JP7281207B2 - 肺炎球菌莢膜分解活性を有するタンパク質及び使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる2017年8月14日に出願された米国仮特許出願第62/545,094号明細書、及び2018年4月3日に出願された米国仮特許出願第62/652,046号明細書の利益を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された1R01AI123383-01A1のもと政府支援によりなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
本出願は、99キロバイトのサイズを有し、2018年8月10日に作成された表題「2018-08-10-SequenceListing-02710201_ST25.txt」のASCIIテキストファイルとして米国特許商標庁にEFS-Webを介して電子的に提出された配列表を含有する。配列表に含有される情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
遺伝子改変細胞及び細胞の使用方法が本明細書に提供される。遺伝子改変細胞は、Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質を産生し得る。Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質は、本明細書においてPn3Pアーゼタンパク質又はPn3Pアーゼと称される。Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質は、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)(Spn)のIII型莢膜多糖を分解する。この莢膜多糖は、肺炎球菌3型多糖(Pn3P)としても公知であり、血清3型(3型とも称される)肺炎球菌(S.pneumoniae)により発現される。Pn3Pの構造を図1に示す。
Pn3Pアーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドも本明細書に提供される。Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書においてPn3Pアーゼポリヌクレオチドと称される。Pn3Pアーゼポリヌクレオチドは、配列番号2、又はその一部に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有し得る。このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列のクラスの一例は、配列番号1又はその一部である。配列番号2により表されるPn3Pアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1に開示のヌクレオチド配列に限定されず、遺伝子コードの縮重の結果としてそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクラスも含むことを理解すべきである。例えば、天然に発生するヌクレオチド配列の配列番号1は、アミノ酸配列の配列番号2を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列のクラスの1つのメンバーにすぎない。選択されたタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列のクラスは大きいが有限であり、そのクラスのそれぞれのメンバーのヌクレオチド配列は、当業者により異なるヌクレオチドトリプレット(コドン)が同一のアミノ酸をコードすることが公知である標準的な遺伝子コードを参照して容易に決定することができる。
本明細書に記載のPn3Pアーゼをコードするポリヌクレオチドを有する遺伝子改変細胞も提供される。遺伝子改変されていない対照細胞と比較して、遺伝子改変細胞は、Pn3Pアーゼの産生を示し得、又はPn3Pアーゼの増加した産生を示し得る。Pn3Pアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクターとして細胞中に存在し得、又は遺伝子改変細胞のゲノムDNA、例えば、染色体又はプラスミド中に組み込むことができる。細胞は、真核細胞又は原核細胞、例えば、細菌ドメインのメンバーであり得る。
本明細書に記載のPn3Pアーゼタンパク質又はPn3Pアーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物も提供される。このような組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」としては、医薬投与と適合性である生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などが挙げられる。追加の活性剤を組成物中に取り込むこともできる。
方法も提供される。一実施形態において、方法は、本明細書に記載のPn3Pアーゼタンパク質を作製する方法である。一実施形態において、方法は、Pn3Pアーゼタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。細胞は、限定されるものではないが、Pn3Pアーゼタンパク質を産生する遺伝子改変細胞又は天然発生細胞であり得る。天然発生細胞の一例は、パエニバシラス属(Paenibacillus)株、例えば、パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352である。場合により、方法は、宿主細胞中に、Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含むベクターを導入することを含む。一実施形態において、方法は、細胞から、又は培地からPn3Pアーゼタンパク質を単離し、又は精製することを含む。Pn3Pアーゼタンパク質が、タンパク質の単離又は精製に有用な追加のアミノ酸を含む実施形態において、方法は、Pn3Pアーゼタンパク質からの追加のアミノ酸の開裂も含み得る。
本開示はまた、Pn3Pアーゼタンパク質を作製するためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含むベクターを、細胞の形質転換に十分な量で含む。一実施形態において、キットは、Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含む遺伝子改変細胞を好適な包装材料中で含む。
態様1.成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様2.コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Pn3Pアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
態様3.前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、態様1又は2の遺伝子改変細胞。
態様4.前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様1~3のいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様5.真核細胞である、態様1~4のいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様6.哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様1~5のいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様7.原核細胞である、態様1~6のいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様8.大腸菌(E.coli)である、態様1~7のいずれか1つの遺伝子改変細胞。態様9.前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様1~8のいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様10.前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様1~9にいずれか1つの遺伝子改変細胞。
態様11.態様1~10のいずれか1つの遺伝子改変細胞を含む組成物。
態様12.単離成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する組成物。
態様13.前記タンパク質が、精製されている、態様1~12のいずれか1つの組成物。態様14.単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する組成物。
態様15.前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、態様12~14のいずれか1つの組成物。
態様16.前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様12~15のいずれか1つの組成物。
態様17.薬学的に許容可能な担体を含む、態様11~16のいずれか1つの組成物。
態様18.Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有し、前記細胞は、成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する方法。
態様19.前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、態様18の方法。
態様20.前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様18~19のいずれか1つの方法。
態様21.前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、態様18~20のいずれか1つの方法。
態様22.前記タンパク質を単離することをさらに含む、態様18~21のいずれか1つの方法。
態様23.前記タンパク質を精製することをさらに含む、態様18~21のいずれか1つの方法。
態様24.前記細胞が、真核細胞である、態様18~21のいずれか1つの方法。
態様25.前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、態様18~24のいずれか1つの方法。
態様26.前記細胞が、原核細胞である、態様18~25のいずれか1つに記載の方法。態様27.前記原核細胞が、大腸菌(E.coli)である、態様18~26のいずれか1つの方法。
態様28.前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、態様18~27のいずれか1つの方法。
態様29.前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、態様18~28のいずれか1つの方法。
態様30.III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、III型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上のIII型莢膜多糖の量を、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して低減させる方法。
態様31.肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質と接触させること
を含み、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の前記沈着を、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して増加させる方法。
態様32.前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、態様30又は31の方法。
態様33.前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様30~32のいずれか1つの方法。
態様34.前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の複製に好適な条件で存在する、態様30~33のいずれか1つの方法。態様35.前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質が、単離Pn3Pアーゼタンパク質である、態様30~34のいずれか1つの方法。
態様36.前記接触が、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)を、前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、態様30~35のいずれか1つの方法。
態様37.前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、態様30~36のいずれか1つに記載の方法。
態様38.前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、対象中に存在する、態様30~37のいずれか1つの方法。
態様39.対象における感染を治療する方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様40.対象における症状を治療する方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様41.対象における定着を減少させる方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
態様42.前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、態様39~41のいずれか1つに記載の方法。
態様43.前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様39~42のいずれか1つの方法。
態様44.前記対象が、ヒトである、態様39~43のいずれか1つの方法。
態様45.治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
態様46.医薬品における使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
態様47.病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
態様48.肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質の使用。
態様49.血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物。
態様50.本明細書に記載の1つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352の肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型莢膜特異的グリコシルヒドロラーゼ遺伝子の同定
要約
「バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)Jordan32352」は、1930年代初期にニュージャージー州土壌中の腐敗性有機物から単離された。この土壌生息細菌は、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)(Spn)の3型莢膜多糖(Pn3P)を分解し得る酵素を産生した。この酵素(Pn3Pアーゼ)の初期報告は、Pn3Pによるその誘導性、及びそれについての特異性を実証した。それ以降、多数の研究はPn3Pアーゼを用いてきた一方、Pn3P生合成及びその抗原特性を調査してきた。本発明者らは、組換え発現のためにこの酵素のクローニングを着手した。本発明者らは、最初のこの細菌種のゲノムをシーケンシングし、Pn3Pアーゼ産生細菌を「パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352」として再分類した。ここで、本発明者らは、質量分析法ベースのプロテオミクスを介してPn3Pアーゼの遺伝子を同定した。本発明者らは、組換え発現のために遺伝子をクローニングし、Pn3Pの酵素的脱重合時に生成されるオリゴ糖産物を特徴付けした。本発明者らは、生存増殖3型Spnに対するPn3Pアーゼの効果を試験し、その結果、Spnのこのハイパービルレント血清型に対する潜在的な治療剤としてそれを調査することができる。
Pn3P利用は、遺伝子座中に組織化された遺伝子の発現を誘導する
本発明者らは、単一炭素源としての2%のグルコース又はPn3Pを有する最小M9培地中でPbacを培養することを開始した。Pbac増殖を、OD600nmにより14時間モニタリングして最大Pn3Pアーゼ産生を達成した(図3A)。Pbacは増殖し得、Pn3P及びグルコースを利用し得たが、セルロースを利用し得なかった。これらの培養物からの上清を20倍濃縮し、タンパク質をクーマシー染色により可視化した。Pn3P増殖条件において、約55kDaの顕著なバンドが観察された(図3B)。溶液中トリプシン消化によるこれらの試料のプロテオーム分析及びLC-MSは、両方の試料中に存在する多数のタンパク質を同定した。しかしながら、2つのタンパク質は、表1に強調されるとおり、Pn3P増殖条件において有意に濃縮された。
Pbac_3554、Pbac_3552、及びPbac_3551を大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞中でクローニングし、発現させ、どの非調節遺伝子産物がPn3Pデポリメラーゼ活性を担うかを決定した。図4Aに示される一次アミノ酸配列を有する仮想タンパク質Pbac_3551(アクセッションWP_079915027)は、トリチウム放射性同位体標識Pn3Pの急速で効率的な加水分解を実証し、それは、反応産物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した場合、より低分子量のオリゴ糖への毎分カウント数のシフトにより示される(図4B)。組換えPn3Pアーゼと非標識Pn3Pとの反応を実施し、PVDF膜上にスポットし、Pn3Pモノクローナル抗体によりプロービングした。モノクローナル抗体に対する反応性は、Pn3PのPn3Pアーゼ処理の4時間後に完全に停止された(図4C)。
Pn3Pアーゼ加水分解のオリゴ糖産物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。この加水分解は、四糖及び六糖に対応する、Superdexペプチドカラム中で後に溶出する2つの主な産物ピークを生じさせた(図5A~C)。これらのピークのアイデンティティは、エレクトロスプレーイオン化質量分析により四糖(図5B)及び六糖(図5C)として確認された。質量分析データを表2にまとめる。
この酵素的分解がエンド分解(endolytic)開裂を介して進行するか、エキソ分解(exolytic)開裂を介して進行するかを理解するため、トリチウム化Pn3P及び組換えPn3Pアーゼを使用してタイムコース実験を実施した。反応産物を、所与の時間の進行後にサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。低分子量オリゴ糖が反応中で早期に生成される(図7A)。経時的なオリゴ糖溶出容量についてのCPMの増加、及びより高分子量のポリマーについてのCPMの対応する減少の両方が、四糖及び六糖を優先的に生成するエキソ分解型開裂(図7A)を示唆する(図5A)。経時的な左側から右側へのピークの緩やかなシフトは、真のランダムなエンド分解開裂を示す。
増殖培地に添加された100μg/mlの組換え酵素を用いて3型WU2株を10時間培養して増殖3型肺炎球菌(S.pneumoniae)のPn3Pアーゼ処理の効果の評価を開始した。細胞のPn3Pアーゼ処理は、図8Aに示されるとおり、細菌増殖に対して有害な増殖効果も細胞毒性効果も実証しなかった。さらに、同等のCFU値が2時間の間隔において得られた(データ示さず)。
パエニバシラス属(Paenibacillus)は、ラテン語逐語翻訳で「ほぼバシラス属(Bacillus)」であり、16S rRNA遺伝子配列に関する系統発生分析がバシラス属(Bacillus)として既に定義された多数の株について実施されたとき、真性のバシラス属(Bacillus)種と区別されて線引きされた(6)。配列分析は、この属にソートされたいくつかの細菌株が、再割り当てを要求することを示した。この属に属する種は、水域(29)から砂漠環境(30)までの、及び温泉(31)から極寒領域(32)までの多様な生態的ニッチ(28)から得られた。多くのパエニバシラス属(Paenibacillus)種が、土壌(3、33)及び植物根環境(34)中で見出されるが、いくつかはヒト試料からも単離された(35)。パエニバシラス属(Paenibacillus)種は、種々の農業、生物医学、及び工業製品についての豊富な資源である(28)。膨大な活性を実証する細胞外酵素(36)は、種々の工業的に重要な材料の製造における用途を有する(28)。多数のこれらの種は、作物成長を促進するために農業的に適用されている効率的な窒素固定細菌である(37)。さらに、パエニバシラス(Paenibacilli)から得られた新規の抗菌ペプチド及び化合物の保護作用が実証されている(38)。
細菌株及び増殖条件
パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352(ATCC 14175)を、5%のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天(Hardy Diagnostics)上で、又は1mMのMgSO4、1mMのビオチン、1mMのチアミン、及び単一炭素源としての2%のグルコース(Sigma Aldrich)又はPn3P粉末(ATCC 172-X)を含有する最小培地(M9 Teknoba)培養物中で37℃において振盪させながら好気的に培養した。Moon Nahm氏(University of Alabama at Birmingham)からの寛大な寄贈品である肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型(WU2株)及び無莢膜誘導体(JD908)を、5%のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天(TSAB)上で、又はトッドヘヴィットブロスと0.5%の酵母エキス(THY)(BD Biosciences)中で37℃において振盪なしで好気的に培養した。
パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352を、上記の2%(w/v)の炭素源を含有する5mlの最小培地M9中で培養した。細菌培養物を対数増殖中期(OD600nm 0.6)において回収した。培養物上清を0.45μmのシリンジフィルターに通し、10Kの分子量カットオフを有するmicrosep advance遠心分離装置(Pall)を使用して1/20の培養物容量に濃縮した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより決定した。溶液中トリプシン消化を既に記載のとおり実施した(39)。簡潔に述べると、培養物上清タンパク質からの20μgのタンパク質を、10mMのDTTとのインキュベーションにより56℃において1時間還元し、次いで55mMのヨードアセトアミドによりカルボキシアミドメチル化を暗所で室温において45分間行い、次いで40mMの重炭酸アンモニウム中の1μgのシーケンシンググレードトリプシン(Promega)により37℃において一晩消化した。トリプシン消化は、1%のトリフルオロ酢酸の添加及び30分間の氷上のインキュベーションにより停止させた。C18スピンカラム(G Biosciences)を使用して得られたペプチドをクリーンアップし、乾燥させ、0.1%のギ酸中で再構成させた。200nL/分の流速における130分間にわたる1~100%の溶媒B(80%のアセトニトリル、0.1%のギ酸)からなる180分間の線形勾配を使用して15cm Acclaim(商標)PepMap(商標)RSLC C18カラム(2μmの粒子サイズ、75μm ID)上でThermo Scientific UltiMate3000システムを使用してペプチドを分離した。分離したペプチドを、Orbitrap Fusion Tribrid質量分析計(Thermo Fisher Scientific)のナノスプレーイオン源中に直接溶出させた。ステンレス鋼エミッタースプレー電圧を2200Vに設定し、イオン移動管の温度を280℃に設定した。完全なMSスキャンは、60,000の分解能におけるm/z200から2000までのOrbitrap検出を使用して取得し、衝突誘導解離(38%の衝突エネルギー)による断片化後のMS2スキャンは、Thermo Xcalibur Instrument Setup3.0を使用して「トップスピード」モードにおける最も強力なイオンについてのイオントラップで取得した。未加工スペクトルを、Proteome Discoverer1.4(Thermo Fisher Scientific)においてSEQUESTを使用してパエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352についてのRapid Annotation Server(40)(RAST)アノテートゲノムデータベースに対して検索し、完全なMSペプチドトレランスは10ppmであり、MS2ペプチドトレランスは0.3Daであった。+57.021Daの一定改変(constant modification)(システイン残基のカルバミドメチル化)、及び+15.995Daの動的改変(dynamic modification)(メチオニン残基の酸化)を検索パラメータにおいて可能とした。結果をペプチドアサインメントについて1%の偽発見率においてフィルタリングした。
Pn3P誘導遺伝子座からの転写産物発現のレベルの比較を、RT-PCRにより実施した。パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352を、上記のとおり2%(w/v)の炭素源を含有する5mlの最小培地中で培養した。3つ組の細菌培養物を対数増殖中期(OD600nm 0.6)において回収し、E.N.Z.A.細菌RNAキットを使用してRNAを精製し、次いで既に記載のとおり汚染ゲノムDNAからのRNAのTRIzol(Thermo Fisher Scientific)抽出を行った(41)。RNA純度をnanodropにより評価し、iscript CDNA合成キット(BioRad)を使用して1μgのRNAを逆転写反応に使用した。定量的リアルタイムPCRを、96ウェルプレート中で、iQ SYBRグリーンマスターミックスを用いてMyiQシステム(BioRad)上で実施した。RT-PCRにおいて使用されたプライマーを表3に列記する。反応を20μlで実施し、それは、10μlのSYBRグリーンミックス、20ngのcDNA、及び1μMのプライマーミックスからなるものであった。反応条件は、95℃で180秒間、次いで95℃で10秒間、55℃で20秒間、及び72℃の30秒間の45サイクルであった。データを16S rRNA転写産物レベルに正規化し、発現レベルの変化を、グルコース補給物を有する最小培地の培養物と比較した変化倍率として計算した。
pDONR221中へのBP反応を介するgatewayクローニング(42)(Thermo Fisher Scientific)を容易にするためのB部位を含有するオーバーハングを用いて2×platinum superfiマスターミックス(Thermo Fisher Scientific)を使用してPbac_3551(ref seq WP_079915027)、Pbac_3552(ref seq WP_079915028)、及びPbac_3554(ref seq WP_079915030.1)(予測シグナルペプチド及び終止コドンを欠く)のコード領域を、パエニバシラス属種(Paenibacillus sp.)32352ゲノムDNAから増幅させた(DNeasy血液組織キット、Qiagen)。クローニング用プライマーを表3に列記する。DH5α形質転換及びDNA配列確認後、LR-clonase反応を実施し、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞中のカルボキシ末端His6タグ付き融合タンパク質の発現用pET-DEST42(Thermo Fisher Scientific)デスティネーションベクター中に遺伝子を挿入した。pET-DEST42-「Pn3Pアーゼ」プラスミドにより形質転換させたBL21(DE3)細胞を、100μg/mlのアンピシリンが補給されたLB培地中で37℃において増殖させ、細胞密度を600nmにおける吸光度によりモニタリングした。OD600nmが0.6に達したら、細胞を25℃に移し、1mMの最終濃度までのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導し、細胞培養物を8時間インキュベートしておいた(A600が約1.1に達するまで)。細胞を遠心分離により回収した。次いで、1mg/mlのリゾチームを有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.2)中で細胞を30℃において20分間再懸濁させ、プローブを2分間超音波処理し(20秒間オン、10秒間オフの4サイクル)、17,000×gにおける遠心分離により4℃において1時間澄明化させ、0.45μmのシリンジフィルターに通した。組換えPn3Pアーゼを、Ni2+-NTA樹脂により4℃において精製し、300mMのイミダゾールにより溶出させ、PBS pH7.2中に緩衝液交換した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより決定した。ゲルdoc EZ撮影装置(BioRad)を使用してステインフリートリス-グリシンゲル(BioRad)上のタンパク質可視化することにより、純度を評価した。
トリチウム化Pn3Pアッセイ-3型莢膜多糖に対する組換え酵素活性を、2μg/mlの組換えタンパク質、又は熱殺菌対照の、PBS中の10μg/mlの3H-Pn3Pとのインキュベーションによりアッセイした。反応を、100℃において5分間加熱することにより2時間後に停止させた。反応混合物を、NGC discoverer FPLCシステム(BioRad)上のsuperdexペプチド10/300GLカラム(GE)上で分離した。1mlの分画を回収し、それぞれの分画における毎分カウント数をTri-Carb2910TR液体シンチレーション分析装置(Perkin Elmer)中でカウントした。タイムコース実験を同一の方法により分析した。
Pn3P粉末(2mg)を、100μgのPn3Pアーゼと37℃において48時間インキュベートした。反応を100℃において5分間加熱することにより停止させ、Superdexペプチド10/300GLカラム(GE)上にロードした。産物をリン酸緩衝生理食塩水中で1ml/分の流速において分離し、屈折率によりモニタリングした。分画(0.5ml)を回収し、オリゴ糖ピークを精製し、充填微細P2カラム(Biorad)上で水中に脱塩した。脱塩したオリゴを凍結乾燥させ、質量決定のためにESI-MSに供し、構造及び還元末端同定のためにNMRに供した。
TSABプレート上の新鮮肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型(WU2)及び無莢膜誘導体(JD908)コロニーを、THYブロス中で0.1のODまで接種し、上記のとおり培養した。100μg/mlのPn3Pアーゼの存在下でのWU2増殖を、OD600nmの計測により10時間の経過にわたりモニタリングした。2μg/ml、10μg/ml、又は10μg/mlの熱不活化Pn3Pアーゼの存在下で増殖させたWU2を無莢膜菌とともに6時間増殖させ、段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定した。培養物を遠心分離により回収し、PBS中で洗浄し、2%のパラホルムアルデヒド中で氷上で20分間固定し、さらに1回洗浄し、1mlのPBS中で懸濁させた。タイムコース実験のため、WU2及び無莢膜株を対数増殖中期(0.6のOD600nm)まで増殖させ、遠心分離により回収し、PBS中で洗浄し、次いで1mlのPBS中で懸濁させた。1μg/mlのPn3Pアーゼを添加し、37℃において1、2、又は4時間インキュベートした。処理した細胞を段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定し、2%のパラホルムアルデヒド中で氷上で20分間固定し、さらに1回洗浄し、1mlのPBS中で懸濁させた。
ELISAプレート(96ウェル、Nunc)を、0.1Mの炭酸塩緩衝液(pH9.0)中の5μg/mlのPn3Pにより室温において一晩コーティングした。Biotek405/LSマイクロプレートワッシャーを使用してプレートをPBS+0.1%のTween(PBS-T)20により4回洗浄した。PBS中の1%のBSAにより室温において1時間ブロッキングした後、マイクロプレートウェルを、PBS-T中のPn3P特異的抗血清と30分間プレインキュベートした固定処理細胞と室温において2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでPBS-T中のヤギ抗マウスIgG-AP(Southern Biotech #1030-04)の1:2000の希釈物と室温において2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを1Mのトリス 0.3mMのMgCl2中の2mg/mlのホスファターゼ基質(Sigma S0942)と37℃において約30分間インキュベートした。405nmにおける吸光度を、Biotek synergy H1マイクロプレートリーダー上で計測した。抗体結合の阻害パーセントを((非阻害OD405-阻害OD405)/非阻害OD405)×100により計算した。
電子顕微鏡観察を、University of GeorgiaのGeorgia Electron Microscopyコア施設により、Hammerschmidt et al.による修正方法に従って実施した(44)。処理細胞を、PBS緩衝液中の2%のグルタルアルデヒド及び0.15%のルテニウムレッド中で氷上で1時間固定し、次いで0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液により2回リンスし、1回のリンスにつき15分間であった。次いで、0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液中の1%の四酸化オスミウム中で細胞を室温において1時間固定し、次いで0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液中で2回リンスし、1回のリンスにつき15分間であった。ペレットをグレードエタノール系列(30%、50%、75%、95%、100%及び100%)中で脱水し、100%のアセトン中で2回交換し、それぞれのステップは15分間であった。次いで、ペレットに25%のスパー樹脂及び75%のアセトンを浸潤させ、2時間後に50%のスパー樹脂及び50%のアセトン、75%のスパー樹脂及び25%のアセトン、100%のスパー樹脂を連続的に浸潤させ、次いで70℃のオーブン中で24時間重合させた。試料をDiatomeダイヤモンドナイフにより60nmにおいて切片化し、スロットグリッド上にピックアップした。グリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛の液滴上で後染めし(それぞれ5分間)、染色の間にH2Oにより30秒間リンスした。JEOL JEM1011TEM(JEOL USA,Peabody,MA)を80kVにおける操作で使用して試料を顕微鏡観察した。
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肺炎球菌莢膜多糖の酵素的加水分解は、宿主防御に対して細菌を脆弱にする
要約
一世紀間の調査にもかかわらず、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)(Spn)は、多数の疾患、例えば、肺炎、髄膜炎、及び中耳炎を引き起こす主要なヒト病原体のままである。多くの莢膜形成病原体と同様、Spnの莢膜多糖(CPS)は、哺乳動物宿主における定着及びビルレンスに重要な構成成分である。この研究は、最もビルレントな血清型の1つである3型SpnのCPSを標的化するグリコシドヒドロラーゼ、Pn3Pアーゼの保護的役割を評価することを目的とした。本発明者らは、生存3型株上の莢膜を分解するPn3Pアーゼの能力を評価した。インビトロアッセイを介して、本発明者らは、Pn3Pアーゼ処理がマクロファージによる食作用及び好中球による補体媒介殺傷に対する細菌の感受性を増加させることを観察した。本発明者らは、インビボPn3Pアーゼ処理が鼻咽頭定着を低減させ、3型Spnにより引き起こされる敗血症からマウスを保護することを実証した。血清型分布のシフトの増加、薬物耐性株の上昇、及びワクチンに含まれる血清型に対する不十分な免疫応答に起因して、肺炎球菌感染を撲滅するためのアプローチを調査することが必要である。この研究は、分子、細胞及び全身レベルにおける肺炎球菌CPSと宿主との相互作用を評価し、CPSの酵素的加水分解を介してSpnにより引き起こされる疾患のための代替的な治療アプローチを提供する。
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)(Spn)は、肺炎、髄膜炎、及び中耳炎の病因であり、ヒトの健康に対して大きな脅威のままである。この細菌は、正常片利共生マイクロフローラの一部としてヒト鼻咽頭に安定的に定着し得る(1~3)。定着は感染の主な様式であり、無症候性保菌にかかわらず、疾患の開始におけるキーステップである(4、5)。ほとんどのSpn株の宿主内の生存及び完全な病原性に重要な構成成分は、莢膜多糖(CPS)である(6、7)。CPSは、細菌の表面全体をコーティングする大型の区別される多糖構造である。莢膜は、Spnが宿主マクロファージによるその食作用への抵抗又はその阻害を介して宿主免疫系を回避するのを補助する一方、粘膜媒介クリアランスも制限する(8~11)。Spnは、90個超のユニークな莢膜血清型を有し、それぞれ、単糖組成及び結合、並びに他の修飾、例えば、アセチル化が異なる(12)。細菌ビルレンス、表面接近性、及び抗原性におけるCPSの要求により、それは100年超にわたるワクチン接種研究における標的となった(12~16)。タンパク質担体への結合によるCPSを利用する肺炎球菌ワクチンの免疫原性及び効力の増加において多大な研究がなされてきた(17、18)。現在の肺炎球菌ワクチンは、ほとんどの関連臨床血清型の一部のための血清型特異的保護を提供することを目的とする(12、13)。7及び13価の肺炎球菌結合型ワクチンPCV7及びPCV13(Prevnar;Pfizer)の使用は大きな成功をおさめ;ワクチン接種及び非ワクチン接種集団の両方において侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)率を有意に軽減した(15、19~22)。
細菌株及び増殖条件
Moon Nahm氏(University of Alabama at Birmingham)からの寛大な寄贈品である肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型(WU2株)及び無莢膜誘導体(JD908)(60、61)を、5%のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天(TSAB)上で、又はトッドヘヴィットブロスと0.5%の酵母エキス(THY)(BD Biosciences)中で37℃において振盪なしで好気的に培養した。
8週齢雌BALB/cマウスをTaconic Biosciences(Hudson,NY)から入手し、University of GeorgiaのCentral Animal Facilityにおいて飼育した。マウスをマイクロアイソレーターケージ中で保持し、BSL-2フード下で取り扱った。
Pn3Pアーゼを既に記載のとおり、軽微に修正して産生した(26)。簡潔に述べると、pET-DEST42-「Pn3Pアーゼ」プラスミドにより形質転換させたBL21(DE3)細胞を、100μg/mlのアンピシリンが補給されたテリフィックブロス中で37℃において増殖させ、細胞密度を600nmにおける吸光度によりモニタリングした。OD600nmが1.0に達したら、細胞を18℃に移した。1mMの最終濃度までのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの添加によりタンパク質発現を誘導し、細胞培養物を18時間インキュベートしておいた。細胞を遠心分離により回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.2)中で再懸濁させ、圧力溶解により溶解させた。溶解物を17,000×gにおける遠心分離により4℃において1時間澄明化し、0.45μmのシリンジフィルターに通した。組換えPn3PアーゼをNi2+-NTA樹脂により4℃において精製し、300mMのイミダゾールにより溶出させ、PBS pH7.2中に緩衝液交換した。タンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイにより製造業者の説明書に従って決定した。純度をクーマシー染色により評価した。
TSABプレート上の新鮮肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)3型(WU2)及び無莢膜誘導体(JD908)コロニーを、THYブロス中で0.1のOD600nmまで接種し、上記のとおり培養した。100μg/mlのPn3Pアーゼの存在下でのWU2増殖を、OD600nmを計測することにより10時間の経過にわたりモニタリングした。2μg/ml、10μg/ml、又は10μg/mlの熱不活化Pn3Pアーゼの存在下でWU2を6時間増殖させ、段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定した。培養物を遠心分離により回収し、PBS中で洗浄し、2%のパラホルムアルデヒド中で氷上で20分間固定し、さらに1回洗浄し、1mlのPBS中で懸濁させた。タイムコース実験のため、WU2及び無莢膜株を対数増殖中期(0.6のOD600nm)まで増殖させ、遠心分離により回収し、PBS中で洗浄し、次いで1mlのPBS中で懸濁させた。次いで、1μg/mlのPn3Pアーゼを添加し、37℃において1、2、又は4時間インキュベートした。処理した細胞を段階希釈し、プレーティングしてコロニー形成単位を決定し、2%のパラホルムアルデヒド中で氷上で20分間固定し、さらに1回洗浄し、1mlのPBS中で懸濁させた。
ELISAプレート(96ウェル、Nunc)を、0.1Mの炭酸塩緩衝液(pH9.0)中の5μg/mlのPn3Pにより室温において一晩コーティングした。Biotek405/LSマイクロプレートワッシャーを使用してプレートをPBS+0.1%のTween(PBS-T)20により4回洗浄した。PBS中の1%のBSAにより室温において1時間ブロッキングした後、マイクロプレートウェルを、PBS-T中のPn3P特異的抗血清と30分間プレインキュベートした固定処理細胞と室温において2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いでPBS-T中のヤギ抗マウスIgG-AP(Southern Biotech #1030-04)の1:2000の希釈物と室温において2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを1Mのトリス 0.3mMのMgCl 2 の中の2mg/mlのホスファターゼ基質(Sigma S0942)と37℃において約30分間インキュベートした。405nmにおける吸光度を、Biotek synergy H1マイクロプレートリーダー上で計測した。抗体結合の阻害パーセントを((非阻害OD405-阻害OD405)/非阻害OD405)×100により計算した。
電子顕微鏡観察を、University of GeorgiaのGeorgia Electron Microscopyコア施設により、Hammerschmidt et al.による修正方法に従って実施した(62)。処理細胞を、PBS緩衝液中の2%のグルタルアルデヒド、2%のパラホルムアルデヒド、0.075Mの酢酸リジン及び0.075%のルテニウムレッド中で氷上で1時間固定し、次いで0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液により2回リンスし、1回のリンスにつき15分間であった。次いで、0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液中の1%の四酸化オスミウム中で細胞を室温において1時間固定し、次いで0.15%のルテニウムレッドを含有する緩衝液中で2回リンスし、1回のリンスにつき15分間であった。ペレットをグレードエタノール系列(30%、50%、75%、95%、100%及び100%)中で脱水し、100%のアセトン中で2回交換し、それぞれのステップは15分間であった。次いで、ペレットに25%のスパー樹脂及び75%のアセトンを浸潤させ、2時間後に50%のスパー樹脂及び50%のアセトン、75%のスパー樹脂及び25%のアセトン、100%のスパー樹脂を連続的に浸潤させ、次いで70℃のオーブン中で24時間重合させた。試料をDiatomeダイヤモンドナイフにより60nmにおいて切片化し、スロットグリッド上にピックアップした。グリッドを酢酸ウラニル及びクエン酸鉛の液滴上で後染めし(それぞれ5分間)、染色の間にH 2 Oにより30秒間リンスした。JEOL JEM1011TEM(JEOL USA,Peabody,MA)を80kVにおける操作で使用して試料を顕微鏡観察した。
対数増殖中期のWU2及びJD908(無莢膜)培養物を洗浄し、10μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)により室温において30分間染色した。WU2株を2μg/mlの活性又は熱不活化Pn3Pアーゼにより同時に処理した。細菌細胞ペレットを広範に洗浄し、1mlの無菌PBS中で懸濁させた。107個の細菌を、ネズミ白血病ウイルス形質転換マクロファージ系RAW264.7(American Type Culture Collection(ATCC)Manassas,VA)のコンフルエントな単層に、活性又は熱不活化幼ウサギ補体(Pel-Freez)と24ウェルプレート中で添加し、37℃において1時間インキュベートした。ウェルをPBSにより4回洗浄して細胞外細菌を除去した。マクロファージを2%のパラホルムアルデヒドにより4℃において15分間固定し、プレートから除去した。顕微鏡観察のため、細胞を、1%のウシ血清アルブミン中のビオチン化コムギ生殖系列アグルチニン(Vector labs)の1/500の希釈物と室温において30分間インキュベートし、次いでストレプトアビジンAPC(Biolegend)の1/1000の希釈物と室温において30分間インキュベートした。細胞を40倍の対物レンズにより画像化した。フローサイトメトリーをBeckman Cytoflex Sサイトメーター上で実施し、FlowJoにより分析した。細胞を散布プロットによりマクロファージ集団に対してゲーティングした。非CFSE標識対照は、高蛍光性の細胞集団をゲーティングするために機能した。Pn3Pアーゼ用量依存的実験を活性補体の添加により上記のとおり実施した。
補体沈着アッセイを既に記載のとおり実施した(63)。細菌の3型WU2及び無莢膜(JD908)株をPBS中の3%のBSA中で再懸濁させた。アリコート(96ウェル丸底プレート上の2つ組のウェル中)をHoechst33342により染色し、5又は50μg/mlにおける不活化又は機能的Pn3Pアーゼにより37℃において1時間処理した。正常マウス血清(1:10希釈物)を試料に37℃において30分間添加した。細胞を洗浄し、マウス補体に対するFITC結合ヤギ抗体(MP BioMedical,Santa Ana,CA)により4℃において30分間染色した。試料をPBS中の3%のPBSにより洗浄し、2%のパラホルムアルデヒド中で再懸濁させて固定した。次いで、試料をフローサイトメトリーにより分析した。FITC-Aの平均蛍光強度(MFI)をHoechst陽性細胞のゲーティングから計算した。
オプソニン食作用殺傷アッセイを既に記載のとおり、修正して実施した(43)。簡潔に述べると、3型WU2及び無莢膜(JD908)株を、96ウェル丸底プレートの2つ組ウェル中で、オプソニン化緩衝液B(OBB、Ca++/Mg++を有する無菌1×PBS、0.1%のゼラチン、及び5%の熱不活化FetalClone)中でPn3Pアーゼ(5又は50ug/mlの濃度における不活化又は機能的)を用いて又は用いずに37℃において1時間又は4時間インキュベートした。ヒト前骨髄球性白血病細胞系、HL-60(ATCC Manassas,VA)を、10%の熱不活化FetalClone(HyClone)及び1%のL-グルタミンを有するRPMI中で培養した。0.6%のN,N-ジメチルホルムアミド(DMF、Fisher)を使用してHL-60細胞を3日間分化させてからOPAアッセイを実施し、回収し、OBB中で再懸濁させた。活性又は熱不活化(補体なし)幼ウサギ補体(Pel-Freez)を、HL-60細胞に1:5の最終容量において添加した。HL-60/補体混合物を血清/細菌に5×105個の細胞/ウェルにおいて添加した(対照については、HL-60/補体を添加せず;代わりに等容量のOBB緩衝液を添加した)。最終反応物を37℃において1時間インキュベートした。試料を氷上で約20分間インキュベートすることにより反応を停止させた。次いで、10μlのそれぞれの反応物を50μlの最終容量に希釈し、2つ組で血液寒天プレート上にプレーティングした。プレートを嫌気的条件下で30℃において一晩インキュベートし、翌日カウントした。生存パーセントを、対照試料(HL-60細胞を有さない反応物、100%の生存率)について得られた平均値に正規化されたそれぞれの2つ組の反応物として計算した。
鼻腔内定着を、本質的にPuchta et al(64)により記載のとおり実施した。対数増殖中期WU2培養物を無菌PBSにより洗浄し、108CFU/ml又は106CFU/10μlの濃度において懸濁させた。5~10匹の無麻酔8週齢雌BALB/cマウス(Taconic)の群に、既に記載のとおり106CFU/10μlを鼻腔内接種した。マウスに、0.3、及び7日目にビヒクルとしての10μlのPBSを接種し、又は0、0及び3、若しくは0、3、及び7日目に10μlのPBS中の50μgのPn3Pアーゼを投与することにより処理した。気管中への25ゲージ針の挿入により鼻咽頭をPBSにより流出させて鼻孔を介して500μlを排出させることにより鼻腔洗浄液を10日目に得た。鼻腔洗浄液の段階希釈物を、5%のヒツジ血液を有するトリプトンソイ寒天(TSAB)上にプレーティングしてコロニー形成単位を計数した。サンドイッチELISA(BiolegendマウスELISA MAX)を製造業者の説明書に従って実施して洗浄液中のIL-6及びTNFαサイトカインレベルを決定した。
対数増殖中期WU2培養物を無菌PBSにより洗浄し、5×103CFU/100μLの濃度において懸濁させた。4匹の無麻酔8週齢雌BALB/cマウス(Taconic)の群に、5×103CFUを腹腔内(I.P.)注射した。対照マウスには、0時間において又は感染直後に100μLのPBS中の5μgの熱不活化Pn3PアーゼをI.P.注射した。処理マウスには、感染の0、12、又は24時間後に100μLのPBS中の0.5μg又は5μgのPn3PアーゼをI.P.投与した。動物を12時間ごとにモニタリングした。
Pn3Pアーゼは、増殖3型Spnから莢膜を除去する
莢膜形成3型WU2株を、増殖培地に添加された組換え酵素と10時間培養し、細菌増殖を、600におけるODを計測することによりモニタリングして増殖3型Spnに対するPn3Pアーゼ処理の効果を評価した。細胞のPn3Pアーゼ処理は、細菌に対して有害な増殖効果も細胞毒性効果も実証しなかった(図9A)。同一実験において、本発明者らは、2時間間隔において酵素処理及び非処理群の両方について同等のCFU値を得た(データ示さず)。細菌生存率に対する酵素処理の直接的な影響を評価するため、対数増殖期培養物を単離し、活性、又は熱不活化Pn3Pアーゼを有する栄養素不含緩衝液中で懸濁させた。酵素処理細胞は、8時間のタイムコースにわたり不活化及びPBS対照と同等のカウント数を示した(図9B)。
CPSの主要なビルレンス機序は、宿主食細胞による食作用に抵抗する能力を細菌に提供することである(1、6)。インビトロでのマクロファージによる取り込みに対するPn3Pアーゼ処理の効果を調査するため、本発明者らは、対数増殖中期細菌培養物をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)により染色し、次いでPn3Pアーゼにより処理し、次いでRAW264.7マクロファージとインキュベートした。次いで、マクロファージを広範に洗浄し、蛍光顕微鏡観察により画像化した(図11A)。マクロファージによる細菌取り込みの程度をフローサイトメトリーにより定量した。酵素により処理した細菌は、莢膜形成株よりも有意に多くマクロファージにより取り込まれた。次いで、本発明者らは、蛍光細菌の食作用を表す蛍光マクロファージの割合を決定した(図11C~D)。熱不活化Pn3Pアーゼとインキュベートした莢膜形成3型株は、最小の蛍光標識食細胞を有した一方、Pn3Pアーゼ処理細菌は、無莢膜突然変異株と同程度で効率的にマクロファージにより取り込まれた。取り込みは、補体の存在下でのより高度な細菌取り込みにより証明されるとおり、補体に部分的に依存的であった(図11C)。Pn3Pアーゼ処理は、用量依存的に細菌をRAWマクロファージによる食作用の飲み込みに対してより感受性とした一方、さらに高用量の不活化酵素は、細菌取り込みに対して有意な効果を有さなかった(図11D)。
インビボで酵素の保護能を調査するため、本発明者らは最初に、BALB/cマウスを用いる鼻腔内定着実験を実施した。Spnによる鼻腔定着は、侵襲性肺炎球菌疾患への移行に不可欠である(4、5)。この株の莢膜は、鼻腔内定着に要求されることが確立されている(6)。したがって、本発明者らは、鼻腔定着モデルを使用し、定着3型株の莢膜の除去を介して鼻咽頭中の細菌定着を低減させるPn3Pアーゼの能力を評価した。本発明者らは最初に、無莢膜突然変異体JD908が、鼻咽頭に定着し得ないことを確認した(データ示さず)。次いで、マウスの群に、10μlのPBS中の106個の対数増殖期の野生型(wt)莢膜形成細菌を鼻腔内接種した。全ての接種材料に、Pn3Pアーゼ又は緩衝液対照のいずれかを追加した。群に0日目、0及び3日目、又は0.3、及び7日目のいずれかで酵素を投与して複数回投与の効果を評価した。10日目にマウスを麻酔し、細菌負荷を定量した。鼻腔洗浄液を得、段階希釈し、プレーティングして細菌負荷を計数した。ビヒクル対照処理マウスは、単一用量のPn3Pアーゼのみにより処理したマウスよりも有意に高い細菌負荷で定着された。2回又は3回用量のPn3Pアーゼの投与により、動物洗浄液の大多数がいかなる生存細菌コロニーも欠いた(図14A)。肺ホモジネート及び血清試料は、細菌負荷の証拠を示さなかった(データ示さず)。シグネチャー炎症促進性サイトカインレベルを鼻腔洗浄液中でELISAにより計測した(52)。ビヒクル対照マウスは、Pn3Pアーゼ処理動物と比較して有意に増加したサイトカインIL-6及びTNFαのレベルを有し、それはこの群における細菌負荷に対する継続した宿主炎症応答を反映した(図14B~C)(52)。IL-6及びTNFαの有意な低減は、0日目の単一用量のPn3Pアーゼの後でも、ほとんどの動物において観察された。単一用量群におけるより高い細菌負荷を有するマウスは、この群における増加したサイトカインレベルに寄与した。
Pn3Pアーゼをその保護能についてさらに評価し、治療剤としてのPn3Pアーゼの有用性を評価するため、本発明者らは、腹腔内(I.P.)敗血症モデルを用いた(53、54)。マウスの群に、5×103CFUの対数増殖期のSpnのWU2の3型株を感染させた。本発明者らは、感染の0時間、12、又は24時間後に投与された5μg又は0.5μgの単一用量の効果を評価した。熱不活化酵素により処理した対照群は、感染の48時間以内に死亡した。酵素用量又は投与のタイミングにかかわらず、全ての処理群は疾病の徴候を示さず、I.P.チャレンジからの完全な保護が認められた(図15)。
この試験は、病原性細菌、血清3型SpnのCPSを標的化する炭水化物分解酵素(グリコシドヒドロラーゼ)、Pn3Pアーゼの保護的役割を評価することを目的とした。Spnにより引き起こされる侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、ヒト健康に対して大きな脅威であり、驚くべき死亡率を伴う。世界的なワクチン接種プログラム及び抗生物質の使用にかかわらず、Spnは、世界規模で史上最悪の感染因子のままである。肺炎球菌ワクチンは経験的に作製され、特に高齢及び免疫減衰個体間で免疫原性が変動し/不十分である。IPDに対する抗生物質の広範な使用は、薬物耐性肺炎球菌株の拡散をもたらした(34、35)。この研究は、IPDに対する現行のワクチン及び抗生物質による解決策の欠点に対する代替的な標的化治療アプローチを提供する。
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本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
(項目2)
コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞であって、前記コード領域は、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する遺伝子改変細胞。
(項目3)
前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、項目1又は2に記載の遺伝子改変細胞。
(項目4)
前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目3に記載の遺伝子改変細胞。
(項目5)
真核細胞である、項目1又は2に記載の遺伝子改変細胞。
(項目6)
哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、項目5に記載の遺伝子改変細胞。
(項目7)
原核細胞である、項目1又は2に記載の遺伝子改変細胞。
(項目8)
大腸菌(E.coli)である、項目7に記載の遺伝子改変細胞。
(項目9)
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、項目1又は2に記載の遺伝子改変細胞。
(項目10)
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、項目9に記載の遺伝子改変細胞。
(項目11)
項目1又は2に記載の遺伝子改変細胞を含む組成物。
(項目12)
単離成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する組成物。
(項目13)
前記タンパク質が、精製されている、項目12に記載の組成物。
(項目14)
単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する組成物。
(項目15)
前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、項目12又は14に記載の組成物。
(項目16)
前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目15に記載の組成物。
(項目17)
薬学的に許容可能な担体を含む、項目12又は14の組成物。
(項目18)
Pn3Pアーゼ活性を有するタンパク質の発現に好適な条件下で細胞をインキュベートすること
を含む方法であって、前記細胞は、コード領域を含むポリヌクレオチドを含み、前記コード領域は、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有し、前記細胞は、前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する方法。
(項目19)
前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記細胞が、遺伝子改変細胞であり、前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドである、項目18に記載の方法。
(項目22)
前記タンパク質を単離することをさらに含む、項目18~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記タンパク質を精製することをさらに含む、項目18~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記細胞が、真核細胞である、項目18~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記細胞が、原核細胞である、項目18~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記原核細胞が、大腸菌(E.coli)である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、項目18~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質と接触させること
を含む方法であって、前記接触を、III型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で行い、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上のIII型莢膜多糖の量を、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して低減させる方法。
(項目31)
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の沈着を増加させる方法であって、
III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質と接触させることを含み、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の前記沈着を、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して増加させる方法。
(項目32)
前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、項目30又は31に記載の方法。
(項目33)
前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の複製に好適な条件で存在する、項目30又は31に記載の方法。
(項目35)
前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質が、単離Pn3Pアーゼタンパク質である、項目30又は31に記載の方法。
(項目36)
前記接触が、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)を、前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞に曝露させることを含む、項目31又は32に記載の方法。
(項目37)
前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記Pn3Pアーゼタンパク質と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、項目31又は32に記載の方法。
(項目38)
前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、対象中に存在する、項目31又は32に記載の方法。
(項目39)
対象における感染を治療する方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
(項目40)
対象における症状を治療する方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有し、又は有するリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
(項目41)
対象における定着を減少させる方法であって、
Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む有効量の組成物を、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)が定着しており、又は定着しているリスクがある対象に投与すること
を含む方法。
(項目42)
前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、項目39~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記対象が、ヒトである、項目39~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
治療法における使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
(項目46)
医薬品としての使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
(項目47)
病態の治療における使用のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質。
(項目48)
肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療用医薬品の調製のための、本明細書に開示の成熟Pn3Pアーゼタンパク質の使用。
(項目49)
血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載の成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物。
(項目50)
本明細書に記載の1つ以上の特徴部を含むタンパク質、組成物、又は方法。
Claims (36)
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む遺伝子改変細胞を含む組成物であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する、組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、コード領域を含むポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞を含む組成物であって、前記コード領域は、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する、組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記細胞が、真核細胞である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、又は昆虫細胞である、請求項5に記載の組成物。
- 前記細胞が、原核細胞である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記細胞が、大腸菌(E.coli)である、請求項7に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、異種アミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記異種アミノ酸配列が、タグを含む、請求項9に記載の組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、単離成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する、組成物。
- 前記タンパク質が、精製されている、請求項11に記載の組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、単離ポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、成熟Pn3Pアーゼタンパク質をコードするコード領域を含み、前記タンパク質は、Pn3Pアーゼ活性を有する、組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64から選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、請求項11又は13に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の組成物。
- 薬学的に許容可能な担体を含む、請求項11又は13の組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物であって、
前記組成物が、III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)と、III型莢膜多糖の酵素的加水分解に好適な条件下で接触させられることを特徴とし、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上のIII型莢膜多糖の量を、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して低減させる、組成物。 - 肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の沈着を増加させるための、Pn3Pアーゼ活性を含む成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物であって、
前記組成物が、III型莢膜多糖を含む肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)と接触させられることを特徴とし、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の表面上の少なくとも1つの補体構成成分の前記沈着を、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較して増加させる、組成物。 - 前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、請求項17又は18に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)の複製に好適な条件で存在する、請求項17又は18に記載の組成物。
- 前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質が、単離Pn3Pアーゼタンパク質である、請求項17又は18に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する遺伝子改変細胞を含み、前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記成熟Pn3Pアーゼタンパク質を発現する前記遺伝子改変細胞に曝露されることを特徴とする、請求項18又は19に記載の組成物。
- 前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、前記組成物と接触させていない前記肺炎球菌(S.pneumoniae)と比較してマクロファージによる食作用に対する増加した感受性、好中球による増加した補体媒介殺傷、又はそれらの組合せを有する、請求項18又は19に記載の組成物。
- 前記肺炎球菌(S.pneumoniae)が、対象中に存在する、請求項18又は19に記載の組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、並びに、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有するか、若しくは有するリスクがある対象における感染を治療するための組成物であって、Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、並びに、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染を有するか、若しくは有するリスクがある対象における症状を治療するための組成物であって、Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物。
- 宿主防御に対する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の脆弱性を増加させるための、並びに、血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)が定着しているか、若しくは定着しているリスクがある対象における定着を減少させるための組成物であって、Pn3Pアーゼ活性を有する成熟Pn3Pアーゼタンパク質を含む組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ末端アミノ酸は、配列番号2の残基2~64のいずれか1つから選択され、カルボキシ末端アミノ酸は、配列番号2の残基1545である、請求項26~28のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、配列番号2のアミノ酸41~1545と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記対象が、ヒトである、請求項26~28のいずれか一項に記載の組成物。
- 治療法における使用のための、請求項1または11に記載の組成物。
- 医薬品としての使用のための、請求項1または11に記載の組成物。
- 病態の治療における使用のための、請求項1または11に記載の組成物。
- 血清3型肺炎球菌(S.pneumoniae)により引き起こされる感染又は症状の治療又は予防における使用のための、請求項1または11に記載の組成物。
- 肺炎、肺炎球菌髄膜炎、中耳炎、菌血症、敗血症、又はそれらの組合せの治療のための、請求項1または11に記載の組成物。
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