KR20150133695A - 바이러스 제조를 위한 세포주 및 이의 사용 방법 - Google Patents

바이러스 제조를 위한 세포주 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20150133695A
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존 마이클 카필로우
마크 스티븐 오베르스트
랄프 에이. 트립
스티븐 엠. 톰킨즈
Original Assignee
유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
써모 피셔 사이언티픽 인크.
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Abstract

본 발명은 조작된(engineered) 세포주를 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 유전자의 발현 변형 및/또는 miRNA의 발현 변형을 가지며, 변형된 발현으로 인해 바이러스의 제조가 증가 또는 감소된다. 바이러스는 폴리오바이러스(poliovirus) 또는 장내바이러스 71(enterovirus 71)과 같은 피코나바이러스(picornavirus)이다. 본 발명은 또한, 바이러스를 제조하기 위해 조작된 세포를 사용하는 방법, 및 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

바이러스 제조를 위한 세포주 및 이의 사용 방법{CELL LINES FOR VIRUS PRODUCTION AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2013년 2월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 61/760,895 및 2013년 10월 1일에 출원된 61/885,357의 이익을 주장하며, 이들은 각각 본 명세서에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 연방 예산선(Federal budget line) 5614A11101 "신생 감염(Emerging Infections)" 하에 정부로부터 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 가진다.
기술분야
본 발명은 바이러스의 제조를 증강시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 조성물은, 유전자 (유전자 표적), 상기 유전자 표적의 효과기(effector), 뿐만 아니라 바이러스 제조를 증강시키도록 유전자 표적이 변형된 세포주 및 세포 용혈물을 포함할 수 있다.
백신은 인간의 질환을 예방하기 위해 적용되는 주요 전략들 중 하나이다. 현재, 24가지가 넘는 백신이, 바이러스 감염에 의해 야기되는 질환 (예를 들어, 수두, B형 간염, 홍역, 소아마비) 및 박테리아 감염에 의해 야기되는 질환 (예를 들어, 콜레라, 파상풍, 장티푸스, 디프테리아)에 대항하는 데 이용가능하다. 마찬가지로, 백신은 가금류, 말, 돼지 및 다른 동물들을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 가축에서 병(affliction)의 숙주를 예방하는 데 사용된다.
몇몇 백신 (인플루엔자 백신 포함)은 여전히 닭 (갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus gallus domesticus))의 수정란에서 제조되고 있지만, 보다 많은 수의 백신들은 세포 배양에서 제조된다. 1가지 경우에서, 잘-특정화된 세포주 (예를 들어, Vero 세포)를 우선, 살아있거나 또는 살아있지만-감쇠된(live-attenuated) 바이러스로 감염시킨다. 이후, 자손(progeny) 바이러스 입자를 포함하는 상층액을 수집하고 처리하여, 집단(population)에서 분포될 수 있는 매우 면역원성인 용량의 백신을 제조한다.
백신의 입증된 성공에도 불구하고, 질환의 발병을 근절하거나 또는 관리하는 능력은 반복해서 백신 제조의 비용 및 제작 한계에 의해 어려움에 직면하게 된다. 이는 소아마비 백신의 경우 가장 잘 예시되어 있다. 폴리오바이러스(poliovirus)는 인간 장내바이러스(enterovirus)로서, 이러한 신경-퇴행성 제제의 변강-구강 전파(fecal-oral transmission)로 인한 급성 마비인 척수성 소아마비(poliomyelitis)의 원인 인자이다. 현재, 백신은 소아마비의 전파(spread)를 제한하기 위해 제조되고 있으며, 효과가 높은 (및 상당히 더 비싼) 불활성화된 소아마비 백신(IPV)과 효능이 좀더 낮은 (및 보다 경제적인) 경구 소아마비 백신(OPV)을 포함한다. 감쇠된 OPV 바이러스 입자를 고 감염성의 신경발병성(neurovirulent) 폴리오바이러스로 복귀시키는 것과 관련된 기술적인 이유를 근거로, IPV 제작 비용을 유의미하게 감소시키는 새로운 기술의 개발은 소아마비의 성공적인 근절에 일조할 것이다.
본 발명은 OPV 백신 및 IPV 백신의 제조 비용을 유의미하게 감소시키기 위해 소아마비 백신 제작업체가 사용할 수 있는 유전자, 시약 및 세포주의 컬렉션을 제공한다. 본 발명은, 조정되는 (하향-조절되거나 또는 과발현되는) 경우, 폴리오바이러스 복제를 증강시키는 숙주 유전자 (단백질 코딩 유전자 및 비-코딩 RNA)의 목록을 제공한다. 이와 같이, 동정된 유전자는 폴리오바이러스 백신 제조를 증가시키도록 조정될 수 있다. 더욱이, 본 발명자들은 폴리오바이러스의 제조를 증강시키도록 제작될 수 있는 일련의 세포주에 관해 기술하고 있다. 상기 모두는 개별적으로 또는 조합해서 사용되어, 소아마비 및 그외 피코나바이러스 감염에 대항하는 데 사용되는 백신의 제조를 증강시킬 수 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 다수의 수단 (예를 들어, siRNA, miRNA, 소분자)에 의해 조정되어 폴리오바이러스 제조를 제한할 수 있는 일련의 유전자에 관해 기술하고 있다.
본 발명은 조작된(engineered) 세포주를 제공한다. 일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시키며, 코딩 영역은 ZNF205, CNTD2, SEC61G, ETS1, TAF1L, MCCD1, LY6G6C, BTN2A1, GLXP3, GCGR, EP300으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시킨다. 상기 감소는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%일 수 있다. 발현의 감소는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 코딩 영역의 발현을 감소시키는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 siRNA, shRNA와 같은 RNA 폴리뉴클레오타이드 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 발현을 감소시키는 편집된(edited) 게놈을 포함한다. 예를 들어, 게놈은 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기에 의해 편집될 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 표 I로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 감소, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가, 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 표 I로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 감소를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 적어도 2개의 코딩 영역의 조합의 발현 감소를 추가로 포함하며, 코딩 영역의 조합은 표 VI으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 증가를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 표 II로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 증가, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소, 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 표 II로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 증가를 포함한다.
일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가를 포함한다. 세포는 miRNA 중 하나와 유사하게 거동하는 miRNA 모방체(mimic)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 적어도 2개의 miRNA의 발현 증가를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 miRNA를 코딩하는 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 내인성 miRNA의 활성을 저해하는 miRNA 저해제를 포함한다.
조작된 세포주의 세포는 피코나바이러스를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 피코나바이러스는 감쇠된 폴리바이러스(polivirus), 예를 들어, 세이빈(Sabin) 1, 세이빈 2, 세이빈 3와 같은 폴리오바이러스이다. 일 구현예에서, 폴리오바이러스는 마호니(Mahoney), 브룬힐데(Brunhilde), MEF-1, 소케트(Saukett) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 세포주의 세포는 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함한다. 일 구현예에서, 피코나바이러스는 장내바이러스 71이다.
조작된 세포주는 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주일 수 있다. 일 구현예에서, 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택된다. 일 구현예에서, 포유류 세포주는 HEp-2 또는 Vero P이다. 일 구현예에서, 조류 세포주는 닭 세포주 또는 오리 세포주이다.
본 발명은 조작된 세포주의 용혈물을 추가로 제공한다.
본 발명은 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 방법은, 본원에 기술된 조작된 세포주를 제공하는 단계, 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에, 조작된 세포주를 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하며, 세포주의 세포는 바이러스를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 세포주를 제공하는 단계, 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하며, 세포주의 세포는 바이러스를 포함하며, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예에서, RNA 폴리뉴클레오타이드는, siRNA, shRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA, 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 활성을 저해하는 mRNA 저해제 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 세포주를 제공하는 단계, 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하며, 세포주의 세포는 바이러스를 포함하며, 세포는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시키는 편집된 게놈을 포함한다. 일 구현예에서, 게놈은 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기에 의해 편집된다. 일 구현예에서, 본 방법은 세포주를 제공하는 단계, 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계, 및 선택적으로 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하며, 세포주의 세포는 바이러스를 포함하며, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 소분자를 포함한다.
본 방법에 사용되는 세포는 피코나바이러스를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 피코나바이러스는 감쇠된 폴리바이러스, 예를 들어, 세이빈 1, 세이빈 2, 세이빈 3와 같은 폴리오바이러스이다. 일 구현예에서, 폴리오바이러스는 마호니, 브룬힐데, MEF-1, 소케트 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 사용되는 세포는 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함한다. 일 구현예에서, 피코나바이러스는 장내바이러스 71이다.
본 방법에 사용되는 세포는 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주일 수 있다. 일 구현예에서, 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택된다. 일 구현예에서, 포유류 세포주는 HEp-2 또는 Vero P이다. 일 구현예에서, 조류 세포주는 닭 세포주 또는 오리 세포주이다.
본 발명은 또한, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 방법은 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 상기 개체의 세포에서 증가시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 상기 개체의 세포에서 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현을 상기 개체의 세포에서 저해하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현을 상기 개체의 세포에서 증가시키는 단계를 포함한다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 모두, 또는 열거된 요소들 중 둘 이상의 조합을 의미한다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 조건에서 소정의 이점을 제공할 수 있는 본 발명의 구현예를 지칭한다. 그러나, 다른 구현예 역시 동일하거나 또는 다른 조건에서 바람직할 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 바람직한 구현예에 대한 언급은, 다른 구현예가 유용하지 않음을 내포하는 것이 아니며, 본 발명의 범위로부터 다른 구현예를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "~을 포함하다" 및 이의 변형된 표현은 이들 용어가 상세한 설명 및 청구항에서 나타나는 곳에서 한정하는 의미를 가지지 않는다.
다르게 명시되지 않는 한, 단수형("a," "an," "the" 및 "적어도 하나")은 상호호환적으로 사용되며, 하나 또는 둘 이상을 의미한다.
본원에서는 또한, 종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함된 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
개별 단계를 포함하는 본원에 개시되는 방법에서, 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있다. 뿐만 아니라, 적절하다면, 둘 이상의 단계들의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
도 1. 일차 게놈-와이드 siRNA 스크린의 결과를 도시한 것이다. 그래프는 폴리오바이러스-특이적인 ELISA를 이용해 18,200개가 넘는 유전자를 스크리닝한 결과를 보여준다. 이들 스크린에 사용된 바이러스는 세이빈 2였다. Y 축은 정상화된(normalized) Z-스코어를 제공한다. X-축은 스크리닝된 유전자를 나타낸다.
도 2. CCID50 분석법의 결과를 도시한 것이다. 그래프는 Vero 세포에서 예시적인 개별 유전자의 컬렉션의 넉다운(knockdown)이 바이러스 타이터(titer)에 어떤 영향을 미치는지 보여준다. Y-축은 비-표적화 대조군(Non-Targeting Control; NTC)에 대해 정상화된 바이러스 타이터이다. 이들 스크린에 사용된 바이러스는 세이빈 2였다. X-축은 유전자 명칭을 제공한다.
도 3. 플라크 분석법의 결과를 도시한 것이다. (A)는, 일차 스크린에서 동정된 표적 유전자의 넉다운이 전체 플라크 수 (바이러스 타이터, 즉, 바이러스의 양)를 어떻게 증가시키는지에 대한 예를 제공한다. 대조군은 비-표적화 대조군 siRNA이다. 상층액 희석 범위는 10^-4 내지 10^-6이다. (B)의 그래프는, 일차 ELISA 스크린에서 동정된 히트(hit)의 컬렉션 결과를 보여준다. NTC는 비-표적화 대조군이다. siPolio는 폴리오바이러스 게놈을 표적화하는 siRNA이다. 이들 스크린에 사용된 바이러스는 세이빈 2였다.
도 4. 항원 등가(antigen equivalency) 연구의 결과를 도시한 것이다. 항원 등가 연구는, 변형시키지 않았거나 또는 특정 유전자를 표적화하는 siRNA를 이용해 변형시킨 Vero 세포에서 제조된 바이러스에서 수행하였다. 숫자는 해당 유전자 넉다운으로부터 유래되는 바이러스의 감염성을 중화시키는, 표준화된 인간 혈청 풀(pool)의 희석율을 의미한다.
도 5. 폴리오바이러스 타입 1 및 3 (세이빈 균주)의 결과를 도시한 것이다. 일차 (세이빈 2) 스크린에서 동정된 유전자를 표적화하는 siRNA로 트랜스펙션시킨 Vero 세포를 후속해서 (도 5a) 폴리오바이러스 타입 1 (세이빈 균주) 또는 (도 5b) 폴리오바이러스 타입 3 (세이빈)으로 감염시켰다. 후속적인 상층액을 실시예 1에 기술된 폴리오바이러스 ELISA를 이용해 평가하였다. 일차 스크린에서 동정된 유전자를 표적화하는 siRNA로 트랜스펙션시킨 Vero 세포를 후속해서 (도 5c) 폴리오바이러스 타입 1 (세이빈 균주) 또는 (도 5d) 폴리오바이러스 타입 3 (세이빈)으로 감염시켰다. 후속적인 상층액을 실시예 1에 기술된 플라크 분석법을 이용해 평가하였다.
도 6. miRNA 모방체 스크린의 요약을 도시한 것이다. 1,200개가 넘는 miRNA 모방체를 일차 ELISA 스크린에서 시험하여, 폴리오바이러스 항원을 증강시키고 감소시키는 유전자를 동정하였다.
도 7. CCID50 분석법에서 개별 miRNA 모방체의 성능을 도시한 것이다. 일차 스크린에서 동정된 11가지의 miRNA는 바이러스 타이터의 2-배 또는 그 이상의 증가를 유도한다.
도 8. 도 8a. 예시적인 유전자 넉다운(KD) 데이터를 도시한 것이다. 개별 siRNA를 Vero 세포로 트랜스펙션한 후, 표적 유전자의 넉다운 수준을 평가하기 위해 q-RT-PCR을 이용하였다. 9회의 유전자 침묵화(silencing) 실험 (ZNF205, SEC61G, ETS1, EP300, BTN21A, GLRXP3, TAF1, MCCD1 및 GCGR) 결과는 70% 이상의 KD가 전형적으로 관찰됨을 보여준다. 도 8b. 그래프는 단일 유전자 넉다운이 7가지의 서로 다른 폴리오바이러스에 미치는 효과를 보여준다. 29가지의 개별 유전자를 Vero 세포에서 개별적으로 침묵화하였다. 후속해서, 세포를, 세이빈 1, 세이빈 2, 세이빈 3, 마호니 (야생형 1), 브룬힐데 (야생형 1), MEF (야생형 2) 및 소케트 (야생형 3)를 비롯한 7가지의 서로 다른 소아마비 균주 중 하나로 감염시켰다. 보고된 타이터는, 비-표적화 대조군 siRNA (NTC)를 세포에 트랜스펙션한 경우 관찰되는 것과 비교한 것이다. 부가적인 대조군은 1) 폴리오바이러스를 표적화하는 siRNA (siPolio), 모크(mock) 감염 (Mock), 및 siRNA의 부재시에 지질 트랜스펙션 시약으로 처리한 세포 (-siRNA)의 풀을 포함한다. 실선은 바이러스 타이터에서 4-배 증가를 나타낸다. 점선은 바이러스 타이터에서 8-배 증가 (또는 그 이상의 증가)를 나타낸다. 이 데이터는, 일차 스크린에서 동정된 유전자 표적의 넉다운이 폴리오바이러스 제조의 증강을 초래한다는 추가적인 지지를 제공한다.
도 9a 및 9b. 이중(dual) 유전자 넉다운이 다중 폴리오바이러스 균주의 타이터에 미치는 효과에 대한 예시적인 데이터를 도시한 것이다. 짙은 회색 막대는, 유전자를 둘 다 동시에 침묵화한 경우, 바이러스 타이터의 실제적인 증가를 나타낸다. 연한 회색 막대는, 개별 유전자를 침묵화한 경우 관찰된 변화의 총합을 기준으로 한 예측된 타이터를 나타낸다. "*"는 관찰된 타이터 증가가 개별 경우의 총합보다 더 큰 경우를 나타낸다 (P<0.05).
도 10. (도 10a) 유전자 침묵화가 EV71 바이러스 제조에 미치는 효과를 도시한 것이다. Vero 세포를, 폴리오바이러스 RNAi 스크린 동안에 동정된 몇몇 유전자 중 하나를 표적화하는 siRNA로 트랜스펙션시켰다. 적절한 기간의 유전자 침묵화 후, EV71을 배양액에 첨가하였다. 후속해서, 상대적인 타이터를 세포변성 효과(cytopathic effect; CPE) 검사에 의해 평가하였다. (도 10b) 플라크 분석법 결과는, 3개의 서로 다른 유전자 (ZNF205, CNTD2 및 MCCD1)의 침묵화가 EV71 타이터에 미치는 영향을 나타낸 결과이다. "RD 세포"는 횡문근육종 세포이다. (도 10c) 막대 그래프는 플라크 분석법의 결과를 정량화한 것이다. 실험은 3중 중복으로 수행하였으며, 비-표적화 대조군 siRNA (NTC), 및 EV71 게놈을 표적화하는 siRNA (siEV71)를 통합하였다.
표 I. 폴리오바이러스 항원 및 복제를 증가시킨 124가지 유전자의 목록을 제공한다. 표는 유전자 명칭, KEGG 변환 번호(conversion number), 및 일차 소아마비-특이적인 ELISA로부터의 Z-스코어 값을 제공한다.
표 II. 침묵화 시, 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 크게 감소시키는 100가지가 넘는 유전자의 목록을 제공한다.
표 III. 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조의 증가를 유도한 2 이상의 siRNA를 가진 (표 I에서 동정된 124 히트(hit) 중) 68가지의 유전자의 목록을 제공한다. 표는 유전자 명칭, 및 표현형을 유도한 siRNA의 수를 제공한다.
표 IV. 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 크게 감소시키는 숙주-코딩된 miRNA의 목록을 제공한다.
표 V. 도 8의 데이터를 생성하는 데 사용된 유전자, 기탁 번호 및 siRNA 서열의 목록을 제공한다.
표 VI. 폴리오바이러스 제조를 상가작용 또는 상승작용 방식으로 증강시키는 49가지의 유전자 조합을 제공한다.
이하, 본 개시내용은 바람직한 구현예와 함께 기술될 것이다. 이들 구현예는 본 개시내용의 이해를 돕고자 제시되며, 본 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하려는 의도가 아니며 그렇게 간주되어서도 안 된다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있는 모든 변화, 변형 및 등가는 본 개시내용의 사상 및 범위에 포함된다.
유전자 지정(designation)과 관련하여, 단일 유전자는 종종 다중 부호(symbol)로 표시된다. 예를 들어, 문헌에서 펩티딜프롤릴(peptidylprolyl) 이소머라제 B를 코딩하는 사이클로필린 B(Cyclophilin B) 유전자는 PPIB 및 CYPB로 표시된다. 이 문헌의 맥락에서 유전자 부호는 인간 또는 비-인간일 수 있든지 간에, 대문자 또는 소문자로 지정될 수 있다. 하나의 특정 부호의 사용 또는 소문자 또는 대문자 부호의 적용 중 어느 것도 이들 발명의 맥락에서 유전자의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 동정된 모든 유전자 동정 번호 (유전자ID)는 다르게 언급되지 않는 한, 국가 바이오테크놀로지 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) "Entrez Gene" 또는 KEGG 웹 사이트로부터 유래된다.
본원에서, 용어 "유전자"는 전사 단위, 및 이 전사 단위에 인접해 있으며 (예를 들어, 상류 및 하류에 위치해 있으며) 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역을 지칭한다. 전사 단위는 RNA 분자로 전사되는 일련의 뉴클레오타이드이다. 전사 단위는 코딩 영역을 포함할 수 있다. "코딩 영역"은 비-가공된 preRNA (즉, 엑손 및 인트론을 둘 다 포함하는 RNA 분자)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 비-가공된 preRNA는 후속해서 mRNA로 가공된다. 전사 단위는 비-코딩 RNA를 코딩할 수 있다. 비-코딩 RNA는 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자이다. 비-코딩 RNA의 예는 마이크로RNA(microRNA)를 포함한다. 전사 단위의 경계는 일반적으로 5' 말단에서는 개시 부위 및 3' 말단에서는 전사 종결자에 의해 결정된다. "조절 영역"은 전사 단위에 작동적으로 연결되어 있으며 이의 발현을 조절하는 뉴클레오타이드 서열이다. 조절 서열의 비-제한적인 예로는, 프로모터, 인핸서, 전사 개시 부위, 번역 시작 부위, 번역 정지 부위, 전사 종결자 및 폴리(A) 신호를 포함한다. 전사 단위의 상류에 위치하는 조절 영역은 5' UTR로 지칭될 수 있으며, 전사 단위의 하류에 위치하는 조절 영역은 3' UTR로 지칭될 수 있다. 조절 영역은 전사될 수 있으며, 비-가공된 preRNA의 일부일 수 있다. 용어 "작동적으로 연결되어 있는"은, 성분들이 원하는 방식으로 작동할 수 있는 관계로 존재하는 병렬(juxtaposition)을 지칭한다.
본원에서, "코딩 영역의 발현 감소" 및 "코딩 영역의 발현 증가"는 코딩 영역의 전사 변화, 코딩 영역에 의해 코딩되는 mRNA의 번역 변화, 또는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 활성 변화를 지칭한다.
이 문헌의 맥락에서, 용어 "백신"은, 동물 또는 인간의 면역계를 자극하여 예를 들어 감염제에 대한 보호를 제공하는 데 사용되는, 펩타이드 또는 변형된 펩타이드, 단백질 또는 변형된 단백질, 살아있는 바이러스, 살아있지만 감쇠된 바이러스, 불활성화되거나 또는 사멸된(killed) 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP) 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 제제를 지칭한다. 백신은 종종, 이러한 치료를 받는 개체(들)에서 항체의 제조, 항체-유사 분자의 제조 또는 세포성 면역 반응을 자극함으로써 작용한다.
용어 "바이러스 제조"는 살아있는 바이러스, 감쇠된 바이러스 및/또는 VLP의 제조를 지칭할 수 있다. 제조는 1) 유기체 (예를 들어, 난황), 배양된 세포 (예를 들어, Vero 세포) 또는 시험관 내 (예를 들어, 세포 용혈물을 통함)에서의 제조를 비롯한 일반적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
용어 "세포주"는 계속해서 분열할 수 있지만 노화하지 않는 세포의 클론 집단(clonal population)을 지칭한다.
용어 "백신 세포주"는 백신을 제조하는 데 사용되는, 하나 이상의 세포로부터 부분적으로 또는 전체적으로 유래되는 임의의 세포, 변형된 세포, 세포 용혈물 또는 변형된 세포 용혈물을 기술한다. 세포(들)는 포유류 (인간, 비-인간 영장류, 햄스터, 개를 포함하지만 이들로 한정되지 않음), 조류 (예를 들어, 닭, 오리), 곤충 등을 비롯한 많은 소스들로부터 유래될 수 있다. 백신 제조에 사용되는 세포 용혈물도 마찬가지로 많은 세포 타입들로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 용어 "숙주 세포" 및 "백신 세포주"는 동의어이며, 1) 병원체 (예를 들어, 바이러스)에 의한 감염의 표적이며, 2) 바이러스 또는 백신의 서브유닛(subunit) (예를 들어, 면역원성 단백질)의 제조에 사용되며, 및/또는 3) 바이오분자의 제조에 사용되는 임의의 세포를 포함한다.
용어 "증강된 백신 세포주", "증강된 세포주", "조작된 백신 세포주" 또는 "조작된 세포주"는 모두, 내인적으로 발현되는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 특성을 조정하는 하나 이상의 수단에 의해 백신 또는 바이오분자의 제조 또는 특성을 증가시키도록 변형된 세포주 또는 세포 용혈물을 지칭한다.
본원에서, 용어 "대조군 세포주" 및 "대조군 세포"는 조작된 세포주와 유전적으로는 유사하지만 동일한 방식으로 조작되지 않은 세포주를 지칭한다. 예를 들어, 조작된 세포주는 동일한 방식으로 조작되지 않은 대조군 세포주와 비교 시, 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시킬 수 있다.
유전자 발현을 조정하는 데 사용될 수 있는 방법으로는, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA), 안티센스 분자, 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TAL(TALE) 뉴클레아제, 트리플렉스(triplex), 변형된 트리플렉스, 소분자, 개방형 해독틀(open reading frame; ORF)의 발현 변화, 또는 클로닝된 DNA 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 ?는다.
이러한 문헌의 맥락에서, 용어 "표적" 또는 "표적 유전자" 또는 "히트(hit)"는, (조정 시) 바이러스 또는 바이오분자 제조의 일부 측면을 긍정적으로 또는 부정적으로 변화시키는 단백질-코딩 유전자 및 비-코딩 RNA (예를 들어, miRNA)를 비롯한 임의의 유전자를 지칭한다. 표적 유전자로는 내인성 숙주 유전자, 병원체 (예를 들어, 바이러스) 유전자 및 트랜스유전자를 포함한다.
용어 "조정하다" 또는 "조정"은 유전자의 조절(regulation), 발현 또는 활성의 변화를 지칭한다. 일반적으로, 당업자에게 용어 "조정"은 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키는 것, 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 것, 및 유전자의 특이성 또는 기능을 변화시키는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 유전자의 발현 또는 활성을 조정하는 것은, 1) 유전자 복사체 수(copy number), 2) 유전자의 전사 또는 번역, 3) 전사체 안정성 또는 수명(longevity), 4) mRNA 또는 miRNA의 복사체 수, 5) 비-코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA 표적 부위의 이용가능성, 6) 단백질에서 번역-후 조정의 위치 또는 정도(degree), 7) 단백질의 활성 및 그외 기전 중 하나 이상을 변화시키는 것을 비롯한 다수의 수단에 의해 달성될 수 있다. 조정은 표적 유전자 활성의 유의미한 감소 (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 이상의 감소) 또는 표적 유전자 활성의 유의미한 증가(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20% 또는 그 이상의 증가)를 초래할 수 있다. 더욱이, 당업자에 의해, 하나 이상의 유전자의 조정은 후속해서 다중 유전자(예를 들어, miRNA)의 조정을 초래할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "마이크로RNA"는 일상적이며 단순한 의미에 따라 사용되며, 진핵생물에서 발견되며 RNA-기재의 유전자 조절에 관여하는 마이크로RNA 분자를 지칭한다(예를 들어, Carrington et al., 2003, Science, 301:336-338 참조). 개별 miRNA는 서로 다른 유기체에서 동정 및 서열화되며, miRNA 레지스트리에의 의뢰(submission)를 토대로 명명된다(Griffiths-Jones, 2004, Nucl. Acids Res., 32(Suppl 1):D109-D111, 및 miRBase.org 참조). miRNA의 명칭은 본원에 제공되며, 이들의 서열은 miRBase.org를 통해 쉽게 입수가능하다. 부가적으로, 다른 miRNA는 당업자에게 알려져 있으며, 본원에 기술된 구현예에서 쉽게 이행될 수 있다. 방법 및 조성물은 실질적으로, 본원에 기술된 구현예에 대한 제한으로써가 아니라 실시예로써 제시된 것이므로, 출원에서 동정된 miRNA에 제한되어서는 안 된다. 자연적인 miRNA 영역과 100% 미만으로 일치하는 miRNA 영역을 가진 miRNA는 "모방체 miRNA"로 지칭될 수 있다. 상기 분자는 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있다.
용어 "바이오가공(bioprocessing)" 또는 "바이오제조"는 1) 세포주, 2) 세포 용혈물, 또는 3) 생체 내 플랫폼(예를 들어, 난황) 모델에서 생물학적 제품(예를 들어, 바이오치료제, 백신)을 실험실-규모로 제조하는 것과 산업적-규모로 제조하는 것을 지칭한다.
용어 "피코나바이러스"는 피코나비리대(Picornaviridae) 과의 구성원을 지칭한다. 피코나비리대 과의 구성원의 예로는, 장내바이러스 속(genus)의 구성원을 포함한다. 장내바이러스 속의 구성원의 예로는 장내바이러스 종(species) A를 포함한다. 장내바이러스 종 A의 예는 장내바이러스 71이며, 본원에서는 EV71이라고도 지칭된다. 장내바이러스 속의 구성원의 예로는 장내바이러스 종 C를 포함한다. 장내바이러스 종 C의 예로는 폴리오바이러스를 포함한다. 야생형의 악성 폴리오바이러스 균주의 예로는, 마호니, 브룬힐데, MEF-1 및 소케트를 포함한다. 감쇠된 폴리바이러스 균주의 예로는, 세이빈 1, 세이빈 2 및 세이빈 3를 포함한다. 폴리오바이러스는 혈청형 1 (예를 들어, 세이빈 1, 마호니 및 브룬힐데), 혈청형 2 (예를 들어, 세이빈 2 및 MEF-1) 또는 혈청형 3 (예를 들어, 세이빈 3 및 소케트)일 수 있다. 용어 "피코나바이러스"는 백신 제조에 사용될 수 있는 현재의 피코나바이러스 또는 미래의 피코나바이러스를 포함하는 것으로 의도된다. 이들로는, 임의의 및 모든 야생형 균주, 부모(parental) 균주, 감쇠된 균주 (예컨대, 폴리오바이러스 혈청형 1, 2 및 3의 세이빈 균주), VLP, 공지된 3가지 폴리오바이러스 이외의 피코나비리대 과의 임의의 구성원, 뿐만 아니라 현재 또는 미래의 재조합 또는 조작된 균주를 포함한다.
바이러스 제조와 같은 일이 발생하기에 "적절한" 조건, 또는 "적절한" 조건은 이러한 일이 발생하는 것을 막지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은 이런 일을 허용, 증강, 촉진 및/또는 조장한다.
피코나바이러스 제조의 증강
본 개시내용은 백신을 제조하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 용도에서, 조성물 및 방법은 소아마비 백신의 제조에 관한 것이다. 본 개시내용을 이용함으로써, 백신 제조를 향상시키는, 변형된 세포주, 세포 용혈물 및/또는 생체 내 시스템 (예를 들어, 난황 내(in ovo))과 관련된 조성물 및 방법이 구상될 수 있다.
백신은 다양한 수단들에 의해 제조될 수 있다. 하나의 경우에서, 비-제한적인 예로 인간, 비-인간 영장류, 개 및 조류를 포함하는 많은 소스로부터 유래되는 세포를 먼저 적절한 환경 (예를 들어, 세포 또는 조직 배양 플레이트 또는 플라스크)에서 원하는 밀도로 배양한다. 이어서, 바이러스 접종 스탁(seed stock) (예를 들어, 세이빈 2 폴리오바이러스)을, 세포를 감염시키는 배양액에 첨가한다. 그런 다음, 감염된 세포를, 바이러스가 복제되어 그 수가 늘어나는 바이오반응기 (예를 들어, 단일 용도의 바이오반응기)로 이송한다. 적절한 기간 후, 새로 방출된 바이러스 입자로부터 세포 및 세포 미립자를 분리한 다음, 부가적인 단계 (예를 들어, 정제, 탈활성화, 농축)를 수행하여, 백신으로 사용할 물질을 추가로 제조한다.
바이러스의 생장과 관련하여, 숙주 세포는 바이러스 복제에 중요한 기여를 한다. 예로써, 숙주-코딩된 세포 표면 단백질은 종종, 바이러스가 세포 내로의 유입을 얻기 위해 바이러스에 의해 사용되게 된다 (Ramos, I et. al. (2012) Front Microbiol. 3:117). 마찬가지로, 숙주 구획 (예를 들어, 세포내이입 소낭(endocytic vesicle))은 병원체-관련 유전자 과정을 위한 필수적인 기능을 가진 세포내 영역으로의 수송을 위해 병원체에 의해 자주 사용된다 (Karlas, A. et.al. (2010) Nature 463:818). 병원체 전파(propagation)에 필수적인 기능이 결실되면, 병원체 복제에 유해한 영향을 받을 수 있다. 반대로, 일부 경우에, 병원체 복제에 부정적인 영향을 미치는 기능의 결실, 또는 병원체 전파에 필수적인 기능의 과발현은 예를 들어, 바이러스의 제조를 크게 증강시킬 수 있다 (Kolokoltsov et. al. (2007) J. Virol. 81:7786).
이전의 연구에서 바이러스 감염을 촉진하는 숙주-코딩된 유전자 넉다운 및 과발현을 동정하긴 하였지만, 이들 발견은 심지어 밀접하게 관련된 시스템에서 종종 불량하게 재현된다는 것은 충분히 입증되어 있다. 예로써, Brass 등 (Science (2008) 319:921) 및 Konig 등 (Cell (2008) 135:49)을 비롯한 몇몇 그룹들은 HIV 복제에서 역할을 하는 숙주-코딩된 유전자를 동정하기 위해 RNAi 기술을 이용한 바 있다. 이들 연구를 하는 동안, 각각의 그룹은, 조정되는 경우 HIV 복제의 하나 이상의 측면을 변경시킨 숙주-코딩된 유전자를 200개가 넘게 동정하였다. 그러나, 각각의 그룹에 의해 생성된 유전자 히트 목록을 비교한 경우, 유전자 중 10% 미만이 양쪽 데이터 세트에서 공통적이었다. 해당 분야의 전문가들은 이들 결과가, 각각의 연구에 이용되는 바이러스 균주, 세포주 및 분석법을 비롯한 다수의 인자들의 미묘한 차이로 인한 것이라고 한다. 본 발명자들은 이들 발견의 미묘한 중요성을 인지하고 있으며, 그러한 이유에서, 그들의 현재 연구를 백신 제조에 현재 이용되는 바이러스 및 세포 시스템에 초점을 두었다.
일 구현예에서, 본 발명은 (개별적으로 또는 조합해서) 조정되는 경우, 세포, 세포주 또는 세포 용혈물에서 폴리오바이러스 또는 폴리오바이러스 항원을 비롯한 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원의 제조를 증강시키는 단백질-코딩 유전자의 목록을 제공한다 (표 I). 바람직하게는, 기술된 목록의 유전자(들)의 조정은 폴리오바이러스의 세이빈-2 백신 균주의 제조를 증강시킨다. 보다 바람직하게는, 기술된 목록의 유전자(들)의 조정은 폴리오바이러스 백신 제작에 사용되는 세포, 세포주 또는 세포 용혈물에서 세이빈-1, 세이빈 2, 및/또는 세이빈 3 폴리오바이러스 또는 폴리오바이러스 항원의 제조를 증강시킨다.
표 I. 침묵화 시, 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 증가시키는 유전자의 목록
유전자 명칭 기탁 번호 Z-스코어
SEC31L2 NM_015490 5.35
ZBTB12 NM_181842 4.78
UNQ3112 NM_212555 4.73
CETN1 NM_004066 4.72
LPAL2 NR_028092 4.71
ETS1 NM_001143820 4.70
HEPN1 NM_001037558 4.67
SNAP29 NM_004782 4.61
MLP NM_023009.5 4.58
KIAA1862 NM_032534 4.58
STK25 NM_006374 4.52
EDD1 NM_015902 4.49
OR10A7 NM_001005280 4.48
UNG NM_003362 4.47
GLRXL (GLRXP3으로도 공지되어 있음) NM_001123388 4.41
BCL9L NM_182557 4.35
VGLL2 NM_153453 4.33
IQGAP3 NM_178229 4.27
CHD5 NM_015557 4.22
RPL32 NM_000994 4.22
LOC164153 NM_203412 4.20
DKFZP434O047 NM_015594 4.16
ZFYVE19 NM_001077268 4.15
ACVR2B NM_001106 4.13
TREM5 NM_174892 4.11
CDR2 NM_001802 4.10
FLJ40121 NM_001038704 4.05
LOC201176 NM_199282 4.02
PKIG NM_007066 3.99
LOC389860 NM_001015038 3.95
CREB1 NM_004379 3.94
CHCHD7 NM_001011667 3.91
MAOA NM_000240 3.91
TUBB8 NM_177987 3.89
TMP21 NM_006827 3.87
BTN2A1 NM_001197233 3.85
LOC345778 NM_001167741 3.85
MGC52423 NM_001164829 3.82
SAST XM_032034 3.80
EFCBP2 NM_019065 3.80
STAU NM_001037328 3.73
RP1-93H18.5 NM_001010919 3.69
SLC39A14 NM_001128431 3.63
ITPK1 NM_001142593 3.62
LY6G6C NM_025261 3.60
MUC1 NM_001018016 3.59
LOC120824 NM_001206625 3.58
SIN3B NM_015260 3.58
NEDD9 NM_001142393 3.56
EP300 NM_001429 3.55
PDCD1LG2 NM_025239 3.54
SIGLEC5 NM_003830 3.52
TMSB4Y NM_004202 3.52
HRI NM_001134335 3.52
MCCD1 (LOC401250으로도 공지되어 있음) NM_001011700 3.51
TAF1 NM_004606 3.51
MGC5352 NM_001170543 3.50
OR10H1 NM_013940 3.48
CNTD2 (FLJ13265로도 공지되어 있음) NM_024877 3.47
MKRN2 NM_014160 3.46
TAF1L NM_153809 3.46
FOXD4L2 NM_001099279 3.45
MED31 NM_016060 3.43
C20ORF129 NM_030919 3.43
BET1L NM_001098787 3.42
FLJ00193 NM_001080471 3.39
SLC1A2 NM_001195728 3.38
ZNF135 NM_001164527 3.35
ZDHHC4 NM_001134387 3.34
COLEC11 NM_024027 3.33
OR4K15 NM_001005486 3.33
RENT1 NM_002911 3.33
LOC126917 XM_375695 3.32
KIAA0459 NM_015207 3.31
HR NM_005144 3.31
DSP NM_004415 3.30
SYT7 NM_004200 3.28
MELL1 NM_033467 3.28
GTF3C2 NM_001035521 3.28
VILL NM_015873 3.27
RNF20 NM_019592 3.26
MYO3B NM_001083615 3.26
CCNL2 NM_001039577 3.26
ANKRD12 NM_001083625 3.25
LILRA2 NM_001130917 3.25
KRTAP4-4 NM_032524 3.25
CCL24 NM_002991 3.20
SEC61G NM_001012456 3.19
JUND NM_005354 3.19
DPM2 NM_003863 3.19
SIRT4 NM_012240 3.18
CTAGE4 NM_198495 3.17
PRAMEF8 NM_001012276 3.16
BOLL NM_033030 3.16
ZNF206 NM_032805 3.15
UGCG NM_003358 3.15
YBX1 NM_004559 3.14
KRT3 NM_057088 3.14
CCL7 NM_006273 3.14
MANSC1 NM_018050 3.13
SEC61A1 NM_013336 3.13
MICB NM_005931 3.13
KPNA1 NM_002264 3.12
TFAP4 NM_003223 3.12
ARHGEF2 NM_001162383 3.11
SEMG1 NM_003007 3.11
SIK2 NM_015191 3.11
CCL16 NM_004590 3.11
RASSF4 NM_032023 3.10
MARCH3 NM_178450 3.10
DZIP1 NM_014934 3.10
FBXO42 NM_018994 3.09
GPR30 NM_001039966 3.09
SPATA13 NM_001166271 3.09
C20ORF177 NM_022106 3.08
FKBP14 NM_017946 3.07
IRS4 NM_003604 3.05
DTYMK NM_001165031 3.04
VDR NM_001017536 3.03
ZNF205 NM_001042428 3.03
GALNACT-2 NM_018590 3.02
PIAS2 NM_004671 3.02
BRMS1L NM_032352 3.02
CYP1A2 NM_000761 3.01
BRD4 NM_014299 3.01
SLC12A3 NM_000339 3.00
CELSR3 NM_001407 2.53
GCGR NM_000160 2.83
OPN3 NM_014322 2.21
PAK1 NM_002576 2.95
목록은, 키나아제, 프로테아제, 유비퀴틴화, 선천적 면역, 세포자살 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 복수의 클래스/과(family) 및 기능에 속하는 유전자를 포함한다. 실시예에 도시된 바와 같이, 소정의 유전자의 하향조절은 바이러스 단백질의 제조 및/또는 살아 있는 감염성 피코나바이러스의 총 타이터를 유의미하게 증강시킨다. 동시에, 이 연구에 사용된 스크린은 또한, 침묵화 시, 폴리오바이러스 복제를 감소시킨 유전자의 컬렉션을 동정하였다 (표 II, 실시예). 이 후자의 클래스의 유전자는 소아마비 및 그외 바이러스 질환의 치료를 위한 잠재적인 치료 표적의 중요한 컬렉션을 나타내는 것으로 인지된다. 이 목록은 또한, 백신 제작의 관점에서 이들 유전자의 과발현이 피코나바이러스 제조를 증강시켜야 한다는 점에서 중요하다.
표 II. 침묵화 시, 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 감소시키는 유전자의 목록
유전자 명칭 기탁 번호 Z-스코어
PTPN9 NM_002833 -2.7385
TDP1 NM_001008744 -2.62421678
GLRA1 NM_000171 -2.5816
RAB7 NM_004637 -2.56473341
KLF15 NM_014079 -2.56065162
COPA NM_001098398 -2.54894774
C9ORF123 NM_033428 -2.5480179
RAN NM_006325 -2.51979459
SOX2 NM_003106 -2.50782291
ARL2 NM_001199745 -2.50310843
SCAMP2 NM_005697 -2.49992908
UBE2I NM_003345 -2.48383828
RPS13 NM_001017 -2.47448119
ASB14 NM_001142733 -2.465731
DLEC1 NM_007335 -2.45854856
KIF11 NM_004523 -2.44757255
CHRDL1 NM_001143981 -2.43765162
ARCN1 NM_001142281 -2.43253991
RPL27 NM_000988 -2.43177109
CCT8 NM_006585 -2.42916239
FBXO24 NM_001163499 -2.42305456
FABP2 NM_000134 -2.41676419
FLNC NM_001127487 -2.4057734
APOC1 NM_001645 -2.39426297
TSTA3 NM_003313 -2.39391153
OR4F15 NM_001001674 -2.39213505
LSM11 NM_173491 -2.39060755
CAGLP NM_138705 -2.36202792
KISS1 NM_002256 -2.36122944
SON NM_032195 -2.35523255
PHC3 NM_024947 -2.34996112
PSMD1 NM_001191037 -2.34541941
STMN1 NM_001145454 -2.34328443
FBXO5 NM_001142522 -2.34003556
BCL2 NM_000633 -2.3380053
RPL10L NM_080746 -2.33109113
KRTAP9-4 NM_033191 -2.32159817
NHP2L1 NM_001003796 -2.32069813
RPL37A NM_000998 -2.31999381
ARL5 NM_001037174 -2.31751988
B3GALT1 NM_020981 -2.31702776
WBSCR20C NR_033323 -2.31475549
RPS9 NM_001013 -2.30446216
IRF7 NM_001572 -2.30052295
CREB3L4 NM_130898 -2.29956619
RP6-166C19.2 NM_173571 -2.2977916
FLJ12969 NM_001168478 -2.29695985
MGC22960 NM_199044 -2.29376515
ALOX5AP NM_001204406 -2.29200518
DNCI1 NM_001135556 -2.29028039
BDH NM_004051 -2.28814336
RPS29 NM_001030001 -2.28744101
PBX1 NM_001204961 -2.28732916
RPS3A NM_001006 -2.28572015
TOP1 NM_003286 -2.2816158
LRRC29 NM_001004055 -2.28002183
SYPL2 NM_001040709 -2.27983961
SMC1L1 NM_006306 -2.2784245
LOC283726 XM_208809 -2.27820228
RPS12 NM_001016 -2.27817208
FLJ44838 XR_110819 -2.2754257
ZNF483 NM_001007169 -2.26406815
NGFR NM_002507 -2.25743873
OR3A4 NR_024128 -2.2556918
GRIN2D NM_000836 -2.2539
SERPINB3 NM_006919 -2.25196492
AADAC NM_001086 -2.24957667
CCNDBP1 NM_012142 -2.24930977
TAS1R2 NM_152232 -2.24745014
HIP-55 NM_001014436 -2.24645872
RPL19 NM_000981 -2.24281714
C10ORF58 NM_001243778 -2.2385437
GPR108 NM_001080452 -2.2369
FURIN NM_002569 -2.2363797
ST6GAL2 NM_001142351 -2.23591802
ZCCHC5 NM_152694 -2.23459361
SS18L2 NM_016305 -2.23407679
LOC343066 NM_001013630 -2.23364666
FBXO17 NM_024907 -2.23101061
LOC374768 NM_199339 -2.23025699
BCORL1 NM_021946 -2.22956861
TMEM39A NM_018266 -2.22894485
FAM3A NM_001171132 -2.22848498
JAG2 NM_002226 -2.22829405
AGTRAP NM_001040194 -2.22616538
CDC14B NM_003671 -2.2259
PFDN5 NM_002624 -2.22392308
FLJ22160 NM_024585 -2.22034258
NEUROG3 NM_020999 -2.21936819
MANEA NM_024641 -2.21500772
GBF1 NM_004193 -2.21445835
ITGAX NM_000887 -2.21374414
ARNT NM_001197325 -2.20970503
SFXN4 NM_213649 -2.20937048
SLC7A5 NM_003486 -2.20816642
FBXW9 NM_032301 -2.20800534
LOC145741 NM_207322 -2.20441572
PPAN-P2RY11 NM_001040664 -2.20373508
SP192 NM_021639 -2.20211573
FABP7 NM_001446 -2.20003134
EPB41L4A NM_022140 -2.19856942
NARG2 NM_001018089 -2.19771971
RPL17 NM_000985 -2.19671437
CFC1 NM_032545 -2.19564617
SGOL1 NM_001012409 -2.19538426
FAM83G NM_001039999 -2.18828344
OR2A14 NM_001001659 -2.18730703
PSMB1 NM_002793 -2.18716256
PGLYRP4 NM_020393 -2.18711354
LNK NM_005475 -2.18537639
HLA-E NM_005516 -2.18281657
FLJ38984 NM_152374 -2.18050259
PTGIS NM_000961 -2.17764803
RASIP1 NM_017805 -2.17751021
LRRC6 NM_012472 -2.17671453
DCDC1 NM_181807 -2.17260641
GPR3 NM_005281 -2.1712
FLJ21148 NM_001160305 -2.17066839
TBX3 NM_005996 -2.16946992
ZMPSTE24 NM_005857 -2.16936496
TNNT1 NM_001126132 -2.16882365
POF1B NM_024921 -2.16476494
LTB4DH NM_001146108 -2.16474877
MGC57858 NM_001008703 -2.16473473
FLJ31978 NM_144669 -2.16258788
P8 NM_012385 -2.16131498
KCNN1 NM_002248 -2.1606
DDX20 NM_007204 -2.16006
HSPA12A NM_025015 -2.15973918
ATP1A1 NM_000701 -2.15928943
GPS2 NM_004489 -2.1588529
KIAA1856 NM_001080495 -2.15796869
LOC196394 NM_207337 -2.15341867
C17ORF32 NM_152464 -2.15287003
KRT10 NM_000421 -2.14871198
FLJ41287 NM_207381 -2.14830576
GASP2 NM_001004051 -2.1472978
HIST1H2BB NM_021062 -2.14710744
LOC134145 NM_199133 -2.14682343
MSX2 NM_002449 -2.14552263
C21ORF5 NM_005128 -2.14443549
FAM47E NM_001136570 -2.1419783
FZD8 NM_031866 -2.1411
SOCS1 NM_003745 -2.1410
NOD3 NM_178844 -2.14095033
IL17E NM_022789 -2.14064682
MRPL16 NM_017840 -2.14007036
TOP1MT NM_052963 -2.14005861
LOC400451 NM_207446 -2.13874052
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피코나바이러스 제조가 증강되는 기전은 다양한 경향이 있다. 일부 경우에, 스크린에서 동정된 유전자는 바이러스의 하나 이상의 성분과 직접적인 음성 상호작용을 가진다. 예를 들어, 숙주 유전자 생성물은 세포의 선천적 면역의 직접적인 매개자일 수 있으며, 따라서, 예를 들어, 바이러스 게놈을 검출하고 이어서 세포자살 상태를 유도함으로써 항-바이러스 특성을 가질 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 작용은 간접적일 수 있는데, 유전자 생성물의 조정은, 바이러스가 예를 들어 복제를 위해 의존하는 경로, 구획 또는 세포 상태를 변형함으로써 바이러스 복제에 긍정적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 특정한 조정은 숙주-단백질의 번역-후 변형을 증강시키며, 그렇게 함으로써, 바이러스 복제에 필수적인 하나 이상의 숙주 세포 분비 경로를 긍정적으로 증가시키는 것이 가능하다. 다른 예로, 하나 이상의 유전자의 조정은 세포 생존율을 증가시킬 수 있으며, 이로써 바이러스 복제를 지지할 수 있는 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 보다 다른 시나리오에서, 하나 이상의 유전자의 조정은 바이러스 생장에 보다 도움이 되는 세포 주기 단계로 세포를 락킹(locking)할 수 있다. 이들 경우에, 본 발명자들은, 본 발명의 이득이 폴리오바이러스 백신 제조에 제한되지 않을 수 있지만 다른 피코나바이러스 또는 바이오분자 (예를 들어, 치료성 항체)로 연장될 수 있다고 예상한다.
본원에서 동정되는 유전자의 조정은 게놈 DNA, 메신저 RNA 및/또는 비-코딩 RNA 및/또는 단백질을 조작하는 기술을 비롯하여 복수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 이와 같이, 대상(of interest) 유전자를 조정하기 위해 이용될 수 있는 기술 또는 기전으로는, 1) 게놈 DNA를 표적화해서 편집된 게놈을 초래하는 기술 및 시약 (예를 들어, 결실과 같은 돌연변이를 유전자에 도입하기 위한 상동성 재조합, 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성자-유사 효과기 (예를 들어, TALEN), 트리플렉스(triplex), 후성적 변형의 매개자, 및 CRISPR과 rAAV 기술), 2) RNA를 표적으로 하는 기술 및 시약 (예를 들어, RNAi 경로를 통해 작용하는 제제, 안티센스 기술, 리보자임 기술), 및 3) 단백질을 표적으로 하는 기술 (예를 들어, 소분자, 앱타머(aptamer), 펩타이드, 옥신(auxin)- 또는 FKBP-매개의 탈안정화 도메인, 항체)을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
DNA를 표적으로 하는 일 구현예에서, 유전자 조정은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 사용해 달성된다. 합성 ZFN은 예를 들어, FokI DNA 절단 도메인과 융합된 주문 설계된(custom designed) 아연 핑거 결합 도메인으로 구성된다. 이들 시약은 광범위한 유기체에서 유전자 발현의 넉아웃(knock out) 또는 넉인(knock in)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 세포 게놈의 편집을 위해 설계/조작될 수 있기 때문에, 이들은 원하는 특성을 가진 안정한 조작된 세포주를 개발하기 위한 표준들 중 하나로 간주된다. 메가뉴클레아제, 트리플렉스, CRISPR 및 재조합 아데노-관련 바이러스도 마찬가지로 다수의 세포 타입에서 게놈 조작에 사용되어 왔으며, ZFN에 대한 실행가능한 대체물이다. 기술된 시약은 프로모터, 단백질-코딩 영역 (엑손), 인트론, 5' UTR 및 3' UTR 등을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
유전자 기능을 조정하기 위한 또 다른 구현예는 세포의 메신저 RNA를 표적으로 하는 세포의 내인성 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 이용한다. 이러한 접근법에서, 유전자를 표적으로 하는 시약은 작은 간섭(small interfering) RNA (siRNA) 뿐만 아니라 마이크로RNA (miRNA)를 포함한다. 이들 시약은 광범위한 화학적 변형, 대상의 표적 전사체에 대한 상보성 수준, 및 안정성, 세포성 전달, 특이성 및 기능성을 증강시키기 위한 설계 (미국 특허 8,188,060 참조)를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 시약은 유전자의 다양한 영역 (mRNA의 5' UTR, 개방형 해독틀, 3' UTR 포함), 또는 (일부 경우에) 대상 유전자를 코딩하는 게놈 DNA의 프로모터/인핸서 영역을 표적화하도록 설계될 수 있다. 유전자 조정 (예를 들어, 넉다운)은 동일한 mRNA 전사체의 서로 다른 영역을 표적으로 하는 단일 siRNA나 miRNA 또는 다중 siRNA나 miRNA (즉, 풀)를 (세포 내로) 도입함으로써 달성될 수 있다. 합성 siRNA/miRNA 전달은 1) 자가-전달 (미국 특허 출원 2009/0280567A1), 2) 지질-매개 전달, 3) 전기천공 또는 4) 벡터/플라스미드-기재의 발현 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다수의 방법들에 의해 달성될 수 있다. 도입된 RNA 분자는 외인성 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드로 지칭될 수 있다.
RNAi 경로를 이용하는 또 다른 유전자 표적화 시약은 작은 헤어핀 RNA를 포함하며 이는 shRNA로도 지칭된다. 예를 들어, 발현 구축물 (예를 들어, 플라스미드, 렌티바이러스)을 통해 세포에 전달되는 shRNA는, 장기(long term) 유전자 넉다운을 이용되는 프로모터의 타입에 따라 구성적 또는 조절적 방식으로 제공하는 능력을 가진다. 하나의 바람직한 구현예에서, 렌티바이러스 입자의 게놈은 대상 유전자 (또는 유전자들)를 표적으로 하는 shRNA 발현 카세트를 하나 이상 포함하도록 변형된다. 이러한 렌티바이러스는 백신 제조용 세포를 감염시킬 수 있으며, 이들의 바이러스 게놈을 숙주 게놈 내로 안정하게 통합시킬 수 있으며, shRNA(들)를 1) 구성적, 2) 조절적, 또는 (다중 shRNA가 발현되는 경우) 구성적이면서 조절적인 방식으로 발현시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 피코나바이러스 제조 능력이 증강된 세포주가 제조될 수 있다. siRNA 또는 shRNA를 이용하는 접근법은 단일 유전자의 개별 변이체 또는 다중의 밀접하게 관련된 유전자 과(family) 구성원의 개별 변이체를 표적으로 하도록 설계될 수 있다는 점에서 부가적인 이득을 가지므로 주목할만하다. 이러한 방식으로, 개별 시약은, 유사하거나 또는 중복되는(redundant) 기능 또는 서열 모티프를 가진 보다 큰 표적 컬렉션을 조정하는 데 사용될 수 있다. 당업자는, 렌티바이러스 구축물이, 클로닝된 DNA, 또는 ORF 발현 구축물을 혼입할 수도 있음을 인지할 것이다.
또 다른 구현예에서, 조정은 단백질 수준에서 이루어진다. 예로써, 유전자 기능을 단백질 수준에서 넉다운하는 것은 예를 들어, 유전자 생성물의 활성을 하향조절하거나 또는 이의 분해 속도를 증강시킬 수 있는 소분자, 펩타이드, 앱타머, 탈안정화 도메인 또는 그외 방법을 이용해 단백질을 표적화하는 것을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 많은 수단들에 의해 달성될 수 있다. 하나의 바람직한 경우에서, 예를 들어, 활성 부위에 결합하여 표적 단백질의 기능을 저해하는 소분자는 예를 들어, 세포 배양 배지에 첨가됨으로써 세포에 도입될 수 있다. 다른 예로, 표적 단백질 기능은 예를 들어, (예를 들어) 단백질-단백질 상호작용을 방지하는 펩타이드를 세포 내로 도입함으로써 조정될 수 있다 (예를 들어, Shangary et. al., (2009) Annual Review of Pharmacology and Toxicology 49:223 참조). 이러한 펩타이드는 트랜스펙션 또는 전기천공에 의해 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 발현 구축물을 통해 도입될 수 있다. 다른 예로, 펩타이드는, 1) 세포성 전달을 촉진하는 하나 이상의 모이어티를 (예를 들어, 접합(conjugation)을 통해) 첨가하거나, 또는 2) 자가-전달을 증강시키기 위해 분자를 과급(supercharging)함으로써 세포 내로 도입될 수 있다 (Cronican, J.J. et al (2010) ACS Chem. Biol. 5(8):747-52). 펩타이드를 발현시키는 기술은 펩타이드를 각각 안정화시키거나 또는 대상 위치 또는 구획으로 향하게 하기 위해, 1) 펩타이드를 스캐폴드(scaffold)에 융합시키는 것, 또는 2) 신호 서열을 부착하는 것을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 제공되는 유전자는 세이빈-2 캡시드(capsid) 항원 및 폴리오바이러스 제조를 증강시키는 유전자 넉다운을 동정하기 위해 설계된 스크린에서 동정되긴 하였지만, 실시예 부문에 제시된 작업은, 이들 표적의 조정이 다른 혈청형의 폴리오바이러스 (예를 들어, 세이빈 1, 세이빈 3) 및 장내바이러스 71의 제조 또한 증강시키는 것을 언급한다. 현재의 폴리오바이러스 백신은 3가지 혈청형 (예를 들어, 세이빈 1, 세이빈 2 및 세이빈 3, 또는 3가지 혈청형 각각의 야생형 균주)을 모두 포함하기 때문에, 백신 제조업체의 관점에서 특히 중요하다. 이러한 이유로, 부가적인 구현예는 조정되는 경우, 세이빈 1, 세이빈 3, 그외 폴리오바이러스 균주 및 장내바이러스 71로부터 유래되는 바이러스 및 항원을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 세이빈 2 폴리오바이러스 또는 세이빈 2 폴리오바이러스 항원 이외의 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원의 제조를 증강시키는 유전자 목록을 포함한다.
폴리오바이러스 제조를 증강시킨 유전자에 대한 오리지널 스크린은 HEp-2C 세포주에서 수행되었다. HEp-2C 세포는 기원이 인간이기 때문에, 오리지널 스크린은, 조정되는 경우 폴리오바이러스 제조를 증강시키는 인간 유전자를 동정하였다. 하기의 실시예 부문에 기술된 바와 같이, 입증 연구는 아프리카 그린 원숭이 신장에서 유래된 Vero 세포를 이용하였다. 일차 스크린에서 동정된 히트 또한, Vero 세포에서 폴리오바이러스 타이터를 증가시키기 때문에, 부가적인 구현예는 일차 스크린에서 동정된 것의 오소로그(ortholog)인 유전자 목록을 포함한다 (표 I). 이러한 오소로그는 폴리오바이러스 또는 폴리오바이러스 항원 제조를 비롯하여 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조를 증가시키도록 인간 또는 비-인간 세포, 세포주 또는 세포 용혈물에서 조정될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 유용한 세포 및 세포주의 예로는, 피코나바이러스의 복제를 지지하는 것으로 알려진 영장류 세포를 포함한다. 이러한 세포는 인간, 침팬지 및 원숭이 세포일 수 있다. 구체적인 예로는, WI-38, MRC-5, HEK293, PERC6, HeLa 및 아프리카 그린 원숭이 신장 세포, 예컨대 Vero 세포를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
개별적으로, 발명자들은, 표 I에 동정된 유전자 목록이 소아마비 바이러스 복제를 증가시키는 잠재적인 약물 표적이기도 함을 인지한다. 이러한 이유로, 개별적인 구현예에서, 표 I에 열거된 유전자는 피코나바이러스 복제를 증가시키도록 조정될 수 있으며, 이로써 폴리오바이러스를 비롯한 피코나바이러스의 제조를 증강시킬 수 있다. 폴리오바이러스의 복제를 증가시키도록 사용될 수 있는 소분자의 예로는, SU1489, PD98059, 레티노산, 커큐민(curcumin), ly294002, DL-TBOA (DL-트레오-β-벤질옥시아스파르트산) 및 DL-트레오-β-하이드록시아스파르트산을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
또 다른 구현예는, 하기 표에서 동정된 유전자 중 하나 이상이 피코나바이러스 복제를 증강 또는 감소시키도록 변형된 넉아웃 동물 (예를 들어, 넉아웃 마우스)을 포함한다.
또 다른 구현예는 피코나바이러스 항원 및 피코나바이러스 제조를 증강시키는 마이크로RNA (miRNA)의 목록을 포함한다. 실시예 부문에 나타낸 바와 같이, 마이크로RNA (miRNA) 모방체 스크린을 수행하여, (상향조절 시) 폴리오바이러스의 제조를 증강시키는 miRNA를 동정하였다. miRNA 모방체 스크린은 세이빈 2 폴리오바이러스 제조를 촉진시키는 다중의 숙주-코딩된 miRNA를 동정하였다. 동정된 프로바이러스 miRNA는 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9였다. miRNA miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p 및 miR-519c-3p는 대조군 세포와 비교해 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 2배 내지 4배 증가시킨다. miRNA miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9는 살아 있는 폴리오바이러스 제조를 4배 내지 12배 증가시킨다. 이들 miRNA는 개별적으로, 다른 miRNA와 조합해서, 또는 하나 이상의 단백질-코딩 유전자와 조합해서 조정되어, 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조를 강화시킬 수 있다. 이러한 miRNA 컬렉션은 폴리오바이러스 제조를 강화시키기 때문에, 마이크로RNA 저해제의 첨가는 내인성 miRNA가 존재하는 세포에서 피코나바이러스 제조를 크게 감소시키는 것으로 예상된다. 이와 같이, 또 다른 구현예는 소아마비에 대한 잠재적인 치료제로 사용될 수 있는 프로-바이러스 miRNA의 목록을 표적으로 하도록 설계된 마이크로RNA 저해제의 목록을 포함한다.
miRNA 저해제 (당해 기술분야에서 항-miR, 안타고미르(antagomir), 및/또는 블라크미르(blockmir)로도 지칭됨)는 세포에 도입되는 경우, 내인성 miRNA를 침묵화하는 조작된 뉴클레오타이드 서열이다. miRNA 저해제의 제조, 동정 및 용도는 당업자에게 알려져 있으며 일반적이다. miRNA 저해제의 예시적인 설계로는, 1) Hutvagner et al., 2004, PLoS Biol., 2:E98, 2) Meister et al., 2004, RNA 10:544-550, 3) 및 Vermeulen et al., 2007, RNA, 13:723-730에 기술된 것들을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
중요하게는, 스크린은 또한, 폴리오바이러스 항원 및/또는 바이러스 제조를 감소시키는 miRNA 모방체를 동정하였다 (실시예 및 표 IV 참조). 이와 같이, 또 다른 구현예로는, 소아마비 감염을 치료하기 위한 잠재적인 치료제로서의 항바이러스 miRNA의 목록을 포함한다. 더욱이, (예를 들어, miRNA 저해제에 의한) 이들 항바이러스 miRNA의 저해는 피코나바이러스 항원 및 바이러스 제조를 증가시키는 것으로 예상된다. 이와 같이, 또 다른 구현예는 피코나바이러스 항원 및 바이러스 제조를 촉진시키는, 항바이러스 miRNA 목록을 표적으로 하는 저해제의 목록을 포함한다. miRNA 저해제(들)가 (치료제 또는 백신 제조를 위해) 이용될 수 있는 경우, 변형 및 비-변형된 단일 부위 선형 분자, 헤어핀 구조를 혼입하는 변형 및 비-변형된 분자, 및 전체 또는 부분 miRNA 표적 부위의 콘카테머(concatemer)를 가진 변형 및 비-변형된 설계를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 설계들이 이용될 수 있다.
폴리오바이러스 제조를 증강시킨 miRNA에 대한 오리지널 스크린은 HEp-2C 세포주에서 이루어졌다. HEp-2C 세포는 기원이 인간이기 때문에, 오리지널 스크린은, 조정되는 경우 폴리오바이러스 제조를 증강시키는 인간 miRNA를 동정하였다. 하나의 종에서 확인되는 miRNA가 종종 동일하거나 또는 밀접하게 관련된 형태로 다른 종에도 존재하기 때문에, 부가적인 구현예는 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조를 증가시키도록 인간 또는 비-인간 세포, 세포주 또는 세포 용혈물에서 조정될 수 있는, 일차 스크린에서 동정된 것들의 오소로그인 miRNA 목록을 포함한다.
또 다른 구현예는 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조를 증강시키도록 변형된, 실시예에 동정된 유전자 (또는 실시예에 동정된 유전자에 대한 오소로그)를 하나 이상 가진 (인간 또는 비-인간) 세포주를 제공한다. 세포주는, i) 표 I에 기술된 유전자 (또는 이의 오소로그)에 존재하는 적어도 하나의 코딩 영역을 변형하여 코딩 영역의 발현을 감소시키는 것, ii) 표 II에 기술된 유전자 (또는 이의 오소로그)에 존재하는 적어도 하나의 코딩 영역을 변형하여 코딩 영역의 발현을 증가시키는 것, iii) miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA의 발현 증가, iv) 표 IV에 기술된 항바이러스 miRNA를 표적으로 하는 저해제, 또는 v) 이들의 조합을 포함한다. 표 I에 기술된 유전자에 존재하는 적어도 하나의 코딩 영역의 변형은 세포의 게놈에 존재하는 유전자의 변경, 또는 세포에서의 siRNA, shRNA 또는 안티센스 RNA의 존재를 통해 달성될 수 있다. 유전자의 변경으로는, 코딩 영역, 또는 코딩 영역에 작동적으로 연결된 조절 영역에서의 돌연변이를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 변형된 유전자는 세이빈 1, 세이빈 2, 및/또는 세이빈 3 제조, 또는 IPV의 제조에 사용되는 야생형 폴리오바이러스 균주의 제조를 증강시킨다. 일 구현예에서, 변형된 유전자는 EV71 제조를 증강시킨다. 바람직하게는, 세포주 및 폴리오바이러스 또는 소아마비 항원은 폴리오바이러스 백신 제조에 이용된다. 발명자들은, 세포주가 진핵생물 또는 조작된 원핵생물일 수 있음을 인지한다. 다른 예로, 세포는 자연적으로 합성 (즉, 인공적으로 생성)될 수 있다 (Gibson et al. (2010) Science 329:52-56). 세포가 진핵생물 또는 변형된 진핵생물 세포인 경우, 상기 세포는 원발성(primary) 세포, 연속(continuous) 세포, 불멸화된 세포 (세포주) 또는 줄기세포일 수 있다. 세포는 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 햄스터, 곤충 등으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 HEp-2C 또는 이의 유도체일 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 Vero 또는 이의 유도체일 수 있다.
또 다른 구현예는 본원에 기술된 세포주로부터 유래되는 세포 용혈물 (인간 또는 비-인간)을 제공한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 세포 용혈물은 바이러스 또는 바이러스 항원 제조를 증강시키도록 변형된, 실시예에서 동정된 하나 이상의 유전자 (실시예에서 동정된 유전자에 대한 오소로그)를 가진다. 바람직하게는, 변형된 유전자는 세이빈 1, 세이빈 2, 및/또는 세이빈 3 바이러스 또는 바이러스 항원 제조, 또는 IPV의 제조에 사용되는 야생형 폴리오바이러스 균주의 제조를 증강시킨다. 바람직하게는, 세포 용혈물은 폴리오바이러스 백신 제조에 이용된다.
또 다른 구현예에서, 표적 유전자 조정 시점은 다양할 수 있다. 일부 경우, 유전자 조정은 피코나바이러스 감염 전에 일어날 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 선택된 유전자 표적이 피코나바이러스 복제 또는 피코나바이러스 항원 제조에 매우 생산적인 세포 주기의 특정 단계에서 세포를 락킹하는 경우, 바이러스 감염 전에 유전자 조정을 개시하는 것이 유리할 수 있다. 다른 경우, 피코나바이러스 감염/복제 또는 항원 제조를 대상 표적 유전자의 조정 전에 개시하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주 유전자의 조정이 바이러스 복제 또는 항원 제조의 후기(later stage)에는 필수적이지만 조기 단계에서는 유해한 경우, 발명자들은, 유전자 조정이 감염 후에 개시되어야 할 것으로 고려한다. 최적화된 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조에 2가지 이상의 유전자의 조정이 필요한 경우, 유전자들 중 일부는 바이러스 감염 전에 변형될 수 있으며, 한편 나머지 유전자들은 바이러스 감염 후에 변형된다. 유전자 조정 시점과 무관하게, 복수의 방법들 (예를 들어, 조절가능한 (예를 들어, Tet-민감성) 프로모터와 함께 shRNA의 적용)이 유전자 조정의 발현 시점을 정하는 데 이용될 수 있다.
폴리오바이러스 스크린으로부터 입증된 히트에서 수행된 경로 분석 연구는 동일한 경로에 존재하는 유전자를 동정하였다. 동시에, 이들 연구는 또한, 비-중복된 경로 또는 무관한 경로에 존재하는 유전자를 동정하였다. 일부 경우, 단일 경로에 존재하는 2 이상의 유전자를 표적으로 하는 것은 상가작용 또는 상승작용 효과를 제공할 수 있다. 다른 경우, 무관한 경로에 존재하는 2 이상의 유전자를 표적으로 하는 것은, 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 제조를, 임의의 단일 유전자 (또는 경로)의 조정에 의해 달성되는 것을 능가할 정도로 유의미하게 증가시킬 수 있다. 더욱이, 일부는 동일한 경로에 존재하지만 다른 것들은 무관한 경로에 존재하는 유전자의 조정의 조합은 바이러스 및/또는 바이러스 단백질 제조를 증가시킬 수 있다. 이러한 이유로, 개별적인 구현예에서, 본원에서 동정된 2가지 이상의 유전자는 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조에 상가작용 또는 상승작용 효과를 제공하도록 조정될 수 있다. 이러한 경우, 상기 기술되거나 또는 현재나 미래에 생명 과학분야의 과학자들에 의해 이용되는 방법/기술 중 임의의 것은 2가지 이상의 유전자를 조정하도록 이용될 수 있다.
스크린 동안, 소정의 숙주-코딩된 유전자의 넉다운은 소아마비 바이러스 복제를 감소시킨 것을 관찰하였음을 주지해야 한다 (표 II). 이와 같이, 일 구현예에서, 발명자들은, 표 II에 열거된 유전자 중 하나 이상의 과발현은 피코나바이러스 또는 피코나바이러스 항원 제조를 또한 증강시킬 수 있다고 고려한다. 표 II에 열거된 유전자의 과발현은, 유전자 복사체 수를 증가시키는 것 (즉, 클로닝된 DNA 또는 ORF 발현 구축물을 도입하는 것), 프로모터 강도를 증가시키는 것, 후생적 변형을 변경하는 것, mRNA 분해를 감소시키는 것, 단백질 기능을 증강시키는 것, 또는 mRNA, 단백질, 단백질 도메인 또는 펩타이드를 세포 내로 트랜스펙션시키는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 중요하게는, 표 II에 열거된 유전자(들)의 과발현은 표 I에 열거된 하나 이상의 유전자를 하향조절하는 것과 동시에 수행될 수 있다.
개별 구현예에서, 본 발명은 조정된 유전자 또는 유전자 생성물을 하나 이상 포함하는 세포 또는 세포 용혈물이 이용되는 폴리오바이러스 백신과 같은 피코나바이러스 백신의 제조 방법을 제공한다.
개별적으로, 발명자들은, 표 II에 동정된 유전자 목록이 소아마비 바이러스 감염을 비롯한 피코나바이러스 감염에 대항하기 위한 잠재적인 치료 약물의 표적이기도 하다는 것을 인지한다. 이러한 이유로, 개별적인 구현예에서, 표 II에 열거된 유전자는 피코나바이러스 복제를 감소시키도록 조정될 수 있으며, 그로 인해 감염, 및 피코나바이러스 감염과 관련된 증상을 감소시킬 수 있다. 표 II의 유전자를 표적화하는 것은 소분자, RNAi 기술, 리보자임 (등)을 포함하는 광범위한 방법에 의해 당해 기술분야에 인지된 전달 기술을 이용해 달성될 수 있다.
폴리오바이러스의 복제를 저해하는 데 사용될 수 있는 소분자의 예로는, 릴루졸 하이드로클로라이드(Riluzole hydrochloride), 세프트리악손 다이소듐 염 헤미(헵타하이드레이트)(Ceftriaxone disodium salt hemi(heptahydrate)), 파시레오타이드(pasireotide), 란레오타이드(lanreotide), 옥트레오타이드(octreotide), ABT-089, ABT 418, 이소플루란(isoflurane), 메카마일라민(mecamylamine), 숙시닐콜린(succinylcholine), 로쿠로늄(rocuronium), 독사쿠리움(doxacurium), 미바쿠리움(mivacurium), 피페쿠로늄(pipecuronium), 라파쿠로늄(rapacuronium), 메토큐린(metocurine), 아트라쿠리움(atracurium), 시사트라쿠리움(cisatracurium), 아세틸콜린, 니코틴, D-투보쿠라린(D-tubocurarine), 아레콜린(arecoline), 엔플루란(enflurane), 판쿠로늄(pancuronium), 베쿠로늄(vecuronium), 드로트레코긴 알파(drotrecogin alfa), 옥트레오타이드(octreotide), 타플루프로스트(tafluprost), 트라보프로스트(travoprost), 이소프로필 유노프로스톤(isopropyl unoprostone), 비마토프로스트(bimatoprost), 라타노프로스트(latanoprost), 다이곡신(digoxin), 오메프라졸(omeprazole), 에타크린산(ethacrynic acid), 페페나진(perphenazine), 헥사-D-아르기닌, 노나-D-아르기닌 아미드, 덱스트로메토판/구아이페네신(dextromethorphan/guaifenesin), 모르핀/덱스트로메토판(morphine/dextromethorphan), 네라멕산(neramexane), 바이시파딘(bicifadine), 델루세민(delucemine), CR 2249, 베손프로딜(besonprodil), UK-240455, 케타민(ketamine), 펠바메이트(felbamate), 메만틴(memantine), 오르페나드린(orphenadrine), 사이클로세린(cycloserine), N-(2-인다닐)글리신아미드, 덱스트로메토판(dextromethorphan), 브롬페니라민/덱스트로메토판/슈도에페드린(brompheniramine/dextromethorphan/pseudoephedrine), 클로페니라민/덱스트로메토판/페닐레프린(chlorpheniramine/dextromethorphan/phenylephrine), 카르비녹사민/덱스트로메토판/슈도에페드린(carbinoxamine/dextromethorphan/pseudoephedrine), 덱스트로메토판/프로메타진(dextromethorphan/promethazine), 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실산, 엘사미트루신(elsamitrucin), T 0128, CT-2106, BN 80927, 타플루포사이드(tafluposide), TAS-103, 베타-라파콘(beta-lapachone), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 9-아미노-20-캄포테신, 루비테칸(rubitecan), 기마테칸(gimatecan), 카레니테킨(karenitecin), 오블리메르센(oblimersen), (-)-고씰폴(gossypol), 칼시포트리엔(calcipotriene), 비타민 D2, ILX-23-7553, 알렌드로네이트/콜레칼시페롤(alendronate/cholecalciferol), 2-(3-하이드록시프로폭시)칼시트리올, 베타메타손 다이프로피오네이트/칼시포트리엔, 파리칼시톨(paricalcitol), 도세칼시페롤(doxercalciferol), 콜레칼시페롤, 1-알파, 25-다이하이드록시 비타민 D3, N-부틸데옥시갈락토노지리마이신(N-butyldeoxygalactonojirimycin), N-부틸데옥시노지리마이신, 릴루졸, HuHMFG1, 라도스티길(ladostigil), 1-에틸페녹사틴 10,10-다이옥사이드, 모클로베마이드(moclobemide), 덱스트로암페타민(dextroamphetamine), 프로카인아미드(procainamide), 트라닐사이프로민(tranylcypromine), 페넬진(phenelzine), 이프로니아지드(iproniazid), 이소카르복사지드(isocarboxazid), 벤즈페타민(benzphetamine), N-(2-인다닐)글리신아미드를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 조작된 세포주를 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 적어도 하나의 피코나바이러스에 의해 감염되기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 조작된 세포주의 세포는 적어도 하나의 피코나바이러스를 포함한다. 세포는 바이러스의 제조에 사용될 수 있다. 조작된 세포주는 적절한 포장 물질에 적어도 하나의 용도에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 선택적으로, 배지와 같은 다른 시약이 포함될 수 있다. 조작된 세포주의 사용 지시사항 역시 포함될 수 있다.
본원에서, "포장 물질"이란 표현은, 키트의 내용물을 담는 데 사용되는 하나 이상의 물리적인 구조를 지칭한다. 포장 물질은 바람직하게는 멸균된 무-오염 환경을 제공하는 공지된 방법에 의해 구성되며, 튜브, 병, 바이얼, 주사기 또는 그외의 적절한 용기 수단과 같은 용기를 포함할 수 있다. 포장 물질은 조작된 세포주가 사용될 수 있는 방법을 지시하는 라벨을 가진다.
예시적인 구현예
구현예 1. 조작된(engineered) 세포주로서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 1로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 감소를 포함하며, 코딩 영역은 ZNF205, CNTD2, SEC61G, ETS1, TAF1L, MCCD1, LY6G6C, BTN2A1, GLXP3, GCGR, EP300으로부터 선택되는, 조작된 세포주.
구현예 2. 조작된 세포주로서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 1로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 감소는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
구현예 4. 구현예 1 또는 2에 있어서, 발현의 감소는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
구현예 5. 구현예 1 또는 2에 있어서, 세포가 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 6. 구현예 1 또는 2에 있어서, 세포가 코딩 영역의 발현을 감소시키는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 7. 구현예 5에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오타이드가 RNA 폴리뉴클레오타이드인, 조작된 세포주.
구현예 8. 구현예 7에 있어서, RNA 폴리뉴클레오타이드가 siRNA, shRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드인, 조작된 세포주.
구현예 9. 구현예 1 또는 2에 있어서, 세포가, 발현을 감소시키는 편집된 게놈(edited genome)을 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 10. 구현예 9에 있어서, 게놈이 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(meganuclease) 또는 전사 활성자-유사 효과기(transcription activator-like effector)에 의해 편집되는, 조작된 세포주.
구현예 11. 구현예 1 또는 2에 있어서, 세포가, 표 I로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 감소, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가, 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 12. 구현예 11에 있어서, 세포가 표 I로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 13. 구현예 1 또는 2에 있어서, 세포가, 적어도 2개의 코딩 영역의 조합의 발현 감소를 추가로 포함하며, 코딩 영역의 조합은 표 VI로부터 선택되는, 조작된 세포주.
구현예 14. 조작된 세포주로서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 15. 구현예 14에 있어서, 발현의 증가는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
구현예 16. 구현예 14에 있어서, 세포가, 표 II로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 증가, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소, 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 17. 구현예 14에 있어서, 세포가 표 II로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 18. 구현예 14에 있어서, 상기 증가는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
구현예 19. 조작된 세포주로서, 조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, 세포는 내인성 miRNA 중 하나와 유사하게 거동하는 miRNA 모방체를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 21. 구현예 1에 있어서, 세포는 적어도 2개의 miRNA의 발현 증가를 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 22. 구현예 19에 있어서, 상기 증가는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
구현예 23. 조작된 세포주로서, 조작된 세포주의 세포가 대조군 세포주와 비교해 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 24. 구현예 23에 있어서, 세포가, 내인성 miRNA를 코딩하는 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 25. 구현예 23에 있어서, 세포는 내인성 miRNA의 활성을 저해하는 miRNA 저해제를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 26. 구현예 1, 구현예 2, 구현예 14, 구현예 19 또는 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포가 피코나바이러스(picornavirus)를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 27. 구현예 26에 있어서, 피코나바이러스가 폴리오바이러스(poliovirus)인, 조작된 세포주.
구현예 28. 구현예 27에 있어서, 폴리오바이러스가 세이빈 1, 세이빈 2 또는 세이빈 3으로부터 선택되는, 조작된 세포주.
구현예 29. 구현예 27에 있어서, 폴리오바이러스가 마호니(Mahoney) 또는 브룬힐데로부터 선택되는, 조작된 세포주.
구현예 30. 구현예 27에 있어서, 폴리오바이러스가 MEF-1인, 조작된 세포주.
구현예 31. 구현예 27에 있어서, 폴리오바이러스가 소케트인, 조작된 세포주.
구현예 32. 구현예 28에 있어서, 세포주의 세포가 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함하는, 조작된 세포주.
구현예 33. 구현예 26에 있어서, 피코나바이러스가 장내바이러스 71인, 조작된 세포주.
구현예 35. 구현예 1, 구현예 2, 구현예 14, 구현예 19 또는 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포주가 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주인, 조작된 세포주.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 포유류 세포주가 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개(canine) 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택되는, 조작된 세포주.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 포유류 세포주가 HEp-2 또는 Vero P인, 조작된 세포주.
구현예 38. 구현예 35에 있어서, 조류 세포주가 닭 세포주 또는 오리 세포주인, 조작된 세포주.
구현예 39. 구현예 19 또는 구현예 23에 있어서, 발현의 변화는 miRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
구현예 40. 구현예 1, 구현예 2, 구현예 14, 구현예 19 또는 구현예 23 중 어느 한 구현예에 따른 조작된 세포주의 용혈물(lysate).
구현예 41. 바이러스의 제조 방법으로서, 구현예 1, 구현예 2, 구현예 14, 구현예 19 또는 구현예 23 중 어느 한 구현예에 따른 조작된 세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는 단계; 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에, 조작된 세포주를 인큐베이션하는 단계; 및 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
구현예 42. 바이러스의 제조 방법으로서, 세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는, 단계; 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계로서, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단계; 및 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, RNA 폴리뉴클레오타이드는, siRNA, shRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA, 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 활성을 저해하는 mRNA 저해제 또는 이들의 조합인, 세포주.
구현예 44. 바이러스의 제조 방법으로서, 세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하며, 세포는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시키는 편집된 게놈을 포함하는, 단계; 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계; 및 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
구현예 45. 구현예 43에 있어서, 게놈이 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기에 의해 편집되는, 조작된 세포주.
구현예 46. 바이러스의 제조 방법으로서, 세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는, 단계; 세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계로서, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 소분자를 포함하는, 단계; 및 세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
구현예 47. 구현예 34, 구현예 35, 구현예 37 또는 구현예 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 바이러스가 피코나바이러스인, 방법.
구현예 48. 구현예 47에 있어서, 피코나바이러스가 폴리오바이러스인, 방법.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 폴리오바이러스가 세이빈 1, 세이빈 2 또는 세이빈 3으로부터 선택되는, 방법.
구현예 50. 구현예 48에 있어서, 폴리오바이러스가 마호니 또는 브룬힐데로부터 선택되는, 방법.
구현예 51. 구현예 48에 있어서, 폴리오바이러스가 MEF-1인, 방법.
구현예 52. 구현예 48에 있어서, 폴리오바이러스가 소케트인, 방법.
구현예 53. 구현예 49에 있어서, 세포주의 세포가 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함하는, 방법.
구현예 54. 구현예 47에 있어서, 피코나바이러스가 장내바이러스 71인, 방법.
구현예 55. 구현예 34, 구현예 35, 구현예 37 또는 구현예 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포주가 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주인, 방법.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 포유류 세포주가 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택되는, 방법.
구현예 57. 구현예 56에 있어서, 포유류 세포주가 HEp-2 또는 Vero P인, 방법.
구현예 58. 구현예 55에 있어서, 조류 세포주가 닭 세포주 또는 오리 세포주인, 방법.
구현예 59. 조작된 세포를 제조하는 방법으로서, 세포의 게놈을 편집하는 분자를 세포 내에 도입하는 단계; 게놈의 편집이 발생하기에 적절한 조건하에 상기 분자를 포함하는 세포를 인큐베이션하는 단계; 편집된 게놈을 포함하는 조작된 세포를 수득하는 단계로서, 편집 결과 대조군 세포주와 비교해 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현이 감소되는 단계를 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법.
구현예 60. 구현예 60에 있어서, 세포의 게놈을 편집하는 분자가 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기인, 조작된 세포를 제조하는 방법.
구현예 61. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
구현예 62. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
구현예 63. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서, miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
구현예 64. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 예시된다. 특정 실시예, 물질, 함량 및 절차는 본원에 명시되는 본 발명의 범위 및 사상에서 광범위하게 해석되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1
일반적인 방법
HEp-2C (본 문헌에서는 "HEp-2" 세포로도 지칭됨) 및 Vero P 세포 둘 다 전파 동안에, 10% 소 혈청 (HyClone, Cat. # Sh30396.03)이 보충되고 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Cellgro, Cat. # 30-004-CI)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Cat. # Sh30243.01)에서 유지시켰다. 일차 스크리닝에 사용되는 인간 표피 세포주인 HEp-2C는 166번째 계대배양(passage)에서 단일 배치에서 유래되었다. Vero 세포 (아프리카 그린 원숭이 신장 세포)는 미국 애틀란타 소재의 질병 통제 예방 센터로부터 제공받았다 (p.12).
일차 스크린에서 HTS siRNA 트랜스펙션을 위해, On-TARGETplus (OTP)-siRNA (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products)를, 96-웰 플레이트에 웰 당 7,500개 HEp-2C 세포로 하여, 0.3% DharmaFECT4 (DF4, Thermo Fisher Scientific, Cat. No. T-2004-01s)에서 50 nM의 최종 siRNA 농도에서 HEp-2C 세포로 역 트랜스펙션(reverse transfection)하였다. 이를 달성하기 위해, DF4를 우선 무-혈청 배지 (OPTI-MEM)에서 5분 동안 희석시켰다. 그런 다음, 이 물질을 1 μM siRNA 용액을 5 ㎕로 포함하는 96-웰 배양 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음, DF4-siRNA 혼합물을 20분 동안 (실온에서) 인큐베이션한 후, 세포를 10% 소 혈청이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에 첨가하였다. 이후, 트랜스펙션된 세포를 37, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 후속해서, 배지를 제거하고, 세포를 2% 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 희석시킨 세이빈 2 폴리오바이러스 백신 균주를 사용해 MOI 0.05에서 감염시켰다. 일차 스크린을 위해, 바이러스-감염된 HEp-2C 세포를 포함하는 플레이트를 바이러스 감염 후 24시간째에 배양 인큐베이터에서 꺼낸 후, -80에 보관하였다. 각각의 플레이트는 또한, 1) siTox (Thermo Fisher Scientific, Cat. # D-001500-01-05), 2) si비-표적화 대조군 (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. D-001810-10-50), 3) VP1 &3D를 표적으로 하는 양성 대조군으로서 폴리오바이러스-특이적인 siRNA (Thermo Fisher Scientific) 및 4) 모크(mock) 대조군을 비롯한 복수의 대조군을 포함하였다.
입증 실험을 위해, Vero P 세포를 이용한 유사한 프로토콜을 후속하였다. 간략하게는, OTP-siRNA를, 웰 당 7,500개 세포로 하여, 0.3% DF4에서 50 nM의 최종 siRNA 농도에서 Vero P 세포로 역 트랜스펙션하였다. 상기와 같이, DF4를 무-혈청 OPTI-MEM에서 5분 동안 희석시킨 다음, 트랜스펙션 시약을 1 μM siRNA 용액을 5 ㎕로 포함하는 96-웰 배양 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음, DF4-siRNA 혼합물(cocktail)을 20분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, Vero P 세포를 10% 소 혈청이 보충된 DMEM에 첨가하였다. 이후, 트랜스펙션된 세포를 37, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 후속해서, 배지를 제거하고, 세포를 2% 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 희석시킨 세이빈 2 폴리오바이러스 백신 균주를 사용해 MOI 0.05에서 감염시켰다. 바이러스-감염된 Vero P 세포를 포함하는 플레이트를 배양 48시간후 꺼내었으며, ELISA 실험 전에 -80에 보관하였다.
침묵화 시약
siRNA
ON-TARGETplus siRNA (OTP-siRNA) 라이브러리 (Thermo Fisher Scientific)를 일차 RNAi 스크린에 사용하였다. OTP 침묵화 시약은 각각의 유전자를 표적화하는 siRNA 풀로서 제공된다. 각각의 풀은 개방형 해독틀(ORF)의 서로 다른 영역을 표적화하는 4개의 개별 siRNA를 포함한다.
입증 실험을 위해, OTP 풀을 포함하는 각각의 개별 siRNA를 개별적으로 시험하여, 2 이상의 siRNA가 관찰된 표현형을 발생시키는지 결정하였다. 마찬가지로, siGENOME 컬렉션 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products)으로부터 유래되며 일차 스크린에서 동정된 유전자 히트를 표적으로 하는 개별, 비-변형된 siRNA를 또한, 원하는 표현형을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 본 연구에 사용된 비-표적화 대조군은 Thermo Fisher Scientific (siGENOME NTC, Thermo Fisher Scientific, Cat. No. D-001210-10-01-05)사로부터 구매하였다.
miRNA 모방체 및 저해제
miRNA 모방체의 miRIDIAN 라이브러리 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products)를 이용하여, 폴리오바이러스 감염을 조정한 숙주-코딩된 miRNA를 동정하였다. 모방체를, DharmaFECT4를 이용한 트랜스펙션에 의해 HEp-2C 세포 내로 도입하였다.
세포 생존율 분석법 및 세포 증식 분석법
siRNA의 트랜스펙션이 세포 독성을 유도함으로써 스크린 결과에 부정적인 영향을 미치는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 ToxiLight™ 바이오분석법 (LONZA Inc.)을 일차 스크린 및 히트 입증 연구 둘 다에 포함시켰다. ToxiLight™은 배양된 포유류 세포 및 세포주에서 독성을 측정하기 위해 설계된 비-파괴성 생물발광(bioluminescent) 세포독성 분석법이다. 손상된 세포로부터의 아데닐레이트 키나아제(AK)의 방출을 정량적으로 측정하는 방법은, siRNA 트랜스펙션 후 48시간째에 배양 상층액을 평가함으로써 이용되었다. 동정된 표적 유전자의 넉다운이 세포 생장에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 본 발명자들은 CellTiter 96® 분석법 (PROMEGA Inc., Kit cat. # G3580)을 이용하여, 생존한 세포의 수를 측정하였다. CellTiter 96® 분석법은 다른 MTT 분석법과 비교해 보다 큰 신호 민감성 및 안정성을 제공하는 것으로 나타났다. 본 발명자들의 연구에서, siRNA 트랜스펙션 후 48시간 또는 72시간째에, CellTiter 96® 분석용 기질을 배양 플레이트에 직접 첨가하였다. 37에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 배양물의 흡광도를 OD495 nm에서 측정하였다.
폴리오바이러스 타입 2 ELISA
폴리오바이러스 타입 2 항원-포착 ELISA는 "샌드위치" 분석법 포맷을 이용하여 진정한(authentic) 폴리오바이러스 항원 ("D-항원")을 검출하도록 설계되었다. 간략하게는, 폴리오바이러스 타입 2-특이적인 마우스 모노클로날 항체 (HYB294-06, Thermo Scientific/Pierce)를 pH 9.6의 0.05 M 탄산염-중탄산염 완충액에서 1:500으로 희석시켰다. 그런 다음, 희석된 항체 50 ㎕를 Immunlon 2HB 고-결합성 96-웰 플레이트 (NUNC, Inc.)에 분배한 다음, 4, 모이스트 챔버에서 16시간 동안 (밤새) 인큐베이션하였다. 그런 다음, 항체-코팅된 플레이트를 0.05% Tween-20이 보충된 pH 7.2의 인산염-완충 식염수(PBS-T)를 사용해 4회 세정하고, 블라킹 완충액(blocking buffer) (0.5% 젤라틴 및 0.25% Tween-20을 포함하는 PBS, 37에서 60분) 100 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이 플레이트를 PBS-T를 사용해 4회 세정하였다. 샘플을 siRNA로 처리한 다음 폴리오바이러스로 24시간 동안 감염시키는 siRNA Hep-2C 스크린에서, 상층액 50 ㎕를 항체-코팅된 플레이트의 각 웰에 첨가하였으며, 37, 모이스트 챔버에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 PBS-T를 사용해 4회 세정하고, HRP-접합된 모노클로날 항체 (HYB 293-06, 1:1000 희석) 50㎕와 37, 모이스트 챔버에서 60분 동안 인큐베이션하였다. PBS-T를 사용해 4회 더 세정한 후, 기질 (SureBlue Reserve, Kirkegaard and Perry Laboratories, 50-85-31) 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, TMB BlueSTOP 용액 (Kirkegaard and Perry Laboratories, 50-85-31) 50 ㎕를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 그런 다음, 플레이트를 620 nm의 파장에서 분광광도계로 평가하였다.
세이빈 1 및 세이빈 3 시험을 위해, 다양한 유전자를 표적으로 하는 siRNA로 트랜스펙션시킨 Vero 세포를 세이빈 1 또는 세이빈 3 바이러스로 감염시켰다. 후속해서, 상기와 같이 상층액을, 적절하다면 포착 및 접합 단계에서 타입 2-특이적인 항체에 대해 치환된, 폴리오바이러스 타입 1 (NBP1-05101, Novus Biologicals) 또는 폴리오바이러스 타입 3 (HYB 300-06, Thermo Scientific/Pierce)에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 ELISA에 의해 시험하였다.
HTS 스크리닝에 사용되는 데이터 분석 방법
품질 관리는 Z'-인자를 사용해 평가하였으며, 여기서, 0.5 내지 1.0의 Z'-인자 스코어는 매우 강력한(robust) 분석을 의미하며, 0 내지 0.5의 스코어는 허용가능한 것으로 여겨진다 (Zhang et al. (1999) J. Biomol Screen 4(2): 67-73 참조). 데이터는 전체 플레이트에 대해 정상화하여(normalized), 본 발명자들은 데이터의 평균 (μ)을 0으로 설정하고 표준 편차(SD)를 1로 설정할 수 있다. 일차 스크린으로부터의 양성 히트는 Z-스코어에 의해 스코어링된다.
플라크 및 세포 배양 감염 용량(Cell Culture Infective Dose; CCID50) 분석법
CCID50 및 플라크 분석법을 수행하여, 살아 있는 바이러스 제조에 미치는 유전자 넉다운의 효과를 평가하였다. 이를 달성하기 위해, Vero 세포 (아프리카 그린 원숭이 신장 세포)를, 일차 스크린에서 동정된 유전자를 표적화하는 siRNA로 트랜스펙션시켰다. 그런 다음, 배양액을 세이빈 2 폴리오바이러스로 감염시키고, 결과적인 상층액을 CCID50 분석법 또는 HEp-2C 세포를 사용하는 플라크 분석법에서 평가하였다. 유전자 침묵화가 감염성 바이러스 입자의 양에 미치는 효과를 연구하기 위해, 50% 세포 배양 감염 용량(CCID50)을, 종점 희석법(end point dilution)에 의해 siRNA 트랜스펙션된 Vero 세포에서 제조된 세이빈-2 바이러스에 대해 측정하였다. 96-웰 포맷에서, 바이러스-함유 상층액의 10배 단계 희석액 (희석: 10-2 내지 10-9, 희석 당 11개의 복제물)을 HEp-2C 세포 (7,500/웰)와 함께 인큐베이션하였다. 각각의 플레이트에서, 8개의 바이러스-음성 세포 대조군을 포함하였다. 플레이트를 37, 5% CO2에서 5일 동안 인큐베이션한 다음, 세포 배양 배지를 제거한 후 크리스탈 바이올렛 시약으로 염색함으로써 잔존한 살아 있는 세포를 시각화하였다. CCID50은 Spearman-Karber 방법으로 계산하였다 (Kaurber G (1931) Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche. Archiv fur Experimentalische Pathologie und Pharmakologie 162:480-483). 플라크 분석법을 수행하여, 히트 유전자 침묵화가 감염성 바이러스 입자의 제조량에 미치는 효과를 측정하였다. 6-웰 포맷에서, HEp-2C 세포 단층 (포화도(confluency): 80% 내지 90%)을, siRNA 트렌스펙션된 Vero 세포로부터 유래되는 세이빈 2 바이러스-함유 상층액의 10배 단계 희석액 (10-4 내지 10-9 희석)과 함께 37에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비-표적화 siRNA로 트랜스펙션된 세포로부터 유래되는 바이러스-함유 상층액 및 폴리오바이러스 표적화 siRNA로 트랜스펙션된 세포로부터 유래되는 바이러스-함유 상층액을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 포함하였다. 이후, 세포를 아가로스로 피복(covering)시킨 후, 37, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 아가로스를 제거하고 살아 있는 세포를 포르말린-함유 크리스탈 바이올렛 시약으로 염색하여 시각화하였다. 플라크를 계수하고 그 수를 이용하여, 감염성 바이러스 입자의 양을, 선별된 상층액 1 ml 당 플라크 형성 단위로 계산하였다. 플라크 수 및 크기를 비-표적화 대조군 및 세이빈 2-표적화 siRNA를 포함하는 대조군과 비교 분석하였다.
항원 등가(Antigen Equivalency)
히트 유전자의 침묵화 발현이 제조된 바이러스의 항원성에 미치는 효과를 연구하기 위해, 마이크로중화(microneutralization) 분석법을, 폴리오바이러스 백신에 이미 노출된 개체로부터 수집한 인간 혈청 풀 및 선별된 유전자에 대한 siRNA로 트랜스펙션시킨 Vero 세포로부터 유래된 세이빈 2 바이러스를 사용해 수행하였다. 96-웰 포맷에서, 선별된 세포 상층액으로부터 유래되는 세이빈 2 바이러스의 100 CCID50을 1:8 희석에서 시작하여 1:1024까지인 항-소아마비 혈청의 2-배 단계 희석액과 조합하였다. siRNA로 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 유래되는 세이빈 2 바이러스는 대조군으로 포함하였다. 바이러스 및 혈청을 3시간 동안 인큐베이션한 다음, HEp-2C 세포를 첨가하였다. 37, 5% CO2에서 5일간 인큐베이션한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 종점 혈청 중화 타이터를 Spearman-Kaurber 식에 의해 계산하였다 (Kaurber G (1931) Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche. Archiv fur Experimentalische Pathologie und Pharmakologie 162:480-483).
실시예 2
일차 스크린 결과
상기 언급된 기술을 이용해, 프로테아제, 이온 채널, 유비퀴틴, 키나아제, 포스파타제, GPCR 및 약물 표적 컬렉션으로부터의 유전자를 포함하여 인간 게놈으로부터의 18,200개가 넘는 유전자를 (3회 중복으로) 스크리닝하여, 폴리오바이러스 복제를 증강시킨 유전자 넉다운을 동정하였다. 도 1은 일차 스크린으로부터 수득한 Z-스코어의 플롯을 도시한 것이다. 지시된 바와 같이, 총 유전자 넉다운 중 단지 소(small) 분획만이 평균으로부터의 표준 편차(SD)가 3.0 이하인 스코어를 제공하였다 (124 유전자, 스크리닝된 유전자 총수의 0.68%). 이 컬렉션에 포함된 유전자는 다중 기능성 과 (키나아제, 프로테아제, 포스파타제 등)에 걸쳐 분포되었으며, 이전에는 "항바이러스"로 동정되지 않은 표적을 상당수 포함하였다. 또한, 100개가 넘는 유전자 침묵화는 폴리오바이러스 복제를 크게 감소시킨 것으로 동정되었다. 이들 유전자는 미래에 항바이러스 약물을 발견하려는 노력에서 치료 표적의 잠재적으로 중요한 컬렉션을 나타낸다.
표 I은 128개의 유전자 넉다운을 동정한다. 총 124개의 유전자 넉다운은 평균보다 3 이상 큰 표준 편차인 ELISA 스코어를 제공하였다. 이들 유전자 중 28개는 4.0 초과의 SD를 제공하였으며, 단일 유전자는 5 이상의 SD 값을 제공하였다. 이들 유전자 중 4개는 2 내지 3의 SD를 제공하였다. 표 I은 또한, KEGG 유전자 기탁 번호 (NM_), 및 Z 스코어 값을 제시한다. 표 II는 평균보다 2 이상 낮은 SD인 ELISA 스코어를 제공한 유전자 넉다운의 목록을 동정한다.
실시예 3
풀 디콘볼루션(Pool Deconvolution) 입증 연구
일차 스크린에서 동정된 유전자 표적을 입증하는 제1 단계는, 동일한 유전자를 표적으로 하는 (그러나 비-일치하는 시드(seed) 서열, 즉 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 2-7을 가지는) 2개 이상의 개별 siRNA가 동일한 표현형을 생성하였음을 언급하는 것을 수반하였다. 이 연구를 수행하기 위해, 일차 스크린에 사용된 OTP 풀을 구성하는 4개의 siRNA를 개별적으로 시험하였다. 별도로, 동일한 유전자(들)를 표적으로 하며 siGENOME siRNA 컬렉션 (Dharmacon Products, Thermo Fisher Scientific)으로부터 유래되는 비-관련 siRNA 시약의 컬렉션을 또한 시험하였다.
입증 연구의 결과를 표 III에 제시하며, 이는 3.0 이상의 SD 값을 제공한 일차 스크린 히트 중 54% (68개 유전자)에서, 주어진 유전자를 표적으로 하는 2개 이상의siRNA가 오리지널 OTP 풀과 동일한 표현형을 유도하였음을 보여준다. 이들 발견은 이 목록의 표적 유전자의 넉다운이 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 증강시킨다는 것을 강하게 지지한다. 단일 siRNA만 잔존한 유전자에 대해 원하는 표현형을 유도하는 한편, 이러한 결과는 동정된 유전자(들)가 폴리오바이러스 감염 동안에 항바이러스 역할을 한다는 가능성을 배제하지는 못한다는 것을 주지해야 한다.
표 III. 둘 이상의 siRNA가 폴리오바이러스 복제를 증가시키는 것으로 나타난 68개 유전자의 목록. 기탁 번호는 이전의 표에 제공되어 있음.
유전자 명칭 siRNA 번호 유전자 명칭 siRNA 번호
NEDD9 7 SLC1A2 2
PKIG 6 BOLL 2
ARHGEF2 5 BTN2A1 2
EP300 5 C17orf47 2
MUC1 5 CCL7 2
RNF20 5 CDR2 2
SEC61A1 5 CNTD2 2
CHD5 4 COLEC11 2
ETS1 4 DPM2 2
IQGAP3 4 DZIP1 2
MAOA 4 FAM83D 2
ZNF205 4 GALNACT-2 2
BCL9L 3 GLRXL 2
BET1L 3 HEPN1 2
C1orf210 3 HR 2
CD300LB 3 KRTAP4-4 2
CETN1 3 MANSC1 2
CHCHD7 3 MCCD1 2
CYP1A2 3 MED31 2
IRS4 3 MELL1 2
LOC120824 3 MTX3 2
LY6G6C 3 NECAB2 2
OR10A7 3 PAGE2B 2
OR10H1 3 PATE2 2
PEAR1 3 PRAMEF8 2
RASSF4 3 SEC61G 2
SEC31B 3 SIGLEC5 2
SIN3B 3 STAU 2
SLC39A14 3 TBC1D29 2
SPATA13 3 TMSB4Y 2
UGCG 3 TUBB8 2
VGLL2 3 VDR 2
VILL 3 ZNF135 2
YBX1 3
ZDHHC4 3
실시예 4
Vero 세포에서 살아 있는 폴리오바이러스 제조에 미치는 유전자 넉다운의 효과
일차 스크린에서 동정된 히트의 추가적인 입증으로서, CCID50 및 플라크 분석을 수행하였다. 이들 연구의 실시예 결과는 도 2 및 도 3에 도시한다. CCID50 발견 (도 2)은, 일차 스크린에서 동정된 히트 중 몇몇은 살아 있는 폴리오바이러스의 타이터를 4배 내지 27배 (4-27x)로 크게 증가시킨다는 것을 보여주었다. 이들 발견은 선행의 디콘볼루션 연구를 지지할 뿐만 아니라, 1) 동정된 유전자 넉다운이 살아 있는 바이러스 제조를 증가시키며, 2) 유전자 넉다운은, 현재 폴리오바이러스 백신 제작에 사용되는 비-인간 (Vero) 세포주에서 살아 있는 바이러스의 제조를 증가시킨다는 것을 보여준다.
플라크 분석은 CCID50 발견을 지지한다. 도 3a에 예시된 바와 같이, SLC1A2, ETS1, EP300 및 PKIG를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다중 유전자의 넉다운에 의해, 바이러스 제조가 크게 증가되며, 이는 바이러스 플라크의 수로써 측정된다. 도 3b는 12개가 넘는 유전자에 대한 결과를 제공한다. 유전자 중 6개 유전자를 siRNA-매개의 넉다운 (BCL9, GLRXP3, LY6G6C, ETS1, GPR30 및 PATE2)시키면, 살아 있는 바이러스 타이터가 5배 내지 10배 (5-10x) 증가하였다. BTN2A1, SEC61A1, Collec11, Sin3B 및 SLC1A2를 포함하는 5개의 다른 유전자의 침묵화는 Vero 세포에서 살아 있는 바이러스 타이터를 10배 내지 20배 (10-20x) 증가시켰다. 주목할만하게도, 2개의 유전자 넉다운 (PKIG 및 EP300)은 플라크 분석에서 바이러스 타이터를 20배 넘게 (>20x) 증강시켰다. 전술한 바와 같이, 유전자의 기능은 히스톤 아세틸라제 (EP300), 단백질 키나아제 저해제 (PKIG), 용질 운반체 (SLC1A2) 등을 포함하는 다중 과/기능에 속한다. 종합하자면, 보고된 디콘볼루션 연구와 더불어 이들 발견은, 단일 유전자 넉다운/넉아웃이 폴리오바이러스 항원 및 복제를 유의미하게 증가시킬 수 있다는 결론을 강하게 지지한다.
실시예 5
항원 등가
히트 유전자의 침묵화 발현이 제조되는 바이러스의 항원성에 미치는 효과를 연구하기 위해, 마이크로중화 분석법을, 폴리오바이러스 백신에 이미 노출된 개체로부터 수집한 인간 혈청 풀 및 선별된 유전자에 대한 siRNA로 트랜스펙션시킨 Vero 세포로부터 유래된 세이빈 2 바이러스를 사용해 수행하였다. 96-웰 포맷에서, 선별된 세포 상층액으로부터 유래되는 세이빈 2 바이러스의 100 CCID50을 1:8 희석에서 시작하여 1:1024까지인 항-소아마비 혈청의 2-배 단계 희석액과 조합하였다. siRNA로 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 유래되는 세이빈 2 바이러스는 대조군으로 포함하였다. 바이러스 및 혈청을 3시간 동안 인큐베이션한 다음, HEp-2C 세포를 첨가하였다. 37, 5% CO2에서 5일간 인큐베이션한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 종점 혈청 중화 타이터를 Kaurber 식에 의해 계산하였다 (Kaurber G (1931) Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche. Archiv fur Experimentalische Pathologie und Pharmakologie 162:480-483).
도 4에 도시된 바와 같이, 시험한 18개의 유전자 표적 중에서, 이들 모두는 동일한 수준의 교차-반응성 또는 보다 양호한 수준의 교차-반응성을 나타낸다. 이들 발견은, 폴리오바이러스 제조를 증강시키기 위해 siRNA로 변형시킨 백신 세포주는, 폴리오바이러스에 이미 노출된 개체로부터 취한 혈청에 존재하는 항체에 의해 인지되는 바이러스 입자를 생성한다는 주장(notion)을 지지한다 (즉, 항원 등가).
실시예 6
세이빈 1 및 세이빈 3 연구
3개의 폴리오바이러스 백신 (세이빈) 균주의 악성 부모(parental) 균주는 LSc/2ab (혈청형 1), P712 (혈청형 2) 및 Leon (혈청형 3)이다. 세이빈 1은, 이를 부모 LSc/2ab 바이러스로부터 구별하는 뉴클레오타이드 치환기를 57개 가진다. 마찬가지로, 세이빈 2 및 세이빈 3은 각각 P712 및 Leon 균주로부터 구별되는 뉴클레오타이드 치환기를 (각각) 2개 및 10개로 가진다.
현재의 백신은 3가지 감쇠된 혈청형 (세이빈 1, 2, 및 3)을 모두 가지기 때문에, 본 발명자들은, 본 발명자들의 세이빈 2 일차 스크린에서 동정된 표적 유전자가 세이빈 1 및 3에 어떻게 영향을 미치는지 시험하였다. 이를 달성하기 위해, 1) 세이빈 2 스크린에서 동정되고 2) 입증된 유전자 중 21개를 표적으로 하는 siRNA를 Vero 세포 내로 도입하였다. 그런 다음, 세포를 세이빈-1 또는 세이빈 3 바이러스로 감염시키고, 후속해서 상층액을 ELISA를 이용해 평가하였다. 이들 연구의 결과는, 세이빈 1 및 세이빈 3 둘 다의 경우, 시험된 24개의 유전자 중 14개가 ELISA 흡광도 스코어를 2배 이상 증가시켰음을 보여준다 (도 5a, 5b). 두 바이러스에 대한 가장 높은 흡광도 증가 (세이빈 1 및 세이빈 3의 경우, 각각 7x 및 5x)는 ZNF205의 넉다운으로 인한 것이었다. 종합하자면, 3개의 혈청형 모두에 대해 바이러스 제조를 증가시키는 유전자 표적의 목록 간에 유의미한 중복(overlap)이 존재하기 때문에, 이들 발견은, 세이빈 2 바이러스 스크린에서 동정된 히트가 다른 피코나바이러스에도 유효(extend)할 수 있음을 보여준다.
상기 기술을 이용해, 세이빈 1 및 세이빈 3 바이러스를 사용해 플라크 분석도 수행하였다. 결과는 ELISA 분석에서 확인된 것을 지지하며, 세이빈 2 스크린에서 동정된 히트 중 몇몇은 세이빈 1 및 세이빈 3 제조 역시 상승시킨다는 것을 언급한다 (각각 도 5c 및 5d).
상기 기술을 이용해, 일차 세이빈 2 스크린에서 동정된 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 사용해 변형시킨 세포에서 제조되는 세이빈 1 및 세이빈 3 바이러스에서 항원 등가 연구를 수행하였다. 세이빈 2 항원 등가 연구에서 관찰된 바와 같이, 유전자 넉다운이 세이빈 1 및 세이빈 3 항체 타이터에 미치는 효과는 거의 없거나 전혀 없었으며 (데이터는 도시되지 않음), 이는 대상 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 사용해 변형시킨 세포에서 제조된 바이러스가 대조군 세포에서 제조된 바이러스와 구별이 불가능하다는 결론을 지지한다.
실시예 7
miRNA 모방체 스크리닝
폴리오바이러스 제조를 증강시키는 숙주-코딩된 miRNA를 동정하기 위해, HEp-2C 세포를 1,200개가 넘는 서로 다른 miRNA 모방체로 트랜스펙션시킨 다음, 세이빈 2 바이러스로 감염시켰다. 그런 다음, 결과적인 상층액을 실시예 1에 기술된 폴리오바이러스-특이적인 ELISA를 이용해 분석하였다.
siRNA 스크린 (실시예 2)에서와 같이, 총 miRNA 집단 중 단지 소 분획만이 바이러스 제조를 증강시켰다 (도 6). 살아 있는 바이러스의 제조에서 miRNA 모방체의 가치를 더 평가하기 위해, CCID50 입증 연구를 Vero 세포에서 수행하였다. 이 컬렉션으로부터, 11개의 miRNA는 폴리오바이러스 제조를 2배 이상 증강시켰다 (도 7). miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p 및 miR-519c-3p를 포함하는 5개의 유전자는 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 2배 내지 4배 증강시킨다. 6개의 miRNA (miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9)는 살아 있는 폴리오바이러스 제조를 4배 내지 12배 (4-12x) 증가시키는 것으로 나타났다. 이들 miRNA의 뉴클레오타이드 서열은 마이크로RNA 데이터베이스, mirbase.org에서 입수가능한 miR 베이스로부터 입수가능하다. 이들 miRNA는 개별적으로 사용되거나, 또는 다른 miRNA, miRNA 저해제, siRNA를 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자, 및/또는 클로닝된 DNA 또는 ORF 발현 구축물과 함께 사용되어, 폴리오바이러스 단백질 및/또는 바이러스 제조를 증가시킬 수 있다.
폴리오바이러스 항원 및 바이러스 제조를 증강시킨 다중 miRNA를 동정하는 것 외에도, 일차 miRNA 스크린은 폴리오바이러스 제조를 감소시킨 다중 miRNA를 동정하였다 (표 IV 참조). 이들 miRNA는 개별적으로 사용되거나, 또는 다른 miRNA, miRNA 저해제, siRNA를 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자, 및/또는 클로닝된 DNA 또는 ORF 발현 구축물과 함께 사용되어, 1) 치료 설정에서 폴리오바이러스 복제를 감소시키거나, 또는 2) 폴리오바이러스 감염에 대항하기 위한 치료 표적을 동정할 수 있다.
표 IV. 폴리오바이러스 항원 및 바이러스 복제를 감소시키는 miRNA 목록
miR 모방체 정상화된 Z
hsa-miR-138 -2.4403
hsa-miR-134 -2.3096
hsa-miR-509-3p -2.1850
hsa-miR-1250 -2.1730
hsa-miR-29b -2.0564
hsa-mir-3132 -2.0313
hsa-miR-7-2* -2.0278
hsa-miR-769-3p -1.9770
hsa-miR-16 -1.9572
hsa-miR-342-5p -1.8980
hsa-miR-323-5p -1.8961
hsa-mir-3140 -1.8811
hsa-miR-1909 -1.8725
hsa-miR-522 -1.8432
hsa-miR-330-5p -1.8413
hsa-miR-29c -1.8369
hsa-miR-1275 -1.8306
hsa-mir-3118-1 -1.8229
hsa-miR-29a -1.8126
hsa-mir-3661 -1.7807
hsa-miR-1255b -1.7509
hsa-miR-424 -1.7503
hsa-miR-1182 -1.7367
hsa-miR-421 -1.7236
hsa-miR-26b -1.7231
hsa-miR-129-3p -1.7159
hsa-mir-4265 -1.6974
hsa-miR-663 -1.6806
hsa-miR-544 -1.6514
hsa-miR-450b-3p -1.6297
hsa-miR-432 -1.6267
hsa-miR-523 -1.6170
hsa-miR-555 -1.5986
hsa-miR-1908 -1.5895
hsa-miR-320d -1.5835
hsa-miR-1181 -1.5697
hsa-miR-801 -1.5610
hsa-miR-924 -1.5341
hsa-miR-218-2* -1.5341
hsa-let-7d -1.5057
실시예 8
Vero 세포에서 입증된 표적에 대한 보다 광범위한 시험
HEp-2C 세포에서 폴리오바이러스 타이터를 증가시킨, 상단의(top) 29개의 유전자 침묵화를, 3개의 감쇠된 백신 균주 (세이빈 1, 세이빈 2 및 세이빈 3), 마호니 (야생형 1), 브룬힐데 (야생형 1), MEF (야생형 2) 및 소케트 (야생형 3)를 포함하는 7개의 서로 다른 소아마비 균주를 사용해 Vero 세포에서 추가적으로 입증하였다. 이를 달성하기 위해, 선택된 유전자를 표적으로 하는 개별 siRNA를, 최종 농도 50 nM에서 10% 태아 소 혈청 (FCS, Hyclone)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지 (DMEM, Hyclone)에서 Vero 세포로 역 트랜스펙션하였다. 유전자 표적 및 siRNA 서열은 표 V에 제공한다. 트랜스펙션은 DharmaFECT 4 트랜스펙션 시약 (0.35%)을 사용해 수행하였다. 모든 트랜스펙션은 3회 중복으로 수행하였다. 정량적 PCR 실험을 수행하여, 이들 실험에 사용된 siRNA 각각에 대한 유전자 침묵화의 수준을 평가하였다. 이들 실험에 대한 대조군 연구는, 1) 폴리오바이러스 캡시드 코딩 영역을 표적으로 하는 폴리오바이러스-특이적인 siRNA로 트랜스펙션시킨 세포, 및 2) 비-표적화 대조군 siRNA (NTC)를 포함하였다. 그런 다음, 세포를, siRNA 트랜스펙션 후 16시간 내지 24째에 37, 5% CO2에서 인큐베이션하고, 세포 배양 배지를 새로 교환하였다. 트랜스펙션 후 48시간째에, 세포를 2% FCS가 보충된 150 ㎕ DMEM에서 60 CCID50의 세이빈-1 바이러스 스톡(stock) (108.6 CCID50/ml), 30 CCID50의 세이빈-2 (107.3 CCID50/ml), 9.5 CCID50의 세이빈-3 (106.8 CCID50/ml), 8.4 CCID50의 야생형 1 마호니 바이러스 (107.75 CCID50/ml), 1 CCID50의 야생형 1 브룬힐데 바이러스 (107.84 CCID50/ml), 6.4의 야생형 2 MEF 바이러스 (107.63 CCID50/ml), 또는 3.8 CCID50의 야생형 3 소케트 바이러스 (107.4 CCID50/ml)로 감염시켰다. 감염되지 않은 세포를 음성 대조군으로 포함하였다. 그런 다음, 세포를 바이러스의 타입에 따라 37, 5% CO2에서 21시간 내지 36시간 동안 인큐베이션한 다음, -80에서 동결시켰다. 상층액을 사용하여, 종점 희석법에 의해 바이러스 타이터를 측정하였다. 간략하게는, 96-웰 포맷에서, 바이러스-함유 상층액의 10배 단계 희석액 (10-2 내지 10-9)을 HEp-2C 세포 (7,500/웰, 바이러스 희석액 당 11개 복제체(replicate))와 함께 37, 5% CO2에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음, CCID50을 Spearman-Kaurber 식을 이용해 모든 웰에서 세포변성 효과(cytopathic effect; CPE)를 스코어링함으로써 계산하였다. 일반적으로 허용된 0.5 log10 변량이 중복 실험에서 CCID50 값 중에서 관찰되었다는 점에서, 히트를 동정하기 위한 컷-오프(cut-off) 값은 NTC와 비교해 바이러스 타이터에서 3.16배 증가에서 설정되었다.
표 V. 도 8에서 데이터 생성에 사용된 유전자, 기탁 번호 및 siRNA 서열의 목록
후보 유전자 기탁 번호 서열 (5'-->3')
BCL9L NM_182557 AACCAGAUCUCGCCUAGCA
BTN2A1 NM_007049 GGGAGAGCGUGCCUGACAA
COLEC11 NM_024027 UGUCCAAGCUAUACAAUAA
DPM2 NM_003863 UGCCAUUCAUCGACAGUCA
CNTD2 NM_024877 AAACUGAGGUCCGGAACUU
MCCD1 NM_001011700 AAGAGUUGUUGGAGCAGCA
LY6G6C NM_025261 GGACAGCAAUGCCUGACAA
MED31 NM_016060 GUUUAGCCAACCCAAAUUA
PATE2 NM_212555 GGGUUAUGCUAUGGUGUCA
ZNF205 NM_001042428 GCGCACAACCGCACACACA
GLRXP3 NM_001123388 GAUUGGAGCUCUGCAGUAA
SEC61G NM_014302 UGAAAUUGAUCCAUAUUCC
KRTAP4-4 NM_032524 GCUGAGUUAUGGGAAGCUA
ZNF135 NM_003436 CGGAACAGCUCGGCACUUA
SEC31B NM_015490 CCUACAGGGUCACUCAGUA
SIN3B NM_015260 GCCAAGCGGUCUCUGUUCA
ACVR2B NM_001106 ACGAGAACCUGCUACAGUU
GCGR NM_000160 CCACGGAGCUGGUGUGCAA
OPN3 NM_001030011 AAAAGAAACUGGCCAAAAU
TAF1 NM_004606 CCAAGCAACUUCUACGUAA
CELSR3 NM_001407 GCCGAAAGCUAGACAAUAA
DTYMK NM_012145 GGGAACAAGUGCCGUUAAU
GPER NM_001031682 GGGUGAAGCGCCUCAGUUA
PAK1 NM_002576 UCAAAUAACGGCCUAGACA
TAF1L NM_153809 CCAAGCAACUUCUACGUAA
SLC1A2 NM_004171 GAUGAGUGCUAGAGAUGAA
ETS1 NM_005238 CAGAAUGACUACUUUGCUA
PKIg NM_007066 AGACAAGGAAGCUGGCAAC
EP300 NM_001429 GGACUACCCUAUCAAGUAA
이들 실험 결과는 도 8에서 확인된다. 도 8a는 정량적 PCR 연구로부터의 예시적인 결과를 제공한다. 확인 결과, siRNA의 트랜스펙션은 전형적으로 표적 유전자의 발현의 약 70% 이상의 넉다운을 유도한다는 것을 보여준다. 도 8b는, 침묵화 시, 상단의 히트 중 몇몇 (예를 들어, ZNF205, CNTD2 (FLJ13265이라고도 지칭됨), SEC61G, ETS1, MCCD1 (LOC401250이라고도 지칭됨), LY6G6C, EP300, BTN2A1, GLRXP3 (GLRXL로도 알려져 있음), GCGR, KRTAP4-4, TAF1)은 하나 이상의 소아마비 균주의 타이터를 유의미하게 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 9
다중유전자 넉다운이 폴리오바이러스 타이터에 미치는 효과에 대한 동정
2개의 개별 유전자의 동시적인 넉다운이 바이러스 타이터를 더 증강시키는 지 알아보기 위한 후속 연구를 위해, 실시예 8의 다중 유전자를 선별하였다. 이를 달성하기 위해, siRNA (2개의 개별 유전자를 표적으로 함) 쌍을 DharmaFECT 4 시약 (0.35%)을 사용해 최종 농도 50 nM (각각의 개별 siRNA의 경우 25 nM)에서 Vero 세포 (7,250개 세포/웰)에 역 트랜스펙션시켰다. 그런 다음, 각각의 siRNA 조합으로 트랜스펙션시킨 세포를 7개의 바이러스 (세이빈 1 (백신), 세이빈2 (백신), 세이빈 3 (백신), 마호니 (야생형 1), 브룬힐데 (야생형 1), MEF (야생형 2) 및 소케트 (야생형 3)) 각각을 이용해 (3회 중복) 시험하였다. 내부적인 실험 대조군으로서, 각각의 유전자를 표적으로 하는 개별 siRNA를 또한 각각의 플레이트에서 역 트랜스펙션시켜 (3회 중복, 25 nM), 이중 유전자 넉다운의 효과의 정확한 평가를 용이하게 하였다.
이들 연구 결과는 도 9 및 표 VI에 보고되어 있다. 도 9a 및 도 9b는 이중 유전자 넉다운 실험의 예시적인 데이터를 보여주며, 하나 이상의 폴리오바이러스 균주의 제조를 상가작용 또는 상승작용 ("*" 참조) 방식으로 유의미하게 증강시키는 다중 조합을 동정한다. 표 VI은 동시에 침묵화되는 경우, 시험된 7개의 바이러스 중 적어도 하나에 대해 1) 상승작용 효과 (즉, 2개의 개별 유전자의 넉다운 결과가 조합/첨가되는 경우, 예측되는 것보다 더 큰 수준의 바이러스 타이터 증가), 또는 2) 상가작용 효과 (개별 유전자의 효과가 조합되는 경우, 예상되는 증가와 동일하거나 또는 거의-동일한 수준의 바이러스 타이터 증가)를 유도한 49개의 유전자 조합을 동정한다. 예를 들어, 이중 넉다운 연구와 함께 수행한 개별 넉다운 실험을 토대로, ZNF205 및 EP300의 동시적인 침묵화는 MEF 타이터를, 효과가 상가작용인 경우, 약 28배 증가시키는 것으로 예상된다. 대신, 이들 2개의 유전자의 동시적인 넉다운은 MEF 타이터를 (평균적으로) 65배 증가시켰다. 마찬가지로, 개별 넉다운 실험을 토대로, EP300 + GCGR의 침묵화는, 상가작용 효과가 발생하는 경우, 소케트 타이터를 18배 증가시키는 것으로 예상된다. 대신, 이들 2개의 유전자가 동시에 침묵화된 경우, 본 발명자들은 (평균적으로) 40배 내지 45배의 증가를 관찰하였다. 이들 발견 및 다른 발견은, (침묵화 시) 폴리오바이러스 제조를 더 증강시키는, 이전에는 알려지지 않은 유전자 조합을 동정한다. 본 발명자들은, 이 목록의 유전자 중 3개 또는 4개를 침묵화하면 폴리오바이러스 제조를 보다 더 증강시킬 수 있다고 예측한다. 예를 들어, [ZNF205 + EP300 + GLRXP3] 또는 [ZNF205 + EP300 + ETS]의 조합은 폴리오바이러스 타이터를 더 증가시키는 것으로 예측된다.
표 VI. 폴리오바이러스 제조를 상가작용 또는 상승작용 방식으로 증강시키는 49가지의 유전자 조합
번호 유전자 조합
1 ZNF205+EP300
2 EP300+GCGR
3 EP300+MCCD1
4 ZNF205+BTN2A1
5 ZNF205+GLRXP3
6 ZNF205+SEC61g
7 BTN2A1+TAF1L
8 BTN2A1+GLRXP3
9 EP300+BTN2A1
10 EP300+GLRXP3
11 CNTD2+EP300
12 ZNF205+CNTD2
13 BTN2A1+ETS1
14 ZNF205+ETS1
15 ZNF205+MCCD1
16 ZNF205+GCGR
17 CNTD2+GCGR
18 CNTD2+MCCD1
19 SEC61G+ETS1
20 CNTD2+GLRXP3
21 ZNF205+TAF1L
22 ZNF205+LY6G6C
23 LY6G6C+BTN2A1
24 TAF1L+GCGR
25 GCGR+GLRXP3
26 TAF1L+ETS1
27 LY6G6C+TAF1L
28 SEC61G+GCGR
29 BTN2A1+GCGR
30 CNTD2+BTN2A1
31 CNTD2+TAF1L
32 SEC61G+MCCD1
33 EP300+ETS1
34 EP300+SEC61G
35 GCGR+ETS1
36 ETS1+GLRXP3
37 CNTD2+ETS1
38 SEC61G+TAF1L
39 LY6G6C+EP300
40 TAF1L+GLRXP3
41 LY6G6C+ETS1
42 EP300+TAF1L
43 CNTD2+SEC61g
44 ETS1+MCCD1
45 GLRXP3+MCCD1
46 SEC61G+BTN2A1
47 LY6G6C+GLRXP3
48 LY6G6C+GCGR
49 GCGR+MCCD1
실시예 10
폴리오바이러스는 피코나비리대 과의 구성원이다. 본 발명자들의 폴리오바이러스 스크린에서 동정된 히트가 피코나비리대 과에 속하는 다른 바이러스에 어떤 영향을 미치는지 시험하기 위해, 장내바이러스 71 (EV71)을 사용해 실험을 수행하였다. 이를 달성하기 위해, PV RNAi 스크린 동안에 동정된 몇몇 유전자 중 하나를 표적으로 하는 siRNA를 50 nM의 농도에서 Vero 세포 (7,200 세포/웰, 96-웰 포맷) 내로 역 트랜스펙션시켰다. 유전자 침묵화가 일어날 수 있게 하는 64시간 내지 72시간 후, 세포를 2% 태아 소 혈청이 보충된 150 ㎕ DMEM에서 3981 CCID50 (50% 세포 배양 감염 용량)의 EV71, 서브-유전형(sub-genotype) C2 (스톡 106.45 CCID50/ml)로 감염시켰다. 그런 다음, 세포를 37, 5% CO2에서 66시간 동안 인큐베이션한 다음, 후속해서 동결한 후 (-80), 배양액을 시험하여 각각의 배양액에서의 세포변성 효과(CPE)의 수준을 측정하였다. 실험은 3회 중복으로 수행하였으며, 비-표적화 대조군 siRNA (NTC), EV71 게놈을 표적으로 하는 siRNA (siEV71) 및 모크 트랜스펙션 대조군 (-siRNA)을 포함하였다.
이들 연구의 결과는, 폴리오바이러스 스크린 동안에 동정된 히트가 EV71의 제조 또한 증강시킨다는 것으로 보여준다. 도 10a에 도시된 바와 같이, MCCD1, ZNF205, GCGR 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 유전자 넉다운 중 몇몇은 세포변성 효과를 크게 증강시키며, 이는 유전자 침묵화가 EV71 바이러스 제조를 유의미하게 증가시켰다는 결론을 지지한다. 감염-후 66시간째 시점에서 수행된 부가적인 실험은 이들 결론을 지지한다 (데이터는 도시되지 않음). 또한 플라크 분석을 수행하여, 관찰된 EV71 타이터 증가를 정량화하였다. 이들 실험에서 바이러스 상층액의 1 x 105 (즉, 1/105) 희석액에서 나타난 바와 같이, ZNF205, CNTD2 및 MCCD1의 넉다운은 EV71 바이러스 입자의 수를 유의미하게 증가시킨다 (도 10b 참조). 도 10c에 도시된 막대 그래프는, CNTD2 및 MCCD1 넉다운은 바이러스 타이터를 약 10배 (10x) 증가시키지만, ZNF205의 넉다운은 타이터를 약 60배 증가시켰음을 보여준다. 폴리오바이러스를 사용한 결과를 토대로, 본 발명자들은, 이들 유전자 넉다운의 조합은 EV71 타이터를 더 증강시킬 것으로 믿는다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공개 및 전자적으로 이용가능한 자료 (예를 들어, GenBank 및 RefSeq 등에서 뉴클레오타이드 서열 제출서, 및 예를 들어, SwissProt, PIR, PRF, PDB에서 아미노산 서열 제출서, GenBank 및 RefSeq에서 함축된 코딩 영역의 번역서)에 대한 완전한 개시내용은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 공개문헌에서 참조된 보조적인 자료 (예컨대 보조적인 표, 보조적인 도면, 보조적인 물질 및 방법, 및/또는 보조적인 실험 데이터) 역시 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 출원의 개시내용과, 참조로 본 명세서에 포함된 임의의 문헌의 개시내용(들) 사이에 불일치하는 부분이 존재하는 경우, 본 출원의 개시내용이 우선시되어야 한다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 이해를 명확하게 하기 위해서만 주어진다. 불필요한 제한은 고려되지 않는다. 본 발명은 정확하게 도시되고 설명된 상세한 설명으로 제한되지 않으며, 당업자가 인지하기에 명백한 변화는 청구항에 의해 정의된 본 발명에 포함될 것이다.
다르게 언급되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용되는 성분의 양, 분자량 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 다르게 언급되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 나타낸 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 특성에 따라 다양할 수 있는 근사치이다. 적어도 그리고 청구항의 범위에 대한 균등론을 제한하려는 시도가 아니면서, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 면에서 일상적인 어림수 기법(rounding technique)을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위에 설정된 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 나타낸 수치는 가능한 한 정확하게 보고되었다. 그러나, 모든 수치는 본래 각각의 시험 측정 시 확인되는 표준 편차로 인한 범위를 포함한다.
모든 제목은 독자의 편의를 위한 것이며, 명시되지 않는 한, 제목에 뒤따르는 내용의 의미를 제한하기 위해 사용되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Georgia Research Foundation, Inc. The Government of the United States of America, represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. KARPILOW, Jon M. OBERSTE, Mark S. TRIPP, Ralph A. TOMPKINS, Stephen M. <120> CELL LINES FOR VIRUS PRODUCTION AND METHODS OF USE <130> 235.02190201 <140> PCT/US2014/014813 <141> 2014-02-05 <150> US 61/885,357 <151> 2013-10-01 <150> US 61/760895 <151> 2013-02-05 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 1 aaccagaucu cgccuagca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 2 gggagagcgu gccugacaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 3 uguccaagcu auacaauaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 4 ugccauucau cgacaguca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 5 aaacugaggu ccggaacuu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 6 aagaguuguu ggagcagca 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 7 ggacagcaau gccugacaa 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 8 guuuagccaa cccaaauua 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 9 ggguuaugcu augguguca 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 10 gcgcacaacc gcacacaca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 11 gauuggagcu cugcaguaa 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 12 ugaaauugau ccauauucc 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 13 gcugaguuau gggaagcua 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 14 cggaacagcu cggcacuua 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 15 ccuacagggu cacucagua 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 16 gccaagcggu cucuguuca 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 17 acgagaaccu gcuacaguu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 18 ccacggagcu ggugugcaa 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 19 aaaagaaacu ggccaaaau 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 20 ccaagcaacu ucuacguaa 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 21 gccgaaagcu agacaauaa 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 22 gggaacaagu gccguuaau 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 23 gggugaagcg ccucaguua 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 24 ucaaauaacg gccuagaca 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 25 ccaagcaacu ucuacguaa 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 26 gaugagugcu agagaugaa 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 27 cagaaugacu acuuugcua 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 28 agacaaggaa gcuggcaac 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic siRNA oligonucleotide <400> 29 ggacuacccu aucaaguaa 19

Claims (64)

  1. 조작된(engineered) 세포주로서,
    조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 1로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 감소를 포함하며,
    코딩 영역은 ZNF205, CNTD2, SEC61G, ETS1, TAF1L, MCCD1, LY6G6C, BTN2A1, GLXP3, GCGR, EP300으로부터 선택되는, 조작된 세포주.
  2. 조작된 세포주로서,
    조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 감소는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    발현의 감소는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세포가 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함하는, 조작된 세포주.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세포가 코딩 영역의 발현을 감소시키는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 세포주.
  7. 제5항에 있어서,
    외인성 폴리뉴클레오타이드가 RNA 폴리뉴클레오타이드인, 조작된 세포주.
  8. 제7항에 있어서,
    RNA 폴리뉴클레오타이드가 siRNA, shRNA 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드인, 조작된 세포주.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세포가, 발현을 감소시키는 편집된 게놈(edited genome)을 포함하는, 조작된 세포주.
  10. 제9항에 있어서,
    게놈이 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(meganuclease) 또는 전사 활성자-유사 효과기(transcription activator-like effector)에 의해 편집되는, 조작된 세포주.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세포가, 표 I로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 감소, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가, 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
  12. 제11항에 있어서,
    세포가 표 I로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    세포가, 적어도 2개의 코딩 영역의 조합의 발현 감소를 추가로 포함하며,
    코딩 영역의 조합은 표 VI로부터 선택되는, 조작된 세포주.
  14. 조작된 세포주로서,
    조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
  15. 제14항에 있어서,
    발현의 증가는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 mRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
  16. 제14항에 있어서,
    세포가, 표 II로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 코딩 영역의 발현 증가, 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소, 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
  17. 제14항에 있어서,
    세포가 표 II로부터 선택되는 적어도 5개의 코딩 영역의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 증가는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
  19. 조작된 세포주로서,
    조작된 세포주의 세포는 대조군 세포주와 비교해 miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA의 발현 증가를 포함하는, 조작된 세포주.
  20. 제19항에 있어서,
    세포는 miRNA 중 하나와 유사하게 거동하는 miRNA 모방체(mimic)를 포함하는, 조작된 세포주.
  21. 제1항에 있어서,
    세포는 적어도 2개의 miRNA의 발현 증가를 추가로 포함하는, 조작된 세포주.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 증가는 대조군 세포주와 비교해 적어도 5%인, 조작된 세포주.
  23. 조작된 세포주로서,
    조작된 세포주의 세포가 대조군 세포주와 비교해 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현 감소를 포함하는, 조작된 세포주.
  24. 제23항에 있어서,
    세포가, 내인성 miRNA를 코딩하는 코딩 영역, 또는 이 코딩 영역에 작동적으로 연결되어 있는 조절 영역에 돌연변이를 포함하는, 조작된 세포주.
  25. 제23항에 있어서,
    세포는 내인성 miRNA의 활성을 저해하는 miRNA 저해제를 포함하는, 조작된 세포주.
  26. 제1항, 제2항, 제14항, 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 피코나바이러스(picornavirus)를 포함하는, 조작된 세포주.
  27. 제26항에 있어서,
    피코나바이러스가 폴리오바이러스(poliovirus)인, 조작된 세포주.
  28. 제27항에 있어서,
    폴리오바이러스가 세이빈(Sabin) 1, 세이빈 2 또는 세이빈 3으로부터 선택되는, 조작된 세포주.
  29. 제27항에 있어서,
    폴리오바이러스가 마호니(Mahoney) 또는 브룬힐데(Brunhilde)로부터 선택되는, 조작된 세포주.
  30. 제27항에 있어서,
    폴리오바이러스가 MEF-1인, 조작된 세포주.
  31. 제27항에 있어서,
    폴리오바이러스가 소케트(Saukett)인, 조작된 세포주.
  32. 제28항에 있어서,
    세포주의 세포가 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함하는, 조작된 세포주.
  33. 제26항에 있어서,
    피코나바이러스가 장내바이러스 71(enterovirus 71)인, 조작된 세포주.
  34. .
  35. 제1항, 제2항, 제14항, 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포주가 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주인, 조작된 세포주.
  36. 제35항에 있어서,
    포유류 세포주가 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개(canine) 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택되는, 조작된 세포주.
  37. 제36항에 있어서,
    포유류 세포주가 HEp-2 또는 Vero P인, 조작된 세포주.
  38. 제35항에 있어서,
    조류 세포주가 닭 세포주 또는 오리 세포주인, 조작된 세포주.
  39. 제19항 또는 제23항에 있어서,
    발현의 변화는 miRNA의 양을 세포에서 측정함으로써 결정되는, 조작된 세포주.
  40. 제1항, 제2항, 제14항, 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포주의 용혈물(lysate).
  41. 바이러스의 제조 방법으로서,
    제1항, 제2항, 제14항, 제19항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는 단계;
    세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에, 조작된 세포주를 인큐베이션하는 단계; 및
    세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
  42. 바이러스의 제조 방법으로서,
    세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는, 단계;
    세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계로서, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단계; 및
    세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    RNA 폴리뉴클레오타이드는, siRNA, shRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 miRNA, 표 IV로부터 선택되는 내인성 miRNA의 활성을 저해하는 mRNA 저해제 또는 이들의 조합인, 세포주.
  44. 바이러스의 제조 방법으로서,
    세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하며, 세포는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 감소시키는 편집된 게놈을 포함하는, 단계;
    세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계; 및
    세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
  45. 제43항에 있어서,
    게놈이 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기에 의해 편집되는, 조작된 세포주.
  46. 바이러스의 제조 방법으로서,
    세포주를 제공하는 단계로서, 세포주의 세포가 바이러스를 포함하는, 단계;
    세포에 의해 바이러스를 제조하기에 적절한 조건하에 세포주를 인큐베이션하는 단계로서, 배지는 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 소분자를 포함하는, 단계; 및
    세포에 의해 제조되는 바이러스를 수집하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조 방법.
  47. 제34항, 제35항, 제37항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스가 피코나바이러스인, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    피코나바이러스가 폴리오바이러스인, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    폴리오바이러스가 세이빈 1, 세이빈 2 또는 세이빈 3으로부터 선택되는, 방법.
  50. 제48항에 있어서,
    폴리오바이러스가 마호니 또는 브룬힐데로부터 선택되는, 방법.
  51. 제48항에 있어서,
    폴리오바이러스가 MEF-1인, 방법.
  52. 제48항에 있어서,
    폴리오바이러스가 소케트인, 방법.
  53. 제49항에 있어서,
    세포주의 세포가 2가지 또는 3가지의 폴리오바이러스를 포함하는, 방법.
  54. 제47항에 있어서,
    피코나바이러스가 장내바이러스 71인, 방법.
  55. 제34항, 제35항, 제37항 또는 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포주가 포유류 세포주, 조류 세포주 또는 곤충 세포주인, 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    포유류 세포주가 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 개 세포주 또는 햄스터 세포주로부터 선택되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    포유류 세포주가 HEp-2 또는 Vero P인, 방법.
  58. 제55항에 있어서,
    조류 세포주가 닭 세포주 또는 오리 세포주인, 방법.
  59. 조작된 세포를 제조하는 방법으로서,
    세포의 게놈을 편집하는 분자를 세포 내에 도입하는 단계;
    게놈의 편집이 발생하기에 적절한 조건하에 상기 분자를 포함하는 세포를 인큐베이션하는 단계;
    편집된 게놈을 포함하는 조작된 세포를 수득하는 단계로서, 편집 결과 대조군 세포주와 비교해 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현이 감소되는 단계를 포함하는, 조작된 세포를 제조하는 방법.
  60. 제60항에 있어서,
    세포의 게놈을 편집하는 분자가 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 전사 활성자-유사 효과기인, 조작된 세포를 제조하는 방법.
  61. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 I로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
  62. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 II로부터 선택되는 코딩 영역의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
  63. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서, miR-520e, miR-1256, miR-520d-3p, miR-513a-5p, miR-519c-3p, miR-1270-2, miR-3187, miR-5763p, miR-22, miR-520c-3p 및 miR-9로부터 선택되는 내인성 miRNA의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
  64. 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체의 세포에서 표 IV로부터 선택되는 miRNA의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 바이러스에 감염되어 있거나 또는 바이러스에 감염될 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
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