CN101781651B

CN101781651B - 用于抑制ⅰ型登革病毒复制的靶向小干扰rna序列

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Publication number: CN101781651B
Application number: CN2009100367058A
Authority: CN
Inventors: 吴新伟; 王鸣; 杜琳; 岳锦亚; 蒋力云
Original assignee: GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER
Current assignee: GUANGZHOU DISEASE PREVENTION-CONTROL CENTER
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN101781651A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及对于重大传染病具有预防、治疗作用的小分子药物。本发明所述的用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列，即siRNA序列，为双链分子，有21个碱基配对，正义链的序列为SEQ IDNO.1，反义链的序列为SEQ ID NO.2。本发明从I型登革病毒基因中设计合成并筛选得到一段小干扰RNA序列即siRNA序列，达到抑制登革病毒复制、保护细胞不被登革病毒破坏的功能。

Description

用于抑制Ⅰ型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及对于重大传染病具有预防、治疗作用的小分子药物。

背景技术

登革病毒属于黄病毒科，分为四个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，登革热(dengue fever，DF)和登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)两种不同类型的急性传染病。据WHO估计，全世界每年约发生1亿例DF，50万例DHF，导致25000人死亡，而且在亚、非、南美的热带地区发病率呈上升趋势，近年在我国周边的印度、越南、印尼及柬埔寨等地屡屡发生登革热的大流行。广东省自佛山市在1978年首次发生IV型DEN流行后，至2001年已发生13次登革热暴发流行或局部流行。广州市在90年代初发生过两次登革热局部流行，1995年发生I型登革热暴发流行，疫情波及7区1县级市，病例数达5505例。2002、2006年广州市再度爆发登革热，超过1000人感染。2006年全国有多个省市报告登革热感染，可见登革热已成为中国的一个严重的公共卫生问题。

登革热至今仍没有有效的疫苗或治疗药物。新近的研究表明，RNA干扰可能是一个新的突破口。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默机制，从线虫到人类细胞中都广泛存在。外源导入的dsRNA被Dicer酶切割成21～25nt的小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)，siRNA与体内其他成分聚合形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过碱基配对原理来切割与siRNA具有同源序列的转录体，最终导致特异的基因沉默效应。目前RNAi技术发展十分迅速，不仅已成为研究基因功能、开发基因治疗药物的有力工具，还作为宿主细胞抑制病毒复制、清除病毒的一种胞内机制，被广泛用于抗病毒感染的研究领域。利用RNAi技术特异性地抑制HIV、HCV、HBV、脊髓灰质炎病毒和流感病毒的复制及蛋白表达都取得了初步成功，甚至也能有效地抑制SARS冠状病毒在Vero E6细胞中的复制。由于RNAi具有高效性、高特异性、低细胞毒性的优点，被认为是抗病毒治疗的新希望。

利用RNAi抑制登革病毒复制的研究在国外尚处于起步阶段，在国内则未见文献报道。国外Adelman等(J Virol.2002；76：12925)利用与II型登革病毒PrM基因同源的290bp的dsRNA转入C6/36蚊细胞，发现可以抑制登革病毒的复制；而将与登革病毒C、PrM及NS5基因同源的240～290bp长度的dsRNA注入成蚊，可以保护成蚊免受登革病毒感染。但是该技术存在以下缺陷：

(1)真正发挥RNAi作用的不是dsRNA，而是dsRNA的裂解产物，21～25nt长度的siRNA混合物，该技术利用290bp长度的dsRNA作为药物，但真正发挥作用的siRNA序列未知；

(2)长度超过30个碱基对的双链RNA导入哺乳动物细胞会诱导干扰素的合成，表现出广泛的非特异性阻抑效应，导致细胞凋亡，该技术利用290bp长度的dsRNA作为药物，无法在实验研究和临床中应用于哺乳动物；

(3)290bp长度的dsRNA体外合成难度大，成本高，难以进一步推广；

(4)该技术针对的是II型登革病毒，对I型登革病毒的作用未知，但国内自1995年以来造成流行的为I型登革病毒，因此该技术对国内的登革热防治工作影响有限。

因此，本发明以达到在C6/36细胞中高效抑制登革病毒复制的目的。

发明内容

本发明的目的是直接从I型登革病毒基因中设计合成并筛选得到一段小干扰RNA序列即siRNA序列，达到抑制登革病毒复制、保护细胞不被登革病毒破坏的功能。

本发明所述的用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列，即siRNA序列，为双链分子，有21个碱基配对，正义链的序列为SEQ ID NO.1，反义链的序列为SEQ ID NO.2。

正义链：5’-AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3’ SEQ ID NO.1

负义链：5’-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3’ SEQ ID NO.2

发明人根据2002年广州市I型登革病毒流行株GZ02-218(GenBank登录号EF079826)、GenBank中I型登革病毒参考株(GenBank登录号NC001477)及其它I型登革病毒基因序列，按以下原则在病毒基因组不同位置设计10段siRNA序列，每段均为21对核苷酸：

A.紧接连续的2个A碱基；

B.G、C碱基含量在30％～50％；

C.不多于连续4个T碱基；

D.与宿主细胞无同源性；

E.尽量选择在I型登革病毒中保守的序列。

经筛选，获得上述的一段21对核苷酸的siRNA序列(代号DenSi-1)。

根据所设计的序列，由美国Ambion公司用化学方法合成相应的siRNA片段，并用PAGE电泳纯化；然后通过实验评价siRNA对登革病毒在蚊细胞C6/36细胞中复制的抑制作用，以及对C6/36细胞的保护作用。

(3)效果评价：

培养C6/36细胞，分为以下三组：

正常组：不添加任何试剂，也不用登革病毒攻击；

对照组：不添加任何试剂，仅用登革病毒攻击；

siRNA组：用脂质体法转染合成的siRNA，以登革病毒攻击。

观察各组以下指标，包括：

A.细胞学检测：细胞形态病变和MTT实验；

B.抗原检测：间接免疫荧光实验

C.核酸检测：荧光定量PCR

本发明所述的用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列，具有以下特点和优点：

(1)本发明成功设计并验证了一段针对I型登革病毒的靶向性siRNA序列，根据该序列合成的siRNA具有抑制登革病毒复制、保护细胞不被登革病毒破坏的功能。目前国内外尚无类似报道。

(2)本发明首次采用长度仅21nt的siRNA来作为针对I型登革病毒的靶向性序列，并通过实验获得了一段效果较好的靶向性siRNA序列。该21nt双链RNA导入哺乳动物细胞不会诱导干扰素的合成，因此可在实验研究和临床中应用于哺乳动物；

(3)本发明所述的靶向性siRNA序列合成方便，成本低，便于推广。

(4)本发明所述的靶向性siRNA序列是针对国内流行的I型登革病毒，对国内的登革热防治具有重要意义。

附图说明

图1显示了正常组、对照组、siRNA组这三组细胞形态病变情况。

图2显示了MTT法检测正常组、对照组、siRNA组这三组活细胞数的情况。

图3显示了免疫荧光法检测正常组、对照组、siRNA组这三组细胞内登革病毒抗原的情况。

图4显示了荧光定量PCR法检测正常组、对照组、siRNA组这三组各组细胞内登革病毒核酸量的情况。

具体实施方式

1、试剂与仪器

I型登革病毒流行株GZ02-218，来源于2002年登革热疫情中分离所得，由广州市疾病预防控制中心病毒免疫科保存(GenBank登录号EF079826)。

白蚊伊蚊C6/36细胞株，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)(货号CRL-1660)，由广州市疾病预防控制中心病毒免疫科传代并保存。

QIAGEN公司HiPerFect Transfection Reagent转染试剂盒、QIAamp ViralRNA提取试剂盒；深圳太太基因有限公司登革1型病毒实时荧光RT-PCR试剂盒；SIGMA公司登革I型病毒鼠抗人单克隆抗体及荧光标记兔抗鼠IgG抗体，GIBCO公司MEM细胞培养基、双抗，广州蕊特生物科技有限公司新生牛血清。其它试剂均为分析纯。

Cepheid公司smart cycler II多程序实时荧光定量PCR仪，ZEISS公司Axiocam HRC荧光显微镜，Eppendorf公司Centrifuge 5417R高速冷冻离心机。

2、siRNA设计与合成

根据2002年广州市I型登革病毒流行株GZ02-218(GenBank登录号EF079826)、GenBank中I型登革病毒参考株(GenBank登录号NC001477)及其它I型登革病毒基因序列，设计以下一段21对核苷酸的siRNA序列(代号DenSi-1)：

正义链：5’-AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3’

负义链：5’-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3’

根据设计的序列，交由美国Ambion公司用化学方法合成相应的siRNA片段，并用PAGE电泳纯化。

3、siRNA转染白蚊伊蚊C6/36细胞

转染前一天接种C6/36细胞至24孔板，细胞计数1X10⁶个/孔，每孔0.5ml含10％新生牛血清MEM培养液。将其平均分为三组：正常组、siRNA组和对照组。待细胞长成单层，融合度达到80％～90％时，对siRNA组细胞进行转染。

具体操作步骤如下：

(1)取无菌且去RNA酶的洁净EP管，做好标记，每管加入200ul无血清MEM培养液；

(2)将1.0ug的siRNA溶解在各管培养液中，再分别加入3ul转染试剂HiPerFect Transfection Reagent，振荡混匀，室温静置10分钟；

(3)siRNA组C6/36细胞吸去培养液后，用PBS洗2次，然后加入转染液200ul/孔。正常组及对照组细胞则加入无血清MEM培养液200ul/孔。轻轻晃匀使液体均匀覆盖各孔。置于28℃、2.5％CO₂培养箱中培养4～6小时。

4、登革病毒攻击白蚊伊蚊C6/36细胞

(1)在P2实验室中进行操作；

(2)将GZ02-218病毒原液稀释10倍；

(3)转染4～6小时后的C6/36细胞吸去转染液，加入稀释后的病毒液200ul/孔，33℃、3％CO₂吸附1小时；

(4)吸去病毒液，加入含2％血清的MEM维持液1ml/孔，置于33℃、3％CO₂培养箱中继续培养。

5、细胞形态变化观察

每日观察细胞病变情况，当细胞出现以下表现时为细胞病变：细胞融合肿胀，细胞数目减少，并逐日加剧。如果siRNA发挥了干扰作用，则对C6/36细胞具有保护作用，实验组将不出现病变。比较siRNA组与正常组、对照组细胞病变差异，并拍照记录。

6、MTT法检测siRNA对白蚊伊蚊C6/36细胞的保护作用

每日观察细胞病变情况，待对照组细胞病变达到++++时，按以下步骤进行MTT法，检测活细胞数：

(1)细胞吸去培养液，用PBS洗2次，加入无血清MEM培养液500ul/孔；

(2)加入MTT 100ul/孔，轻轻晃匀使其均匀分布，置37℃、3％CO2培养箱内培养4小时；

(3)吸去培养上清液，加入DMSO 1ml/孔溶解，振荡10分钟，酶标仪上测定OD₄₉₀的读数；

(4)计算细胞存活率，存活率＝(siRNA组或对照组OD值/正常组OD值)×100％，根据存活率绘制细胞生存曲线，以细胞存活率作为评价siRNA对C6/36细胞保护作用的指标。

7、实时荧光定量RT-PCR检测登革病毒RNA含量

(1)样本收集：待对照组细胞病变达到++++时，收集C6/36细胞，将细胞吹打下来，于-80℃及37℃反复冻融裂解3次。

(2)RNA提取：采用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA提取试剂盒提取登革病毒RNA：

①在洁净的EP管中加入560ul AVL及140ul样本，振荡混匀15s，室温静置10分钟；

②加入500ul于4℃预冷的无水乙醇，振荡混匀15s，轻微离心；

③转移液体至吸附柱中，8000rpm离心1min，弃掉离心管，将柱子安装于新管中；

④重复步骤③；

⑤加入500ul AW1于吸附柱中，8000rpm离心1min，弃掉离心管，将柱子安装于新管中；

⑥加入500ul AW2于吸附柱中，14000rpm离心3min，弃掉离心管；

⑦将柱子安装于洁净的1.5ml EP管中，加入50ul去RNA酶灭菌水，室温静置1min溶解RNA，8000rpm离心1min，所得RNA于-80℃保存。

(3)RT-PCR检测：采用深圳太太基因有限公司登革I型病毒实时荧光RT-PCR试剂盒，检测病毒RNA含量。

①扩增试剂准备：从冰箱中取出PCR反应液，室温融化并颠倒混匀，2000rpm离心10s，取出Taq酶和反转录酶，反应体系配制如下：按每个样本加入PCR反应液15ul+Taq酶0.5ul+反转录酶0.5ul计算各试剂用量，加入一适当体积的洁净离心管中，振荡混匀15s，轻微离心，以15ul/管分装至各PCR反应管中；

②取上述各组RNA样本10ul加入反应管中，并按试剂盒说明分别准备阳性及阴性对照管，反应体系为25ul。各管做好标记，盖紧管盖，2000rpm离心10s，置于smart cycler II多程序实时荧光定量PCR仪中；

③荧光PCR扩增及信号收集：PCR反应条件如下：

第一步：50℃30min，95℃3min，1个循环；

第二步：95℃5sec，60℃40sec(收集FAM荧光值)，40个循环。

(4)病毒RNA含量分析：PCR仪根据荧光值和循环数自动计算得出各组的Ct值，Ct值越小，表明所含登革病毒RNA量越多，Ct值减少n，则代表登革病毒RNA量增加2ⁿ倍。

8、免疫荧光检测病毒颗粒含量

待对照组细胞病变达到++++时，收集各组C6/36细胞，按以下步骤用间接免疫荧光法检测病毒颗粒含量。

实验前准备：

(1)免疫荧光专用玻片，95％酒精浸泡，去离子水冲洗，烘干备用；

(2)0.01mol/L浓度PBS，pH7.4，含0.5％吐温40；

(3)抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释；

(4)缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制；

(5)可插玻片的玻璃槽一只，固定细胞用；

(6)有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)；

(7)ZEISS公司Axiocam HRC荧光显微镜；

(8)玻片架；

(9)滤纸；

(10)37℃温箱。

实验步骤如下：

(1)细胞去培养液后用PBS洗2次，收集细胞2000rpm/min离心5分钟，弃去PBS，用1ml的PBS重悬沉渣，吹散制成细胞悬液；

(2)制作抗原片：取出洁净的玻片，将细胞悬液滴加在小孔内，每孔20ul，2孔/组，每次设空白对照2孔，滴加PBS，吹干；

(3)固定：用冰预冷的丙酮溶液固定10分钟，PBS冲洗5次，吹干；

(4)一抗孵育：滴加单克隆一抗，每孔15ul，置于湿盒内，37℃孵育30分钟。取出用PBS洗5次，吹干；

(5)二抗孵育：滴加荧光标记二抗，每孔15ul，置于湿盒内，37℃孵育30分钟。取出用PBS洗5次，吹干；

(6)甘油封闭，镜下观察荧光，拍照。

9.结果分析

(1)siRNA对C6/36细胞的保护作用

如图1所示，登革病毒攻击C6/36细胞7天后，观察各组细胞形态，可见正常组无细胞病变；对照组出现大量细胞病变，其病变程度达到++++，细胞数明显减少；siRNA组仅出现极少量细胞病变，病变程度为+，细胞数减少不明显。

如图2所示，登革病毒攻击C6/36细胞7天后，以MTT法检测各组活细胞数，以正常组活细胞数为基准计算细胞存活率，对照组为26.4％，siRNA组为57％，相比对照组活细胞增加2.16倍，表明转染的siRNA具有保护C6/36细胞的作用。

用免疫荧光法检测细胞内登革病毒抗原，可见正常组无病毒抗原，对照组出现大量病毒抗原，siRNA组仅出现少量病毒抗原。

(2)siRNA对登革病毒复制的抑制作用

如图3所示，登革病毒攻击C6/36细胞7天后，用免疫荧光法检测细胞内登革病毒颗粒，结果正常组无病毒颗粒，对照组出现大量病毒颗粒，siRNA组仅出现少量病毒颗粒。同时用荧光定量RT-PCR法检测各组细胞内登革病毒核酸量，结果正常组无病毒核酸，siRNA组病毒核酸量比对照组减少约30倍(图4，表1)，表现出明显的抑制登革病毒复制增殖的作用。

表1荧光定量PCR法检测各组细胞内登革病毒核酸量

分组	正常组	siRNA组	对照组
				Ct值	/	18.71	13.89

结果表明：登革病毒攻击C6/36细胞7天后，用荧光定量PCR法检测细胞内登革病毒核酸量，可见正常组无病毒核酸，对照组病毒核酸的Ct值为13.89，siRNA组病毒核酸的Ct值为18.71，比对照组高4.82，即病毒核酸量减少24.82倍，约30倍。

SEQUENCE LISTING(序列表)

<110>广州市疾病预防控制中心

<120>用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

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<211>21

<212>RNA

<213>人工合成

<400>1

aacggaacca gaugacguug a 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工合成

<400>2

ucaacgucau cugguuccgu u 21

Claims

1.用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列，其特征在于：所述小干扰RNA序列即siRNA序列为双链分子，有21个碱基配对，正义链的序列为SEQ ID NO.1，反义链的序列为SEQ ID NO.2。