CN116920073B - 一种多肽在腹泻治疗中的应用及含该多肽的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽在腹泻治疗中的应用及含该多肽的药物，属于畜牧业技术领域。本发明所提供的多肽是Vioprolide C，Vioprolide C是一种具有特定结构的环状多肽，其可以有效的抑制猪流行性腹泻病毒，从而可以将其用于制备治疗猪流行性腹泻的药物，并产生优异的猪流行性腹泻病毒抑制效果。
Description
技术领域
本发明属于畜牧业技术领域，尤其涉及一种多肽在腹泻治疗中的应用及含该多肽的药物。
背景技术
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，简称PEDV）是一种主要感染猪的病原体，其是一种有囊膜单股正链RNA病毒并且是引起猪流行性腹泻的重要病因之一。该病毒主要通过粪便传播，可以通过直接接触感染猪或者间接接触受污染的物体而传播。感染猪流行性腹泻病毒后，猪会出现呕吐、水样腹泻和严重脱水等症状。
猪流行性腹泻病毒首次在英国被发现，之后在全球范围内广泛传播。2010年，PEDV的变异株在中国大规模爆发，给养猪业带来了严重的经济损失。目前，针对PEDV的防控措施主要是通过给母猪接种疫苗，使其产生母源抗体，从而传递给仔猪，达到免疫的目的。然而，近年来的临床实践表明，疫苗的保护效率并不能达到100%的完全防护，仍然有部分已免疫的猪场出现PEDV疫情的情况。因此，迫切需要找到一种能够有效阻止PEDV感染的方法。
Vioprolide C是从紫色孢囊杆菌（Cystobacter Violaceus）中获得的一种环状多肽，其结构如下式（1）所示：
式（1）
尽管相关的研究表明Vioprolide C具有优异的抗真菌和抗癌活性，但是目前还没有关于Vioprolide C在猪流行性腹泻病毒抑制和猪流行性腹泻治疗方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽在腹泻治疗中的应用及含该多肽的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了Vioprolide C在制备治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
优选地，所述Vioprolide C的结构如式（1）所示。
优选地，所述Vioprolide C通过抑制猪流行性腹泻病毒来治疗猪流行性腹泻。
第二方面，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒的抑制药物，所述抑制药物的制备方法包括如下步骤：
（1）将0.2g 维生素C，3g海藻酸钠，1-16mg Vioprolide C用100ml水配置成悬液；
（2）使用0.22微米的滤膜过滤，得到猪流行性腹泻病毒的抑制药物。
优选地，所述Vioprolide C的结构如式（1）所示。
第三方面，本发明提供了Vioprolide C在制备猪流行性腹泻病毒的抑制药物中的应用。
优选地，所述Vioprolide C的结构如式（1）所示。
优选地，所述Vioprolide C通过直接抑制猪流行性腹泻病毒来抑制猪流行性腹泻病毒感染。
第四方面，本发明提供了Vioprolide C在制备抑制猪流行性腹泻病毒的病毒抑制剂中的应用。
优选地，所述Vioprolide C的结构如式（1）所示。
优选地，所述Vioprolide C提供通过减少猪流行性腹泻病毒的RNA复制和病毒蛋白表达来有效的抑制猪流行性腹泻病毒。
本发明的有益效果在于，本发明发现一种环状的多肽Vioprolide C能够有效抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的复制，该研究结果为PEDV的防治带来新的希望。
本发明发现Vioprolide C可以显著抑制PEDV在Vero细胞中的复制，减少病毒的RNA复制以及病毒的核衣壳蛋白表达。而且，本发明通过实验发现，Vioprolide C主要通过对PEDV的直接杀伤来抑制PEDV。
总体来说，本发明首次发现Vioprolide C是一种潜在的抗PEDV天然产物。该研究为PEDV的防治提供了新的候选药物，并且可以将其用于制备治疗猪流行性腹泻的药物。
附图说明
图1为Vioprolide C对于Vero-E6细胞的细胞毒性的检测结果；
其中，*表示P＜0.05；
图2为Vioprolide C对于PEDV病毒的抑制作用的检测结果；
其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；
图3为Vioprolide C对于PEDV病毒的RNA复制影响的检测结果；
其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；
图4为Vioprolide C对于细胞内PEDV病毒的核衣壳蛋白表达量影响的检测结果；
图5为Vioprolide C发挥病毒抑制作用的作用机制的检测结果；
其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1:Vioprolide C的细胞毒性
（1）使用无血清的DMEM培养基将Vioprolide C多肽配置成320、160、80、40、20和10μg/ml的浓度，并使用0.22微米的滤膜过滤；
（2）将对数生长期的Vero-E6细胞经过胰酶消化后，加入适量的DMEM培养基制备成细胞悬液并接种在96孔板中；
（3）待细胞长满为单层后，分别加入不同浓度添加血清的Vioprolide C溶液，同时设置对照组加入含血清的DMEM培养基，每个浓度处理设置3个重复孔；
（4）将孔板放入37℃的细胞培养箱中，继续培养48小时后；
（5）加入10μl CCK-8，孵育3h后，利用酶标仪测定各孔的OD450nm值；
（6）根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率=（实验组OD450nm-空白孔OD450nm）-（对照组OD450nm-空白孔OD450nm）。
实施例2:Vioprolide C对于PEDV病毒的抑制作用检测
（1）对数生长期的Vero-E6细胞经过胰酶消化后，加入适量的DMEM培养基制备成细胞悬液并接种100ul在96孔板中；
（2）待细胞长满为单层后，实验组加入10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的含血清的Vioprolide C多肽溶液预处理12个小时，阳性对照组和阴性对照组添加含血清的DMEM培养基；
（3）弃去培养基并使用PBS清洗，使用0.1MOI PEDV感染细胞2h，阴性对照组不进行感染；
（4）更换为病毒维持培养基继续培养48h；
（5）加入10μl CCK-8，孵育3h后，利用酶标仪测定各孔的OD450nm值；
（6）根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率=（实验组OD450nm-空白孔OD450nm）-（对照组OD450nm-空白孔OD450nm）。
实施例3:检测Vioprolide C对于PEDV病毒RNA复制的影响
（1）对数生长期的Vero-E6细胞经过胰酶消化后，加入适量的DMEM培养基制备成细胞悬液并接种在6孔板中；
（2）待细胞长满为单层后，实验组加入10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的含血清的Vioprolide C多肽溶液预处理12个小时，阳性对照组不做处理；
（3）弃去培养基并使用PBS清洗，使用0.1MOI PEDV感染细胞2h；
（4）更换为病毒维持培养基继续培养48h；
（5）去除培养基，使用PBS清洗后，每孔加入Trizol试剂彻底裂解细胞;
（6）向裂解液中加入氯仿，剧烈摇晃使样本充分混合，静置分层，将上层转移到新的RNase free的EP管中；
（7）加入等体积异丙醇，充分混合后，4°C条件下离心沉淀RNA；
（8）用75%乙醇轻轻洗涤RNA沉淀，弃去乙醇，风干后，用40μl RNase free水溶解；
（9）使用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度合格后，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；
（10）使用SYBR荧光定量PCR试剂盒检测各组的PEDV RNA的相对表达水平。
实施例4:检测Vioprolide C对于细胞内PEDV核衣壳蛋白（PEDV-N）的表达量的影响
（1）对数生长期的Vero-E6细胞经过胰酶消化后，加入适量的DMEM培养基制备成细胞悬液并接种在6孔板中；
（2）待细胞长满为单层后，实验组加入10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的含血清的Vioprolide C多肽溶液预处理12个小时，阳性对照组不做处理；
（3）弃去培养基并使用PBS清洗，使用0.1MOI PEDV感染细胞2h；
（4）更换为病毒维持培养基继续培养48h；
（5）去除培养基，使用PBS清洗后，每孔加入100μl RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，每10分钟混匀一次；
（6）将裂解液转移至1.5mL EP管，4°C、12000rpm离心15分钟；
（7）吸取上清到新的EP管中，得到蛋白样品，配置BCA工作液，测定各组蛋白样品的蛋白浓度；
（8）在蛋白样品中加入上游缓冲液，100℃煮沸5min；
（9）配置分离胶，装胶并加酒精层保湿，等分离胶凝固后，倒掉酒精层加入浓缩胶；
（10）等胶凝固后，装槽并加入1倍电泳缓冲液，上样后，80V恒电压电泳至溴酚蓝到达分离胶后，调整电压为120V直至结束；
（11）活化PVDF膜，配制转膜缓冲液，转膜设备夹层设置海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵， 100V恒电压转膜1.5小时；
（12）5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2小时后，使用一抗稀释液按照1:1000比例稀释PEDV-N抗体，4°C孵育过夜；
（13）PBST洗涤3次，每次10分钟，按照1:5000稀释二抗，室温孵育1小时；
（14）PBST 洗涤3次，每次10分钟， ECL试剂显色和曝光。
实施例5：检测Vioprolide C发挥PEDV病毒抑制作用时的作用机制
（1）将Vero-E6细胞经过胰酶消化后，加入适量的DMEM培养基制备成细胞悬液并接种100ul在96孔板中；
（2）待细胞生长为单层细胞后，按照如下分组进行实验：
a组（感染前期阶段）：加入含有20μg/ml Vioprolide C的DMEM细胞培养基预处理Vero-E6细胞12h后，弃去培养基，使用0.1MOI PEDV感染细胞2h后，使用病毒维持培养基继续培养48h；
b组（感染阶段）：使用PEDV病毒液将Vioprolide C配置成20μg/ml的浓度，置于37℃孵育1h后，使用0.1MOI孵育后的PEDV感染细胞2h，使用病毒维持培养基继续培养48h；
c组（感染后阶段）：使用0.1MOI PEDV感染细胞2h后，添加含有20μg/mlVioprolide C的病毒维持培养基继续培养48h；
同时，设置不进行病毒感染的阴性对照组和只进行病毒感染不使用Vioprolide C处理的阳性对照组；
（3）加入10μl CCK-8，孵育3h后，利用酶标仪测定各孔的OD450nm值；
（4）根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率=（实验组OD450nm-空白孔OD450nm）-（对照组OD450nm-空白孔OD450nm）。
实施例6:（1）将0.2g 维生素C，3g海藻酸钠，1mg Vioprolide C用100ml水配置成悬液；
（2）使用0.22微米的滤膜过滤，得到猪流行性腹泻病毒的抑制药物1。
实施例7:（1）将0.2g 维生素C，3g海藻酸钠，2mg Vioprolide C用100ml水配置成悬液；
（2）使用0.22微米的滤膜过滤，得到猪流行性腹泻病毒的抑制药物2。
实施例8:（1）将0.2g 维生素C，3g海藻酸钠，16mg Vioprolide C用100ml水配置成悬液；
（2）使用0.22微米的滤膜过滤，得到猪流行性腹泻病毒的抑制药物3。
实验结果:
实施例1的实验结果如图1所示，从图中可以看出，在Vioprolide C的浓度为10μg/ml-160μg/ml时，实验组的细胞生存率与对照组没有显著差异。然而，当Vioprolide C的浓度达到320μg/ml时，实验组的细胞生存率出现了下降。这表明，Vioprolide C对于Vero-E6细胞的安全浓度范围应该在10μg/ml-160μg/ml之间。
实施例2的实验结果如图2所示，从图中可以看出，10、20和40μg/ml的VioprolideC能够显著增加PEDV感染后细胞的活性。这表明Vioprolide C可以有效降低PEDV感染Vero-E6细胞。
实施例3的实验结果如图3所示，从图中可以看出，在未添加Vioprolide C的情况下，细胞中的病毒RNA含量较高。这表明，在未受到抑制剂的干预下，PEDV在细胞内持续复制，并不断释放病毒RNA。然而，当细胞被Vioprolide C处理后，病毒RNA的含量明显减少。这表明Vioprolide C能够抑制PEDV的复制过程，从而减少病毒RNA的产生和释放。
实施例4的结果如图4所示，从图中可以看出，在使用Vioprolide C处理后，细胞中PEDV-N的表达水平显著下降。这表明Vioprolide C能够通过减少PEDV的病毒组装来抑制PEDV的复制；
同时，结合图2-图4的结果可以看出，当Vioprolide C的浓度为10μg/ml时，已经能够发挥出明显的抑制作用；而当浓度增至20μg/ml时，Vioprolide C表现出最佳的治疗效果。
实施例5的结果如图5所示，从图中可以看出，在感染前阶段、感染阶段和感染后阶段，使用Vioprolide C都可以抑制PEDV的生长。这说明Vioprolide C在不同感染阶段均具有抗PEDV的活性。
同时，可以看出，在感染后阶段使用Vioprolide C的抑制效果最差，而在感染阶段使用Vioprolide C的效果最佳。这表明Vioprolide C主要通过对PEDV的直接杀伤作用来产生抑制效果。这些结果进一步验证了Vioprolide C作为PEDV抑制剂的潜在应用价值。
Claims (4)
1.Vioprolide C在制备治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Vioprolide C通过抑制猪流行性腹泻病毒来治疗猪流行性腹泻。
3. Vioprolide C在制备猪流行性腹泻病毒的抑制药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Vioprolide C通过直接抑制猪流行性腹泻病毒来抑制猪流行性腹泻病毒感染。
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