agtggcccct ccggggcttg ttgatcgact gcgcggcctt cggccttgcc 4260

caaggtggcg ctgccccctt ggaacccccg cactcgccgc cgtgaggctc ggggggcagg 4320

cgggcgggct tcgccttcga ctgcccccac tcgcataggc ttgggtcgtt ccaggcgcgt 4380

caaggccaag ccgctgcgcg gtcgctgcgc gagccttgac ccgccttcca cttggtgtcc 4440

aaccggcaag cgaagcgcgc aggccgcagg ccggaggctt ttccccagag aaaattaaaa 4500

aaattgatgg ggcaaggccg caggccgcgc agttggagcc ggtgggtatg tggtcgaagg 4560

ctgggtagcc ggtgggcaat ccctgtggtc aagctcgtgg gcaggcgcag cctgtccatc 4620

agcttgtcca gcagggttgt ccacgggccg agcgaagcga gccagccggt ggccgctcgc 4680

ggccatcgtc cacatatcca cgggctggca agggagcgca gcgaccgcgc agggcgaagc 4740

ccggagagca agcccgtagg gcgccgcagc cgccgtaggc ggtcacgact ttgcgaagca 4800

aagtctagtg agtatactca agcattgagt ggcccgccgg aggcaccgcc ttgcgctgcc 4860

cccgtcgagc cggttggaca ccaaaaggga ggggcaggca tggcggcata cgcgatcatg 4920

cgatgcaaga agctggcgaa aatgggcaac gtggcggcca gtctcaagca cgcctaccgc 4980

gagcgcgaga cgcccaacgc tgacgccagc aggacgccag agaacgagca ctgggcggcc 5040

agcagcaccg atgaagcgat gggccgactg cgcgagttgc tgccagagaa gcggcgcaag 5100

gacgctgtgt tggcggtcga gtacgtcatg acggccagcc cggaatggtg gaagtcggcc 5160

agccaagaac agcaggcggc gttcttcgag aaggcgcaca agtggctggc ggacaagtac 5220

ggggcggatc gcatcgtgac ggccagcatc caccgtgacg aaaccagccc gcacatgacc 5280

gcgttcgtgg tgccgctgac gcaggacggc aggctgtcgg ccaaggagtt catcggcaac 5340

aaagcgcaga tgacccgcga ccagaccacg tttgcggccg ctgtggccga tctagggctg 5400

caacggggca tcgagggcag caaggcacgt cacacgcgca ttcaggcgtt ctacgaggcc 5460

ctggagcggc caccagtggg ccacgtcacc atcagcccgc aagcggtcga gccacgcgcc 5520

tatgcaccgc agggattggc cgaaaagctg ggaatctcaa agcgcgttga gacgccggaa 5580

gccgtggccg accggctgac aaaagcggtt cggcaggggt atgagcctgc cctacaggcc 5640

gccgcaggag cgcgtgagat gcgcaagaag gccgatcaag cccaagagac ggcccgagac 5700

cttcgggagc gcctgaagcc cgttctggac gccctggggc cgttgaatcg ggatatgcag 5760

gccaaggccg ccgcgatcat caaggccgtg ggcgaaaagc tgctgacgga acagcgggaa 5820

gtccagcgcc agaaacaggc ccagcgccag caggaacgcg ggcgcgcaca tttccccgaa 5880

aagtgccacc tgggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg 5940

caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt 6000

tatggacagc aagcgaa 6017

Claims

1.一组基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029突变株，其特征在于：所述突变株是以野生型伯克氏菌DSM 7029为出发菌，删除其基因组Tn1区域、Tn2区域、Tn34区域、Tn5-GI3区域、Tn6-GI1区域、Prophage 1区域、Prophage2-GI7区域和生物合成基因簇5制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5突变株，命名为DT8，该突变株删除了4.7％的基因组非必需区域；其中所述Tn1区域为46,274bp，是GenBank：CP011371.1，399,555-445,828bp；所述Tn2区域为30,979bp，是GenBank：CP011371.1，1,869,872-1,900,850bp；所述Tn34区域为64,539bp，是GenBank：CP011371.1，4,789,725-4,854,263bp；所述Tn5-GI3区域为27,328bp，是GenBank：CP011371.1，5,111,402-5,138,729bp；所述Tn6-GI1区域为36,134bp，是GenBank：CP011371.1，6,161,822-6,197,955bp；所述Prophage 1区域为24,197bp，是GenBank：CP011371.1，2,396,164-2,420,360bp；所述Prophage2-GI7区域为59,887bp，是GenBank：CP011371.1，4,682,041-4,741,927bp；所述生物合成基因簇5为BGC5，17.308bp，是GenBank：CP011371.1，2,677,295-2,694,602bp；或是以DT8基因组简约化突变株为出发菌，继续删除其生物合成基因簇6制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔPropha ge2-GI7ΔBGC5ΔBGC6突变株，命名为DT9，该突变株删除了4.8％的基因组非必需区域；其中所述生物合成基因簇6为BGC6，3,373bp，是GenBank：CP011371.1，3,093,895-3,097,267bp；或是以DT9基因组简约化突变株为出发菌，继续删除其生物合成基因簇7制得的基因组简约化的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1ΔTn2ΔTn34ΔTn5-GI3ΔTn6-GI1ΔProphage1ΔProphage2-GI7ΔBGC5ΔBGC6ΔBGC7突变株，命名为DT10，该突变株删除了4.9％的基因组非必需区域；其中所述生物合成基因簇7为BGC7，7,588bp，是GenBank：CP011371.1，3,195,049-3,202,636bp。

2.权利要求1所述基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM7029突变株的构建方法，包括基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶的遗传操作系统，还包括结合多组学分析对伯克氏菌DSM 7029基因组上非必需基因的确定、Cre/loxP位点特异性重组系统以及SacB反向筛选系统的基因组简约化方法的建立，实现DSM 7029基因组上多个非必需区域的无抗性筛选标记连续删除；其特征在于，所述的基因组简约化方法是：

1)基于伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km介导的重组系统，删除伯克氏菌DSM 7029野生型中的Tn1区域，其中所述Tn1区域为46,274bp，是GenBank：CP011371.1，3 99,555-445,828bp；具体的，以质粒pR6K-genta-loxM-FleQ为模板，利用引物Tn1-del-F，Tn1-del-R通过PCR扩增两端带有～80bp同源臂及lox66，lox71位点特异性重组酶识别位点的庆大霉素抗性筛选标记的基因盒，通过同源重组取代目标删除区域Tn1，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；

2)利用引物RK2-Apra-1，sacB-Apra-2和sacB-1进行PCR获得Apra-SacB片段，与线性化的pRK2-BAD-Cre-cm质粒获得PRK2-BAD-Cre片段通过线线重组构建核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的Cre位点特异性重组酶表达载体pRK2-BAD-Cre-apra-SacB，将该质粒电转化至成功取代Tn1区域的转化子中，添加2％的100mg/mL阿拉伯糖诱导Cre酶瞬时表达，消除基因组上的庆大霉素抗性筛选标记，留下一个不可被Cre酶识别的lox72疤痕位点，并利用引物Tn1-check-F，Tn1-check-R，genta-ins-check-1和genta-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；

3)将成功消除庆大霉素抗性筛选标记的转化子在含有浓度为5％、7％、10％或15％蔗糖的液体培养基中少量多次连续转接，30℃，950rpm培养，以消除Cre位点特异性重组酶表达质粒，利用引物sacB-ins-1，sacB-ins-2进行菌落PCR与双划线鉴定，经过这一轮基因组简化方法制得缺失Tn1区域的伯克氏菌DSM 7029ΔTn1突变株，命名为DT1突变株；

4)重复上述步骤1)～3)，删除Tn2区域时替换引物为：Tn2-del-F，Tn2-del-R，Tn2-check-F和Tn2-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT2；重复上述步骤1)～3)，删除Tn34区域时替换引物为：Tn3Tn4-del-F，Tn3Tn4-del-R，Tn3Tn4-check-F和Tn3Tn4-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT3；重复上述步骤1)～3)，删除Tn5-GI1区域时替换引物为Tn5-del-F，Tn5-del-R，Tn5-check-F和Tn5-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT4；重复上述步骤1)～3)，删除Tn6区域时替换引物为：Tn6-del-F，Tn6-del-R，Tn6-check-F和Tn6-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT5；重复上述步骤1)～3)，删除Prophage1区域时替换引物为Pro1-del-F，Pro1-del-R，Pro1-check–F和Pro1-check–R，得到基因组合理简约化突变株DT6；重复上述步骤1)～3)，删除Prophage2-GI7区域时替换引物为：Pro2-del-F，Pro2-del-R，Pro2-check–F和Pro2-check–R，得到基因组合理简约化突变株DT7；重复上述步骤1)～3)，删除生物合成基因簇5时替换引物为：C5-del-F，C5-del-R，C5-check-F和C5-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT8；重复上述步骤1)～3)，删除生物合成基因簇6时替换引物为：C6(3k)-del-F，C6(3k)-del-R，C6(3k)-check-F和C6(3k)-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT9；重复上述步骤1)～3)，删除生物合成基因簇7时替换引物为：C7(7k)-del-F，C7(7k)-del-R，C7(7k)-check-F和C7(7k)-check-R，得到基因组合理简约化突变株DT10。

3.一组基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029底盘菌株，其特征在于：所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT8出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT8突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT8-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT9突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT9-attB；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，利用其自身重组酶介导的同源重组在DT10突变株的基因组上定点插入phiC31 attB位点取代该突变株如GenBank：CP011371.1，3,979,777bp-3,982,566bp所示的2789bp的基因组区域得到的突变株，命名为DT810-attB。

4.权利要求3所述基因组合理简约化的伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM7029底盘菌株的构建方法，步骤是：

5.一组基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea)DSM 7029底盘菌株，其特征在于：所述底盘菌株是一个由基因组简约化突变株DT6出发，在DT6中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT6-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT7出发，在DT7中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT7-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT8出发，在DT8中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT8-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT9出发，在DT9中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT9-pf；或是一个由基因组简约化突变株DT10出发，在DT10中利用核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒消除重组酶表达质粒后得到的突变株，命名为DT10-pf。

6.权利要求5所述基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea)DSM 7029底盘菌株的构建方法，步骤是：

基于伯克氏菌DSM 7029重组酶表达质粒pBBR1-Rha-RedG-BA 7029-Km，利用引物GBA7029::apra-F和GBA7029::apra-R通过PCR扩增带有～50bp同源臂的apra-sacB片段，利用同源重组发生线环重组构建核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的pBBR1-SacB-apra竞争质粒；将该竞争质粒pBBR1-SacB-apra分别电转化至基因组简约化突变株DT6，DT7，DT8，DT9和DT10中，在含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上筛选正确的转化子，并利用pBBR1-SacB-apra质粒的内部引物sacB-apra-ins-check-1,sacB-apra-ins-check-2进行菌落PCR鉴定；鉴定正确的转化子挑入含有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG液体培养基中连续少量转接2～3次，在最后一次转接培养结束后，取100μL菌液三区划线于带有相应浓度阿卜拉霉素的CYMG平板上，并挑取单克隆利用引物GBA7029-ins-check-1，GBA7029-ins-check-2进行菌落PCR验证重组酶质粒已消除；最后利用SacB反向筛选，在含有浓度为5％、7％、10％或15％蔗糖的液体培养基中少量多次连续转接上述已验证正确的转化子，30℃，950rpm培养，以消除引入的竞争质粒pBBR1-SacB-apra，即可分别得到基因组合理简约化伯克氏菌DSM 7029无重组酶表达质粒的底盘菌株DT6-pf，DT7-pf，DT8-pf，DT9-pf和DT10-pf。

7.一组与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子或细胞自溶相关的调控因子，其特征在于：所述与伯克氏菌DSM 7029生长相关的调控因子分别为编码基因长度为651个碱基对的TetR/AcrA家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS20450，4,852,481-4,853,131)，及编码基因长度为930个碱基对的LysR家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26400，6,187,137-6,188,066)；所述与伯克氏菌DSM 7029细胞自溶相关的调控因子为编码基因长度为480个碱基对的裂解酶(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS19980，4,741,451-4,741,930)，及编码基因长度为246个碱基对的XRE家族转录调控因子(GenBank：CP011371.1，AAW51_RS26360，6,176,723-6,176,968)。

8.基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株或基因组合理简约化的无重组酶表达质粒的伯克氏菌底盘菌株在对β-变形菌纲来源天然产物的产量优化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述底盘菌株是底盘菌DT8-attB，DT9-attB或DT10-attB；所述β-变形菌纲来源天然产物为来源于粘细菌Sorangium cellulosumSo ce90中的NRP/PK类天然产物epothilones；所述应用方法是：将构建的埃博霉素生物合成基因簇的表达质粒pBAC-cm-phiC31-apra-P11-epothilone通过电转化与phiC31整合酶介导的位点特异性重组，再分别将所述基因簇整合到三株基因组合理简化底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB以及野生型伯克氏菌DSM 7029中，评价埃博霉素在各个菌中的异源表达产量。

10.基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株在对β-变形菌纲来源的隐秘基因簇的高效异源表达中的应用，其特征在于：所述底盘菌株是底盘菌DT8-attB，DT9-attB或DT10-attB；所述应用方法是：利用ExoCET介导的直接克隆技术和Red/ET重组工程对Chitinimonaskoreensis DSM 17726中的隐秘基因簇chm进行直接克隆，启动子替换及phiC31整合酶插入，构建异源表达载体p15A-phiC31-amp-Papra-chm，通过电转化与phiC31整合酶介导的位点特异性重组，再分别将该基因簇整合到三株基因组合理简化底盘菌DT8-attB，DT9-attB和DT10-attB以及野生型伯克氏菌DSM 7029中，评价在各个菌中是否有新化合物异源表达。