CN102399780B

CN102399780B - 抑制手足口病病毒基因的干扰rna，包含其的载体及其应用

Info

Publication number: CN102399780B
Application number: CN 201110333378
Authority: CN
Inventors: 杨倬; 田波
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: CN102399780A

Abstract

本发明提供了抑制引起手足口病病毒基因表达的方法，具体地涉及两种主要病原体肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因组的干扰RNA及其DNA序列，并包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰RNA用于制备预防和治疗手足口病的药物中的应用。实验结果表明，在细胞水平和实验动物上，本发明的载体，由载体转录的干扰RNA在降低肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因表达的同时，显著抑制两种病毒的复制，并且消除了手足口病的临床表现症状。说明本发明的载体转录的干扰RNA以及包含其的载体可在手足口病的预防和治疗中起到至关重要的作用。

Description

抑制手足口病病毒基因的干扰RNA,包含其的载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及针对引起手足口病的两种主要病原体肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因组的干扰RNA，包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰RNA及其在制备用于预防或治疗手足口病的药物中的应用。

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由肠道病毒引起，临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区包括中国的多个省份均有此病流行的报导，已引起了全世界的普遍关注。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最常见，成为手足口病的主要病原体(Li et al.，2004)。由于目前尚无公认的十分有效的针对手足口病主要病毒肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的疫苗，因此研发能有效地针对手足口病的预防或治疗手段是十分急迫的。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种序列特异的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子，在mRNA水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默。随着研究的进展，发现这一现象具有重要的生物学功能，如RNA干扰可产生类似于基因敲除的表型，使其作为一种工具，对基因的功能进行研究；并且越来越多的文献报道RNA干扰可以用来作为清除病毒的一种手段，以此作为基因治疗的方式。例如人类免疫缺陷病毒、乙肝病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒等(Gao et al.，2006；Gitlin et al.，2002；Haasnoot et al.，2007；Liu et al.，2007；Ying et al.，2007)。

本发明的发明人设计了针对引起手足口病的两种主要病原体肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因组的干扰RNA序列，并将其编码DNA序列构建到小环DNA载体中，申请人的实验结果证明，本发明设计的干扰RNA序列以及包含其的载体可以同时有效地抑制肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的表达，从而显著抑制了病毒的复制水平。本发明的小环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构，从而减少了未甲基化的CpG所致的炎性反应，提高了安全性；而碱基数的减小，更有效的提高了目的基因的表达和生物利用度。小环DNA载体克服了传统质粒载体转染率低、易引起免疫反应及外源基因在体内表达时间短的缺点，是一种安全、高效的新型载体。因此所构建的小环DNA载体转录的干扰RNA不仅相比于化学合成的干扰RNA靶向性更好，特异性更强，具有更好的稳定性，能够克服化学合成干扰RNA的不稳定，药物作用持续时间短，吸收量少的特点，而且相比于病毒载体具有更好的安全性，作用效果稳定，药物作用持续时间长，可以多次免疫的优点。

参考文献

[1]Li，L.，He，Y.，Yang，H.，Zhu，J.，Xu，X.，Dong，J.，Zhu，Y.，Jin，Q.，2005.Genetic characteristics of human Enterovirus 71 and coxsackievirus A16circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China.J.Clin.Microbiol.43，3835-3839.

[2]Gao，Y.，Sun，L.，Dong，J.，Xu，X.，Shu，Y.，Chen，M.，Yin，L.，Liang，Z.，Jin，Q.，2006.Rapid identification of small interfering RNA that caneffectively inhibit the replication of multiple influenza B virus strains.Antiviral Ther.11，431-438.

[3]Gitlin，L.，Karelsky，S.，Andino，R.，2002.Short interfering RNA confersintracellular antiviral immunity in human cells.Nature 418，430-434.

[4]Haasnoot，J.，Westerhout，E.M.，Berkhout，B.，2007.RNA interferenceagainst viruses：strike and counterstrike.Nat.Biotechnol.25，1435-1443.

[5]Ying，R.S.，Zhu，C.，Fan，X.G.，Li，N.，Tian，X.F.，Liu，H.B.，Zhang，B.X.，2007.Hepatitis B virus is inhibited by RNA interference in cell culture andin mice.Antiviral Res.73，24-30.

发明内容：

本发明提供下列：

第一方面，提供一种用于预防和治疗手足口病的载体转录的干扰RNA。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA分别靶向所述肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3A/3C/3D保守区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列分别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体是质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是pMC.BESPX载体。在一个实施方案中，本发明构建的小环DNA质粒载体的宿主菌株保藏编号分别为CGMCC No.5160，CGMCC No.5158和CGMCC No.5157

第二方面，提供一种上述第一方面的干扰RNA的编码DNA序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列分别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6。

第三方面，提供一种载体，其包含编码上述第一方面的干扰RNA或第二方面的干扰RNA的编码DNA序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3A/3C/3D保守区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列分别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体是质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是pMC.BESPX载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体的宿主菌株保藏编号分别为CGMCC No.5160，CGMCC No.5158和CGMCCNo.5157。

第四方面，提供一种载体，其是一种双价载体，同时包含分别干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C和3D保守区域序列的干扰RNA的DNA编码序列。在一个实施方案中，所述载体是质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是pMC.BESPX载体。在一个实施方案中，干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C保守区域序列的干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，3D保守区域序列的干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

第五方面，提供上述第一方面的干扰RNA或第二方面的干扰RNA的编码DNA序列和/或第三方面的载体和/或第四方面的双价载体在制备预防和治疗手足口病的药物中的应用。

第六方面，提供一种预防和治疗手足口病的药物，其包含上述第一方面的干扰RNA或第二方面的干扰RNA的编码DNA序列和/或第三方面的载体和/或第四方面的双价载体作为活性成分。

第七方面，提供一种干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的干扰RNA编码的DNA与载体连接；

b)用所述载体转染感染肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16的细胞。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3A/3C/3D保守区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列分别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，所述载体是质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是pMC.BESPX载体。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述载体包含由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6形成的双链DNA片段。在一个实施方案中，所述细胞是RD细胞。

申请人分别根据肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3A/3C/3D保守区域序列设计了干扰RNA序列，并将其构建到小环DNA载体中，细胞的转染实验结果显示，其可明显抑制肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的表达水平，从而显著降低了病毒滴度和病毒核酸的拷贝数，细胞病变效应也明显得到改善。动物水平的药效学检测显示感染肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16动物的肠道组织和肌肉组织中病毒基因的表达水平明显被其抑制，小鼠体重增加，无肢体麻痹无力表现，手足口病临床症状消失，各项体征显示正常。

实验结果表明，本发明的载体，由载体转录的干扰RNA在降低肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因表达的同时，显著抑制两种病毒的复制，并且消除了手足口病的临床表现症状。说明本发明的载体转录的干扰RNA以及包含其的载体可在手足口病的预防和治疗中起到至关重要的作用。并且本文构建的载体转录的干扰RNA明显地具有靶向性好，特异性强，更加稳定，并且药物作用效果时间长的优点。同时，观察到由分别干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C和3D保守区域序列串联构建的双价载体对预防和治疗手足口病有增强作用。

附图说明

图1.抑制EV71和CA16基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体构建

图1A.转录载体的构建

图1B.所设计的与siRNA对应的DNA序列及其双链结构、BglII和SalI的酶切位点、转录终止信号(terminal signal)及其形成的环结构(loop)。

图1C.siRNA重组小环DNA载体的琼脂糖凝胶电泳检测。

图2.小环DNA载体的siRNA在细胞水平对EV71基因表达的抑制

图2A.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对EV71RNA的影响。siRNA有明显的抑制作用，尤其si-3C的抑制率达到90％，而无关干扰RNA Si-EGFP(Control)无明显作用。

图2B.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对EV71基因蛋白表达的影响。siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNASi-EGFP(Control)无明显作用。β-actin为内参照。

图2C.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对EV71基因蛋白表达影响的定量分析结果。

图3.小环DNA载体的siRNA在细胞水平对EV71复制的抑制

图3A.实时定量PCR法检测细胞培养上清中EV71基因组RNA拷贝数。结果显示siRNA有明显的抑制作用。

图3B.细胞培养上清中EV71病毒滴度TCID50。结果显示siRNA有明显的抑制作用。与图3A结果一致，si-3C抑制作用最显著，抑制率达90％，其次是si-3D。

图3C.转染小环DNA载体的siRNA的细胞病变(CPE)现象比较。如图所示，转染了si-3A、si-3C、si-3D重组载体的细胞病变(CPE)现象明显减弱。

图4.小环DNA载体的siRNA在细胞水平对CA16基因表达的抑制

图4A.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对CA16RNA的影响。siRNA有明显的抑制作用，尤其si-3D的抑制率达到80％，而无关干扰RNA Si-EGFP(Control)无明显作用。

图4B.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对CA16基因蛋白表达的影响。siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNASi-EGFP(Control)无明显作用。β-actin为内参照。

图4C.si-3A、si-3C、si-3D和无关干扰RNA Si-EGFP在细胞中对CA16基因蛋白表达影响的定量分析结果。

图5.小环DNA载体的siRNA在细胞水平对CA16复制的抑制

图5A.实时定量PCR法检测细胞培养上清中CA16基因组RNA拷贝数。结果显示siRNA有明显的抑制作用。

图5B.细胞培养上清中CA16病毒滴度TCID50。结果显示siRNA有明显的抑制作用。与图5A结果一致，si-3D抑制作用最显著，抑制率达90％，其次是si-3C。

图5C.转染小环DNA载体的siRNA的细胞病变(CPE)现象比较。如图所示，转染了si-3A、si-3C、si-3D重组载体的细胞病变(CPE)现象明显减弱。

图6.小环DNA载体的图谱及其诱导产生过程。

图7.靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16的双价载体的构建

具体实施方式：

本发明通过下述实施例进行举例说明，所述实施例不限制在权利要求中描述的本发明的范围。

下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法(分子克隆实验指南第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社。)

实施例一、靶向肠道病毒71型基因的干扰RNA序列的设计，载体构建及细胞和动物水平药效学检测。

一、抑制肠道病毒71型基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体的构建

1、干扰RNA序列的设计

(1)、靶向肠道病毒71型编码区3A基因的干扰RNA序列的设计

应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向为肠道病毒71型编码区3A基因的干扰RNA序列，所设计的与干扰RNA对应的DNA序列如图1B，干扰序列为肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区3A的保守区域序列，转录后自身能够形成小发夹结构，以便能成功的被dicer酶识别并剪切，并导致mRNA的降解。以si-3A的序列为例，其DNA序列为：

si-3A：

si-3A-S：5.’-GATCAAAAA GTGTCTCTTGTCTATGTCA TTCAAGAGATGACATAGACAAGAGACAC TTTTT-3’(SEQ ID NO：1)

si-3A-AS：5.’-TCGAAAAAA GTGTCTCTTGTCTATGTCA TCTCTTGAATGACATAGACAAGAGACACTTTTT-3’(SEQ ID NO：2)

(2)、靶向肠道病毒71型编码区3C基因的干扰RNA序列的设计

应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向为肠道病毒71型编码区3C基因的干扰RNA序列，所设计的与干扰RNA对应的DNA序列如图1B，干扰序列为肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区3C的保守区域序列，设计原则同上。以si-3C为例，其DNA序列为：

si-3C：

si-3C-S：5.’-GATCAAAAAGATGAGCAAGGTGTAAACT TTCAAGAGAAGTTTACACCTTGCTCATC TTTTT-3’(SEQ ID NO：3)

si-3C-AS：5.’-TCGA AAAAA GATGAGCAAGGTGTAAACT TCTCTTGAAAGTTTACACCTTGCTCATCTTTTT-3’(SEQ ID NO：4)

(3)、靶向肠道病毒71型编码区3D基因的干扰RNA的设计

应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向为肠道病毒71型编码区3D基因的干扰RNA序列，所设计的与干扰RNA对应的DNA序列如图1B，干扰序列为肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区3D的保守区域序列，设计原则同上。以si-3D为例，其DNA序列为：

si-3D：

si-3D-S：5.’-GATCA AAAAAGAAATTGGCTCGAATTAT TTCAAGAGAATAATTCGAGCCAATTTCT TTTTT-3.’(SEQ ID NO：5)

si-3D-AS：5.’-TCGAAAAAA AGAAATTGGCTCGAATTAT TCTCTTGAAATAATTCGAGCCAATTTCTTTTTT-3’(SEQ ID NO：6)

(4)、靶向增强绿色荧光蛋白基因的干扰RNA的设计

为了检测所设计的以上干扰序列的特异性，设计了靶向无关对照基因增强绿色荧光蛋白的干扰序列si-EGFP，与其干扰RNA对应的DNA序列为：

si-EGFP：

si-EGFP-S：5’-GATCAAAAAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGAGAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTTTTT-3’(SEQ ID NO：7)

si-EGFP-AS：5’-TCGAAAAAAAGAACGGCATCAAGGTGAACTCTCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTTTTT-3’(SEQ ID NO：8)

2、小环DNA载体的构建

si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP干扰RNA序列双链DNA序列片段的构建：

将合成的相对应的干扰RNA序列的单链DNA片段(用水或TE溶解至终浓度为0.25mmol/L，进行退火处理，退火体系(50μL反应体系，5nmoles总oligo)：20μL oligo sense(终浓度为100mmol/L)(即SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7)，20μL oligo antisense(终浓度100mmol/L)(即SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：8)，5μL ddH₂O，5μL10×退火buffer(1mol/L NaCl，100mmol/L TrisPH7.4)。95℃加热10分钟后，逐渐冷却至室温(一般1-2h，过夜更好)。把退火好的双链DNA片段取一部分以1∶4,000稀释于0.5×退火buffer中，然后与载体进行连接。

根据分子克隆实验指南(第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社)和(Baer M et al，1990)，在pSUPER-H1(购自oligoengine)载体上后面反向插入一个U6启动子获得pSUPER-H1+U6载体，所述重组载体经BglII和SalI双酶切后，与上述退火的所述合成的相对应的干扰RNA序列(si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP)的双链DNA片段相连接构建成pSUPER-H1+siRNA+U6重组质粒。从所述pSUPER-H1+siRNA+U6重组质粒上用BamHI和EcoRI切下含有H1+siRNA+U6双启动子的表达盒克隆到小环DNA载体上(pMC.BESPX载体)(图6)(购自美国SBI公司)，得到重组小环质粒载体pMC-H1+siRNA+U6(图1A)(此处指的是重组载体pMC-si3A，pMC-si3C，pMC-si3D和pMC-siEGFP)，并测定序列。经测序检测，所合成的与干扰序列相对应的DNA片段准确插入小环DNA载体的适当位点，小环DNA载体构建成功。

申请人将含有上述干扰序列表达盒的小环重组质粒(重组小环质粒载体pMC-H1+siRNA+U6；siRNA序列分别为上述构建的si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP双链DNA片段)转化工程菌ZYCY10P3S2T大肠杆菌(购自美国SBI公司)，分别得到大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(Escherichia coli)菌株MC-si3A，MC-si3C，MC-si3D和MC-si3EGFP，申请人将所述大肠杆菌菌株MC-si3A，MC-si3C，MC-si3D和MC-si3EGFP于2011年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号分别为CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156。

二、小环DNA干扰系统在细胞水平对肠道病毒71型的抑制

1、小环DNA干扰系统在细胞水平对肠道病毒71型基因表达的抑制

将构建的含有干扰序列表达盒的小环重组质粒转化工程菌ZYCY10P3S2T大肠杆菌(保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCCNo.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156)挑取单克隆，接于3ml含卡那霉素(50μg/ml)LB液体培养基中，37℃，200RPM，培养12小时，按1∶1000接种于200ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，200RPM，培养过夜，等量混合小环载体诱导LB液体培养基(含8ml 1NNaOH和200ul 20％L-阿拉伯糖)，30℃，200RPM，培养5小时。用质粒大提试剂盒(QIAGEN公司)提取质粒，测浓度，并通过1％琼脂糖电泳进行鉴定。如图1C所示，小环DNA干扰重组载体诱导成功，纯度达95％以上。

用含10％FBS(胎牛血清)的MEM培养液(含100μg/ml链霉素，100U/ml青霉素的双抗)培养RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞系，购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心)，培养条件为37℃，5％CO₂的培养箱。在转染前24小时，将RD细胞按每孔10⁵个细胞的数量接种于六孔板中。应用Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，按质粒(μg)/转染试剂(μl)2/4的比例将上述提取的小环DNA重组载体(分别对应si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP序列)转染RD细胞，转染12小时后，用0.01MOI(感染复数)的肠道病毒71型(Shzh-98，GenBank accession no.AF302996，购自深圳市疾病预防控制中心)感染RD细胞，培养24小时后，吸掉上清，将其冰浴用PBS轻轻洗涤3次，其中一板细胞每孔各加0.5ml的TRIZOL试剂(美国invitrogen公司)，提取细胞总RNA，用DEPC(焦碳酸二乙脂)水充分溶解后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用分光光度计测量RNA浓度。采用TAKARA公司的逆转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。用Applied Biosystem SYBR green master mix试剂盒，将其在AppliedBiosystems Prism 7300型仪器上进行real time PCR(实时定量PCR)反应，设计肠道病毒71型和Beta-actin作为定量PCR特异性引物，其中Beta-actin作为相对定量的参照。利用Applied Biosystems Prism 7300系统的Ct值，采用公式2^-ΔCt进行相对定量的计算，检测RD细胞中肠道病毒71型RNA表达水平的变化。PCR反应的条件为：预变性95℃，10min；40个循环15s，95℃，60s，60℃的程序。PCR引物序列如下：

EV71 forward：5’-AGTATGATTGAGACTCGGTG-3’

EV71 reverse：5’-GCGACAAAAGTGAACTCTGC-3’

Beta-actin forward：5′-ACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′

Beta-actin reverse：5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3′

此外，另一板细胞每孔加入100μl细胞裂解液，待至细胞裂解完全后，吸入1.5ml离心管中，12000转/分，4℃离心10分钟。将上清转移到离心管中，应用Biorad公司的A\B液测量蛋白浓度，12％SDS-PAGE，80V电泳2小时，将所述蛋白通过半干转的方法转移至PVDF膜(Amersham)上(27mA、45min)，考马斯亮蓝染色确定转膜效率，脱色后TBST(Tris-HCl缓冲液(0.5M pH 7.6)100ml NaCl 8.5～9g(0.15mol/L)，1ml/L的triton-20)洗涤3次，5％脱脂奶粉封闭过夜，TBST洗涤3次后，加入EV71抗体(Millipore，MAB979)(1％脱脂奶粉，抗体1/2000稀释)，37℃孵育1小时，TBST洗涤3次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(购自中杉金桥)(1％脱脂奶粉，抗体1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次后(每次10分钟)，再用超敏发光液显色，压片，洗片。通过上述方法检测RD细胞中肠道病毒71型蛋白表达水平的变化。

荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，si-3A、si-3C、si-3D均对RD细胞中肠道病毒71型基因RNA水平有明显的抑制作用(图2A)，尤其si-3C的抑制率达到90％，与蛋白表达水平的检测结果一致(图2B)。同时通过western blotting法分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的蛋白表达量无明显变化，证明无脱靶现象。

2、小环DNA干扰系统在细胞水平对肠道病毒71型复制的影响

肠道病毒71型感染转染了上述重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)的RD细胞，培养24小时后，吸取上清培养液，将含有病毒的上清培养液作连续10倍稀释，接种于96孔板RD细胞，孵箱培养，每日在倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司，型号XDS-1C)下观察细胞病变(CPE)，连续观察7天；以Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50。利用荧光定量PCR法，用已知拷贝数的RNA标准品制作标准曲线，测定并计算上清中肠道病毒71型RNA的拷贝数。如图3A所示，siRNA有明显的抑制作用。病毒滴度检测结果同肠道病毒71型RNA的拷贝数变化一致(图3B)，si-3C抑制作用最显著，抑制率达90％，其次是si-3D。此外，与对照组相比，转染了si-3A、si-3C、si-3D重组载体的细胞病变(CPE)现象明显减弱(图3C)。

三、小环DNA干扰系统在动物水平对肠道病毒71型的抑制

1、小环DNA干扰系统在动物水平对肠道病毒71型基因表达的抑制

本实验所采用的动物模型为1日龄ICR乳鼠(购自军事医学科学院)。将乳鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组5只。除F组以外其余所有乳鼠首先按10⁶TCID₅₀/只的剂量腹腔注射(IP)EV71(Shzh-98，GenBankaccession no.AF302996，购自深圳市疾病预防控制中心)，24小时后，A-D组按10μg/只的剂量腹腔注射(IP)siRNA(si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP)重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)，E组和F组注射生理盐水，E组作为阳性对照组，F组作为阴性对照组。注射后饲养一周，处死小鼠。

取一定量的小鼠肌肉组织和肠组织分为两份于液氮保存，一份加全组织裂解液和全蛋白酶抑制剂(罗氏公司)，于冰上匀浆，至细胞完全裂解，离心，取上清，稀释后测量蛋白浓度，即刻上样分析(方法同细胞水平一致)。另一份组织样本于液氮研磨后，加入TRIZOL试剂提取总RNA，反转录成cDNA，进行实时定量PCR(方法同细胞水平一致)。动物水平的实验结果显示，与对照组相比，si-3A、si-3C、si-3D对小鼠肌肉组织和肠组织中肠道病毒71型基因的抑制效率达到了60％以上。同时分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。

2、小环DNA干扰系统对实验动物的影响

将乳鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组5只。除F组以外其余所有乳鼠首先按10⁶TCID₅₀/只的剂量腹腔注射(IP)EV71，24小时后，A-D组按10μg/只的剂量腹腔注射(IP)siRNA(si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP)重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)，E组和F组注射生理盐水，E组作为阳性对照组，F组作为阴性对照组。每日观察乳鼠体重变化和动物症状如食量变化、活动情况、精神状态等，连续观察两周，处死小鼠，并取其肌肉组织和肠组织，用于病理标本的制作。采用10％的福尔马林固定组织样本，修块后石蜡包埋，使用苏木精伊红染色，随后光学显微镜下观察病理变化。另外组织样本还进行免疫组织化学检测，组织样本切片使用3种梯度浓度的二甲苯脱蜡，6种浓度梯度浓度的乙醇水化，用清水冲洗切片10min，使用含3％过氧化氢的甲醇溶液浸泡以封闭内源性过氧化物酶活性。使用枸橼酸钠溶液浸泡，加热以修复抗原。使用羊血清封闭后滴加一抗，一抗为anti-EV71 MAb(Millipore)，稀释度为1000倍。置于湿盒中4℃过夜。PBS洗三次，滴加二抗，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗IgG多聚抗体，37℃温育30min。用DAB显色，清水冲洗后置于苏木精染色，用光学显微镜观察显色结果。

实验结果显示，与阳性对照组相比，注射siRNA(si-3A、si-3C和si-3D)重组小环载体的小鼠体重增长速度明显增加，无肢体麻痹无力表现。阳性对照组小鼠的小肠和骨骼肌均观察到明显病理改变，小鼠小肠绒毛上皮细胞空泡变性；骨骼肌细胞肌浆溶解，炎细胞浸润。而注射siRNA重组小环载体的小鼠组织无明显病理改变。免疫组化检测，结果发现EV71病毒抗原在阳性对照组小鼠的肌肉组织和小肠组织中有特异分布，注射siRNA重组小环载体的小鼠组织中只检测到部分区域的微弱分布。

综上所述，小环DNA干扰系统能够有效的抑制肠道病毒71型基因的表达和复制，并改善动物感染病毒的病理状态。

实施例二、靶向柯萨奇病毒A16基因干扰序列的设计，载体构建及细胞和动物水平药效学检测。

一、抑制柯萨奇病毒A16基因表达的干扰RNA基因表达载体的构建

1、干扰RNA序列的设计

应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向柯萨奇病毒A16编码区3A/3C/3D基因的干扰RNA序列，干扰序列为柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型基因编码区3A/3C/3D的保守区域序列，序列同实施例1。

2、小环DNA载体的构建

构建方法同实施例1。

二、小环DNA干扰系统在细胞水平对柯萨奇病毒A16的抑制

1、小环DNA干扰系统在细胞水平对柯萨奇病毒A16基因表达的抑制

用0.1MOI(感染复数)的柯萨奇病毒A16(shzh05-1，GenBank Accession：EU262658.1，购自深圳市疾病预防控制中心)感染转染了重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)的RD细胞，培养24小时后，加入TRIZOL试剂提取总RNA，反转录成cDNA，进行实时定量PCR。实施方法同实施例1，柯萨奇病毒A16基因PCR引物序列如下：

CA16 forward：5’-GGAAATGCGAGTTGTTTACCT-3’

CA16 reverse：5’-GGGGACTGACACTTGAGCTG-3’

荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，si-3A、si-3C、si-3D均对RD细胞中柯萨奇病毒A16基因RNA水平有明显的抑制作用(图4A)，尤其si-3D的抑制率达到80％，与蛋白表达水平的检测结果一致(图4B)。同时分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。

2、小环DNA干扰系统在细胞水平对柯萨奇病毒A16复制的影响

柯萨奇病毒A16感染转染了上述重组小环质粒的RD细胞，培养24小时后，吸取上清培养液，将含有病毒的上清培养液作连续10倍稀释，接种于96孔板RD细胞，孵箱培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，连续观察7天；以Reed-Muench法计算病毒滴度TCID50。利用荧光定量PCR法，用已知拷贝数的RNA标准品制作标准曲线，测定并计算上清中柯萨奇病毒A16RNA的拷贝数。。如图5A所示，siRNA有明显的抑制作用。病毒滴度检测结果与柯萨奇病毒A16 RNA的拷贝数变化一致(图5B)，si-3D抑制作用最显著，抑制率达90％，其次是si-3C。

三、小环DNA干扰系统在动物水平对柯萨奇病毒A16的抑制

1、小环DNA干扰系统在动物水平对柯萨奇病毒A16基因表达的抑制

所用小鼠模型同上。将乳鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组5只。除F组以外其余所有乳鼠首先按10⁸TCID₅₀/只的剂量腹腔注射(IP)CA16(shzh05-1，GenBank Accession：EU262658.1，购自深圳市疾病预防控制中心)，24小时后，A-D组按10μg/只的剂量腹腔注射(IP)siRNA(si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP)重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)，E组和F组注射生理盐水，E组作为阳性对照组，F组作为阴性对照组。注射后饲养一周，处死小鼠，取一定量的小鼠肌肉组织和肠组织液氮保存备用检测。检测方法同实施例1。

动物水平的实验结果显示，与对照组相比，si-3A、si-3C、si-3D对小鼠肌肉组织和肠组织中柯萨奇病毒A16基因的抑制效率达到了60％以上。同时分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。

2、小环DNA干扰系统对实验动物的影响

将乳鼠分为A、B、C、D、E、F六组，每组5只。除F组以外其余所有乳鼠首先按10⁸TCID₅₀/只的剂量腹腔注射(IP)CA16，24小时后，A-D组按10μg/只的剂量腹腔注射(IP)siRNA(si-3A、si-3C、si-3D和si-EGFP)上述重组小环质粒(提取自保藏号分别为：CGMCC No.5160，CGMCC No.5158，CGMCC No.5157和CGMCC No.5156的大肠杆菌菌株)，E组和F组注射生理盐水，E组作为阳性对照组，F组作为阴性对照组。每日观察乳鼠体重变化和动物症状如食量变化、活动情况、精神状态等，连续观察两周，处死小鼠，并取其肌肉组织和肠组织，用于病理标本的制作。

实验结果显示，与阳性对照组相比，注射siRNA(si-3A、si-3C和si-3D)重组小环载体的小鼠体重增长速度明显增加，无肢体麻痹无力表现。阳性对照组小鼠的小肠和骨骼肌均观察到明显病理改变，小鼠小肠绒毛上皮细胞空泡变性；骨骼肌细胞肌浆溶解，炎细胞浸润。而注射siRNA重组小环载体的小鼠组织无明显病理改变。免疫组化检测，结果发现柯萨奇病毒A16病毒抗原在肌肉组织和小肠组织中有特异分布。注射siRNA重组小环载体的小鼠组织中只检测到部分区域的微弱分布。

综上所述，小环DNA干扰系统能够有效的抑制柯萨奇病毒A16基因的表达和复制，并改善动物感染病毒的病理状态。

实施例三：靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16的双价载体的构建，细胞水平及动物水平药效学检测。

1、双价干扰RNA载体的构建

将上述已经证明最为有效的靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C和3D保守区域序列的干扰片段表达盒(H1+si-3C+U6)和(H1+si-3D+U6)分别利用EcoRI、BamHI酶切位点相连接，串连到小环DNA载体的相应位点。送测序，pMC-H1+si-3C+si-3D+U6构建成功。(图7)

2、干扰RNA的药效学检测

(1)、干扰RNA细胞水平的药效学检测

检测方法同上，实验结果显示，在RD细胞系中，si-3C+si-3D重组小环DNA载体对肠道病毒71型基因的表达抑制效率达到90％，对柯萨奇病毒A16基因的表达抑制效率达到80％。同时病毒滴度和RNA拷贝数明显下降。与单独的siRNA相比，抑制病毒的效果更加明显。分析了转录因子NFκB-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。

(2)、干扰RNA动物水平的药效学检测

检测方法同上，动物水平的实验结果显示，与对照组相比，si-3C+si-3D重组小环DNA载体对小鼠肌肉组织和肠组织中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的抑制效率达到了70％以上。同时分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。同时，注射si-3C+si-3D重组小环DNA载体的小鼠体重增长速度比注射单独的siRNA增加更明显。临床表现正常，无肢体麻痹无力表现，小鼠组织无明显病理改变。

上述实验结果说明si-3C+si-3D双价干扰序列的重组小环DNA载体能够特异且更为有效的靶向病毒基因，与单独的siRNA相比，能够起到更好的治疗手足口病的效果。

Claims

1.一种用于治疗由肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16引起的手足口病的载体转录的干扰RNA，其同时靶向肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因，其靶向所述肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C/3D保守区域序列，所述干扰RNA的编码DNA序列分别是SEQ ID NO:3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

2.权利要求1的干扰RNA的编码DNA序列。

3.一种载体，其包含权利要求2的编码DNA序列。

4.权利要求3的载体，其中所述载体是小环DNA质粒载体。

5.权利要求3或4的载体，其是一种双价载体，同时包含分别干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因编码区的3C和3D保守区域序列的干扰RNA的编码DNA序列。

6.权利要求1的干扰RNA、权利要求2的编码DNA序列和/或权利要求3-5中任一项的载体在制备治疗由肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16引起的手足口病的药物中的应用。

7.一种治疗由肠道病毒71型或柯萨奇病毒A16引起的手足口病的药物，其包含权利要求1的干扰RNA和/或权利要求3-5中任一项的载体作为活性成分。

8.一种干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将干扰肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16基因的干扰RNA的编码DNA序列与载体连接，所述编码DNA序列分别是SEQ ID NO:3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

b)在体外用所述载体转染感染肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16的细胞。