CN105121645A

CN105121645A - 用于病毒生产的细胞系和使用方法

Info

Publication number: CN105121645A
Application number: CN201480007578.8A
Authority: CN
Inventors: J.M.卡皮洛; M.S.奧伯斯特; R.A.特里普; S.M.汤普金斯
Original assignee: United States, Represented by Secretary Department of Health; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF; Thermo Fisher Scientific Inc
Current assignee: United States, Represented by Secretary Department of Health; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF; Thermo Fisher Scientific Inc
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-02-05
Also published as: AU2014215025B2; WO2014123967A2; KR20150133695A; US10137188B2; US20170151322A9; AU2014215025A1; HK1219975A1; CN105121645B; JP2016506734A; WO2014123967A3; CA2899928A1; BR112015018493A2; EP3372685A3; US20150374812A1; EP2954055A2; RU2015137703A3; EP2954055B1; EP3372685A2; MX2015010017A; RU2015137703A

Abstract

在此提供了工程化细胞系。在一些实施例中，一种工程化细胞系的细胞具有一种基因的改变的表达和/或一种miRNA的改变的表达，其中该改变的表达会导致提高或降低一种病毒的生产。该病毒是一种微小核糖核酸病毒如一种脊髓灰质炎病毒或肠道病毒71。在此还提供了用于使用这些工程化细胞来产生病毒的方法，以及用于治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法。

Description

用于病毒生产的细胞系和使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年2月5日提交的美国临时申请序列号61/760,895和2013年10月1日提交的序列号61/885,357的权益，每份申请通过引用结合在此。

政府资助

本发明是在联邦预算线5614A11101“新发性传染病”下由政府支持进行的。政府具有本发明中一定的权利。

发明领域

本发明涉及用于增强病毒生产的组合物和方法。具体而言，这些组合物可以包括基因(基因靶标)、所述基因靶标的效应物、以及其中基因靶标已被改变来增强病毒生产的细胞系和细胞裂解物。

背景

疫苗是用来预防人类疾病的主要策略之一。当前，2种以上疫苗可用于对抗由病毒传染引起的疾病(例如，水痘、乙型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎)和细菌传染引起的疾病(例如，霍乱、破伤风、伤寒、白喉)。类似地，疫苗用来预防家畜的许多疾患，这些家畜包括但不限于：家禽、马、猪、以及其他动物。

虽然若干疫苗(包括流感疫苗)仍然是产生于受精鸡卵(家鸡(Gallusgallusdomesticus))中，但更多数量的疫苗是产生于细胞培养物中。在一种情况下，充分表征的细胞系(例如，维洛细胞(VeroCell))首先感染活病毒或活的减毒病毒。随后，含有子代病毒颗粒的上清液被收集和加工来产生之后可以分配到种群中的高度免疫原性剂量的疫苗。

尽管疫苗被证明是成功的，但根除或控制疾病爆发的能力因疫苗生产的成本和制造局限而重复受到挑战。脊髓灰质炎疫苗对此作出了最佳说明。脊髓灰质炎病毒是一种人肠道病毒并且是脊髓灰质炎的病原体，这种神经变性剂的粪-口传播会导致急性麻痹。此时，疫苗被产生来限制脊髓灰质炎的传播，并且包括高效(且明显更为昂贵)的灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)以及效力略低(且更为经济)的口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)。出于有关减毒的OPV病毒颗粒会回复到高度传染性的神经毒性脊髓灰质炎病毒的技术原因，成功根除脊髓灰质炎将借助于开发显著降低IPV制造成本的新技术。

发明既述

在此提供了可以由脊髓灰质炎疫苗制造厂家使用来显著降低OPV和IPV疫苗的生产成本的一批基因、试剂以及细胞系。本发明提供调节(下调或过表达)时增强脊髓灰质炎病毒复制的一列宿主基因(蛋白编码基因和非编码RNA)。因此，鉴别的基因可以被调节来提高脊髓灰质炎病毒疫苗生产。另外，诸位发明人描述了可以被产生来增强脊髓灰质炎病毒生产的一系列细胞系。以上全部可以单独或组合使用来增强用来对抗脊髓灰质炎以及其他微小核糖核酸病毒感染的疫苗的生产。最后，诸位发明人描述了可以通过多种手段(例如，siRNA、miRNA、小分子)调节来限制脊髓灰质炎病毒生产的一系列基因。

在此提供了工程化的细胞系。在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞具有选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达，其中该编码区选自ZNF205、CNTD2、SEC61G、ETS1、TAF1L、MCCD1、LY6G6C、BTN2A1、GLXP3、GCGR、EP300。在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞具有选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达。与该对照细胞系相比，该降低可以是至少5％。表达的降低可以通过测量细胞中由该编码区编码的多肽或mRNA的量来确定。在一个实施例中，这些细胞在该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。在一个实施例中，这些细胞包括降低该编码区的表达的一种外源多核苷酸。该外源多核苷酸可以是RNA多核苷酸如siRNA、shRNA、或反义多核苷酸。在一个实施例中，这些细胞包括导致降低的表达的一个编辑基因组。例如，该基因组可以由锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活因子样效应物编辑。

在一个实施例中，这些细胞进一步包括选自表I的至少一个另外的编码区的降低的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。在一个实施例中，这些细胞包括选自表I的至少五个编码区的降低的表达。在一个实施例中，这些细胞进一步包括至少2个编码区的一个组合的降低的表达，其中编码区的这些组合选自表VI。在一个实施例中，这些细胞包括选自表II的与一种对照细胞系相比一个编码区的提高的表达。在一个实施例中，这些细胞进一步包括选自表II的至少一个另外的编码区的提高的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的降低的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。在一个实施例中，这些细胞包括选自表II的至少五个编码区的提高的表达。

在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞包括与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达。这些细胞可以包括充当这些miRNA之一的一种miRNA模拟物。在一个实施例中，这些细胞进一步包括至少两个miRNA的提高的表达。

在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞包括选自表IV的与一种对照细胞系相比一个内源miRNA的降低的表达。在一个实施例中，这些细胞在编码该miRNA的该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。在一个实施例中，这些细胞包括抑制该内源miRNA的活性的一种miRNA抑制剂。

一个工程化细胞系的细胞可以包括一种微小核糖核酸病毒。在一个实施例中，该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒如减毒的脊髓灰质炎病毒，例如，沙宾(Sabin)1、沙宾2、沙宾3。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney、Brunhilde、MEF-1、Saukett、或它们的组合。在一个实施例中，该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。

该工程化细胞系可以是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。在一个实施例中，该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。在一个实施例中，该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。在一个实施例中，该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

在此进一步提供了一种工程化细胞系的一种裂解物。

在此提供了用于产生一种病毒的方法。在一个实施例中，该方法包括提供在此描述的该工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该工程化细胞系；任选地收获由这些细胞产生的该病毒。在一个实施例中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包括抑制选自表I的一个编码区的表达的一种RNA多核苷酸；并且任选地收获由这些细胞产生的该病毒。在一个实施例中，该RNA多核苷酸可以是一种siRNA，一种shRNA，或一种反义多核苷酸，选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一种miRNA，抑制选自表IV的一种miRNA的活性的一种mRNA抑制剂，或它们的组合。

在一个实施例中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒，并且其中这些细胞包括会导致选自表I的一个编码区的降低的表达的一个编辑基因组；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系；并且任选地收获由这些细胞产生的该病毒。在一个实施例中，该基因组是由锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活因子样效应物编辑。在一个实施例中，该方法包括提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包括抑制选自表I的一个编码区的表达的一种小分子；并且任选地收获由这些细胞产生的该病毒。

一种方法中所使用的细胞可以包括一种脊髓灰质炎病毒。在一个实施例中，该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒如减毒的脊髓灰质炎病毒，例如，沙宾1、沙宾2、沙宾3。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney、Brunhilde、MEF-1、Saukett、或它们的组合。在一个实施例中，所使用的这些细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。在一个实施例中，该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。

一种方法中所使用的细胞可以是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。在一个实施例中，该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。在一个实施例中，该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。在一个实施例中，该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

还提供了用于治疗患有病毒感染、或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法。在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中提高选自表I的一个编码区的表达。在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中抑制选自表II的一个编码区的表达。在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中抑制选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个内源miRNA的表达。在一个实施例中，该方法包括在受试者的细胞中提高选自表IV的一种miRNA的表达。

术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更多个的组合。

词语“优选的”和“优选地”指代本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施例。然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施例的叙述不意味着其他实施例是无用的，并且不意图将其他实施例排除在本发明的范围之外。

术语“包含”及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求中出现的情况下，不具有限制性含义。

除非另外说明，“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换地使用并且意指一个或多于一个。

而且在此，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包括的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来进行这些步骤。另外，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

图和表的简要说明

图1.初步基因组范围内siRNA筛选的结果图示示出了使用一种脊髓灰质炎病毒特异性ELISA筛选＞18,200个基因的结果。这些筛选中所使用的病毒是沙宾2。Y轴线提供标准化Z-评分。X轴线表示筛选的基因。

图2.CCID₅₀测定结果。图示示出了维洛细胞中的一批示例性单个基因的敲低如何影响病毒滴度。Y轴线，标准化为非靶向对照(NTC)的病毒滴度。这些筛选中所使用的病毒是沙宾2。X轴线提供基因名称。

图3.空斑测定结果。(A)图提供了初步筛选中鉴别的靶基因的敲低如何提高总空斑数(病毒滴度，即，病毒数)的实例。对照＝非靶向对照siRNA。上清液的稀释液的范围是从10^-4至10^-6。(B)图示示出了初步ELISA筛选中鉴别的一批命中区域的结果。NTC＝非靶向对照。siPolio＝靶向脊髓灰质炎病毒基因组的siRNA。这些筛选中所使用的病毒是沙宾2。

图4.抗原等效性研究结果。对在维洛细胞中产生的用靶向特异性基因的siRNA未修饰或修饰的病毒进行抗原等效性研究。数值指示了中和来源于给定基因敲低的病毒的感染性的一种标准化人血清池的稀释度。

图5.1型和3型脊髓灰质炎病毒(沙宾株)结果。用靶向初步(沙宾2)筛选中鉴别的基因的siRNA转染的维洛细胞随后感染(A)1型脊髓灰质炎病毒(沙宾株)或(B)3型脊髓灰质炎病毒(沙宾)。使用实例1中描述的脊髓灰质炎病毒ELISA评定随后的上清液。用靶向初步筛选中鉴别的基因的siRNA转染的维洛细胞随后感染(C)1型脊髓灰质炎病毒(沙宾株)或(D)3型脊髓灰质炎病毒(沙宾)。使用实例1中描述的空斑测定评定随后的上清液。

图6.miRNA模拟物筛选概述。在初步ELISA筛选中测试大于1,200个miRNA模拟物以鉴别增强和降低脊髓灰质炎病毒抗原的基因。

图7.CCID₅₀测定中各个miRNA模拟物的性能。初步筛选中鉴别的11种miRNA诱导病毒滴度两倍或更多倍的增加。

图8.A.示例性基因敲低(KD)数据。q-RT-PCR用来评定各个siRNA转染到维洛细胞中之后的靶基因敲低的水平。9个基因沉默实验(ZNF205、SEC61G、ETS1、EP300、BTN21A、GLRXP3、TAF1、MCCD1以及GCGR)的结果显示典型地观察到70％的KD或更大。B.图示示出了单一基因敲低事件对七种不同的脊髓灰质炎病毒的影响。使29种单独的基因分别在维洛细胞中沉默。随后，细胞感染七种不同的脊髓灰质炎株中的一种，包括沙宾1、沙宾2、沙宾3、Mahoney(野生型1)、Brunhilde(野生型1)、MEF(野生型2)、以及Saukett(野生型3)。记录滴度是相对于在将一种非靶向对照siRNA(NTC)转染到细胞中时所观察到的那些而言的。另外的对照包括1)靶向脊髓灰质炎病毒(siPolio)的siRNA池、模拟感染(mockinfections)(Mock)、以及在siRNA不存在(-siRNA)下用脂质转染试剂处理的细胞。实线指示病毒滴度的4倍增加。点线指示病毒滴度的8倍(或更佳)增加。此数据为初步筛选中鉴别的基因靶标的敲低会带来脊髓灰质炎病毒生产的增强提供进一步的支持。

图9A和图9B.双基因敲低对多种脊髓灰质炎病毒株的滴度的影响的示例性数据。深灰色条表示两种基因同时沉默时所观察到的病毒滴度的实际增加。浅灰色条表示基于各个基因沉默时观察到的变化总和预测的滴度。“*”表示观察到的滴度的增加大于单一事件总和的事件(incidents)(P＜0.05)。

图10.(A)基因沉默对EV71病毒生产的影响。用靶向脊髓灰质炎病毒RNAi筛选过程中鉴别的若干基因中的一种的siRNA转染维洛细胞。在一个适当的基因沉默时间段之后，将EV71添加到培养物中。随后，通过检测细胞病变效应(CPE)来评定相对滴度。(B)空斑测定结果证实三种不同的基因(ZNF205、CNTD2和MCCD1)沉默如何影响EV71滴度。“RD细胞”＝横纹肌肉瘤细胞。(C)条形图量化了空斑测定的结果。实验重复进行三次，并且结合一种非靶向对照siRNA(NTC)以及靶向EV71基因组的一种siRNA(siEV71)。

表I.提供增加脊髓灰质炎病毒抗原和复制的124个基因的列表。表提供基因名称、KEGG转换编号、以及来自初步脊髓灰质炎特异性ELISA的Z-评分值。

表II.提供沉默时大大减少脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的大于100个基因的列表。

表III.提供具有诱导脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产增加的两个或更多个siRNA的68个基因(表I中鉴别的124个命中区域除外)的列表。表提供基因名称以及诱导表型的siRNA的数目。

表IV.提供大大减少脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的宿主编码的miRNA的列表。

表V.基因、检索号、以及用来产生图8中的数据的siRNA序列的列表。

表VI.以加合或协同方式增强脊髓灰质炎病毒生产的49个基因组合。

展示性实施方式的详细说明

现将结合优选实施例来描述本披露。这些实施例被呈现来帮助理解本披露，并且并不意图且不应被解释为以任何方式限制本披露。在阅读本披露之后对普通技术人员而言可能变得显而易见的所有替代方案、修改以及等效物被包括在本披露的精神和范围内。

关于基因命名，单一基因经常由多个符号表示。例如，在文献中，编码肽酰脯氨酰异构酶B的亲环蛋白B基因标示为PPIB和CYPB。在本文件的上下文中，基因符号无论是人的还是非人的都可以通过大写字母或小写字母来指定。一个特定符号的使用或小写字母或大写字母符号的采用都不意图限制基因在这些发明的上下文中的范围。除非另外鉴别，在此鉴别的所有基因鉴别编号(GeneID)来源于美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)“Entrez基因”或KEGG网站。

如在此所使用，术语“基因”指代转录单元以及邻近(例如，位于上游和下游)且可操作地连接到该转录单元上的调节区。一个转录单元是转录成一个RNA分子的一系列核苷酸。一个转录单元可以包括一个编码区。“编码区”是编码随后被加工成mRNA的未加工的preRNA(即，包括外显子和内含子的RNA分子)的核苷酸序列。一个转录单元可以编码一个非编码RNA。一个非编码RNA是未被翻译成一种蛋白质的一个RNA分子。非编码RNA的实例包括微小RNA。一个转录单元的边界通常由5′端的一个起始位点和3′端的一个转录终止子确定。“调节区”是调节其可操作地连接的转录单元的表达的核苷酸序列。调节序列的非限制性实例包括启动子、增强子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点、转录终止子、以及poly(A)信号。位于一个转录单元上游的一个调节区可以被称为一个5’UTR，并且位于一个转录单元下游的一个调节区可以被称为一个3’UTR。一个调节区可以进行转录，并且是一个未加工的preRNA的一部分。术语“可操作地连接”指代使得组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的连接。

如在此所使用，“编码区的降低的表达”和“编码区的提高的表达”指代编码区的转录的变化、由编码区编码的mRNA的翻译的变化、或由编码区编码的多肽的活性的变化。

在本文件的上下文中，术语“疫苗”指代用来刺激动物或人的免疫系统以便于提供保护以免受到例如传染性病原体的影响的一种试剂，包括但不限于：肽或修饰的肽、蛋白质或修饰的蛋白质、活病毒、活的减毒病毒、灭活的或杀死的病毒、病毒样颗粒(VLP)、或它们的任何组合。疫苗常常通过刺激接收这类治疗的一位或多位受试者体内的一种抗体、一种抗体样分子、或一种细胞免疫反应的产生来起作用。

术语“病毒生产”可以指代活病毒、减毒病毒、和/或VLP的生产。可以通过包括1)在一种生物体(例如，蛋)、一种培养细胞(例如，维洛细胞)或体外(例如，经由一种细胞裂解物)生产的常规方法来进行生产。

术语“细胞系”指代能够继续分裂而不会经受衰老的细胞克隆性群体。

术语“疫苗细胞系”描述了用来产生疫苗的任何细胞、或修饰的细胞、或部分或全部来源于一种或多种细胞的任何细胞裂解物或修饰的细胞裂解物。一种或多种细胞可以来源于任何数量的来源，包括哺乳动物(包括但不限于人、非人灵长动物、仓鼠、狗)、禽类(例如，鸡、鸭)、昆虫等等。用来产生疫苗的细胞裂解物可以类似地来源于任何数目的细胞类型。在一些情况下，术语“宿主细胞”和“疫苗细胞系”是同义的并且包括以下这样的任何细胞：1)病原体(例如，病毒)感染的靶标，2)用于产生病毒或疫苗的亚单元(例如，免疫原性蛋白)，和/或3)用于产生生物分子。

术语“增强的疫苗细胞系”、“增强的细胞系”、“工程化疫苗细胞系”或“工程化细胞系”都指代以下这样的细胞系或细胞裂解物：通过一种或多种手段修饰来调节一种或多种内源性表达基因的表达或特性以便加强疫苗或生物分子的生产或特性。

如在此所使用，术语“对照细胞系”和“对照细胞”指代遗传上类似于工程化细胞系但未以相同方式工程化的细胞系。例如，一种工程化细胞系可以具有与未以相同方式工程化的一种对照细胞系相比时选自表I的一个编码区的降低的表达。

可以用来调节基因表达的方法包括但不限于：小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义分子、锌指核酸酶、大范围核酸酶、TAL(TALE)核酸酶、三链体、修饰的三链体、小分子、开放阅读框(ORF)的改变的表达或克隆DNA等等。

在本文件的上下文中，术语“靶标”或“靶基因”或“命中区域”指代(在调节时)有利地或不利地改变病毒或生物分子生产的某一方面的任何基因，包括蛋白-编码基因以及非编码RNA(例如，miRNA)。靶基因包括内源宿主基因、病原体(例如，病毒)基因、以及转基因。

术语“调节(modulates)”或“调节(modulation)”指代基因的调节、表达或活性的改变。一般而言，本领域技术人员应理解，术语“调节”包括提高基因的表达或活性、降低基因的表达或活性、以及改变基因的特异性或功能。调节一种基因的表达或活性可以通过多种手段来实现，包括改变以下各项中的一种或多种：1)基因拷贝数；2)基因的转录或翻译；3)转录物的稳定性或寿命；4)mRNA或miRNA的拷贝数；5)非编码RNA或非编码RNA靶位点的有效性；6)蛋白质上翻译后修饰的位置或程度；7)蛋白质的活性；以及其他机制。调节能够导致靶基因活性的显著降低(例如，至少5％、至少10％、至少20％或更大降低)或靶基因活性的提高(例如，至少10％、至少20％或更大提高)。另外，本领域技术人员应理解，一个或多个基因的调节随后可能导致多种基因(例如，miRNA)的调节。

术语“微小RNA”是根据它的普通且简单的含义使用，并且指代基于RNA的基因调节中涉及的真核生物中发现的微小RNA分子(参见，例如卡林顿(Carrington)等人，2003，科学(Science)，301：336-338)。各个miRNA已在不同的生物体中进行鉴别和测序，并且基于对miRNA登记库的提交来命名(格瑞菲斯·琼斯(Griffiths-Jones)，2004，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，32(增刊1)：D109-D111，并且参见miRBase.org)。在此提供了miRNA的名称，并且通过miRBase.org可容易地获得它们的序列。另外，其他miRNA对于本领域技术人员而言是已知的，并且可以在于此描述的实施例中容易地实施。方法和组合物不应限于本申请中鉴别的miRNA，因为它们提供为实例，而非必要地限制在此描述的实施例。具有与一个天然miRNA区的一致性小于100％的一个miRNA区的一种miRNA可以被称为一种“模拟miRNA”。所述分子可以是修饰的或未修饰的。

术语“生物加工”或“生物生产”指代在1)细胞系，2)细胞裂解物，或3)体内平台模型(例如，蛋)中实验室和工业规模生产生物产品(例如，生物治疗剂、疫苗)。

术语“微小核糖核酸病毒”指代小RNA病毒科家族的成员。小RNA病毒科家族的成员的实例包括肠道病毒属的成员。肠道病毒属的成员的实例包括肠道病毒种类A。一种肠道病毒种类A的一个实例是肠道病毒71，在此又称为EV71。肠道病毒属的成员的实例包括肠道病毒种类C。肠道病毒种类C的一个实例包括脊髓灰质炎病毒。野生型强毒性脊髓灰质炎病毒株的实例包括Mahoney、Brunhilde、MEF-1、以及Saukett。减毒的脊髓灰质炎病毒株的实例包括沙宾1、沙宾2、以及沙宾3。一种脊髓灰质炎病毒可以是血清型1(例如，沙宾1、Mahoney和Brunhilde)、血清型2(例如，沙宾2和MEF-1)或血清型3(例如，沙宾3和Saukett)。术语“微小核糖核酸病毒”意图包括可以用于疫苗生产中的任何当前的或未来的细小核糖核酸病毒。这些包括任何和所有野生型株、亲本株、减毒株(如脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3的沙宾株)、VLP、除三种已知的脊髓灰质炎病毒之外的微小核糖核酸病毒家族的任何成员、以及当前的或未来的重组的或工程化的株。

“适合”于发生一个事件如产生病毒的条件，或“适合”的条件是不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于该事件。

增强微小核糖核酸病毒生产

本披露涉及用于产生疫苗的组合物和方法。在一个优选的应用中，这些组合物和方法涉及产生脊髓灰质炎疫苗。通过使用本披露，可以设想涉及提高疫苗生产的修饰的细胞系、细胞裂解物和/或体内系统(例如，在卵内)的组合物和方法。

疫苗可以通过各种手段来产生。在一种情况下，首先在一个适当的环境(例如，细胞或组织培养板或烧瓶)中，将包括但不限于人、非人灵长动物、犬以及禽类的任何数目来源的细胞培养至一个所希望的密度。随后，将病毒种子母液(例如，沙宾2脊髓灰质炎病毒)添加到它们感染细胞的培养物中。之后将感染细胞转移到一个生物反应器(例如，一次性生物反应器)中，在该生物反应器中，病毒进行复制并且数目扩增。在一个适合的时间段之后，将细胞和细胞微粒从新释放的病毒颗粒中分离，并且进行另外的步骤(例如，纯化、失活、浓缩)来进一步制备用作一种疫苗的材料。

对于病毒的生长，宿主细胞对病毒复制做出了重大贡献。举例来说，病毒经常使用宿主编码的细胞表面蛋白来进入到细胞中(拉莫斯·I(Ramos，I)等人，(2012)微生物前沿(FrontMicrobiol.)3：117)。类似地，病原体常常使用宿主区室(例如，细胞内小泡)以用于运输至具有病原体相关基因过程的必要功能的胞内区(卡尔拉斯·A(Karlas，A.)等人，(2010)自然(Nature)463：818)。对病原体繁殖而言必要的功能的缺失会对病原体复制产生不利影响。相反地，不利地影响病原体复制的功能的缺失或对病原体繁殖而言必要的功能的过表达在一些情况下可以极大地增强例如病毒的生产(科罗柯斯夫(Kolokoltsov)等人，(2007)病毒学杂志(J.Virol.)81：7786)。

虽然先前研究已鉴别促进病毒感染的宿主编码的基因敲低以及过表达事件，但已充分证明，这些发现在紧密相关的系统中经常很难复制。举例来说，包括布拉斯(Brass)等人(科学(2008)319：921)和柯尼格(Konig)等人(细胞(Cell)(2008)135：49)的若干小组已使用RNAi技术来鉴别在HIV复制中发挥作用的宿主编码的基因。在这些研究的过程中，每组鉴别出调节时改变HIV复制的一个或多个方面的超过两百个的宿主编码的基因。然而当将每组产生的基因命中区域列表进行比较时，两个数据集共有不到10％的基因。本领域专家将这些结果归因于多个因子的细微差异，该多个因子包括病毒株、细胞系、以及每项研究中所采用的测定。诸位发明人认识到了这些发现的微妙的重要性，并且为此原因已将他们的当前的研究聚焦到疫苗生产中当前采用的病毒和细胞系统上。

在一个实施例中，在此提供了(单独或组合地)调节时增强细胞、细胞系或细胞裂解物中包括脊髓灰质炎病毒或脊髓灰质炎病毒抗原的微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原的生产的一列蛋白编码基因(表I)。优选地，所述列表中一种或多种基因的调节能增强脊髓灰质炎病毒的沙宾-2疫苗株的生产。更优选地，所述列表中的该一种或多种基因的调节能增强细胞、细胞系或细胞裂解物中用于脊髓灰质炎病毒疫苗制造中的沙宾-1、沙宾2和/或沙宾3脊髓灰质炎病毒或脊髓灰质炎病毒抗原的生产。

表I.沉默时提高脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的基因列表

该列表包括落入到多个类别/家族和功能中的基因，该功能包括但不限于：激酶、蛋白酶、泛素化、先天免疫、细胞凋亡等等。如实例中所示，某些基因的下调会显著增强病毒蛋白的生产和/或活的传染性微小核糖核酸病毒的总滴度。同时，这项研究中所使用的筛选还鉴别出沉默时减少脊髓灰质炎病毒复制的一批基因(表II，实例)。已认识到，这一后一类基因代表用于治疗脊髓灰质炎和其他病毒疾病的一批有价值的潜在治疗性靶标。这个列表从疫苗制造的角度来看也是有价值的，因为这些基因的过表达应该会增强微小核糖核酸病毒的生产。

表II.沉默时降低脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的基因列表

增强微小核糖核酸病毒生产的机制可能是多种多样的。在一些情况下，筛选中鉴别的基因与病毒的一种或多种组分具有直接的负面相互作用。例如，宿主基因产物可能是细胞的先天免疫的一个直接介导物，并且因此通过例如检测病毒基因组并随后诱导一个细胞凋亡状态而具有抗病毒特性。在其他情况下，当基因产物的调节通过修改一个途径、一个区室或病毒例如复制所依赖的一个细胞状态有利地影响病毒复制时，基因的作用可能是间接的。例如，可以想到的是，特定的调节事件会增强一个宿主蛋白翻译后修饰，并且通过这种方式有利地加强病毒复制所必要的一个或多个宿主细胞分泌途径。可替代地，一种或多种基因的调节可以提高细胞活力，从而增加能够支持病毒复制的细胞数目。在另一种情况下，一种或多种基因的调节可以将细胞锁定到细胞周期中更有利于病毒生长的一个阶段。在这些情况下，诸位发明人预见到本发明的益处可能不限于脊髓灰质炎病毒疫苗生产，而是可以延伸到其他微小核糖核酸病毒或生物分子(例如，治疗性抗体)。

在此鉴别的基因的调节可以通过多种方法来实现，该多种方法包括操纵基因组DNA、信使和/或非编码RNA和/或蛋白质的技术。因此，可以被采用来调节一种感兴趣的基因的技术或机制包括但不限于：1)靶向基因组DNA以产生一个编辑基因组的技术和试剂(例如，将一个突变如一个缺失引入到一种基因中的同源重组、锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物(例如，TALEN)、三链体、外遗传修饰的介导物、以及CRISPR和rAAV技术)；2)靶向RNA的技术和试剂(例如，通过RNAi途径起作用的试剂、反义技术、核糖酶技术)；以及3)靶向蛋白质的技术(例如，小分子、适体、肽、生长素-或FKBP-介导的去稳定结构域、抗体)。

在靶向DNA的一个实施例中，基因调节使用锌指核酸酶(ZFN)来实现。合成ZFN由与例如一个FokIDNA裂解结构域融合的一个定制设计的锌指结合结构域构成。由于这些试剂可以被设计/工程化用于编辑各式各样的生物体中的一种细胞的基因组，包括但不限于敲出或敲入基因表达，因此它们被认为是用于开发具有所希望的特性的稳定的工程化细胞系的一个标准。大范围核酸酶、三链体、CRISPR和重组腺病毒伴随病毒被类似地用于广泛的细胞类型的基因组工程化，并且是ZFN的有效替代物。所述试剂可以用来靶向启动子、蛋白编码区(外显子)、内含子、5’和3’UTR等等。

用于调节基因功能的另一个实施例利用细胞的内源RNA干扰(RNAi)途径来靶向细胞信使RNA。在这种方法中，基因靶向试剂包括小干扰RNA(siRNA)以及微小RNA(miRNA)。这些试剂可以结合各式各样的化学修饰、与感兴趣的靶转录物的互补的水平以及设计(参见美国专利号8,188,060)以增强稳定性、细胞递送、特异性、以及功能性。此外，这类试剂可以被设计成靶向一种基因的不同区(包括mRNA的5’UTR、开放阅读框、3’UTR)，或(在一些情况下)编码感兴趣的基因的基因组DNA的启动子/增强子区。基因调节(例如，敲低)可以通过将靶向同一mRNA转录物的不同区的单个siRNA或miRNA或者多个siRNA或miRNA(即，池)引入(到一种细胞中)来实现。合成siRNA/miRNA递送可以通过任何数目的方法来实现，这些方法包括但不限于：1)自我递送(美国专利申请号2009/0280567A1)；2)脂质介导的递送；3)电穿孔；或4)基于载体/质粒的表达系统。一种引入的RNA分子可以被称为一种外源核苷酸序列或多核苷酸。

使用RNAi途径的另一种基因靶向试剂包括小发夹RNA，又称为shRNA。经由例如表达构建体(例如，质粒、慢病毒)递送给细胞的shRNA具有以构建或调节方式(取决于所采用的启动子的类型)提供长时间基因敲低的能力。在一个优选实施例中，一种慢病毒颗粒的基因组被修饰来包括靶向感兴趣的一种基因(或多种基因)的一个或多个shRNA表达盒。这类慢病毒可以感染意图用于疫苗生产的一种细胞，将它们的病毒基因组稳定地结合到宿主基因组中，并且以1)构建、2)调节或(在多种shRNA被表达的情况下)构建且调节的方式表达该一种或多种shRNA。以此方式，可以创建具有增强的微小核糖核酸病毒生产能力的细胞系。值得注意的是，使用siRNA或shRNA的方法具有的附加益处是它们可以被设计成靶向单个基因或多个紧密相关基因家族成员的各个变体。以此方式，单独试剂可以用来调节具有相似或丰余功能或序列模体的更大量的靶标。技术人员将认识到慢病毒构建体还可以结合克隆的DNA或ORF表达构建体。

在另一个实施例中，在蛋白质水平上进行调节。举例来说，蛋白质水平上的基因敲低功能可以通过多种手段来实现，该多种手段包括但不限于：用小分子、肽、适体、去稳定结构域，或可以例如下调活性或增强一种基因产物的降解速度的其他方法靶向蛋白质。在一种优选情况下，可以将结合例如一个活性位点且抑制一种靶蛋白的功能的一种小分子添加到例如细胞培养基中并且由此引入到细胞中。可替代地，靶蛋白功能可以通过将(例如)防止蛋白质相互作用的例如一种肽引入到一种细胞中来调节(参见例如，夏娜加里(Shangary)等人，(2009)药理学与毒理学年鉴(AnnualReviewofPharmacologyandToxicology)49：223)。这类肽可以通过转染或电穿孔引入到一种细胞中，或经由一个表达构建体引入。可替代地，肽可以通过以下方式引入到细胞中：1)添加(例如，通过缀合)促进细胞递送的一个或多个部分，或2)向分子增压以增强自我递送(克罗尼坎·J·J(Cronican，J.J.)等人，(2010)美国化学学会生物化学杂志(ACSChem.Biol.)5(8)：747-52)。用于表达一种肽的技术包括但不限于：1)将该肽融合到一个支架上；或2)附接一个信号序列，以分别将该肽稳定或引导在感兴趣的一个位置或区室上。

虽然在此提供的基因在被设计成鉴别增强沙宾-2衣壳抗原和脊髓灰质炎病毒生产的基因敲低事件的一种筛选中被鉴别，但实例部分中呈现的研究证实这些靶标的调节还能增强脊髓灰质炎病毒(例如，沙宾1、沙宾3)的其他血清型和肠道病毒71的生产。这从疫苗制造商的角度来看特别重要，因为当前的脊髓灰质炎病毒疫苗包括所有三种血清型(例如，沙宾1、沙宾2和沙宾3，或三种血清型各自的野生型株)。为此原因，一个另外的实施例包括调节时增强除沙宾2脊髓灰质炎病毒或沙宾2脊髓灰质炎病毒抗原之外的，包括但不限于来源于沙宾1、沙宾3、其他脊髓灰质炎病毒株、以及肠道病毒71的病毒和抗原的微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原的生产的一列基因。

增强脊髓灰质炎病毒生产的基因的原始筛选发生在一个HEp-2C细胞系中。HEp-2C细胞来源于人，并且为此原因，原始筛选鉴别出调节时增强脊髓灰质炎病毒生产的人基因。如在以下实例部分中所述，有效性研究利用来源于非洲绿猴肾的维洛细胞。由于初步筛选中鉴别的命中区域还提高维洛细胞的脊髓灰质炎病毒滴度，一个另外的实施例包括为初步筛选中鉴别的那些(表I)的直向同源物的一列基因。这类直向同源物可以在人或非人细胞、细胞系、或细胞裂解物中被调节来提高包括脊髓灰质炎病毒或脊髓灰质炎病毒抗原生产的微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原生产。在于此描述的方法中有用的细胞和细胞系的实例包括已知支持微小核糖核酸病毒的复制的灵长动物细胞。这类细胞可以是人、黑猩猩以及猴子的细胞。具体实例包括但不限于WI-38、MRC-5、HEK293、PERC6、海拉细胞、以及非洲绿猴肾细胞如维洛细胞。

另外，诸位发明人认识到表I中鉴别的基因列表也是用于提高脊髓灰质炎病毒复制的潜在药物靶标。为此原因，在一个单独的实施例中，表I中所列的基因可以被调节来提高微小核糖核酸病毒复制，并且由此增强包括脊髓灰质炎病毒的微小核糖核酸病毒的生产。可以用来提高脊髓灰质炎病毒复制的小分子的实例包括但不限于：SU1489、PD98059、视黄酸、姜黄素、ly294002、DL-TBOA(DL-苏型-β-苄氧基天冬氨酸)、以及DL-苏型-β-羟基天冬氨酸。

另一个实施例包括具有下表中鉴别的修饰来增强或减弱微小核糖核酸病毒复制的一种或多种基因的敲除动物(例如，敲除小鼠)。

另一个实施例包括增强微小核糖核酸病毒抗原和微小核糖核酸病毒生产的一列微小RNA(miRNA)。如实例部分中所示，一种微小RNA(miRNA)模拟物筛选被进行来鉴别(上调时)增强脊髓灰质炎病毒的生产的miRNA。miRNA模拟物筛选鉴别出促进沙宾2脊髓灰质炎病毒生产的多种宿主编码的miRNA。所鉴别的原病毒miRNA是miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p、以及miR-9。与一种对照细胞相比，miRNA(miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p以及miR-519c-3p)将脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产提高2倍至4倍。miRNA(miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9)将活脊髓灰质炎病毒生产提高4倍至12倍。这些miRNA可以单独地、结合其他miRNA或结合一种或多种蛋白编码基因调节来促进微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原的生产。由于这批miRNA促进脊髓灰质炎病毒生产，添加一种微小RNA抑制剂有望极大地降低其中存在内源miRNA的细胞中的微小核糖核酸病毒的生产。因此，另一个实施例包括被设计成靶向该列原病毒miRNA的可以用作抵抗脊髓灰质炎的潜在治疗剂的一列微小RNA抑制剂。

miRNA抑制剂(在本领域中又称为抗miR、antagomir和/或blockmir)是引入到一种细胞中时使内源miRNA沉默的工程化核苷酸序列。miRNA抑制剂的生产、鉴别以及使用是本领域技术人员已知的并且是常规的。miRNA抑制剂的示例性设计包括但不限于以下描述的那些：1)哈特瓦格纳(Hutvagner)等人，2004，公共科学图书馆·生物学(PLoSBiol.)，2：E98，2)；迈斯特(Meister)等人，2004，RNA10：544-550，3)以及韦尔默朗(Vermeulen)等人，2007，RNA，13：723-730。

重要的是，该筛选还鉴别出降低脊髓灰质炎病毒抗原和/或病毒生产的miRNA模拟物(参见实例以及表IV)。因此，另一个实施例包括作为用于治疗脊髓灰质炎感染的潜在治疗剂的该列抗病毒miRNA。此外，预测这些抗病毒miRNA的抑制(通过例如miRNA抑制剂)能提高微小核糖核酸病毒抗原和病毒生产。因此，另一个实施例包括靶向该列抗病毒miRNA的用于促进微小核糖核酸病毒抗原和病毒生产的该列抑制剂。在可以实现一种或多种miRNA抑制剂(用于治疗或疫苗生产)的情况下，可以采用多种设计，包括但不限于：修饰的和未修饰的单一位点线性分子、结合发夹结构的修饰的或未修饰的分子、以及全部或部分miRNA靶位点具有多联体的修饰的或未修饰的设计。

增强脊髓灰质炎病毒生产的miRNA的原始筛选发生在一个HEp-2C细胞系中。HEp-2C细胞来源于人，并且为此原因，原始筛选鉴别出调节时增强脊髓灰质炎病毒生产的人miRNA。由于一种物质中发现的miRNA经常以相同或密切相关的形式存在于另一种物质中，一个另外的实施例包括为初步筛选中鉴别的那些的直向同源物的一列miRNA，该列miRNA可以在人或非人细胞、细胞系、或细胞裂解物中调节来提高微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原的生产。

另一个实施例提供具有实例中鉴别的，被修饰来增强微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原生产的一种或多种基因(或实例中鉴别的基因的直向同源物)的一个细胞系(人的或非人的)。一个细胞系包括：i)表I中描述的一种基因(或它的直向同源物)中存在的至少一个编码区的，使得编码区的表达出现降低的一个修饰；ii)表II中描述的一种基因(或它的直向同源物)中存在的至少一个编码区的，使得编码区的表达出现提高的一个修饰；iii)选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的至少一个miRNA的提高的表达；iv)靶向表IV中描述的一种抗病毒miRNA的一种抑制剂；或v)它们的组合。表I中描述的一种基因中存在的至少一个编码区的修饰可以通过细胞的基因组中的基因的改变，或细胞中siRNA、shRNA、或反义RNA的存在来实现。一种基因的一个改变包括但不限于该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中的一个突变。在一个实施例中，修饰的基因能增强沙宾1、沙宾2和/或沙宾3的生产或用于产生IPV的野生型脊髓灰质炎病毒株的生产。在一个实施例中，修饰的基因增强EV71的生产。优选地，细胞系和脊髓灰质炎病毒或脊髓灰质炎抗原被采用于脊髓灰质炎病毒疫苗生产中。诸位发明人察觉到细胞系可以是真核细胞或工程化原核细胞。可替代地，细胞实质上可以是合成的(即，人为产生的)(吉布森(Gibson)等人，(2010)科学329：52-56)。在细胞是真核细胞或修饰的真核细胞的情况下，所述细胞可以是原代细胞、连续细胞、永生化细胞(细胞系)或干细胞。细胞可以来源于人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、仓鼠、昆虫等等。在一个实施例中，细胞可以是HEp-2C或它的衍生物。在一个实施例中，细胞可以是维洛细胞或它的衍生物。

另一个实施例提供来源于在此描述的一个细胞系的一种细胞裂解物(人的或非人的)。例如，在一个实施例中，细胞裂解物具有实例中鉴别的，被修饰来增强病毒或病毒抗原生产的一种或多种基因(或实例中鉴别的基因的直向同源物)。优选地，修饰的基因能增强沙宾1、沙宾2和/或沙宾3病毒或病毒抗原的生产，或用于产生IPV的野生型脊髓灰质炎病毒株的生产。优选地，细胞裂解物被采用于脊髓灰质炎病毒疫苗生产中。

在另一个实施例中，靶基因调节的定时可以发生变化。在一些情况下，可以设想可以在微小核糖核酸病毒感染之前进行基因调节。例如，如果所选基因靶标将细胞锁定在细胞周期中微小核糖核酸病毒复制或微小核糖核酸病毒抗原生产高产的一个特定阶段，在病毒感染之前启动基因调节可能是有益的。在其他情况下，可能有益的是，在调节感兴趣的靶基因之前，启动微小核糖核酸病毒感染/复制或抗原生产。例如，如果一个特定的宿主基因调节事件在病毒复制或抗原生产的晚期是必要的，但在早期是有害的，那么诸位发明人设想到将在感染之后启动基因调节。在最优微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原生产需要两个或更多个基因调节事件的情况下，可以在病毒感染之前修饰一些基因，而在病毒感染之后修饰其他基因。无论基因调节的定时如何，多种方法(包括例如结合可调节(例如，Tet敏感型)启动子应用shRNA)都可以被采用来记录基因表达的调节的时间。

针对来自脊髓灰质炎病毒筛选的有效命中区域进行的途径分析研究鉴别出停留在相同途径中的基因。同时，这些研究还鉴别出停留在非重叠或非相关途径中的基因。在一些情况下，靶向单一途径中的两种或更多种基因可以提供加合或协同效应。在其他情况下，靶向来自非相关途径中的两种或更多种基因可以显著提高超出通过调节任何单一基因(或途径)实现的病毒蛋白和/或病毒的生产。另外，调节基因(一些停留在相同途径中而其他停留在非相关途径中)的组合可以增强病毒和/或病毒蛋白生产。为此原因，在一个单独的实施例中，在此鉴别的两种或更多种基因可以被调节来向微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原生产提供加合或协同效应。在这类情况下，上述或生命科学家当前或未来采用的任何方法/技术都可以被采用来调节该两种或更多种基因。

应注意到，在筛选的过程中，观察到某些宿主编码的基因的敲低会导致脊髓灰质炎病毒复制的减少(表II)。因此，在一个实施例中，诸位发明人设想到表II中所列的一种或多种基因的过表达也可以增强微小核糖核酸病毒或微小核糖核酸病毒抗原的生产。表II中所列基因的过表达可以通过多种方法来实现，该多种方法包括但不限于：增加基因拷贝数(即，引入一个克隆DNA或ORF表达构建体)，提高启动子强度，改变外遗传修饰，减少mRNA降解，增强蛋白质功能，或将mRNA、蛋白质、蛋白质结构域、或肽转染到细胞中。重要的是，可以完成表II中所列任一种或多种基因的过表达，而同时下调表I中所列的一种或多种基因。

在一个单独的实施例中，本发明提供一种产生微小核糖核酸病毒疫苗如脊髓灰质炎病毒疫苗的方法，其中采用一种或多种基因或基因产物被调节的细胞或细胞裂解物。

另外，诸位发明人认识到表II中鉴别的基因的列表还是用于对抗包括脊髓灰质炎病毒感染的微小核糖核酸病毒感染的潜在治疗性药物靶标。为此原因，在一个单独的实施例中，表II中所列的基因可以被调节来减少微小核糖核酸病毒复制，并且由此减少感染以及与微小核糖核酸病毒感染相关联的症状。靶向表II中的基因可以通过各式各样的包括小分子、RNAi技术、核糖酶(等等)的方法使用本领域认可的递送技术来实现。

可以用来抑制脊髓灰质炎病毒的复制的小分子的实例包括但不限于：利鲁唑盐酸盐、头孢曲松二钠盐半(七水合物)、帕瑞肽、兰瑞肽、奥曲肽、ABT-089、ABT418、异氟烷、美卡拉明、琥珀酰胆碱、罗库铵、多库铵、米伐铵、哌库铵、瑞库铵、二甲筒箭毒、阿曲库铵、顺阿曲库铵、乙酰胆碱、烟碱、D-筒箭毒碱、槟榔碱、恩氟烷、库铵、维溴、屈曲可净α、奥曲肽、他氟前列素、曲伏前列素、异丙基乌诺前列酮、比马前列素、拉坦前列素、地高辛、奥美拉唑、依他尼酸、奋乃静、六-D-精氨酸、九-D-精氨酸酰胺、右美沙芬/愈创木酚甘油醚、吗啡/右美沙芬、1-氨基-烷基环己烷衍生物(neramexane)、比西发定、德芦西明(delucemine)、CR2249、贝生罗地(besonprodil)、UK-240455、氯胺酮、非尔氨酯、美金刚、奥芬那君、环丝氨酸、N-(2-茚满基)甘氨酰胺、右美沙芬、溴苯那敏/右美沙芬/伪麻黄碱、氯苯那敏/右美沙芬/去氧肾上腺素、卡比沙明/右美沙芬/伪麻黄碱、右美沙芬/异丙嗪、1-氨基环丙烷-1-羧酸、依沙芦星、T0128、CT-2106，BN80927、他氟泊苷(tafluposide)、TAS-103、β-拉帕醌、伊立替康、托泊替康、9-氨基-20-喜树碱、卢比替康、吉马替康、卡仑尼替星、奥利默森(oblimersen)、(-)-棉酚、卡泊三烯、维生素D2、ILX-23-7553、阿仑膦酸/胆钙化醇、钙三醇，2-(3-羟基丙氧基)骨化三醇、二丙酸倍他米松/卡泊三烯、帕立骨化醇、度骨化醇、胆钙化甾醇，1-α，25-二羟基维生素D3、N-(正丁基)脱氧半乳糖霉素、N-丁基脱氧野尻霉素、利鲁唑、HuHMFG1、拉多替吉(ladostigil)、1-乙基吩恶噻10，10-二氧化物、吗氯贝胺、右旋苯丙胺、普鲁卡因胺、反苯环丙胺、苯乙肼、异丙烟肼、异卡波肼、苄非他明、N-(2-茚满基)甘氨酰胺。

在此还提供了一种包括在此描述的工程化细胞系的试剂盒。在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞可以用作被至少一种微小核糖核酸病毒感染的一种宿主细胞。在一个实施例中，该工程化细胞系的细胞包括至少一种微小核糖核酸病毒。这些细胞可以用于产生病毒。该工程化细胞系可以以足够用于至少一种用途的量存在于一种适合的包装材料中。任选地，可以包括其他试剂如培养基。也可以包括用于使用该工程化细胞系的说明书。

如在此使用，短语“包装材料”是指用于储藏该试剂盒内容物的一种或多种物理结构。该包装材料通过已知的优选地用于提供一个无菌的无污染物的环境的方法来构造，并且可以包括一个容器如一个管子、瓶子、小瓶、注射器、或其他适合的容器装置。该包装材料具有指示可以如何使用该工程化细胞系的一个标签。

说明性实施例

实施例1.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达，其中该编码区选自ZNF205、CNTD2、SEC61G、ETS1、TAF1L、MCCD1、LY6G6C、BTN2A1、GLXP3、GCGR、EP300。

实施例2.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达。

实施例3.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该降低是至少5％。

实施例4.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中该表达的降低是通过测量这些细胞中由该编码区编码的多肽或mRNA的量来确定。

实施例5.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞在该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。

实施例6.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括降低该编码区的表达的一种外源多核苷酸。

实施例7.如实施例5所述的工程化细胞系，其中该外源多核苷酸是一种RNA多核苷酸。

实施例8.如实施例7所述的工程化细胞系，其中该RNA多核苷酸是一种siRNA、一种shRNA或一种反义多核苷酸。

实施例9.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括导致该降低的表达的一个编辑基因组。

实施例10.如实施例9所述的工程化细胞系，其中该基因组是由一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶或一种转录激活因子样效应物编辑。

实施例11.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括选自表I的至少一个另外的编码区的降低的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。

实施例12.如实施例11所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括选自表I的至少五个编码区的降低的表达。

实施例13.如实施例1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括至少2个编码区的一个组合的降低的表达，其中这些编码区的组合选自表VI。

实施例14.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表II的与一种对照细胞系相比一个编码区的提高的表达。

实施例15.如实施例14所述的工程化细胞系，其中该表达的提高是通过测量这些细胞中由该编码区编码的多肽或mRNA的量来确定。

实施例16.如实施例14所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括选自表II的至少一个另外的编码区的提高的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的降低的表达，选自表IV的一个miRNA的降低的表达，或它们的组合。

实施例17.如实施例14所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括选自表II的至少五个编码区的提高的表达。

实施例18.如实施例14所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该提高是至少5％。

实施例19.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达。

实施例20.如实施例19所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括充当这些内源miRNA之一的一种miRNA模拟物。

实施例21.如实施例1所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括至少两个miRNA的提高的表达。

实施例22.如实施例19所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该提高是至少5％。

实施例23.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表IV的与一种对照细胞系相比一个内源miRNA的降低的表达。

实施例24.如实施例23所述的工程化细胞系，其中这些细胞在编码该内源miRNA的该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。

实施例25.如实施例23所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括抑制该内源miRNA的活性的一种miRNA抑制剂。

实施例26.如实施例1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括一种微小核糖核酸病毒。

实施例27.如实施例26所述的工程化细胞系，其中该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

实施例28.如实施例27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒选自沙宾1、沙宾2或沙宾3。

实施例29.如实施例27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney或Brunhilde。

实施例30.如实施例27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是MEF-1。

实施例31.如实施例27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是Saukett。

实施例32.如实施例28所述的工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。

实施例33.如实施例26所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。

实施例35.如实施例1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中该细胞系是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。

实施例36.如实施例35所述的工程化细胞系，其中该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。

实施例37.如实施例36所述的工程化细胞系，其中该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。

实施例38.如实施例35所述的工程化细胞系，其中该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

实施例39.如实施例19或实施例23所述的工程化细胞系，其中表达的变化是通过测量这些细胞中该miRNA的量来确定。

实施例40.一种如实施例1、2、14、19或23所述的工程化细胞系的裂解物。

实施例41.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：提供如实施例1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该工程化细胞系；并且收获由这些细胞产生的该病毒。

实施例42.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包含抑制选自表I的一个编码区的表达的一种RNA多核苷酸；并且收获由这些细胞产生的该病毒。

实施例43.如实施例42所述的细胞系，其中该RNA多核苷酸是一种siRNA，一种shRNA，或一种反义多核苷酸，选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一种miRNA，抑制选自表IV的一种内源miRNA的活性的一种mRNA抑制剂，或它们的组合。

实施例44.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒，并且其中这些细胞包括导致选自表I的一个编码区的降低的表达的一个编辑基因组；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系；并且收获由这些细胞产生的该病毒。

实施例45.如实施例43所述的工程化细胞系，其中该基因组是由一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶或一种转录激活因子样效应物编辑。

实施例46.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包含抑制选自表I的一个编码区的表达的一种小分子；并且收获由这些细胞产生的该病毒。

实施例47.如实施例34、35、37或39所述的方法，其中该病毒是一种微小核糖核酸病毒。

实施例48.如实施例47所述的方法，其中该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

实施例49.如实施例48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒选自沙宾1、沙宾2或沙宾3。

实施例50.如实施例48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney或Brunhilde。

实施例51.如实施例48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒是MEF-1。

实施例52.如实施例48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒是Saukett。

实施例53.如实施例49所述的方法，其中该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。

实施例54.如实施例47所述的方法，其中该微小核糖核酸病毒是肠道病毒71。

实施例55.如实施例34、35、37或39所述的方法，其中该细胞系是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。

实施例56.如实施例55所述的方法，其中该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。

实施例57.如实施例56所述的方法，其中该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。

实施例58.如实施例55所述的方法，其中该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

实施例59.一种用于制备工程化细胞的方法，该方法包括：将一种细胞引入到用于编辑该细胞的基因组的一种分子中；在适于对该基因组进行编辑的条件下孵育包含该分子的该细胞；获得包含一个编辑基因组的一种工程化细胞，其中该编辑导致选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达。

实施例60.如实施例60所述的方法，其中用于编辑该细胞的该基因组的该分子是一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶、或一种转录激活因子样效应物。

实施例61.一种治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中提高选自表I的一个编码区的表达。

实施例62.一种治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中抑制选自表II的一个编码区的表达。

实施例63.一种用于治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中抑制选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个内源miRNA的表达。

实施例64.一种用于治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中提高选自表IV的一个miRNA的表达。

本发明通过以下实例来说明。应理解，具体实例、材料、量以及程序应根据如在此所阐述的本发明的范围和精神广义地解释。

实例1

一般方法

在繁殖过程中，将HEp-2C(本文件中又称为“HEp-2”细胞)和VeroP细胞两者维持在杜氏改良培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium)(DMEM，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，目录号Sh30243.01)中，该杜氏改良培养基补充有10％的小牛血清(海克隆公司(HyClone)，目录号Sh30396.03)并且含有1％的青霉素-链霉素(Cellgro，目录号30-004-CI)。用于初步筛选的人表皮样细胞系HEp-2C来源于第166代的单一批次。从亚特兰大的美国疾病控制和预防中心(CentersForDiseaseControlandPrevention)(p.12)接收维洛细胞(非洲绿猴肾细胞)。

用于初步筛选中的HTSsiRNA转染，以96孔板中每孔7,500个HEp-2C细胞将On-TARGETplus(OTP)-siRNA(赛默飞世尔科技公司，Dharmacon产品)逆转染到HEp-2C细胞中，0.3％的DharmaFECT4(DF4，赛默飞世尔科技公司，目录号T-2004-01s)中的最终的siRNA浓度为50nM。为实现这一点，首先在不含血清的培养基(OPTI-MEM)中将DF4稀释5分钟。然后将这种材料添加到含有5μl1μM的siRNA溶液的96孔培养板中。之后在将细胞添加到补充有10％的小牛血清的杜氏改良培养基中之前，将DF4-siRNA混合物孵育20分钟(室温)。然后，在37℃，5％CO₂下将转染细胞培养48小时。随后，去除培养基，并且在0.05的MOI下，使用在含有2％的小牛血清和1％的青霉素-链霉素的DMEM中稀释的一种沙宾2脊髓灰质炎病毒疫苗株来使细胞感染。用于初步筛选，在病毒感染之后24小时，将含有病毒感染的HEp-2C细胞的板从培养孵育器移出并且在-80℃下保存该板。每个板还含有多个对照，包括：1)siTox(赛默飞世尔科技公司，目录号D-001500-01-05)；2)siNon-靶向对照(赛默飞世尔科技公司，目录号D-001810-10-50)；3)作为靶向VP1&3D(赛默飞世尔科技公司)的阳性对照的脊髓灰质炎病毒特异性siRNA；以及4)一个模拟对照。

对于验证实验，遵照利用VeroP细胞的一个相似方案。简而言之，以7,500个细胞/孔将OTP-siRNA逆转染到VeroP细胞中，0.3％DF4中的最终的siRNA浓度为50nM。如上所述，在不含血清的OPTI-MEM中将DF4稀释5分钟，之后将转染试剂添加到含有5ul1μM的siRNA溶液的96孔培养板中。然后在室温下将DF4-siRNA混合物孵育20分钟，之后将VeroP细胞添加到补充有10％的小牛血清的DMEM中。之后，在37℃，5％CO₂下将转染细胞培养48小时。然后去除培养基，并且在0.05的MOI下，使用在含有2％的小牛血清和1％的青霉素-链霉素的DMEM中稀释的沙宾2脊髓灰质炎病毒疫苗株来使细胞感染。在48小时之后将含有病毒感染的VeroP细胞的板从培养物移出，并且在ELISA实验之前，在-80℃下保存该板。

沉默试剂

siRNA

ON-TARGETplussiRNA(OTP-siRNA)文库(赛默飞世尔科技公司)用于初步RNAi筛选。OTP沉默试剂被提供为靶向每种基因的siRNA池。每个池含有靶向开放阅读框(ORF)的不同区的4个单独的siRNA。

对于验证实验，分别测试包含OTP池的单独的siRNA中的每一个以确定两个或更多个siRNA是否产生所观察的表型。类似地，还测试来源于siGENOME集合(赛默飞世尔科技公司，Dharmacon产品)且靶向初步筛选中鉴别的基因命中区域的单独的未修饰的siRNA诱导所希望的表型的能力。这项工作中所使用的非靶向对照购自赛默飞世尔科技公司(siGenomeNTC，赛默飞世尔科技公司，目录号D-001210-10-01-05)。

miRNA模拟物和抑制剂

miRNA模拟物的miRIDIAN文库(赛默飞世尔科技公司，Dharmacon产品)被用来鉴别调节脊髓灰质炎病毒感染的宿主编码的miRNA。通过用DharmaFECT4转染来将模拟物引入到HEp-2C细胞中。

细胞活力测定和细胞增殖测定

为了检验siRNA的转染是否通过诱导细胞毒性来不利地影响筛选结果，我们在初步筛选和命中区域有效性研究两者中结合了ToxiLightTM生物测定(龙沙公司(LONZAInc.))。ToxiLight^TM是被设计成测量培养的哺乳动物细胞和细胞系中的毒性的一种非破坏性生物发光细胞毒性测定。采用定量测量从受损细胞释放的腺苷酸激酶(AK)的方法评定siRNA转染之后48小时的培养上清液。为了检验鉴别的靶基因的敲低是否影响细胞生长，我们采用用于确定活细胞数目的CellTiter测定(普洛麦格公司(PROMEGAInc.)，试剂盒目录号G3580)。CellTiter测定显示提供比其他MTT测定更大的信号敏感性以及稳定性。在我们的研究中，在siRNA转染之后48小时或72小时，将CellTiter测定的底物直接添加到培养板中。在37℃下孵育4小时之后，在OD495nm下测量培养物吸光度。

2型脊髓灰质炎病毒ELISA

2型脊髓灰质炎病毒抗原捕获ELISA被设计成使用“夹心”测定形式检测真的脊髓灰质炎病毒抗原(“D-抗原”)。简而言之，按1∶500在pH为9.6的0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中稀释2型脊髓灰质炎病毒特异性小鼠单克隆抗体(HYB294-06，赛默飞科技公司(ThermoScientific)/皮尔斯公司(Pierce))。然后将50μl稀释抗体分配到Immunlon2HB高结合96孔板(NUNC公司)上，之后在保湿室中在4℃下将这些96孔板孵育16小时(过夜)。然后用pH为7.2，补充有0.05％的Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS-T)将抗体涂布板洗涤四次，接着用100μl封闭缓冲液(含有0.5％的明胶和0.25％的Tween-20的PBS，在37℃下60分钟)进行孵育。之后用PBS-T对这些板进行四次(4)洗涤。在样品用siRNA进行处理并且随后感染脊髓灰质炎病毒24小时的siRNAHep-2C筛选中，将50μl上清液添加到抗体涂布板的每个孔中，并且在保湿室中在37℃下孵育60分钟。然后用PBS-T将这些板洗涤四次，接着在保湿室中在37℃下，用50μlHRP-缀合的单克隆抗体(HYB293-06，1∶1000稀释度)孵育60分钟。在用PBS-T进行另外四次洗涤之后，将50μl底物(SureBlueReserve，柯克加德和佩里实验室公司(KirkegaardandPerryLaboratories)，50-85-31)添加到每个孔中。之后在室温下将这些板孵育15分钟，并且通过添加50μlTMBBlueSTOP溶液(柯克加德和佩里实验室公司，50-85-31)来终止反应。然后在620nm波长下，在质谱仪上评价板。

对于沙宾1和沙宾3测试，用靶向不同基因的siRNA转染的维洛细胞感染了沙宾1或沙宾3病毒。随后，如上所述使用(适当时)替代捕获和缀合步骤中的2型特异性抗体的特异于1型脊髓灰质炎病毒(NBP1-05101，诺伍斯生物制剂公司(NovusBiologicals))或3型脊髓灰质炎病毒(HYB300-06，赛默飞科技公司/皮尔斯公司)的单克隆抗体通过ELISA测试上清液。

HTS筛选中所使用的数据分析方法

使用Z’-因子评定质量控制，其中0.5与1.0之间的Z’-因子评分指示高度强力的测定，而0与0.5之间的评分被认为是可接受的(参见张(Zhang)等人，(1999)生物分子筛选杂志(J.BiomolScreen)4(2)：67-73)。针对整个板将数据标准化，从而允许我们将数据的平均值(μ)设定为零并且将标准偏差(SD)设定为1。来自初步筛选的阳性命中区域通过Z-评分来计分。

空斑测定和细胞培养感染剂量(CCID₅₀)测定

进行CCID₅₀测定和空斑测定来评定基因敲低对活病毒生产的影响。为了实现这一点，用靶向初步筛选中鉴别的基因的siRNA转染维洛细胞(非洲绿猴肾细胞)。培养物之后感染沙宾2脊髓灰质炎病毒，并且使用HEp-2C细胞在CCID₅₀测定或空斑测定中评定所得上清液。为了研究基因沉默事件对感染病毒颗粒的量的影响，通过终点稀释来确定siRNA转染的维洛细胞中产生的沙宾-2病毒的50％细胞培养物感染剂量(CCID₅₀)。在96孔形式中，用HEp-2C细胞(7,500个细胞/孔)孵育含病毒的上清液的10倍系列稀释液(稀释度：10^- ²至10^-9，每个稀释度具有11个复制样本)。在每个板上，包括8个病毒阴性细胞对照。在37℃，5％CO₂下将板孵育5天，之后通过去除细胞培养基且用结晶紫试剂染色来使剩余活细胞可视化。使用斯皮尔曼-卡伯(Spearman-Karber)方法(G(1931)Beitragzurkollektivenbehandlungpharmakologischerreihenversuche.ArchivfürExperimentalischePathologieundPharmakologie162：480-483)来计算CCID₅₀。进行空斑测定来确定命中区域基因沉默对所产生的感染病毒颗粒的量的影响。在6孔形式中，在37℃下，用来自siRNA转染的维洛细胞的含沙宾2病毒的上清液的10倍系列稀释液(10-4至10^-9稀释度)将单层HEp-2C细胞(80％至90％的汇合)孵育1小时。来自用非靶向siRNA转染的细胞以及来自用靶向siRNA的脊髓灰质炎病毒转染的细胞的含病毒的上清液分别被包括作为阴性对照和阳性对照。细胞随后由琼脂糖覆盖，并且在37℃，5％CO₂下孵育48小时。通过去除琼脂糖且用含福尔马林的结晶紫试剂对活细胞染色来使空斑可视化。对空斑计数，并且将这些空斑用来按照空斑形成单位/ml选择上清液计算感染病毒颗粒的量。对比来自非靶向对照和利用沙宾2靶向siRNA的对照的那些来分析空斑数目和尺寸。

抗原等效性

为了研究命中区域基因的沉默表达对所产生的病毒的抗原性的影响，用来自用针对所选基因的siRNA转染的维洛细胞的沙宾2病毒以及从先前暴露于脊髓灰质炎病毒疫苗的个人收集的人血清池来进行微量中和测定。在96孔形式中，将来自所选细胞上清液的沙宾2病毒的100CCID₅₀与抗脊髓灰质炎血清的2倍系列稀释液组合，开始于1∶8稀释度至高达1∶1024。来自未用任何siRNA转染的细胞的沙宾2病毒被包括作为对照。将病毒和血清孵育3小时，之后添加HEp-2C细胞。在37℃、5％CO₂下孵育5天之后，用结晶紫对细胞染色，并且通过斯皮尔曼-卡伯公式(G(1931)Beitragzurkollektivenbehandlungpharmakologischerreihenversuche.ArchivfürExperimentalischePathologieundPharmakologie162：480-483)来计算终点血清中和反应滴度。

实例2

初步筛选结果

使用上文所述的技术，对来自人基因组的＞18,200个基因(包括来自蛋白酶、离子通道、遍在蛋白质、激酶、磷酸酶、GPCR以及药物靶标集合的基因)进行筛选(重复三次)以鉴别增强脊髓灰质炎病毒复制的基因敲低事件。图1示出了从初步筛选获得的Z-评分的图。如图所示，总基因敲低事件中仅一小部分给出了相对于平均值等于或大于3.0标准偏差(SD)的评分(124个基因，所筛选基因总数的0.68％)。这个集合中所含的基因分布在多个功能家族(激酶、蛋白酶、磷酸酶等)上，并且包括先前未鉴别为“抗病毒”的大量靶标。此外，鉴别出了大大降低脊髓灰质炎病毒复制的超过100个的基因沉默事件。这些基因代表未来抗病毒药物发现研究中潜在有价值的一批治疗性靶标。

表I鉴别出128个基因敲低事件。总共124个基因敲低事件给出比平均值高三(3)或更多的标准偏差的ELISA评分。这些基因中的二十八(28)个给出大于4.0的SD值，并且单个基因给出5或更大的SD值。这些基因中的四个给出2与3之间的SD值。表I还呈现出KEGG基因检索号(NM_)以及Z评分值。表II鉴别了给出比平均值小二(2)或更多的SD的ELISA评分的基因敲低事件的列表。

实例3

池去卷积有效性研究

验证初步筛选中鉴别的基因靶标的第一步骤涉及证实靶向相同基因(但具有不一致的种子序列，即，反义链的核苷酸2-7)的两种或更多种单独的siRNA产生相同的表型。为了进行这项研究，分别测试构成初步筛选中所使用的OTP池的四种siRNA。另外，还测试靶向一种或多种相同基因且来源于siGENOMEsiRNA集合(Dharmacon产品，赛默飞世尔科技公司)的一批非相关siRNA试剂。

有效性研究的结果呈现于表III，并且显示对于初步筛选命中区域中给出3.0或更大的SD值的54％(68个基因)，靶向给定基因的两种或更多种siRNA诱导与原始OTP池相同的表型。这些发现强有力地支持以下结论：这个列表中的靶基因的敲低增强了脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产。应注意，虽然针对剩余基因仅单一siRNA诱导所希望的表型，但这个结果并未消除一种或多种鉴别的基因在脊髓灰质炎病毒感染过程中发挥抗病毒作用的可能性。

表III.68个基因列表，其中两种或更多种siRNA被示出提高脊髓灰质炎病毒复制。先前的表中提供了检索号。

实例4

基因敲低对维洛细胞中的活脊髓灰质炎病毒生产的影响

作为初步筛选中鉴别的命中区域的进一步验证，进行CCID₅₀测定和空斑测定。图2和图3中示出了这些研究的示例结果。CCID₅₀发现(图2)示出初步筛选中鉴别的若干命中区域极大地提高了活脊髓灰质炎病毒的滴度，提高4倍至27倍(4-27x)。这些发现不仅支持先前的去卷积研究，而且显示出1)鉴别的基因敲低事件提高了活病毒生产，并且2)基因敲低事件提高了脊髓灰质炎病毒疫苗制造中当前使用的非人(维洛)细胞系中的活病毒的生产。

空斑测定支持CCID₅₀发现。如图3A中所例证，包括但不限于SLC1A2、ETS1、EP300和PKIG的多种基因的敲低导致了如由病毒空斑的数目所测量的病毒生产的大幅提高。图3B提供了超过12个基因的结果。这些基因中的六种基因(BCL9、GLRXP3、LY6G6C、ETS1、GPR30以及PATE2)的siRNA介导的敲低将活病毒滴度提高5倍到10倍(5-10x)。包括BTN2A1、SEC61A1、Collec11、Sin3B以及SLC1A2的五种其他基因的沉默将维洛细胞中的活病毒滴度提高10倍至20倍(10-20x)。值得注意的是，在空斑测定中，两种基因敲低事件(PKIG和EP300)将病毒滴度增强20倍以上(＞20x)。如前所述，基因功能落到多个家族/功能，包括组蛋白乙酰化酶(EP300)、蛋白激酶抑制剂(PKIG)、溶质载体(SLC1A2)等等。总而言之，这些发现结合记录的去卷积研究强有力地支持了以下结论：单个基因敲低/敲除事件可以显著提高脊髓灰质炎病毒抗原和复制。

实例5

抗原等效性

为了研究命中区域基因的沉默表达对所产生的病毒的抗原性的影响，用来自用针对所选基因的siRNA转染的维洛细胞的沙宾2病毒以及从先前暴露于脊髓灰质炎病毒疫苗的个人收集的一组人血清来进行微量中和测定。在96孔形式中，将来自所选细胞上清液的沙宾2病毒的100CCID₅₀与抗脊髓灰质炎血清的2倍系列稀释液组合，开始于1∶8稀释度至高达1∶1024。来自未用任何siRNA转染的细胞的沙宾2病毒被包括作为对照。将病毒和血清孵育3小时，之后添加HEp-2C细胞。在37℃、5％CO₂下孵育5天之后，用结晶紫对细胞染色，并且通过卡伯公式(G(1931)Beitragzurkollektivenbehandlungpharmakologischerreihenversuche.ArchivfürExperimentalischePathologieundPharmakologie162：480-483)来计算终点血清中和反应滴度。

如图4中所示，在所测试的18个基因靶标当中，全部证实了等效的或更好的交叉反应性。这些发现支持以下观点：用siRNA修饰的，用于增强脊髓灰质炎病毒生产的疫苗细胞系产生被从先前暴露于脊髓灰质炎病毒的个人取得的血清中存在的抗体识别的病毒颗粒(即，抗原等效性)。

实例6

沙宾1和沙宾3研究

三种脊髓灰质炎病毒疫苗(沙宾)株的强毒性亲本株是LSc/2ab(血清型1)、P712(血清型2)以及Leon(血清型3)。沙宾1具有将其与亲本LSc/2ab病毒区别开来的57个核苷酸取代。类似地，沙宾2和沙宾3(分别)具有分别将其与P712和Leon株区别开来的2个核苷酸取代和10个核苷酸取代。

由于当前疫苗结合了所有三种减毒血清型(沙宾1、沙宾2以及沙宾3)，我们测试我们的沙宾2初步筛选中鉴别的靶基因如何影响沙宾1和沙宾3。为了实现这一点，将靶向1)沙宾2筛选中鉴别的，且2)验证的这些基因中的21种基因的siRNA引入到维洛细胞中。细胞之后感染沙宾-1或沙宾3病毒，并且随后使用ELISA来评定上清液。这些研究的结果显示对于沙宾1和沙宾3，所测试的21种基因中的14种将ELISA吸光度评分提高两倍或更多倍(图5A、图5B)。针对从ZNF205的敲低获得的病毒两者(对于沙宾1和沙宾3，分别是7倍和5倍)，最高吸光度增加。总而言之，由于针对所有三种血清型病毒生产都提高的该列基因靶标之间存在明显的重叠，这些发现显示沙宾2病毒筛选中鉴别的命中区域可以延伸到其他微小核糖核酸病毒。

使用前文所述的技术，还使用沙宾1和沙宾3病毒进行空斑测定。结果支持ELISA测定中发现的那些，并且证实沙宾2筛选中鉴别的若干命中区域还提高沙宾1和沙宾3的生产(分别是图5c和图5d)。

使用上文所述技术，对细胞中产生的，用靶向初步沙宾2筛选中鉴别的基因的siRNA修饰的沙宾1和沙宾3病毒进行抗原等效性研究。正如沙宾2抗原等效性研究中所观察，基因敲低对沙宾1和沙宾3抗体滴度几乎不或不产生影响(数据未示出)，从而支持以下结论：细胞中产生的，用靶向感兴趣的基因的siRNA修饰的病毒与对照细胞中产生的那些是不可区分的。

实例7

miRNA模拟物筛选

为了鉴别增强脊髓灰质炎病毒生产的宿主编码的miRNA，HEp-2C细胞用1,200种以上不同的miRNA模拟物转染，并且随后感染沙宾2病毒。然后用实例1中所描述的脊髓灰质炎病毒特异性ELISA分析所得上清液。

正如siRNA筛选(实例2)的情况，仅一小部分的总miRNA群体增强病毒生产(图6)。为了进一步评定miRNA模拟物在活病毒生产中的价值，在维洛细胞中进行CCID₅₀有效性研究。在这个集合中，11种miRNA将脊髓灰质炎病毒生产增强两倍或更多倍(图7)。包括miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p以及miR-519c-3p的五种基因将脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产增强2倍至4倍。六种miRNA(miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9)被示出将活脊髓灰质炎病毒生产提高4倍至12倍(4-12x)。这些miRNA的核苷酸序列可获自可从mirbase.org获得的为miRBase的微小RNA数据库。这些miRNA可以单独使用或结合其他miRNA、miRNA抑制剂、靶向蛋白编码基因的siRNA、和/或克隆DNA或ORF表达构建体使用，以提高脊髓灰质炎病毒蛋白和/或病毒生产。

除了鉴别增强脊髓灰质炎病毒抗原和病毒生产的多种miRNA之外，初步miRNA筛选还鉴别降低脊髓灰质炎病毒生产的多种miRNA(参见表IV)。这些miRNA可以单独使用或结合其他miRNA、miRNA抑制剂、靶向蛋白编码基因的siRNA、和/或克隆DNA或ORF表达构建体使用，以1)在治疗背景中降低脊髓灰质炎病毒复制，或2)鉴别用于对抗脊髓灰质炎病毒感染的治疗性靶标。

表IV.降低脊髓灰质炎病毒抗原和病毒复制的miRNA列表。

实例8

维洛细胞中有效靶的大量测试

用包括三种减毒疫苗株(沙宾1、沙宾2和沙宾3)，Mahoney(野生型1)、Brunhilde(野生型1)、MEF(野生型2)以及Saukett(野生型3)的七种不同的脊髓灰质炎株的维洛细胞中进一步验证提高HEp-2C细胞中的脊髓灰质炎病毒滴度的29个最佳基因沉默事件。为了实现这一点，在补充有10％的胎牛血清(FCS，海克隆公司)的杜氏改良培养基(DMEM，海克隆公司)中，在50nM最终浓度下，将靶向所选基因的各个siRNA逆转染到维洛细胞(6,000个细胞/孔，96孔形式)中。表V中提供了基因靶标和siRNA序列。使用DharmaFECT4转染试剂(0.35％)来进行转染。进行所有转染，重复三次。定量PCR实验被进行来评价这些实验中所使用的每个siRNA的基因沉默的水平。这些实验的对照研究包括1)用靶向脊髓灰质炎病毒衣壳抗原编码区的一种脊髓灰质炎病毒特异性siRNA转染细胞，以及2)用一种非靶向对照siRNA(NTC)转染细胞。之后在37℃，5％CO₂下将细胞孵育16至24小时，并且在siRNA转染之后，更换细胞培养基。在转染后48小时，在补充有2％FCS的150μlDMEM中，细胞感染60CCID50的沙宾-1病毒母液(10^8.6CCID₅₀/ml)、30CCID₅₀的沙宾-2(10^7.3CCID₅₀/ml)、9.5CCID₅₀的沙宾-3(10^6.8CCID₅₀/ml)、8.4CCID₅₀的野生型1Mahoney病毒(10^7.75CCID₅₀/ml)、1CCID₅₀的野生型1Brunhilde病毒(10^7.84CCID₅₀/ml)、6.4的野生型2MEF病毒(10^7.63CCID₅₀/ml)或3.8CCID₅₀的野生型3Saukett病毒(10^7.4CCID₅₀/ml)。未感染的细胞被包括作为一个阴性对照。然后，在37℃、5％CO₂下将细胞孵育21至36小时(取决于病毒类型)，并且随后在-80℃下冷冻。上清液用来借助于终点稀释度来确定病毒滴度。简而言之，在96孔形式中，在37℃、5％CO₂下，用HEp-2C细胞(7,500个细胞/孔，每个病毒稀释度具有11个复制样本)将病毒上清液的10倍系列稀释液(稀释度起始于10^-2至高达10^-9)孵育5天。用结晶紫对细胞染色，并且通过所有孔中的细胞病变效应(CPE)评分使用斯皮尔曼-卡伯公式来计算CCID₅₀。根据重复实验中CCID₅₀值当中观察到的大体接受的0.5log₁₀变化，与NTC相比，用于鉴别命中区域的截断值被设定在病毒滴度的3.16倍增加。

表V.基因、检索号和用来产生图8中的数据的siRNA序列的列表

候选基因	检索号	序列(5′--＞3′)
			BCL9L	NM_182557	AACCAGAUCUCGCCUAGCA
BTN2A1	NM_007049	GGGAGAGCGUGCCUGACAA
			COLEC11	NM_024027	UGUCCAAGCUAUACAAUAA
DPM2	NM_003863	UGCCAUUCAUCGACAGUCA
			CNTD2	NM_024877	AAACUGAGGUCCGGAACUU
MCCD1	NM_001011700	AAGAGUUGUUGGAGCAGCA
			LY6G6C	NM_025261	GGACAGCAAUGCCUGACAA
MED31	NM_016060	GUUUAGCCAACCCAAAUUA
			PATE2	NM_212555	GGGUUAUGCUAUGGUGUCA

ZNF205	NM_001042428	GCGCACAACCGCACACACA
			GLRXP3	NM_001123388	GAUUGGAGCUCUGCAGUAA
SEC61G	NM_014302	UGAAAUUGAUCCAUAUUCC
			KRTAP4-4	NM_032524	GCUGAGUUAUGGGAAGCUA
ZNF135	NM_003436	CGGAACAGCUCGGCACUUA
			SEC31B	NM_015490	CCUACAGGGUCACUCAGUA
SIN3B	NM_015260	GCCAAGCGGUCUCUGUUCA
			ACVR2B	NM_001106	ACGAGAACCUGCUACAGUU
GCGR	NM_000160	CCACGGAGCUGGUGUGCAA
			OPN3	NM_001030011	AAAAGAAACUGGCCAAAAU
TAF1	NM_004606	CCAAGCAACUUCUACGUAA
			CELSR3	NM_001407	GCCGAAAGCUAGACAAUAA
DTYMK	NM_012145	GGGAACAAGUGCCGUUAAU
			GPER	NM_001031682	GGGUGAAGCGCCUCAGUUA
PAK1	NM_002576	UCAAAUAACGGCCUAGACA
			TAF1L	NM_153809	CCAAGCAACUUCUACGUAA
SLC1A2	NM_004171	GAUGAGUGCUAGAGAUGAA
			ETS1	NM_005238	CAGAAUGACUACUUUGCUA
PKIg	NM_007066	AGACAAGGAAGCUGGCAAC
			EP300	NM_001429	GGACUACCCUAUCAAGUAA

图8中给出了这些实验的结果。图8a提供了定量PCR研究的示例性结果。发现显示了siRNA的转染典型地诱导约70％或更大的靶基因表达的敲低。图8b示出沉默时，若干最佳命中区域(例如，ZNF205、CNTD2(又称为FLJ13265)、SEC61G、ETS1、MCCD1(又称为LOC401250)、LY6G6C、EP300、BTN2A1、GLRXP3(又称为GLRXL)、GCGR、KRTAP4-4、TAF1)显著提高脊髓灰质炎株中的一种或多种的滴度。

实例9

鉴别多基因敲低对脊髓灰质炎病毒滴度的影响

实例8的多种基因被选择用于后续研究以确定两种单独的基因的同时敲低是否会进一步增强病毒滴度。为了实现这一点，使用DharmaFECT4试剂(0.35％)，在50nM最终浓度(每种单独的siRNA为25nM)下，将siRNA对(靶向两种单独的基因)逆转染到维洛细胞(7,250个细胞/孔)中。之后，分别用七种病毒(沙宾1(疫苗)、沙宾2(疫苗)、沙宾3(疫苗)、Mahoney(野生型1)、Brunhilde(野生型1)、MEF(野生型2)以及Saukett(野生型3))中的每种测试(重复三次)用每个siRNA组合转染的细胞。作为内部实验对照，还将靶向每种基因的各个siRNA逆转染(重复三次，25nM)到每个板上，以促进双基因敲低的影响的准确评定。

图9和表VI中报告了这些研究的结果。图9A和图9B示出了来自我们的双基因敲低实验的示例性数据，并且鉴别出以加合或协同(参见“*”)方式显著增强一种或多种脊髓灰质炎病毒株的生产的多个组合。表VI鉴别出以下这样的49个基因组合：在同时沉默时，诱导所测试的七种病毒中的至少一种的1)协同效应(即，病毒滴度的增加大于将两种单独的基因敲低结果组合/相加情况下所预测的那些)，或2)加合效应(病毒滴度的增加等于或近似等于将各个基因的作用组合情况下人们将预期的增加)。例如，基于与双敲低研究平行进行的单个敲低实验，如果效应是加合的，ZNF205和EP300的同时沉默有望将MEF滴度增加约28倍。替代地，这两种基因的同时敲低会导致MEF滴度的(平均)65倍的增加。类似地，基于单个敲低实验，如果出现加合效应，EP300+GCGR的沉默有望给出Saukett滴度的18倍的增加。替代地，当这两种基因同时沉默时，我们观察到(平均)40至45倍的增加。这些发现和其他发现鉴别出了先前未知的(沉默时)进一步增强脊髓灰质炎病毒生产的基因组合。诸位发明人预测使这个列表中的三种或四种基因沉默可以更进一步增强脊髓灰质炎病毒的生产。例如，[ZNF205+EP300+GLRXP3]或[ZNF205+EP300+ETS]的组合预测能进一步提高脊髓灰质炎病毒滴度。

编号	基因组合
		1	ZNF205+EP300
2	EP300+GCGR
		3	EP300+MCCD1
4	ZNF205+BTN2A1
		5	ZNF205+GLRXP3
6	ZNF205+SEC61g
		7	BTN2A1+TAF1L
8	BTN2A1+GLRXP3
		9	EP300+BTN2A1
10	EP300+GLRXP3
		11	CNTD2+EP300
12	ZNF205+CNTD2
		13	BTN2A1+ETS1
14	ZNF205+ETS1
		15	ZNF205+MCCD1
16	ZNF205+GCGR
		17	CNTD2+GCGR
18	CNTD2+MCCD1
		19	SEC61G+ETS1
20	CNTD2+GLRXP3
		21	ZNF205+TAF1L
22	ZNF205+LY6G6C
		23	LY6G6C+BTN2A1
24	TAF1L+GCGR
		25	GCGR+GLRXP3

26	TAF1L+ETS1
		27	LY6G6C+TAF1L
28	SEC61G+GCGR
		29	BTN2A1+GCGR
30	CNTD2+BTN2A1
		31	CNTD2+TAF1L
32	SEC61G+MCCD1
		33	EP300+ETS1
34	EP300+SEC61G
		35	GCGR+ETS1
36	ETS1+GLRXP3
		37	CNTD2+ETS1
38	SEC61G+TAF1L
		39	LY6G6C+EP300
40	TAF1L+GLRXP3
		41	LY6G6C+ETS1
42	EP300+TAF1L
		43	CNTD2+SEC61g
44	ETS1+MCCD1
		45	GLRXP3+MCCD1
46	SEC61G+BTN2A1
		47	LY6G6C+GLRXP3
48	LY6G6C+GCGR
		49	GCGR+MCCD1

实例10

脊髓灰质炎病毒是微小核糖核酸病毒家族的一个成员。为了测试我们的脊髓灰质炎病毒筛选中鉴别的命中区域如何影响从属于微小核糖核酸病毒家族的其他病毒，用肠道病毒71(EV71)进行实验。为了实现这一点，在50nM浓度下，将靶向PVRNAi筛选过程中鉴别的若干种基因中的一种的siRNA逆转染到维洛细胞(7,200个细胞/孔，96孔形式)中。在允许基因沉默的64至72小时时间段之后，在补充有2％胎牛血清的150微升DMEM中，细胞感染为亚基因型C2(母液10^6.45CCID₅₀/ml)的3981CCID₅₀(50％细胞培养感染剂量)的EV71。之后在37℃、5％CO₂下将细胞孵育66小时，并且随后冷冻(-80℃)，之后对培养物进行检验以确定每种培养物中的细胞病变效应(CPE)的水平。实验重复进行三次，并且结合一种非靶向对照siRNA(NTC)、靶向EV71基因组的siRNA(siEV71)、以及模拟转染对照(-siRNA)。

这些研究的结果证实脊髓灰质炎病毒筛选过程中鉴别的命中区域还能增强EV71的生产。如图10A中所示，包括但不限于MCCD1、ZNF205、GCGR以及其他的若干基因敲低事件极大地增强了细胞病变效应，从而支持以下结论：基因沉默显著提高EV71病毒生产。转染时间点后66小时的另外的实验支持这些结论(数据未示出)。还进行空斑测定来量化观察到的EV71滴度的增加。如在这些实验的病毒上清液的1×10⁵(即，10⁵例中的1例)的稀释液中所示，ZNF205、CNTD2和MCCD1的敲低显著提高了EV71病毒颗粒的数目(参见图10B)。图10C中所示的条形图示出虽然CNTD2和MCCD1敲低将病毒滴度提高了约10倍(10x)，但ZNF205的敲低将滴度提高了约60倍。基于脊髓灰质炎病毒的这些结果，诸位发明人相信这些基因敲低事件的组合将进一步增强EV71滴度。

在此援引的全部专利、专利申请、和出版物、和以电子方式可获得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交，例如GenBank和RefSeq；和氨基酸序列提交，例如SwissProt、PIR、PRF、PDB；以及来自GenBank和RefSeq中经注释的编码区的翻译)的完整披露内容通过引用以其全文结合。出版物中引用的补充性材料(如补充性表、补充性图、补充性材料和方法、和/或补充性实验数据)同样地通过引用以其全文结合。在本申请的披露内容和通过引用方式结合在此的任何文献的披露内容之间存在任何不一致性的情况下，本申请的披露内容应当占据主导。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示和所述的精确细节，因为将在权利要求书限定的本发明内包含对于本领域技术人员而言显而易见的变体。

除非另外指明，本说明书和权利要求书中所用的表达组分、分子量等的量的全部数字应当理解为在全部情况下受术语“约”修饰。因此，除非另外相反地指明，在本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的所希望的特性而不同。至少，并且不是试图限制权利要求的范围的等效物的原则，每个数值参数至少应根据所报导的有效位的数值并且通过应用一般舍入方法被解释。

虽然阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中阐述的数值是尽可能精确报导的。然而，所有数值固有地含有必然由其对应的测试测量中所发现的标准偏差所产生的范围。

全部标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思，除非如此说明。

Claims

1.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达，其中该编码区选自ZNF205、CNTD2、SEC61G、ETS1、TAF1L、MCCD1、LY6G6C、BTN2A1、GLXP3、GCGR、EP300。

2.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达。

3.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该降低是至少5％。

4.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中该表达的降低是通过测量这些细胞中由该编码区编码的多肽或mRNA的量来确定。

5.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞在该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。

6.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括降低该编码区的表达的一种外源多核苷酸。

7.如权利要求5所述的工程化细胞系，其中该外源多核苷酸是一种RNA多核苷酸。

8.如权利要求7所述的工程化细胞系，其中该RNA多核苷酸是一种siRNA、一种shRNA或一种反义多核苷酸。

9.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括导致该降低的表达的一个编辑基因组。

10.如权利要求9所述的工程化细胞系，其中该基因组是由一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶或一种转录激活因子样效应物编辑。

11.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括选自表I的至少一个另外的编码区的降低的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达，选自表IV的一个内源miRNA的降低的表达，或它们的组合。

12.如权利要求11所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括选自表I的至少五个编码区的降低的表达。

13.如权利要求1或2所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括至少2个编码区的一个组合的降低的表达，其中这些编码区的这些组合选自表VI。

14.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表II的与一种对照细胞系相比一个编码区的提高的表达。

15.如权利要求14所述的工程化细胞系，其中该表达的提高是通过测量这些细胞中由该编码区编码的多肽或mRNA的量来确定。

16.如权利要求14所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括选自表II的至少一个另外的编码区的提高的表达，与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个内源miRNA的降低的表达，选自表IV的一个内源miRNA的降低的表达，或它们的组合。

17.如权利要求14所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括选自表II的至少五个编码区的提高的表达。

18.如权利要求14所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该提高是至少5％。

19.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括与一种对照细胞系相比选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个miRNA的提高的表达。

20.如权利要求19所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括充当这些miRNA之一的一种miRNA模拟物。

21.如权利要求1所述的工程化细胞系，其中这些细胞进一步包括至少两个miRNA的提高的表达。

22.如权利要求19所述的工程化细胞系，其中与该对照细胞系相比，该提高是至少5％。

23.一种工程化细胞系，其中该工程化细胞系的细胞包括选自表IV的与一种对照细胞系相比一个内源miRNA的降低的表达。

24.如权利要求23所述的工程化细胞系，其中这些细胞在编码该内源miRNA的该编码区中或可操作地连接到该编码区上的一个调节区中包括一个突变。

25.如权利要求23所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括抑制该内源miRNA的活性的一种miRNA抑制剂。

26.如权利要求1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中这些细胞包括一种微小核糖核酸病毒。

27.如权利要求26所述的工程化细胞系，其中该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

28.如权利要求27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒选自沙宾1、沙宾2或沙宾3。

29.如权利要求27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney或Brunhilde。

30.如权利要求27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是MEF-1。

31.如权利要求27所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是Saukett。

32.如权利要求28所述的工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。

33.如权利要求26所述的工程化细胞系，其中该脊髓灰质炎病毒是肠道病毒71。

35.如权利要求1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中该细胞系是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。

36.如权利要求35所述的工程化细胞系，其中该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。

37.如权利要求36所述的工程化细胞系，其中该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。

38.如权利要求35所述的工程化细胞系，其中该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

39.如权利要求19或权利要求23所述的工程化细胞系，其中该表达的变化是通过测量这些细胞中该miRNA的量来确定。

40.一种如权利要求1、2、14、19或23所述的工程化细胞系的裂解物。

41.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：

提供如权利要求1、2、14、19或23所述的工程化细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；

在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该工程化细胞系；并且

收获由这些细胞产生的该病毒。

42.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：

提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；

在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包含抑制选自表I的一个编码区的表达的一种RNA多核苷酸；并且

收获由这些细胞产生的该病毒。

43.如权利要求42所述的细胞系，其中该RNA多核苷酸是一种siRNA，一种shRNA，或一种反义多核苷酸，选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一种miRNA，抑制选自表IV的一种内源miRNA的活性的一种mRNA抑制剂，或它们的组合。

44.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：

提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒，并且其中这些细胞包括导致选自表I的一个编码区的降低的表达的一个编辑基因组；

在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系；并且

收获由这些细胞产生的该病毒。

45.如权利要求43所述的工程化细胞系，其中该基因组是由一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶或一种转录激活因子样效应物编辑。

46.一种用于产生病毒的方法，该方法包括：

提供一个细胞系，其中该细胞系的细胞包括一种病毒；

在适于通过这些细胞产生该病毒的条件下孵育该细胞系，其中培养基包含抑制选自表I的一个编码区的表达的一种小分子；并且

收获由这些细胞产生的该病毒。

47.如权利要求34、35、37或39所述的方法，其中该病毒是一种微小核糖核酸病毒。

48.如权利要求47所述的方法，其中该微小核糖核酸病毒是一种脊髓灰质炎病毒。

49.如权利要求48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒选自沙宾1、沙宾2或沙宾3。

50.如权利要求48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒选自Mahoney或Brunhilde。

51.如权利要求48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒是MEF-1。

52.如权利要求48所述的方法，其中该脊髓灰质炎病毒是Saukett。

53.如权利要求49所述的方法，其中该细胞系的细胞包括两种或三种脊髓灰质炎病毒。

54.如权利要求47所述的方法，其中该微小核糖核酸病毒是肠道病毒71。

55.如权利要求34、35、37或39所述的方法，其中该细胞系是哺乳动物细胞系、禽类细胞系、或昆虫细胞系。

56.如权利要求55所述的方法，其中该哺乳动物细胞系选自人细胞系、非人灵长动物细胞系、犬细胞系、或仓鼠细胞系。

57.如权利要求56所述的方法，其中该哺乳动物细胞系是HEp-2或VeroP。

58.如权利要求55所述的方法，其中该禽类细胞系是鸡细胞系，或鸭细胞系。

59.一种用于制备工程化细胞的方法，该方法包括：

将一种细胞引入到用于编辑该细胞的基因组的一种分子中；

在适于对该基因组进行编辑的条件下孵育包含该分子的该细胞；

获得包含一个编辑基因组的一种工程化细胞，其中该编辑导致选自表I的与一种对照细胞系相比一个编码区的降低的表达。

60.如权利要求60所述的方法，其中用于编辑该细胞的基因组的该分子是一种锌指核酸酶、一种大范围核酸酶、或一种转录激活因子样效应物。

61.一种治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中提高选自表I的一个编码区的表达。

62.一种治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中抑制选自表II的一个编码区的表达。

63.一种用于治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中抑制选自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一个内源miRNA的表达。

64.一种用于治疗患有病毒感染或处于患病毒感染的风险中的受试者的方法，该方法包括在该受试者的细胞中提高选自表IV的一个miRNA的表达。