CN103993014A - 一种抑制i型登革病毒复制的重组慢病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒，该慢病毒含有基于I型登革病毒prM基因保守区序列设计合成的表达shRNA，该shRNA在宿主细胞中经Dicer酶等加工转变成针对prM基因的siRNA，干扰prM蛋白的表达，以达到抑制登革病毒复制、保护宿主不被登革病毒感染的功能。
Description
技术领域
本发明涉及重组慢病毒，具体涉及一种能抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒。
背景技术
(1)登革病毒
登革病毒(dengue virus,DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征的病原体.登革病毒归于黄病毒科(flaviviridae)中的黄病毒属.根据包膜蛋白的抗原特异性差异，登革病毒分为4个血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型登革病毒.
病毒结构与基因组
成熟的登革病毒颗粒呈球形，直径45～55纳米，由包膜、衣壳和核酸组成.核衣壳含单股正链RNA(核糖核酸)，大小约为1.1万对碱基，含有1个开放阅读框,编码3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白。
prM蛋白是一种糖蛋白，为M蛋白的前体，在病毒成熟过程中prM糖蛋白经特异性酶酶切后形成M蛋白，它能导致病毒感染增强，并形成毒粒的表面结构.包膜蛋白E存在有诱导中和抗体和血凝抑制抗体，并且可能会引起抗体依赖的感染增强作用.非结构蛋白中NS1和NS3在病毒免疫反应中起重要作用，可诱导产生针对同型登革病毒的保护作用的抗体.
疫苗研究
登革热疫苗主要可分为传统的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗以及以质粒、腺病毒、慢病毒为载体的基因疫苗等.理想的登革疫苗应该是四价疫苗，对四种血清型登革病毒感染均有保护作用.长期以来，困扰登革疫苗发展的一个主要因素就是缺乏合适的动物模型.虽然登革病毒能够感染小鼠、猴子等动物，但这些动物感染后不出现或仅出现轻微发热等症状，而不出现登革出血热和登革休克综合征等典型症状.登革疫苗开发面临的另一个主要的问题是抗体依赖的感染增强作用.通常初次感染后，可对同型登革病毒的再次感染产生终生免疫，但对异型登革病毒的感染不但没有保护作用，往往会通过抗体依赖的感染增强作用机制促进病毒的感染.登革疫苗的研究已有50多年的历史，但至今仍无安全有效的疫苗用于临床.虽然传统的灭活疫苗、减活疫苗已取得一定的进展，但其安全性、有效性及稳定性等问题仍有待进一步的研究.以RNA干扰为基础的基因疫苗作为一种新型疫苗，具有传统灭活/减毒活疫苗无法比拟的优势，分子生物学技术的发展，为登革基因疫苗的研制提供了广阔的舞台.随着动物模型和多价疫苗定量系统的成熟和完善，以及登革热致病机制研究的不断深入，势必会加快登革疫苗的研究进程.
(2)RNA干扰
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制.将与靶基因的转录产物信使RNA(mRNA)存在同源互补序列的双链RNA(double strandRNA，dsRNA)导人细胞后，能特异性地降解该mRNA(信使RNA)，从而产生相应的功能表型缺失.这一过程属于转录后基因沉默机制范畴.RNA干扰广泛存在于生物界.从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制更为复杂.
RNA干扰作用机制
现已初步总结出RNA干扰的作用机制：细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，形成22bp大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA(小干扰RNA)可进一步掺入多部分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNA(小干扰RNA)序列互补的mRNA(信使RNA)，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.除此机制外，在果蝇及线虫的研究中发现，RNA干扰还可以通过影响染色质结构来调控基因的表达.因此从目前的研究结果来看，RNA干扰现象并不仅仅发生在转录后水平，而是在多水平影响着基因的表达.RNA干扰的基本过程分为三个步骤(文献：Nature,2004,431:343-349；Genes Dev,2005,19:517-529)：
siRNA(小干扰RNA)的形成：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式导入dsRNA(双链RNA)，dsRNA(双链RNA)在细胞内被Dicer酶切割成21～23碱基长的小分子双链干扰RNA片断：siRNA(小干扰RNA)，其结构特点为在3’末端有两个碱基凸出和5’末端为磷酸的双链RNA.
RNA诱导的沉默复合物的形成：经Dicer加工过的siRNA(小干扰RNA)是解旋的，在ATP(三磷酸腺苷)存在的情况下，双链siRNA(小干扰RNA)打开.其中一条链被整合到RNP(核糖核蛋白)的复合体中.形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induce silencing complex，RISC).这个复合物由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成.
目的mRNA(信使RNA)的降解：活化的RISC(RNA诱导的沉默复合物)定位到与siRNA(小干扰RNA)中的反义链互补的靶mRNA(信使RNA)转录本上，并在距离siRNA(小干扰RNA)3’端12个碱基的位置切割目的mRNA(信使RNA).被激活的RISC(RNA诱导的沉默复合物)以其中的一条单链siRNA(小干扰RNA)作为向导链，结合与之互补的目标mRNA(信使RNA).然后内切核酸酶在siRNA(小干扰RNA)附近开始切割mRNA(信使RNA)，切割位点多为尿嘧啶，切割下来的RNA被核酸外切酶完全降解.
RNA干扰的应用领域
RNA干扰在真核生物中具有序列特异性的基因沉默功能，现普遍认为RNA干扰是真核生物原有的抵御病毒和外源转座子入侵的有效机制.自从RNA干扰发现以来，它已经发展成为一种重要的基因敲除工具，并广泛应用于反向遗传学的基因功能研究之中.另外，在哺乳动物细胞中外源注入siRNA(小干扰RNA)能够诱导RNA干扰的发生，这一发现使RNA干扰成为抵御病毒入侵的潜在治疗手段.其中包括一些重要的人类病原体，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革病毒(DENV)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、流感病毒(influenza virus)等(文献：Biomed Sci,2003,10(6):607-16；HandbExp Pharmacol,2006,173:117-50.).自从1998年首次报导以来，RNA干扰研究迅猛发展，在美国《科学》杂志评出的2002年十大科技进展的排行榜中名列榜首，同时《自然》杂志亦将其评为2002年度重大科技成就之一.并且认为RNA干扰研究的突破性进展是生物学领域近20年来可与人类基因组计划相提并论的最重大成果之一.
利用RNA干扰抑制登革病毒复制的研究在国外尚处于起步阶段，在国内则未见文献报道.国外Adelman等(J Virol.2002；76:12925)利用与II型登革病毒PrM基因同源的290bp的dsRNA(双链RNA)转入C6/36蚊细胞，发现可以抑制登革病毒的复制；而将与登革病毒C、PrM及NS5基因同源的240～290bp长度的dsRNA(双链RNA)注入成蚊，可以保护成蚊免受登革病毒感染.Travanty等将连接有登革病毒RNA片段的重组病毒感染蚊子后，能够减少同型病毒的复制和传播(Insect Biochem Mol Biol,2004,34(7):607-13)。随后，他们应用埃及伊蚊中肠某蛋白启动子构建的载体，使埃及伊蚊完全失去了作为II型登革病毒载体的能力，成功构建了抗病毒的转基因埃及伊蚊(PANS,2006,103:4198-4203)。但是，目前该技术存在以下缺陷：
(a)真正发挥RNA干扰作用的不是dsRNA(双链RNA)，而是dsRNA(双链RNA)的裂解产物：21～25nt长度的siRNA(小干扰RNA)混合物，该技术利用dsRNA(双链RNA)作为药物，但真正发挥作用的siRNA(小干扰RNA)序列未知；
(b)长度超过30个碱基对的双链RNA导入哺乳动物细胞会诱导干扰素的合成，表现出广泛的非特异性阻抑效应,导致细胞凋亡,该技术利用dsRNA(双链RNA)作为药物，无法在实验研究和临床中应用于哺乳动物；
(c)利用登革病毒作为载体合成难度大，成本高，病毒本身具有毒副作用，难以进一步推广；
(d)该技术针对的是II型登革病毒，对I型登革病毒的作用未知，但中国国内自1995年以来造成流行的为I型登革病毒，因此该技术对国内的登革热防治工作影响有限.
(3)慢病毒载体
南佛罗里达大学的Zhang等人利用腺病毒载体转染siRNA(小干扰RNA)的方法也达到了启动RNA干扰途经的效果(Genet Vaccines and Ther,2004,2(1):8)。在这项研究中，从非洲绿猴肾细胞和人树突状细胞(DCs)中观察到，通过辅助性腺病毒(adeno-associated virus,AAV)编码siRNA(小干扰RNA)的方法有效减少了登革病毒感染。其实，在体外研究中，最为理想的病毒载体是慢病毒载体.一方面，相对于逆转录病毒和腺病毒，慢病毒不仅能够感染分裂期细胞，而且能够感染非分裂期细胞.另一方面，慢病毒能够将基因整合到宿主细胞的基因组之中，使携带的siRNA基因稳定表达，长期抑制同源基因mRNA(信使RNA)的翻译过程.虽然，病毒载体能够高效的将外源基因整合到宿主基因组之中，但是由于病毒载体本身所具有的毒副作用，严重限制了它们的临床应用.目前，利用慢病毒做为短发夹结构RNA(short hairpin RNA，shRNA)载体的体内研究正在进行之中.解决问题的方法之一就是改造病毒载体，减少病毒的毒副作用.另一种方法就是寻找一种非病毒的载体转运siRNA(小干扰RNA)，这也成为了现在研究的热点.
综上，本发明中拟构建慢病毒载体，利用宿主细胞本身的RNA干扰系统表达出成熟的siRNA(小干扰RNA)，在避免干扰素反应的同时，能够高效特异性的抑制I型登革病毒的复制，在预防与治疗I型登革病毒方面发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的在于，基于I型登革病毒prM基因保守区序列，设计合成可表达shRNA(短发夹结构RNA)的慢病毒，shRNA(短发夹结构RNA)在宿主细胞中经Dicer酶等加工转变成针对prM基因的siRNA(小干扰RNA)，干扰prM蛋白的表达，以达到抑制登革病毒复制、保护宿主不被登革病毒感染的功能。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种shRNA(短发夹结构RNA)序列，其结构如下所示：
一种siRNA(小干扰RNA)序列，由所述shRNA(短发夹结构RNA)序列在酶的作用下，去掉尾部和环状序列形成，优选所述酶为Dicer酶。
一种慢病毒，含有所述shRNA(短发夹结构RNA)序列，且所述shRNA(短发夹结构RNA)序列在宿主细胞中通过酶的作用去掉尾部和环状序列转变成针对I型登革病毒prM基因的siRNA(小干扰RNA)；优选所述酶为Dicer酶。
一种制备所述慢病毒的方法，包括以下步骤：
(1)设计：
根据专利《用于抑制I型登革病毒复制的靶向小干扰RNA序列》(专利号ZL200710074188.4)所提供的序列，正义链：5’-AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3’，负义链：5’-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3’，按要求设计互补的短发夹结构shRNA(短发夹结构RNA)序列，shRNA(短发夹结构RNA)在宿主细胞中被Dicer酶等切割形成成熟的siRNA(小干扰RNA)，成熟的siRNA(小干扰RNA)整合成RNA介导的沉默复合体，识别靶基因并启动降解机制.
(2)siRNA(小干扰RNA)表达质粒的构建
根据设计的序列，合成两条互补的DNA单链，每条单链含有4个核苷酸的不配对尾部，用于与线性质粒连接.退火将两条DNA单链合成DNA双链，用T4DNA连接酶将之与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒连接，转染大肠杆菌并挑选阳性克隆，瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞，观察短时的siRNA(小干扰RNA)表达效果.
(3)重组慢病毒的构建
按照包装试剂包说明书，利用BP/LR重组反应，将pDONR221质粒，siRNA(小干扰RNA)表达质粒以及pLenti6/V5-DEST骨架质粒共转染293FT细胞系，构建成慢病毒表达质粒.收集病毒上清并测定滴度.
(4)慢病毒转染非洲绿猴肾细胞
将非洲绿猴肾细胞接种6孔板，按感染复数(Multiplicity Of Infection，MOI)100接种慢病毒.转染24小时后，换完全培养液.用流式细胞仪分选出绿色荧光蛋白阳性(GFP+)细胞群，培养于含10％(体积比)胎牛血清、10μg/mL杀稻瘟霉素的MEM选择培养基中加压筛选，37℃、5％(体积比)CO2培养并传代.
(5)效果评价：
实验分为以下四组：
正常组：正常非洲绿猴肾细胞，不添加任何试剂，也不用登革病毒攻击；
空白对照组：正常非洲绿猴肾细胞，不添加任何试剂，仅用登革病毒攻击；
siRNA(小干扰RNA)实验组：表达prMsiRNA(小干扰RNA)的非洲绿猴肾细胞，以登革病毒攻击；
neg-siRNA(小干扰RNA)阴性对照组：表达neg-siRNA(小干扰RNA)的非洲绿猴肾细胞，以登革病毒攻击；
观察各组以下指标，以评价siRNA(小干扰RNA)对登革病毒在C6/36细胞中复制的抑制作用：
A.抗原检测：Western印迹实验，检测prMsiRNA(小干扰RNA)对prM基因的抑制作用，
B.核酸检测：实时荧光逆转录聚合酶链式反应实验，统计prMsiRNA(小干扰RNA)对登革病毒复制的抑制作用。
有益效果：
本发明为一种表达shRNA(短发夹结构RNA)的慢病毒，该慢病毒可抑制登革病毒prM基因的表达以及登革病毒在非洲绿猴肾细胞中复制，目前尚无同类型产品.
附图说明
图1是中国仓鼠卵巢细胞中瞬时转染siRNA(小干扰RNA)表达质粒(100×)：2～8×104中国仓鼠卵巢细胞接种24孔板，转染当天，将siRNA(小干扰RNA)表达质粒以及lipofectamine2000在培养液中混合，加入细胞中孵育6小时，隔天观察绿色荧光蛋白表达.(A)荧光视野(B)白光视野。
图2是慢病毒包装时293FT细胞中荧光表达(100×)：6×106293FT细胞接种10cm2培养皿中，转染当天，将包装试剂,慢病毒表达质粒和Lipofectamine2000轻轻混匀，小心加入细胞中，37℃孵育6小时，48h后收集细胞病毒上清，并观察细胞中荧光表达情况.(A)荧光视野(B)白光视野。
图3是慢病毒滴度测定(×40)：8×103293FT细胞接种96孔板，滴度测定当天，将慢病毒原液按1:10梯度稀释，小心加入293FT细胞中，孵育24小时后换液，继续培养48小时，观察荧光表达.A～E:10-3,10-4,10-5,10-6,10-7稀释组。
图4是慢病毒转染非洲绿猴肾细胞：将非洲绿猴肾细胞接种6孔板，按感染复数MOI100接种慢病毒.流式细胞分选仪分选出绿色荧光蛋白阳性细胞群，培养于含杀稻瘟霉素的MEM选择培养基中加压筛选.(A)筛选后第10代细胞，荧光显微镜下荧光表达情况(B)筛选后第10代细胞，流式细胞术分析，确定表达siRNA(小干扰RNA)的非洲绿猴肾细胞百分率。
图5是siRNA(小干扰RNA)对I型登革病毒prM基因的抑制作用：按照不同分组分别培养细胞，以I型登革病毒感染，37℃孵育2小时后，换成完全培养液.继续培养6～7天后，收集细胞，Western印迹方法检测prM蛋白表达。
图6是prMsiRNA(小干扰RNA)对I型登革病毒复制的抑制作用：按照不同分组分别培养细胞，以I型登革病毒感染，37℃孵育2小时后，换成完全培养液.分别收集第0～6天细胞上清，提取总RNA，实时荧光逆转录聚合酶链式反应方法检测上清中I型登革病毒基因组RNA量。
具体实施方式
1靶基因的信息，siRNA(小干扰RNA)和shRNA(短发夹结构RNA)的设计
根据2002年广州市I型登革病毒流行株GZ02-218(国际基因序列数据库登录号EF_079826)、I型登革病毒参考株(国际基因序列数据库登录号NC_001477.1)及其它I型登革病毒基因序列，按以下原则在病毒prM基因保守区设计siRNA(小干扰RNA)序列，每段均为21对核苷酸：
(1)紧接连续的2个A碱基；
(2)G、C碱基含量在30％～50％(体积比)；
(3)不多于连续4个T碱基；
(4)与宿主细胞无同源性；
(5)尽量选择在I型登革病毒中保守的序列.
经筛选，获得以下一段21对核苷酸的siRNA(小干扰RNA)序列：同义链：5’–AACGGAACCAGAUGACGUUGA-3’.反义链：5’-UCAACGUCAUCUGGUUCCGUU-3’.详细信息参见专利ZL200710074188.4.
考虑siRNA(小干扰RNA)与靶基因结合的动力学因素，将上述siRNA(小干扰RNA)序列做适当改变：同义链5’-CGGAACCAGAUGACGUUGACU-3’.反义链5′-AGUCAACGUCAUCUGGUUCCG-3’.
按照表达质粒构建试剂盒BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi Expression VectorKit with EmGFP(Invitrogen公司)说明书，设计能够转录shRNA(短发夹结构RNA)的DNA序列：
正义链设计：
(1)5’-TGCTG
(2)与靶基因序列反向互补的21碱基序列，即成熟的siRNA(小干扰RNA)反义链序列
(3)GTTTTGGCCACTGACTGAC(尾部环状结构)
(4)靶基因(即同义链)序列1-8碱基(5’-3’)
(5)靶基因序列11-21碱基(5’-3’)
正义链序列为：5′-TGCTGAGTCAACGTCATCTGGTTCCGGTTTTGGCCACTGACTGACCGGAACCATGACGTTGACT-3′。
反义链设计：
(1)去掉上述设计的正义链5’端TGCT，即新序列起点为G
(2)与上述正义链中新序列反向互补，并在序列5’端加CCTG
反义链序列为：5′-CCTGAGTCAACGTCATGGTTCCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGGAACCAGATGACGTTGACTC-3′.
阴性对照为Invitrogen公司统一制备，能够切割形成成熟siRNA(小干扰RNA)，但是不针对细胞内任何已知基因，正义链序列5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3′，反义链序列：5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3′.
2siRNA(小干扰RNA)表达载体的构建和测序.
(1)根据上述序列合成能够表达shRNA(短发夹结构RNA)的两条DNA单链；
(2)将两条单链DNA退火成双链DNA.然后用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol IImiR(Invitrogen公司)进行重组克隆，将双链DNA插入到siRNA(小干扰RNA)表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建siRNA(小干扰RNA)表达质粒，并转化至感受态大肠杆菌细胞.构建成功的siRNA(小干扰RNA)表达质粒能够同时表达绿色荧光蛋白、短发夹状shRNA(短发夹结构RNA)以及杀稻瘟菌素抗性，绿色荧光蛋白可用于观察siRNA(小干扰RNA)质粒在宿主细胞中的表达，杀稻瘟菌素抗性可用于纯合细胞的筛选.退火和连接的具体方法如下：
(a)退火
将合成好的单链DNA用双蒸水溶解成100μM，互补单链各取5μl两两混合，按表一给出体系进行退火.然后将混合物在95℃加热5分钟，放置室温自然冷却20分钟，形成双链DNA.
表一.单链DNA退火体系
| 100μM top strand oligo | 5μl |
| 100μM bottom strand oligo | 5μl |
| 10×oligo annealing buffer | 2μl |
| ddH2O | 8μl |
| Total volume | 20μl |
(b)连接
将退火的双链DNA继续稀释成10nM浓度，按表二给出体系在室温与pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒连接30分钟.
表二.酶连接体系
| 5×ligation buffer | 4μl |
| pcDNA6.2-GW/EmGFP | 2μl |
| ds oligo(10nM) | 4μl |
| T4DNA ligase(1U/μl) | 1μl |
| ddH2O | 9μl |
| Total volume | 20μl |
(3)每个大肠杆菌转化平板分别挑取4个克隆，用载体通用引物进行菌落聚合酶链式反应筛选.筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的序列一致.验证无误后扩增质粒备用.
3瞬时转染siRNA(小干扰RNA)表达质粒，观察干扰质粒在靶细胞中的转染效果
(1)转染前一天，将中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1种入6孔板中，使细胞密度为90％；
(2)将4ug siRNA(小干扰RNA)表达载体加入500ul培养液中，10ullipofectamine2000加入500ul培养液中，室温放置5min.
(3)将siRNA(小干扰RNA)表达载体加入lipofectamine2000中，混匀，室温放置20min；
(4)质粒复合物加入细胞中，培养箱中放置6h后，换液；
(5)第二天观察荧光表达.
结果：见图1，约40％的中国仓鼠卵巢细胞表达绿色荧光蛋白，质粒构建成功。
4慢病毒载体的构建
应用慢病毒载体构建试剂盒(invitrogen公司)，具体方法如下：
(1)配制以下体系：
(2)取出BP MIX冰上融解；
(3)漩涡混匀BP MIX2秒；
(4)加入2ul BP MIX，上下轻轻混匀；
(5)25度孵育1小时；
(6)取3ul至另一试管中，其余-20度保存；试管中加入以下试剂：
Destination Vector(150ng/ul) 1ul
TE Buffer PH8.0 4ul
(7)取出LR MIX，2分钟内冰上融解；
(8)快速漩涡混匀2秒，2次；
(9)加入2ul LR MIX，上下轻轻混匀；
(10)25度孵育2-4小时(如果需要更多克隆可以过夜反应孵育)；
(11)每管加1ul蛋白酶K，37度孵育10分钟；
(12)转化质粒，涂板，挑克隆，抽质粒，测序.
(13)验证测序结果正确后，扩增质粒备用.
5慢病毒包装
取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的细胞培养皿3x106个293T细接种于细胞培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜.
(1)9ug包装试剂和3ug重组慢病毒质粒加入1.5ml培养液(37℃预热)中，36ul lipofectamine2000加入1.5ml培养液中，轻轻混匀，室温放置5min；
(2)轻轻混合质粒和lipofectamine2000稀释液，室温孵育20min；
(3)细胞培养皿中细胞，用培养液小心洗两遍后，加入5mL培养液.
(4)将3ml质粒脂质体复合物小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5％CO2的培养箱中孵育4-6个小时后，更换完全培养基.
(5)48h后收集细胞培养上清，3000转/分离心5min，去除细胞残余；上清用0.45um的滤器过滤分装，每管0.5ml.
(6)将病毒液放置于-80℃保存备用.(尽量避免反复冻融，反复冻融<3次)
结果：见图2，慢病毒包装时，293FT细胞约有80％以上表达GFP，说明慢病毒包装效率高，效果良好。
6慢病毒滴度测定
将转染了重组慢病毒的293T细胞培养至对数生长期.
(1)第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37度培养过夜，感染时细胞长至30－50％的融合密度；
(2)第二天，当天转染时，将保存于-80度冰箱中病毒液冰水浴融化，用含有8ug/ml多聚胺和2％胎牛血清的细胞培养液进行梯度稀释：
1号稀释液 5ul病毒液+245ul病毒稀释用培养基，
2号稀释液 25ul1号稀释液+225ul病毒稀释用培养基
3号稀释液 25ul2号稀释液+225ul病毒稀释用培养基
4号稀释液 25ul3号稀释液+225ul病毒稀释用培养基
5号稀释液 25ul4号稀释液+225ul病毒稀释用培养基
6号稀释液 25ul5号稀释液+225ul病毒稀释用培养基
……
小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37度的细胞培养箱中过夜培养；
(3)第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；
(4)第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数.
慢病毒滴定结果：见图3，慢病毒感染细胞293T，五号孔中观察到表达绿色荧光的细胞分别为25个和26个，则病毒的滴度为：
第五孔(25+26)/2＝25.5 25.5TU/(2*10-7)ml＝1.275*108TU/ml
7慢病毒转染非洲绿猴肾细胞
(1)将非洲绿猴肾细胞接种6孔板，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜.
(2)接种18小时后，细胞密度约为70％，用含2％胎牛血清、6μg/mL多聚胺的培养液稀释慢病毒原液，按感染复数100接种细胞.
(3)转染24小时后，换完全培养液.
(4)流式细胞仪分选出绿色荧光蛋白阳性细胞群，培养于含10％胎牛血清、10μg/mL杀稻瘟霉素的选择培养基中，37℃、5％CO2培养并传代.
(5)取流式细胞分选后第10代细胞，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，并通过流式细胞术分析，确定表达siRNA(小干扰RNA)的非洲绿猴肾细胞百分率.
结果：见图4，约97.5％的非洲绿猴肾细胞表达绿色荧光蛋白，筛选出的纯合细胞可以高效表达prM siRNA(小干扰RNA)或者阴性对照neg siRNA(小干扰RNA)。
8Western印迹检测prM siRNA(小干扰RNA)对prM基因的抑制作用
(1)将Vero、表达prM siRNA(小干扰RNA)-Vero以及表达neg siRNA(小干扰RNA)-Vero纯合细胞同时接种6孔板.
(2)12h后，去除培养液，接种登革病毒，37℃孵育2小时，37℃、3％CO2培养箱中继续培养5天.
(3)加入80μL细胞裂解液，收集后100℃煮沸30min.12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白.
(4)Western印迹分析:①电转前先把与凝胶大小一致的PVDF(聚偏氟乙烯)膜用甲醇完全浸泡2～3min后，以双蒸水彻底漂洗三次.将滤纸、海绵垫和PVDF(聚偏氟乙烯)膜一起浸于pH8.3电转印缓冲液中浸泡15分钟.②展开电转印夹，转膜时放置顺序从阴极到阳极依次为海绵，滤纸，凝胶，PVDF(聚偏氟乙烯)膜，滤纸，海绵，排尽气泡，制成电转印“三明治”结构.③低温下(置于冷藏柜或冰上)，100伏特电转移1小时.④转印结束后，将PVDF(聚偏氟乙烯)膜置于含7％脱脂奶粉的缓冲溶液中，室温封闭1小时，同时以0.25％考马斯亮兰染色已转过膜的凝胶，观察转膜效果.⑤弃去封闭液，将PVDF(聚偏氟乙烯)膜浸入含1:1000的prM抗体或β-Actin抗体，4℃孵育过夜.洗膜3次后，加入含1:2000的辣根过氧化物酶标记抗小鼠多克隆抗体，室温振荡2小时.洗膜3次，于暗室中加入底物进行化学发光获得杂交条带.
结果：见图5，相对阴性对照neg siRNA(小干扰RNA)组的prM蛋白免疫印迹条带，siRNA(小干扰RNA)实验组几乎看不到prM蛋白的表达，干扰效果十分显著。
9实时荧光逆转录聚合酶链式反应检测siRNA(小干扰RNA)对登革病毒复制的抑制作用
(1)按照不同分组分别培养细胞接种6孔板。
(2)12小时后按上述的方法接种登革病毒，转染第1～6天分别收集细胞上清。
(3)各取140μL样品采用QIAGEN公司病毒RNA提取试剂盒提取总RNA.具体实验方法：
1>在洁净的EP管中加入560ul裂解液及140ul样本，振荡混匀15秒，室温静置10分钟.
2>加入500ul冰预冷的无水乙醇，振荡混匀15秒，轻微离心.
3>转移液体至柱中，8000转/分离心1min，弃掉离心管，将柱子安装于新管中.
4>重复步骤③
5>加入500ul洗液1于柱中，8000转/分离心1分钟，弃掉离心管，将柱子安装于新管中.
6>加入500ul洗液2于柱中，14000转/分离心3分钟，弃掉离心管.
7>将柱子安装于洁净的1.5ml试管中，加入30ul去RNA酶灭菌水，室温静置1分钟，8000转/分离心1分钟.
(4)实时荧光逆转录聚合酶链式反应：用深圳太太基因有限公司登革I型病毒实时荧光逆转录聚合酶链式反应试剂盒检测病毒RNA含量.反应条件：42℃5分钟，95℃10秒，一个循环；95℃5秒，60℃30秒，共40个循环.根据标准曲线，算出对应的登革病毒RNA初始拷贝数，即病毒RNA量.
结果：见图6，neg siRNA(小干扰RNA)阴性对照组中登革病毒并没有被抑制，感染后第6天，细胞上清中登革病毒基因组RNA含量高达107拷贝/10ul，而prMsiRNA(小干扰RNA)实验组中登革病毒基因组RNA含量只有104拷贝/10ul，干扰效果十分显著。
(七)结果分析
(1)prM siRNA(小干扰RNA)对登革病毒prM基因的抑制作用
prM siRNA(小干扰RNA)对登革病毒prM基因的抑制十分显著，用Western印记分析方法几乎检测不到prM蛋白的表达，所以我们制备的该重组慢病毒做为siRNA(小干扰RNA)表达载体，可以成功抑制I型登革病毒在非洲绿猴肾细胞中相应蛋白的表达(图5)。
(2)prM siRNA(小干扰RNA)对登革病毒复制的抑制作用
登革病毒攻击非洲绿猴肾细胞后，用荧光定量逆转录聚合酶链式反应法检测各组细胞上清中登革病毒核酸量，结果prM siRNA(小干扰RNA)实验组登革病毒核酸量比neg siRNA(小干扰RNA)阴性对照组减少约1000倍(图6)，表现出明显的抑制登革病毒复制增殖的作用.
(八)结论
本发明成功设计了一个重组慢病毒，能够表达针对I型登革病毒prM基因保守区的shRNA(短发夹结构RNA)，shRNA(短发夹结构RNA)经Dicer酶等作用产生的siRNA(小干扰RNA)，可以十分显著地抑制I型登革病毒的复制。
序列表
<110>吴新伟
<120>一种抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒
<160>12
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>25
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>shRNA
<400>1
cugagucaac gucaugguuc cgguu 25
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>正义链
<400>2
aacggaacca gaugacguug a 21
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>负义链
<400>3
ucaacgucau cugguuccgu u 21
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>siRNA同义链
<400>4
aacggaacca gaugacguug a 21
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>siRNA反义链
<400>5
ucaacgucau cugguuccgu u 21
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>siRNA同义链
<400>6
cggaaccaga ugacguugac u 21
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>siRNA反义链
<400>7
agucaacguc aucugguucc g 21
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>尾部环状结构
<400>8
gttttggcca ctgactgac 19
<210>9
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>正义链
<400>9
tgctgagtca acgtcatctg gttccggttt tggccactga ctgaccggaa ccatgacgtt 60
gact 64
<210>10
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>反义链
<400>10
cctgagtcaa cgtcatggtt ccggtcagtc agtggccaaa accggaacca gatgacgttg 60
actc 64
<210>11
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>正义链
<400>11
tgctgaaatg tactgcgcgt ggagacgttt tggccactga ctgacgtctc cacgcagtac 60
attt 64
<210>12
<211>60
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>反义链
<400>12
cctgaaatgt actgcgtgga gacgtcagtg gccaaaacgt ctccacgcgc agtacatttc 60
Claims (4)
1.一种shRNA序列，其结构如下所示：
2.一种siRNA序列，由权利要求1所述的shRNA序列在酶的作用下，去掉尾部和环状序列形成。
3.一种慢病毒，含有权利要求1所述的shRNA序列，且所述shRNA序列能在宿主细胞中通过酶的作用去掉尾部和环状序列转变成针对I型登革病毒prM基因的siRNA。
4.如权利要求2所述的siRNA序列，其中所述酶为Dicer酶。
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-
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李磊 等: "表达登革病毒prM 基因小干扰RNA 的Vero 细胞系的建立", 《中国生物化学与分子生物学报》, vol. 27, no. 11, 30 November 2011 (2011-11-30) * |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140820 |