CN102660545B - 一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的RNAi及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的RNAi及其制备方法，所述包含siRNA序列、shRNA慢病毒表达载体构建、复制缺陷型慢病毒的获得、慢病毒感染Marc-145细胞（绿猴肾细胞）以及抑制PRRSV复制效果的验证方法，该序列具有明显抑制PRRSV在敏感细胞上复制的作用。本发明对猪瘟病毒体内外复制进行RNA干扰的探索，构建靶向猪瘟病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术，有望构建靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒的siRNA的转基因动物。为RNAi应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因功能研究以及猪瘟的防治积累了必要的实验数据，为动物的抗病育种提供前期准备。

Description

一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的RNAi及其制备方法

技术领域

本发明涉及抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）防治技术领域，由抑制PRRSV复制的两对shRNA序列组成的一种用于抑制PRRSV复制的RNAi，本发明还包括RNAi的制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，亦称蓝耳病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起，是一种严重危害养猪业的接触性传染病，PRRSV有欧洲型和美洲型病毒。均属于冠状病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜呈20面体或球形的RNA（核糖核酸）病毒。2006年夏秋季节暴发的“高致病性猪蓝耳病”给养猪业造成巨大经济损失，引起社会各界的广泛关注。OIE（国际兽医局）将其列为必须上报类动物疫病，是纳入世界性联防计划，予以重点控制和消灭的疫病之一。我国将其列为一类动物疫病，虽然相应灭活疫苗也获得使用，并在蓝耳病的预防控制方面取得了可喜成绩，但由于蓝耳病病毒非常容易发生变异，导致新的变异株不断出现、更迭，传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对蓝耳病的暴发和流行。RNAi（核糖核酸干扰）现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展，为蓝耳病的防制研究开辟了一个新的探索领域。

RNAi是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源mRNA（信使RNA）高效特异性降解的现象，是许多生物具有的对抗入侵的核酸，保护自身的天然机制。诱发RNAi的最关键分子是长度为19～27bp的双链RNA，被称为小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)。随着RNAi 机制及其应用研究的不断深入，人们发现无论体内还是体外试验，siRNA均能够抑制多种病毒的增殖。利用RNAi技术来抑制(或敲低)脊椎动物细胞中任何基因的表达开始了反义遗传学的革命。Lassus等研究结果证明，RNAi作为一种实用工具诱导细胞内的基因表达沉默，使得我们以前许多无法运用传统功能基因组学技术研究的机制和模型成为可能，开创了研究基因和蛋白质功能的新天地。它最大的优点在于具有高度有效性和特异性并且具有快速防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各类疾病治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是目前关于RNAi仍有很多问题亟待解决，例如：进行RNAi的时间和靶位点；哺乳类动物中的干扰素反应；RNAi作用的确切机制；脱靶效应等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用机制的探讨上，以及如何改进运用RNAi的方法来研究基因的功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以控制蓝耳病尤其高致病性蓝耳病的不足，构建靶向蓝耳病病毒基因组的特定保守基因区段的慢病毒载体介导稳定整合的RNA干扰技术，本发明还提供该技术的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于抑制PRRSV复制的RNAi及其制备方法：包含siRNA序列、通过构建shRNA(short hairpin RNA即短发夹脱氧核糖核酸)慢病毒表达载体，获得完整慢病毒、以获得的慢病毒感染Marc-145细胞，筛选出具有抑制PRRSV复制的Marc-145阳性细胞克隆。

所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:4包括：

875: 5’→3’ 

SEQ ID NO.1：T CACCGGAACAGGTTTCCAACCAAGGCGAA

CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC

SEQ ID NO.2：B AAAAGGAACAGGTTTCCAACCAAGGTTCG

               CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC

1010: 5’→3’

SEQ ID NO.3：T CACCGGACAATACTTGGCACCAATACGAA

TATTGGTGGCAAGTATTGTCC

SEQ ID NO.4：B AAAAGGACAATACTTGGCACCAATATTCG

               TATTGGTGCCAGTATTGTCC

所述shRNA表达载体的构建，包括shRNA克隆载体的构建和表达载体的构建。

所述复制缺陷型慢病毒的获得，包括shRNA表达质粒与Packaging Mix（包装混合物）共同转染293-FT(人胚肾细胞株）细胞，收获细胞上清，获得复制缺陷型慢病毒。

所述复制缺陷型慢病毒感染Marc145细胞，包括复制缺陷型慢病毒感染Marc145细胞， blasticidin抗性筛选，获得抑制PRRSV复制的Marc145阳性细胞克隆。 

所述抑制PRRSV复制效果的验证方法，包括流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50及Real-time RT-PCR。

本发明还提供了RNAi的制备及验证方法，包括以下步骤：

a. 设计并合成shRNA对应的DNA序列—ds oligo。

b. 利用T4 DNA连接酶将ds oligo 克隆进pEN/U6 载体。

c. 转化TOP 10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性。

d. 将上述pEN/U6-875和pEN/U6-1010两种质粒分别与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架。

e．获得的表达骨架与Packaging Mix共转染293-FT 细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子。

f．将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染Marc-145细胞，将ds oligo 整合到宿主细胞的基因组上。

g. blasticidin抗性筛选，获得稳定抑制PRRSV复制的Marc-145阳性细胞克隆。

h．分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50(组织细胞半数感染量)及Real-time RT-PCR（实时定量-反转录-聚合酶链反应）验证抑制效果。

本发明采用的Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶﹙RNA-dependent RNA polymerase，RdRp﹚，对病毒的复制起关键作用，参与病毒复制过程，高度保守，并且此酶只在病毒复制时出现。另外，现对Nsp9基因序列进行分析发现，在PRRSV不同的血清型和亚型中，Nsp9的核苷酸序列高度保守。鉴于此，本方法针对Nsp9基因设计shRNA序列，经过筛选可以使Nsp9基因沉默的序列从而达到同时抑制多种血清型PRRSV复制的目的，并通过建立稳定细胞系进一步验证，这有望成为猪繁殖与呼吸综合征病毒预防和控制的一个崭新途径。

鉴于以上分析，本研究选择了在PRRSV复制过程中发挥重要作用并且具有较高保守性的Nsp9基因区域作为干扰靶区。

按照shRNA序列选择的一般原则，利用Invitrogen公司的BLOCK-it^TM RNAi Designer在线设计程序初步筛选一些shRNA序列，同时对干扰靶位序列进行了同源性分析。从BLAST检验结果可以看出，所选shRNA干扰靶序列在较广泛流行的PRRSV血清型中都有很高的保守性。

当前较为常用的5种制备siRNAs的方法是体外转录法、直接化学合成法、长片段dsRNAs经RNase III类(如Dicer)降解、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达、siRNA质粒表达载体或病毒载体在细胞内表达siRNAs五种。前三种涉及到RNA操作，对实验室的要求较高。利用表达载体在细胞内表达siRNA不仅可以避开RNA操作，而且可以长效、稳定的产生RNAi效应。常用siRNA表达载体的启动子属于RNA聚合酶III (pol III)，主要有鼠源的U6启动子、人源的U6启动子和人H1启动子3种。各种siRNA表达载体转录出的产物是可折叠形成的shRNA，然后在细胞中被Dicer酶切割成siRNA，进而启动RNAi介导基因沉默。

使用siRNA表达载体需要合成2条编码shRNA序列的DNA单链，经退火后插入对应载体的pol III启动子下游。本发明使用的pEN/U6是含有人源U6启动子的shRNA表达载体，它是由Pol III启动子、卡那霉素抗性基因和大肠杆菌复制子等组成。利用已经线性化载体的粘性末端的碱基特性，将合成的一对带有4个碱基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并连接到上述pEN/U6载体。这种部分具有回文结构的DNA序列在RNA pol III启动子的作用下可以在哺乳动物细胞内转录出众多的shRNA，从而启动RNA干扰过程。

本发明注重干扰靶区的选择和shRNA的初步筛选，在细胞水平上考察了所选shRNA对靶基因的干扰作用，并借助慢病毒表达系统，筛选表达shRNA的阳性Marc-145细胞克隆，在细胞模型水平有助于阐明抑制FMDV复制的关键靶基因、病原感染过程及病原中该靶基因的生物学功能，并为转基因抗病育种打下坚实基础。 

附图说明

图1为表达shRNA的875 ds oligo与pEN/U6载体连接的重组质粒测序结果示意图；

图2为表达shRNA的1010 ds oligo与pEN/U6载体连接的重组质粒测序结果示意图；

图3为pENU6/875-shRNA与plentil6/DEST表达载体重组的测序结果示意图；

图4为pENU6/1010-shRNA与plentil6/DEST表达载体重组的测序结果示意图。

图5为间接免疫荧光验证shRNA对PRRSV复制的抑制效果

图6为流式细胞术验证shRNA对PRRSV复制的抑制效果

图7为TCID50测定shRNA抗病毒效果

图8 为real-time RT-PCR验证shRNA对PRRSV复制的抑制效果

 具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述

实施例1

1、表达shRNA的ds oligo的生成

借助美国Invitrogen公司网上在线设计软件(BLOCK-iT^TM RNAi Designer），确定针对pEN/U6载体要求的具体shRNA片段875及1010对应的DNA插入序列，送与宝生物工程(大连)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下：

875: 5’→3’ 

SEQ ID NO.1：T CACCGGAACAGGTTTCCAACCAAGGCGAA

CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC

SEQ ID NO.2：B AAAAGGAACAGGTTTCCAACCAAGGTTCG

               CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC

1010: 5’→3’

SEQ ID NO.3：T CACCGGACAATACTTGGCACCAATACGAA

TATTGGTGGCAAGTATTGTCC

SEQ ID NO.4：B AAAAGGACAATACTTGGCACCAATATTCG

2、ds oligo与pEN/U6载体连接，构建pEN/U6-shRNA

连接反应体系：

2.1双链寡核苷酸(ds oligo)的生成

  (1) 在0.2ml的PCR扩增管中建立下列体系：

(2) 95℃孵育上述反应4min，然后放置室温下退火5-10min。

(3) 短暂离心后，移出1μl反应液稀释至适当浓度备用。剩余的50μM ds oligo储存于-20℃。

2.2 ds oligo短片段与载体的连接

(1) 在室温下，0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列试剂建立连接反应体系：

(2) 上下吹打混匀后在室温下反应5min。

(3) 反应时间可延长至60min，然后放置冰上，进行下面的

转化TOP10感受态细胞。

3、将连接产物转化TOP10大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆即为构建的pEN/U6-shRNA，测序检验序列的保真性。测序结果见附图1及图2。

4、pEX/U6-shRNA表达质粒的构建

借助LR Enzyme Mix（重组酶混合物）作用，将pEN/U6-shRNA 重组在pLenti6-dest-vector(慢病毒系统的目的载体)上，从而构建pEX/U6-shRNA表达载体质粒。

4.1  LR重组反应

(1) 在0.2ml的PCR扩增管中建立下列反应体系：

(2) 从-20℃的冰箱取出LR Clonase Enzyme Mix在冰上融化1～2 min，简短离心2次后吸取2 μL加入上述反应体系，并上下吹打混匀。

(3)  25℃孵育上述扩增管1.5h，然后加1μL 蛋白酶K，37℃ 保温15min。接下来就可以进行转化感受态细胞。

4.2  重组体转化感受态细胞及阳性质粒鉴定

(1) 将上述中LR重组后的产物(约8 μL)加到50 μL在冰上融化的Stbl3感受态细胞(10min 内)中混匀，冰浴30min，42℃水浴热击60s(切勿振荡)，再冰浴2～3min，加入450μL预热的SOC，拧紧盖子混匀，37℃水平转速225 rpm振荡1h，3500rpm离心2min，吸弃约350μL，剩余的100μL菌液涂布在含对应抗生素的LB平皿上，吸收液体10min后37℃倒置培养14h至单菌落出现。

(2) 随机挑取生长于LB平皿上的数个单菌落，增菌培养后小量提取质粒，经PCR鉴定为阳性的，送于金唯智生物科技(北京)有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pEX/U6-shRNA。测序结果见附图3及图4。

5、复制缺陷型慢病毒的获得

pEX/U6-shRNA与已经优化的ViraPower? Packaging Mix共转染人胚肾细胞293-FT(脂质体转染法)，50h收获无复制能力的慢病毒上清液。4℃条件下3500 rpm离心5 min以去除细胞碎片，收集上清（慢病毒）于-70℃保存备用。必要时可以过滤。

6、复制缺陷型慢病毒感染Marc-145细胞及阳性细胞克隆的筛选

将正常Marc-145细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到80%～90%（24h）时，滴加阳性和对照包装复制缺陷型慢病毒液。48h后吸弃含慢病毒的DMEM，换上含有blasticidin的新鲜DMEM进行连续培养，当出现blasticidin抗性的细胞克隆时，挑取单个阳性细胞克隆和阴性对照单克隆细胞接种于96 孔细胞板，连续筛选四周，直至找到干扰效率最高的阳性克隆，再扩大培养并进行抑制效率分析。

7、样品1的制备

 取患蓝耳病猪肺脏组织，用双抗、石英砂研磨，pH7.6 0.05M PBS(磷酸盐缓冲液)悬浮，4℃浸毒过夜，次日，12000rpm/min、4℃离心30min，上清0.22um滤膜过滤后接种Marc-145细胞1～2mL/瓶，静置于37℃温箱内吸附1h（期间轻摇2～3次，使病毒与整个细胞面充分接触）。添加病毒维持液（不含血清DMEM）9～8 mL，以覆盖细胞层为度，同时以维持液代替病毒上清接种正常细胞作为阴性对照。继续置37℃恒温箱内培养，观察致细胞病变产生情况。待细胞出现典型细胞病变时，将其置于-70℃，反复冻融，离心，上清（记作F1）接种正常细胞，同上连续传代，待收毒时间稳定(约4d)时将其作为制备好的细胞毒保存备用。

8、间接免疫荧光检测shRNA抑制PRRSV表达的能力

为验证表达shRNA的阳性Marc-145细胞克隆抑制PRRSV包装能力，给筛选的阳性Marc-145细胞克隆接种实施案例1中步骤7培养的PRRSV细胞毒。培养24h后，弃去培养液，以PBS缓冲液(pH7.6)洗涤细胞2次，每次1.5min，冲洗后加入预冷的80%丙酮，放入-20℃冰箱固定25min，吸弃丙酮，以PBST缓冲液(pH7.6)洗涤单层细胞3次，每次4 min。室温下用含3~5%BSA的PBS封闭液封闭45min。弃掉封闭液，用PBS洗涤细胞3次，每次8 min。每孔加入用PBS 1:700稀释的兔抗PRRSV阳性血清1mL，在37℃湿盒中作用1h，弃去阳性血清，用PBST缓冲液洗涤单层细胞3次，每次6～8min。每孔加入1:85稀释的FITC（辣根过氧化物酶）标记的羊抗兔IgG 800μL，再在湿盒中37℃孵育1 h，吸弃荧光二抗，用PBST冲洗细胞3次，每次6～8min，吸干冲洗液后滴加2滴50%甘油溶液，置于荧光显微镜下观察染色结果并照相。

9、结果

阴性对照克隆和未转基因的空白对照在接种病毒24h后，每株细胞克隆的感染率均比有干扰序列的阳性细胞克隆的感染率高，并且差别比较明显。表明设计的shRNA具有抑制PRRSV的表达。详见附图5。

实施例2 

1-6步骤同实施例1。

7、样品2的制备

（1）表达质粒pEGFP+ Nsp9的构建

为验证表达shRNA的Marc-145细胞抑制靶基因的能力，本研究构建了带有GFP及Nsp9基因的真核表达载体。具体构建方法如下：

将扩增到的Nsp9基因和pEGFP-N1空载体分别用BamH I和XhoI双酶切并回收，然后用T4 DNA连接酶16℃连接3h，转化至感受态E.coli JM109，用50μg/mL卡那霉素抗性LB平板筛选，经PCR及BamH I和XhoI双酶切鉴定后获得阳性重组质粒。将序列和读码框均正确的重组质粒命名为pEGFP+ Nsp9。

（2）重组质粒pEGFP+ Nsp9转染Marc-145细胞

将Marc-145细胞培养于6孔培养板中，24h后，弃去孔内培养基，用不含血清和抗生素的DMEM洗细胞面两次，每孔按1 μg质粒DNA和2 μL 脂质体 2000的比例进行转染，分别设转染空载体和未转染的细胞为阴性对照。4.5h后吸弃转染液，加入新鲜的含10%犊牛血清的DMEM，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养。

8、流式细胞检测shRNA抑制靶基因Nsp9复制的能力

各细胞孔在转染后24小时分别用PBS缓冲液冲洗2次，胰酶消化并收集细胞，PBS重悬后加入流式管准备流式细胞术的检测，用激发波长为488nm的光进行检测，以CellQuest软件获取试验数据并进行分析。所有测定均在相同的仪器参数下进行，每个细胞孔收集10000个细胞。

9、结果

经流式细胞仪分析，转染后24 h后，pEX/U6-875孔平均阳性细胞率为12.1%；pEX/U6-1010孔平均阳性细胞率为11.9%；pEGFP- Nsp9孔平均阳性细胞率为57.2%；未转染的空白细胞平均阳性率为2%。由此可知表达shRNA的Marc-145细胞具有一定的抑制靶基因复制的能力，详见附图6。

实施例3

1-7步骤同实施例1。

8、TCID50测定shRNA抗病毒效果

将实施案例1中步骤7培养的PRRSV细胞毒取1份，连续做十倍倍比稀释(10^-1～10^-11)，每孔中加入每个稀释度的病毒液100μL，每个稀释度作8个重复孔，第12列加入维持液作为阴性对照，TCID50测定操作如下：

8.1 用含有10%犊牛血清的DMEM将生长良好的Marc-145细胞传代于96孔培养板，放置细胞培养箱中培养至长满孔底。

8.2 吸弃细胞孔中的培养基，用不含血清的DMEM冲洗2遍，然后每孔加入每个稀释度的病毒液100μL，37℃吸附1h后吸弃病毒稀释液，用不含血清的DMEM冲洗2遍，加入100μL只含1%双抗的DMEM继续培养。

8.3 每天观察直到终点，即看到能够引起CPE的最大病毒稀释度，观察并记录每个病毒稀释度细胞发生CPE的孔数，用Reed-Muench公式计算TCID50。取3次重复实验结果的算术平均值为最终TCID50数值，在实验中同时设空白对照。

9、结果

结果显示，pU6-shRNA-875和pU6-shRNA-1010的实验组病毒TCID50明显低于对照组(pU6-shRNA-CON和未转基因细胞株)。表明表达shRNA的Marc-145细胞能够抑制PRRSV的复制，抑制效果印证了实施案例1中直接观察到的结果。详见附图7。

实施例4 

1-7步骤同实施例1。

8、real-time RT-PCR验证shRNA对PRRSV复制的抑制效果

以对Nsp9基因的扩增检测PRRSV基因的复制情况，同时以管家基因 β-actin作为内参。分别收集稳定整合干扰序列、对照无关序列的转基因细胞和未转基因的细胞，提取总RNA。经反转录获得cDNA，在完全一致的PCR条件下，将Nsp9基因和β-actin基因同步扩增。然后，用比较阈值法分析不同样品中PRRSV的相对拷贝数(Kenneth J and Thomas D,2001)，计算方法为：①△CT=处理样品Nsp9基因扩增CT值-处理样品β-actin扩增CT值；②△△CT=未处理样品△CT值-处理样品△CT值；③以2-△△CT计算处理组PRRSV拷贝数相对于对照组的倍数。

9、结果

与pU6-shRNA-CON和未转基因的正常细胞相比， pU6-shRNA-875、pU6-shRNA-1010病毒基因相对拷贝数低至0.58以下，抑制率达到为90.05%以上，说明2个干扰组都表现出了很强的抑制病毒感染的能力。详见附图8。

序列表

 

Organization Applicant

----------------------

      Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号

      City : 兰州

      State : 甘肃

      Country : 中国

      PostalCode : 730046

      PhoneNumber : 0931-8343385

      FaxNumber : 0931-8340977

      EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com

<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所

 

Application Project

-------------------

<120> Title : 一种用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的RNAi及其制备方法

<130> AppFileReference : RNA Interference Targeting VP1 Inhibits Foot-and-Mouth Disease Virus Replication in BHK-21 Cells and Suckling Mice

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      SequenceName : SEQ ID NO.2

      SequenceDescription :

 

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caccggacaa tacttggcac caatacgaat attggtggca agtattgtcc                 50

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      SequenceDescription :

 

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      SequenceName : SEQ ID NO.4

      SequenceDescription :

Claims (2)

1. 一种用于抑制PRRSV复制的shRNA，其特征在于包括siRNA序列，通过构建shRNA慢病毒表达载体，获得复制缺陷型慢病毒，以获得的慢病毒感染Marc-145细胞，筛选表达shRNA的Marc-145细胞克隆并验证其对PRRSV的抑制效果；

所述shRNA序列是SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2，即：

875: 5’→3’ 

SEQ ID NO.1：T CACCGGAACAGGTTTCCAACCAAGGCGAA

CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC

SEQ ID NO.2：B AAAAGGAACAGGTTTCCAACCAAGGTTCG

               CCTTGGTTGGAAACCTGTTCC。

2. 一种如权利要求1所述shRNA的制备方法，包括以下步骤：

a. 设计并合成shRNA对应的DNA序列—ds oligo；

b. 利用T4 DNA连接酶将ds oligo 克隆进pEN/U6 载体；

c. 转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性；

d. 将步骤c中获得的质粒与pDEST载体进行LR重组，获得表达骨架；

e．获得的表达骨架与Packaging Mix共转染293-FT 细胞，产生复制缺陷型慢病毒粒子；

f．将产生的复制缺陷型慢病毒粒子感染Marc-145细胞；

g. blasticidin抗性筛选，获得表达shRNA的Marc-145阳性细胞克隆；

h．分别用流式细胞术、间接免疫荧光、TCID50及Real-time RT-PCR验证抑制效果。

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