CN111372448A - 具有肺炎球菌荚膜降解活性的蛋白及使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种称为Pn3Pase蛋白的蛋白，该蛋白降解血清型3肺炎链球菌的荚膜多糖。本披露包括一种包含Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞，以及包含该蛋白、编码该蛋白的多核苷酸、该基因修饰细胞或其组合的组合物。还提供了使用Pn3Pase蛋白的方法，包括使具有III型荚膜多糖的肺炎链球菌与Pn3Pase蛋白接触、增加至少一种补体成分在肺炎链球菌表面的沉积、治疗受试者的感染、治疗受试者的症状、减少肺炎链球菌对受试者的定植或其组合的方法。

Description

具有肺炎球菌荚膜降解活性的蛋白及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月14日提交的美国临时申请序列号62/545,094和2018年4月3日提交的美国临时申请序列号62/652,046的权益，每个申请通过援引并入本文。

政府资助

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的1R01AI123383-01A1下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。

序列表

本申请包含通过EFS-Web以电子方式提交给美国专利及商标局(United StatesPatent and Trademark Office)的序列表，该序列表是标题为“2018-08-10-SequenceListing-02710201_ST25.txt”、大小为99千字节且创建于2018年8月10日的ASCII文本文件。该序列表中所含的信息通过援引并入本文。

背景技术

由肺炎链球菌(Spn，Streptococcus pneumoniae)引起的疾病一直以来都是对人类健康的主要威胁，具有惊人的死亡率。肺炎这种疾病在全球影响着大约4.5亿人(占人口的7％)，并且每年导致约400万人死亡。现今，肺炎球菌病的预防依赖于易感人群接种疫苗。肺炎球菌疫苗是凭经验生产的，并且具有可变/弱的免疫原性，特别是在幼儿、老年人和免疫功能低下的个体中。肺炎球菌病药物治疗的主要手段是抗生素治疗；然而，针对肺炎链球菌广泛使用抗生素已导致抗药性肺炎球菌菌株的传播。在2015年，根据CDC，在30％的病例中肺炎球菌细菌对一种或多种抗生素具有抗性。

肺炎链球菌具有超过90种独特的荚膜血清型，每一种在单糖组成和键合以及其他修饰(诸如乙酰化)方面都不同。虽然结合型疫苗已能有效预防由疫苗中所包括的大多数肺炎链球菌血清型引起的携带和疾病，但血清型3除外。

发明内容

本文描述了对由类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株表达的Pn3Pase基因的鉴定和克隆。Pn3Pase酶降解肺炎链球菌血清型3的荚膜多糖，肺炎链球菌血清型3是毒力最强的血清型，具有高发病率和高死亡率。荚膜多糖是肺炎链球菌(Spn)的主要毒力因子，并且大多数无荚膜的细菌无感染性。该酶成功降解活细菌表面的荚膜多糖。而且，细菌在该酶的存在下对吞噬作用敏感。

本文提供了包含成熟Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。在一个实施例中，基因修饰细胞包括包含编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列。该蛋白可包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。在一个实施例中，该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，基因修饰细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。在一个实施例中，基因修饰细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。在一个实施例中，该蛋白包含异源氨基酸序列，诸如标签。

本文还提供了组合物。在一个实施例中，组合物包含基因修饰细胞。在一个实施例中，组合物包含分离的，任选纯化的成熟P3nPase蛋白。在一个实施例中，组合物包含分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码成熟Pn3Pase蛋白的编码区。成熟P3nPase蛋白可包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。在一个实施例中，该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

本文还提供了方法。在一个实施例中，一种方法包括在适于具有Pn3Pase活性的蛋白表达的条件下孵育细胞。该细胞可包含含有编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列，其中该蛋白具有Pn3Pase活性，并且其中该细胞在合适的条件下表达成熟Pn3Pase蛋白。该蛋白可包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。在一个实施例中，该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。该细胞可以是野生型细胞，例如类 芽孢杆菌属菌株，诸如类芽孢杆菌属物种32352，或者可以是基因修饰细胞，其中编码的多核苷酸是外源多核苷酸。该方法可进一步包括分离或纯化该蛋白。在一个实施例中，该细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。在一个实施例中，基因修饰细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌。在一个实施例中，该蛋白包含异源氨基酸序列，诸如标签。

在一个实施例中，一种方法包括使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与成熟Pn3Pase蛋白接触，其中该接触是在适于酶水解III型荚膜多糖的条件下进行的，其中该肺炎链球菌表面上III型荚膜多糖的量和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比减少。在另一个实施例中，一种方法是用于增加至少一种补体成分在肺炎链球菌表面的沉积。在一个实施例中，该方法可以包括使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与成熟Pn3Pase蛋白接触，其中至少一种补体成分在该肺炎链球菌表面的沉积和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比增加。该蛋白可包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。在一个实施例中，该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，肺炎链球菌存在于适于肺炎链球菌复制的条件中。在一个实施例中，成熟Pn3Pase蛋白是分离的Pn3Pase蛋白。在一个实施例中，该接触包括将肺炎链球菌暴露于表达该成熟Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。在一个实施例中，该肺炎链球菌和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比，对巨噬细胞吞噬作用的敏感性增加、补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用增加、或其组合。在一个实施例中，肺炎链球菌存在于受试者中。

在一个实施例中，一种方法是用于治疗受试者的感染并且包括向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。在一个实施例中，该方法是用于治疗受试者的症状并且包括向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。在一个实施例中，一种方法是用于减少受试者中的定植并且包括向受血清型3肺炎链球菌定植或处于受血清型3肺炎链球菌定植的风险中的受试者施用有效量的包含具有P3nPase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。该蛋白可包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。在一个实施例中，该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，受试者是人。

还提供了用于在治疗中使用的本文披露的成熟Pn3Pase蛋白、作为药物使用的本文披露的成熟Pn3Pase蛋白、以及用于在病状治疗中使用的本文披露的成熟Pn3Pase蛋白。

进一步提供了本文披露的成熟Pn3Pase蛋白用于制备治疗肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎、菌血症、败血症或其组合的药剂的用途；用于在治疗或预防由血清型3肺炎链球菌引起的感染或症状中使用的、包含本文所述的成熟P3nPase蛋白的组合物；以及包括本文所述的一个或多个特征的蛋白、组合物或方法。

如本文所用，“基因修饰细胞”是指已向其中引入了外源多核苷酸诸如表达载体的细胞。例如，细胞是由于向合适的细胞中引入对该细胞而言是外来的外源多核苷酸而进行基因修饰的细胞。“基因修饰细胞”也指已经受到基因操纵使得内源核苷酸已被改变的细胞。例如，细胞是由于向合适的细胞中引入内源核苷酸改变而进行基因修饰的细胞。基因修饰细胞的实例是具有改变的调控序列，诸如启动子，导致可操作地连接的内源编码区表达增加或减少的细胞。

如本文所用，术语“蛋白”泛指通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物。术语“蛋白”还包括含有一种以上通过二硫键连接的蛋白的分子，或共价或非共价连接在一起作为多聚体(例如，二聚体、四聚体)的蛋白复合物。因此，术语肽、寡肽、酶和多肽全部包括在蛋白的定义内，并且这些术语可互换使用。应当理解，这些术语不暗示特定长度的氨基酸聚合物，也不旨在暗指或区分蛋白是使用重组技术，化学或酶促合成产生的还是天然存在的。

如本文所用，“成熟蛋白”是指具有与在翻译后已经加工产生其最终形式的蛋白相同或具有结构相似性的氨基酸序列的蛋白。翻译后加工可包括N端加工或C端截短。如本文所用，“预加工蛋白”是指已经从mRNA翻译而尚未进行翻译后加工以产生成熟蛋白的蛋白。

如本文所用，“分离的”物质，例如蛋白，是已经从其自然环境中移除的，使用重组技术产生的，或者化学或酶促合成的物质。例如，蛋白或多核苷酸可以是分离的。优选地，物质是纯化的，即，至少60％不含，优选至少75％不含，且最优选至少90％不含与它们天然缔合的其他组分。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)聚合形式，并且包括双链和单链RNA和DNA。多核苷酸可直接从天然来源获得，或者可借助重组、酶促或化学技术制备。多核苷酸在拓扑结构上可为线性或环状。多核苷酸可以是例如载体(诸如表达载体或克隆载体)的一部分，或片段。多核苷酸可以包含具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码区和非编码区，诸如调控区。

如本文所用，“可检测部分”或“标记”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段直接或间接检测的分子。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶及其底物(例如，如酶联免疫测定中通常所用的，例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)、生物素-链霉亲和素、地高辛、蛋白诸如抗体，或半抗原以及抗血清或单克隆抗体可用的蛋白。标记或可检测部分通常通过接头或化学结合而以共价方式结合至，或通过离子、范德华力(van der Waals)或氢键而结合至待检测的分子。

如本文所用，术语“编码区”和“编码序列”可互换使用，并且是指编码蛋白，并在置于适当调控序列的控制下时表达所编码的蛋白的核苷酸序列。编码区的边界通常由其5'末端的翻译起始密码子和其3'末端的翻译终止密码子确定。“调控序列”是调控与之可操作地连接的编码序列的表达的核苷酸序列。调控序列的非限制性实例包括启动子、增强子、转录起始位点、翻译起始位点、翻译终止位点和转录终止子。术语“可操作地连接”是指使得组分处于容许它们以其预期方式起作用的关系中的并置。当调控序列以在与调控序列相容的条件下实现编码区表达的方式连接时，调控序列与编码区“可操作地连接”。

包括编码区的多核苷酸可包括侧接编码区一侧或两侧的异源核苷酸。如本文所用，“异源核苷酸”是指通常不存在于野生型细胞中存在的编码区侧翼的核苷酸。因此，包括编码区和异源核苷酸的多核苷酸不是天然存在的分子。例如，存在于野生型微生物中并且编码Pn3Pase蛋白的编码区的侧翼是同源序列，在该编码区侧翼的任何其他核苷酸序列被认为是异源的。异源核苷酸的实例包括但不限于调控序列。通常，通过使用本领域技术人员众所周知的标准遗传学和/或重组方法，在本文所述的多核苷酸中存在异源核苷酸。本文所述的多核苷酸可包含在合适的载体中。

本文所述的蛋白可包含存在于N端、C端或其组合的异源氨基酸。如本文所用，“异源氨基酸”是指通常不存在于野生型细胞中天然存在的蛋白侧翼的氨基酸。因此，包含异源氨基酸的蛋白不是天然存在的分子。例如，存在于野生型微生物中的天然存在的Pn3Pase蛋白在N端或C端不具有其他氨基酸，而在N末端或C末端存在的任何其他氨基酸被认为是异源的。本文描述了异源氨基酸序列的实例，包括但不限于亲和纯化标签。通常，通过使用本领域技术人员众所周知的标准遗传学和/或重组方法，在本文所述的蛋白中存在异源氨基酸。

如本文所用，“外源多核苷酸”是指在细胞中通常未发现或未天然发现的多核苷酸。如本文所用，术语“内源多核苷酸”是指在细胞中通常或天然发现的多核苷酸。“内源多核苷酸”也称为“天然多核苷酸”。

如本文所用，术语“补体”和“互补”是指两条单链多核苷酸彼此碱基配对的能力，其中一条多核苷酸链上的腺嘌呤将会与第二多核苷酸链上的胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基配对，并且一条多核苷酸链上的胞嘧啶将会与第二多核苷酸链上的鸟嘌呤碱基配对。当一个多核苷酸中的核苷酸序列可以与第二多核苷酸中的核苷酸序列碱基配对时，这两个多核苷酸彼此互补。例如，5'-ATGC和5'-GCAT互补。如本文所用，术语“实质性补体”及其同源词是指在严格杂交条件下能够与指定的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。严格杂交可以在许多pH、盐和温度条件下进行。pH可以在6至9之间变化，优选在6.8至8.5之间变化。盐浓度可以在0.15M钠至0.9M钠之间变化，并且可以使用其他阳离子，只要离子强度等于对于钠指定的离子强度即可。杂交反应的温度可以在30℃至80℃之间变化，优选在45℃至70℃之间变化。另外，可以向杂交反应中添加其他化合物以促进在较低温度下，诸如在室温或接近室温下的特异性杂交。在考虑用于降低温度要求的化合物中有甲酰胺。因此，如果在多核苷酸和第二多核苷酸之间发生杂交，则该多核苷酸通常基本上与第二多核苷酸互补。如本文所用，“特异性杂交”是指在严格杂交条件下两个多核苷酸之间的杂交。

在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可以用百分比“同一性”来指代，或者可以用百分比“相似性”来指代。“同一性”是指存在相同氨基酸。“相似性”是指不仅存在相同氨基酸，而且还存在保守性取代。通过比对两种蛋白的残基(例如，候选氨基酸序列和参考氨基酸序列，诸如成熟Pn3Pase蛋白，例如，SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545)来测定两种蛋白之间的序列相似性以沿其序列长度优化相同氨基酸的数量；为了优化共有氨基酸的数量，在进行比对时容许一个或两个序列中存在空位，但每个序列中的氨基酸仍必须保持其正确的顺序。可以例如使用测序技术，诸如Tatusova等人(FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物学快报]1999,174:247-250)所述并且可通过万维网获得(例如在由美国国立卫生研究院国家生物技术信息中心维护的互联网网站上可获得)的GCG包(麦迪逊(Madison)，威斯康星州(WI))中的BESTFIT算法，或BLAST 2搜索算法的Blastp程序来测定序列相似性。优选地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序来测定两个氨基酸序列之间的序列相似性。优选地，使用所有BLAST 2搜索参数的默认值。在使用BLAST搜索算法比较两个氨基酸序列时，将结构相似性称为“同一性”。因此，提及本文所述的蛋白，诸如成熟Pn3Pase蛋白，例如SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545，可以包括与参考蛋白具有至少80％同一性、至少81％同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的蛋白。替代性地，提及本文所述的蛋白，诸如成熟Pn3Pase蛋白，例如SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545，可以包括与参考蛋白具有至少80％相似性、至少81％相似性、至少82％相似性、至少83％相似性、至少84％相似性、至少85％相似性、至少86％相似性、至少87％相似性、至少88％相似性、至少89％相似性、至少90％相似性、至少91％相似性、至少92％相似性、至少93％相似性、至少94％相似性、至少95％相似性、至少96％相似性、至少97％相似性、至少98％相似性或至少99％相似性的蛋白。

通过比对两个多核苷酸(例如，候选核苷酸序列和编码成熟Pn3Pase蛋白的参考核苷酸序列)的残基来测定两个多核苷酸之间的序列相似性以沿其序列长度优化相同核苷酸的数量；为了优化共有核苷酸的数量，在进行比对时容许一个或两个序列中存在空位，但每个序列中的核苷酸仍必须保持其正确的顺序。可以例如使用测序技术，诸如GCG FastA(威斯康星州麦迪逊遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin))、MacVector4.5(Kodak/IBI软件包)或本领域已知的其他合适的测序程序或方法来测定序列相似性。优选地，使用如Tatusova等人(1999,FEMS Microbiol Lett[FEMS微生物学快报],174:247-250)所述并且可通过万维网获得(例如在由美国国立卫生研究院国家生物技术信息中心维护的互联网网站上可获得)的BLAST 2搜索算法的Blastp程序来测定两个核苷酸序列的序列相似性。优选地，使用所有BLAST 2搜索参数的默认值。在使用BLAST搜索算法比较两个核苷酸序列时，将序列相似性称为“同一性”。序列相似性通常为至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少81同一性、至少82％同一性、至少83％同一性、至少84％同一性、至少85％同一性、至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

如本文所用，“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以包括但不限于试管。如本文所用，术语“体内”是指受试者体内的自然环境。

“允许”事件发生的条件或“适于”事件发生的条件(诸如酶促反应)或“合适的”条件是不会防止此类事件发生的条件。因此，这些条件容许、增强、促进和/或有益于该事件。

术语“和/或”意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任两个或更多个的组合。

词语“优选的”和“优选地”是指本披露的在某些情况下可以提供某些益处的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。另外，对一个或多个优选实施例的叙述不暗指其他实施例是无用的，并且不旨在从本披露的范围中排除其他实施例。

术语“包含”及其变型在这些术语出现在说明书和权利要求书中时不具有限制意义。

应当理解，当本文中用语言“包括(include、includes或including)”等来描述实施例时，还提供了在“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面所描述的其他类似实施例。

除非另外说明，“一”、“一个(一种)”、“该”和“至少一个”可互换使用，并且意指一个或多于一个。

同样在本文中，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于本文披露的包括不连续的步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序实施。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。

在整个说明书中，提及“一个实施例(one embodiment)”、“一个实施例(anembodiment)”、“某些实施例(certain embodiments)”或“一些实施例(someembodiments)”等意指结合该实施例描述的特定特征、配置、组合物或特性包括在本披露的至少一个实施例中。因此，此类短语在本说明书全篇各处的出现不一定都指本披露的同一实施例。此外，特定的特征、配置、组合物或特性可以在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。

本披露的以上概述并非旨在描述本披露的每个所披露的实施例或每个实施方式。以下描述更加具体地示例了说明性实施例。在整个申请中的若干个地方，通过实例列表提供了指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所述列表仅用作代表组，而不应解释为排他性列表。

在本文的描述中，为了清楚起见，可以独立地描述特定实施例。除非另外明确指出特定实施例的特征与另一实施例的特征不相容，否则某些实施例可以包括本文结合一个或多个实施例描述的相容特征的组合。

附图说明

当结合以下附图阅读时，可以最好地理解以下详细描述的本披露的说明性实施例。

图1示出了肺炎链球菌(Spn)血清型3荚膜多糖的重复单元结构。

图2示出了来自类芽孢杆菌属的七种糖苷水解酶的氨基酸比对。WP_079915027.1(SEQ ID NO:2)、WP_113018908.1(SEQ ID NO:4)、WP_068663733.1(SEQ ID NO:5)、KRE82476.1(SEQ ID NO:6)、WP_082593776.1(SEQ ID NO:7)、WP_056617367.1(SEQ ID NO:8)和WP_028553222.1(SEQ ID NO:9)。

图3示出了类芽孢杆菌属物种32352在以Pn3P作为碳源的基本培养基中的培养。(图3A)类芽孢杆菌属物种32352(Pbac)在加有2％(w/v)葡萄糖、Pn3P、纤维素作为碳源或不加任何碳源的基本培养基上的生长。(图3B)在葡萄糖(泳道1)或Pn3P(泳道2)上生长的Pbac的浓缩培养物上清液的SDS-PAGE考马斯蓝染色凝胶。(图3C)基于快速注释服务器(Aziz等人，2008，BMC Genomics[BMC基因组学]9,75)(RAST)注释提出的Pn3P利用组织的基因座。(图3D)在2％葡萄糖或Pn3P上生长的Pbac的推定基因座内的选择基因的实时PCR，显示为在Pn3P培养物中的表达相对于葡萄糖培养物的倍数变化。

图4示出了Pn3Pase鉴定和一级氨基酸序列的结构域示意图。(图4A)Pn3Pase的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和登录号。(图4B)通过尺寸排阻色谱法分离重组Pn3Pase解聚的氚放射性同位素标记的Pn3P，通过每1ml级分中每分钟的计数来测量。(图4C)用Pn3P单克隆抗体探测的重组Pn3Pase解聚的冷Pn3P的斑点印迹。(图4D)InterPro预测的Pn3Pase结构域的示意图。(图4E)编码Pn3Pase的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

图5示出了通过电喷雾电离质谱法鉴定寡糖产物。寡糖产物的分离(图5A)及四糖(图5B)和六糖(图5C)的质谱图。表1中示出了实验分子量和精度。

图6示出了寡糖产物的核磁共振特征。Pn3四糖的1H NMR波谱(A)、2D HSQC NMR波谱(B)和2D COSYNMR波谱(C)。Pn3六糖的1H NMR波谱(D)、2D HSQC NMR波谱(E)和2DCOSYNMR波谱(F)。

图7示出了Pn3Pase的活性评估。(图7A)通过尺寸排阻色谱法分离的重组Pn3Pase解聚的氚放射性同位素标记的Pn3P的时程测定，通过每1ml级分中每分钟的计数来测量。(图7B)在三种不同的缓冲液条件下的重组Pn3Pase的优化，通过生成的葡糖醛酸还原性末端的浓度(μg/ml)进行测量。(C)用Mg2+和Ca2+反应补充剂测定金属依赖性，通过生成的葡糖醛酸还原性末端的浓度(μg/ml)进行测量。用双尾学生t检验测定统计显著性**P<0.01

图8示出了活的、正在生长的3型肺炎链球菌WU2菌株的Pn3Pase处理。(图8A)在600nm下的OD之后，在100ug/ml Pn3Pase的存在下，THY肉汤中WU2的生长曲线。(图8B-8C)竞争ELISA，其中使用无荚膜的WU2或经Pn3Pase处理的WU2与Pn3P特异性抗体竞争结合Pn3P包被的ELISA板。数据表示为抗体结合的抑制百分比。(图8D)WU2(左上)、无荚膜的衍生物(右上)和代表性Pn3Pase处理的WU2(下图)的透射电子显微镜检查。用双尾学生t检验测定统计显著性**P<0.01，***P<0.001。

图9示出了Pn3Pase处理对3型Spn活力的影响。(图9A)在600nm下的OD之后，在100μg/ml Pn3Pase的存在下，THY肉汤中WU2的生长曲线。(图9B)在100μg/ml活性或热灭活的Pn3Pase的存在下，WU2在PBS中的存活率。

图10示出了通过Pn3Pase处理使活的3型Spn上的荚膜耗尽。(图10A-B)竞争ELISA，其中使用无荚膜的WU2、经热灭活的Pn3Pase处理的WU2或经两种不同浓度(2μg/ml或10μg/ml)的Pn3Pase处理的WU2与Pn3P特异性抗体竞争结合Pn3P包被的ELISA板。数据表示为抗体结合的抑制百分比。用双尾学生t检验测定统计显著性**P<0.01，***P<0.001。用2μg/ml热灭活的Pn3Pase处理的WU2模拟物(图10C)，无荚膜的WU2菌株(图10D)和2μg/ml活性Pn3Pase处理的WU2(E)的透射电子显微镜图像。下方的图以15000X直接放大倍数成像，而上方的图以10000X直接放大倍数成像(C-E)。

图11示出了经Pn3Pase处理的3型Spn的巨噬细胞摄取。(图11A)在热灭活(左)或活性(右)Pn3Pase处理后，含有荧光链球菌的RAW 264.7巨噬细胞。链球菌，CFSE，绿色。巨噬细胞，生物素化WGA，链霉亲和素-APC，红色。(图11B)Pn3Pase处理和补体对通过流式细胞术定量的CFSE标记的Spn的巨噬细胞摄取的影响。(图11C)Pn3Pase对荧光吞噬细胞百分比的剂量依赖效应。用双尾学生t检验测定统计显著性***P<0.001。

图12示出了Pn3Pase处理对Spn表面的补体沉积的影响。通过流式细胞术分析在Pn3Pase处理或未处理的3型Spn上的小鼠补体沉积。由Hoechst阳性细胞的门控来计算FITC-A的平均荧光强度(MFI)定量。用双尾学生t检验测定统计显著性**P<0.01，***P<0.001，ns＝不显著。

图13示出了Pn3Pase处理对补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用的影响。补体介导的分化的HL-60细胞对Pn3Pase处理的Spn的杀伤能力。将每个重复反应归一化为对照样品获得的平均值(无HL60细胞的反应，存活率100％)，计算存活百分比。用双尾学生t检验测定统计显著性***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，ns＝不显著。

图14示出了3型Spn的鼻内定植。Pn3Pase处理减少BALB/c小鼠鼻咽中的Spn定植的能力。(图14A)为各组小鼠鼻内接种106个在10μl PBS中的对数期细菌。用50μg Pn3Pase或缓冲液对照(10μl)追踪所有接种物。在第0天(WU2+Pn3Pase*1)，第0天和第3天(WU2+Pn3Pase*2)或第0、3和7天(WU2+Pn3Pase*3)向各组定量给予酶。在第10天对细菌载量进行定量。将连续稀释的鼻灌洗液一式两份平板接种以测定CFU值。通过ELISA测定鼻灌洗液中的(图14B)IL-6和(图14C)TNFα浓度。用双尾学生t检验测定统计显著性*P<0.05，**P<0.01。

图15示出了Pn3Pase的保护能力。评估Pn3Pase保护BALB/c小鼠免受致命攻击的能力。通过腹膜内施用5×103个对数期毒力3型Spn而使各组小鼠感染。灭活组是热灭活的Pn3Pase。*示出了在感染后0时、12或24小时施用的5μg或0.5μg单剂量的作用，每组n＝5只小鼠。

具体实施方式

蛋白

本文提供了基因修饰细胞和使用这些细胞的方法。这些基因修饰细胞可以产生具有Pn3Pase活性的蛋白。具有Pn3Pase活性的蛋白在本文中称为Pn3Pase蛋白或Pn3Pase。具有Pn3Pase活性的蛋白降解肺炎链球菌(Spn)的III型荚膜多糖。这种荚膜多糖也称为肺炎球菌3型多糖(Pn3P)并且是由血清型3(也称为3型)肺炎链球菌表达的。图1中示出了Pn3P的结构。

可以通过体外测定来确定蛋白是否具有Pn3Pase活性。在一个实施例中，如本文所述进行体外测定(参见实例1)。简言之，Pn3P可以用可检测部分标记，暴露于正在测试Pn3Pase活性的蛋白中，并使用容许检测分子量差异的方法解析反应产物。Pn3P可以使用技术人员已知并且常规的方法获得，或者可以从美国典型培养物保藏中心ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))购买。检测多糖分子量变化的方法是技术人员已知的并且是常规的。

Pn3Pase蛋白可以是，并且在一些实施例中优选是，成熟蛋白。在一个实施例中，Pn3Pase蛋白由获自野生型细胞的编码序列编码，其中该蛋白已经加工，从N末端去除了一个或多个氨基酸产生成熟蛋白，例如该蛋白缺少信号序列。因此，当与获自野生型细胞的编码序列编码的经预加工的Pn3Pase蛋白相比时，成熟蛋白可缺少来自预加工蛋白的氨基端的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少51个、至少52个、至少53个、至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少58个、至少59个、至少60个、至少61个、至少62个或至少63个氨基酸。在另一个实施例中，Pn3Pase蛋白由不包含编码对应于信号序列的氨基酸的核苷酸的编码区编码。

SEQ ID NO:2描绘了Pn3Pase蛋白的一个实例，其中Pn3Pase蛋白是预加工蛋白。成熟Pn3Pase蛋白的实例包括具有N端氨基酸的氨基酸序列，该N端氨基酸选自SEQ ID NO:2的氨基酸2-64，并且C端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。Pn3Pase蛋白的其他实例包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有序列相似性的蛋白，或包含SEQ ID NO:2的氨基酸子集的成熟Pn3Pase蛋白。与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其一部分具有序列相似性的Pn3Pase蛋白具有Pn3Pase活性。可以从微生物中分离出预加工的或成熟的Pn3Pase蛋白，该微生物诸如芽孢杆菌属(Bacillus)的成员，诸如环状芽孢杆菌(B.circulans)。微生物的具体实例是环状芽孢杆菌约旦(Jordan)菌株32352(ATCC 14175)。来自于确定环状芽孢杆菌核苷酸序列的数据表明该细菌应重新分类为类芽孢杆菌属，因为它的最近邻在系统发育上属于该分类。先前将类芽孢杆菌属物种包括在芽孢杆菌属中，直到认为它们适当地不同为止(Ash等人，1993,Antonie Van Leeuwenhoek[安东尼·范·列文虎克]64:253-260)。通过在16s核糖体RNA上存在独特的3群杆菌(类芽孢杆菌)核苷酸序列(TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT，SEQID NO:3)来确认分类为类芽孢杆菌属(Ash等人，1993,Antonie Van Leeuwenhoek[安东尼·范·列文虎克]64:253-260)。Pn3Pase蛋白也可以使用重组技术产生，或使用常规方法化学或酶促合成。重组产生的蛋白可包括可由mRNA转录物，或其编码成熟Pn3Pase蛋白的部分翻译的完整氨基酸序列。

与SEQ ID NO:2或其对应于成熟Pn3Pase蛋白的部分具有序列相似性的Pn3Pase蛋白的氨基酸序列可以包括氨基酸的保守性取代。保守性取代通常是一个氨基酸取代是同一类别成员的另一个氨基酸。例如，在蛋白质生物化学领域中众所周知，属于具有特定大小或特征(诸如电荷、疏水性和/或亲水性)的一组氨基酸的氨基酸通常可以取代另一种氨基酸，基本上不改变蛋白的二级和/或三级结构。出于本披露的目的，将保守性氨基酸取代定义为起因于以下残基类别之一的氨基酸残基的交换：I类：Gly、Ala、Val、Leu和Ile(代表脂肪族侧链)；II类：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser和Thr(代表脂肪族和脂肪族羟基侧链)；III类：Tyr、Ser和Thr(代表羟基侧链)；IV类：Cys和Met(代表含硫侧链)；V类：Glu、Asp、Asn和Gln(含羧基或酰胺基的侧链)；VI类：His、Arg和Lys(代表碱性侧链)；VII类：Gly、Ala、Pro、Trp、Tyr、Ile、Val、Leu、Phe和Met(代表疏水性侧链)；VIII类：Phe、Trp和Tyr(代表芳香族侧链)；和IX类：Asn和Gln(代表酰胺侧链)。这些类别不限于天然存在的氨基酸，还包括人工氨基酸，诸如β或γ氨基酸以及那些含有非天然侧链的氨基酸，和/或其他类似单体，诸如羟基酸。

Bowie等人提供了有关如何产生表型沉默氨基酸取代的指南(1990,Science[科学],247:1306-1310)，其中作者指出蛋白惊人地耐受氨基酸取代。例如，Bowie等人披露有两种研究蛋白序列对改变的耐受性的主要方法。第一种方法依赖于进化过程，其中突变被自然选择接受或拒绝。第二种方法是利用基因工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化，并选择或筛选以监督保持功能性的序列。如作者所述，这些研究揭示蛋白惊人地耐受氨基酸取代。作者进一步指出了在蛋白的某个位置可能容许哪些变化。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的很少特征通常是保守的。Bowie等人及其中引用的参考文献中描述了其他此类表型沉默取代。

图2还提供了有关如何修饰本文披露的蛋白的氨基酸序列的指南。图2描绘了由类芽孢杆菌表达的糖苷水解酶蛋白的Clustal Omega氨基酸比对。Clustal Omega是一种多序列比对程序(Sievers等人，2011,Molecular Systems Biology[分子系统生物学]7:539,doi:10.1038/msb.2011.75；Goujon等人，2010,Nucleic acids research[核酸研究]38(增刊2):W695-9,doi:10.1093/nar/gkq313)。在图2中，星号(*)表示具有单个完全保守残基的位置；冒号(：)表示性质非常相似的组之间的保守性，在Gonnet PAM 250矩阵中大致相当于评分>0.5；句点(.)表示性质不太相似的组之间的保守性，在Gonnet PAM 250矩阵中大致相当于评分＝<0.5且>0。通过参考该图，技术人员可以预测氨基酸序列的哪些改变可能会改变酶活性，以及哪些改变不太可能会改变酶活性。

Pn3Pase蛋白包括保守结构域，包括糖苷水解酶家族39结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸180-353)，半乳糖结合结构域类似物(SEQ ID NO:2的氨基酸621-765)，与内切1,3-1,4-β葡聚糖酶具有结构相似性的功能未知的结构域DUF1080(SEQ ID NO:2的氨基酸781-950)，和伴刀豆球蛋白A样凝集素/葡聚糖酶结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸1,209-1,348)。在一个实施例中，Pn3Pase蛋白具有在pH 7.2的磷酸钠缓冲液中显示比在pH 6.0的MES缓冲液中略佳的活性，并且在pH 8.0的Tris缓冲液中显著更差的特征(参见实例1)。在另一个实施例中，Pn3Pase蛋白对Ca2+显示出浓度依赖性的偏好，因为它在10mM Ca2+的存在下产生更高浓度的还原性末端GlcA(参见实例1)。

本文所述的Pn3Pase蛋白可以表达为包含本文所述的Pn3Pase蛋白和异源氨基酸的融合蛋白。例如，附加氨基酸序列可用于通过亲和色谱法纯化融合蛋白。可用于纯化的氨基酸序列可称为标签，包括但不限于聚组氨酸标签(His标签)和麦芽糖结合蛋白。代表性实例可以在Hopp等人(美国专利号4,703,004)、Hopp等人(美国专利号4,782,137)、Sgarlato(美国专利号5,935,824)和Sharma Sgarlato(美国专利号5,594,115)中找到。有各种方法可用于将此类亲和纯化部分添加至蛋白上。任选地，然后可以裂解附加氨基酸序列，诸如His标签。

多核苷酸

本文还提供了编码Pn3Pase蛋白的分离的多核苷酸。编码具有Pn3Pase活性的蛋白的多核苷酸在本文中称为Pn3Pase多核苷酸。Pn3Pase多核苷酸可具有下述核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其一部分的蛋白。编码此类蛋白的核苷酸序列的类别的实例是SEQ ID NO:1或其一部分。应当理解，编码SEQ ID NO:2表示的Pn3Pase蛋白的多核苷酸不限于SEQ ID NO:1披露的核苷酸序列，而且还包括由于遗传密码的简并性而产生的编码此类蛋白的多核苷酸的类别。例如，天然存在的核苷酸序列SEQ IDNO:1只是编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白的核苷酸序列类别的一个成员。编码选定蛋白序列的核苷酸序列的类别很大，但是是有限的，并且本领域技术人员可以参考标准遗传密码容易地确定该类别每个成员的核苷酸序列，其中已知有不同的核苷酸三联体(密码子)编码相同的氨基酸。

Pn3Pase多核苷酸可以与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其部分，例如编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸具有序列相似性。与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其部分具有序列相似性的Pn3Pase多核苷酸编码Pn3Pase蛋白。Pn3Pase多核苷酸可以从微生物，诸如类芽孢杆菌分离，或者可以使用重组技术产生，或者化学或酶促合成。Pn3Pase多核苷酸可进一步包含位于编码Pn3Pase蛋白的开放阅读框侧翼的异源核苷酸。通常，异源核苷酸可以在编码区的5'末端、在编码区的3'末端或其组合。异源核苷酸的数量可以是例如至少10个、至少100个或至少1000个。

本文所述的多核苷酸可存在于载体中。载体是复制性多核苷酸，诸如质粒、噬菌体或粘粒，可将另一多核苷酸附接于载体上，从而实现所附接的多核苷酸的复制。含有本披露的多核苷酸的载体的构建采用本领域已知的标准连接技术。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社](1989)。载体可以提供进一步的克隆(多核苷酸的扩增)，即为克隆载体，或提供多核苷酸的表达，即为表达载体。术语载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、粘粒载体和人工染色体载体。病毒载体的实例包括例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和疱疹病毒载体。通常，载体能够在微生物宿主，例如微生物(诸如大肠杆菌)中复制，或在真核宿主，例如酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞中复制。在一个实施例中，载体是质粒。

载体的选择取决于所得构建体中的多种所需特征，诸如选择标志物、载体复制速率等。在一些方面，本文中用于克隆或表达载体的合适宿主细胞包括原核细胞。可以使用技术人员已知和常规使用的方法将载体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。

编码Pn3Pase蛋白的多核苷酸可获自微生物，例如诸如类芽孢杆菌属物种的微生物，或在体外或在体内产生。例如，体外合成的方法包括但不限于用传统DNA/RNA合成仪进行化学合成。合成多核苷酸和用于此类合成的试剂的商业供应商是众所周知的。

表达载体任选地包括与编码区可操作地连接的调控序列。本披露不受任何特定启动子的使用的限制，并且已知多种启动子。启动子起调控信号的作用，该调控信号结合细胞中的RNA聚合酶以起始下游(3'方向)编码区的转录。所用的启动子可以是组成型或诱导型启动子。关于宿主细胞，它可以是但没有必要是异源的。可用于本文所述方法的启动子可以是但不限于组成型启动子、温度敏感型启动子、非调控型启动子或诱导型启动子。在一个实施例中，启动子是在细菌域成员中起作用的启动子。在一个实施例中，启动子是在真核生物中起作用的启动子。

表达载体可任选地包含核糖体结合位点和起始位点(例如，密码子ATG)以起始转录消息的翻译以产生蛋白。表达载体还可以包含终止序列以终止翻译。终止序列通常是不存在相应的氨基乙酰基-tRNA，从而终止蛋白合成的密码子。用于转化宿主细胞的多核苷酸可任选地进一步包含转录终止序列。

引入宿主细胞中以产生基因修饰细胞的载体任选地包含一个或多个标记序列，该标记序列通常编码灭活或以其他方式检测生长培养基中的化合物或通过该化合物而检测到的分子。例如，包含标记序列可以使转化细胞对抗生素具有抗性，或者可以赋予转化细胞以化合物特异性代谢。标记序列的实例包括但不限于赋予卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、链霉素和新霉素抗性的序列。

可以使用重组DNA技术，诸如细胞中存在的表达载体来产生本文所述的蛋白。此类方法是常规的并且是本领域已知的。该蛋白也可以体外合成，例如通过固相肽合成法合成。固相肽合成法是常规的并且是本领域已知的。使用重组技术或通过固相肽合成法产生的蛋白可以通过常规方法进一步纯化，诸如在免疫亲和色谱柱或离子交换柱上分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅胶或阴离子交换树脂诸如DEAE上色谱分离，色谱聚焦，SDS-PAGE，硫酸铵沉淀，使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤，或配体亲和力纯化。

基因修饰细胞

还提供了具有编码本文所述的Pn3Pase的多核苷酸的基因修饰细胞。与未经基因修饰的对照细胞相比，基因修饰细胞可以表现出Pn3Pase的产生，或者可以表现出Pn3Pase的产生增加。编码Pn3Psae的多核苷酸可以作为载体存在于细胞中或整合到基因修饰细胞的基因组DNA，诸如染色体或质粒中。细胞可以是真核细胞或原核细胞，例如细菌域的成员

是可以基因修饰为包括编码本文所述的Pn3Pase的多核苷酸的细菌域的成员的宿主细胞的实例包括但不限于埃希氏菌属(诸如大肠埃希氏菌(Escherichia coli))和沙门氏菌属(诸如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))。

是可以基因修饰为包括编码Pn3Pase的多核苷酸的真核细胞的宿主细胞的实例包括但不限于酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母属(Pichiaspp.))、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

组合物

还提供了包含本文所述的Pn3Pase蛋白或编码Pn3Pase蛋白的多核苷酸的组合物。此类组合物通常包含药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。附加活性剂也可以掺入组合物中。

组合物可以通过药学领域众所周知的方法制备。一般而言，可以将组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用可以是全身性的或局部的。施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肌内)、肠内(例如，口服)和局部(例如，表皮、吸入、经粘膜)施用。用于肠内施用本披露的化合物的适当剂型包括但不限于片剂、胶囊剂或液体。用于肠胃外施用的适当剂型可包括静脉内或腹膜内施用。用于局部施用的适当剂型包括但不限于鼻喷雾剂、定量吸入器、干粉吸入器或通过雾化。

溶液或混悬剂可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如供施用的水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；电解质，诸如钠离子、氯离子、钾离子、钙离子和镁离子，以及用于调节张度的药剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。

组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌溶液或分散体的无菌粉末。对于肠胃外施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。组合物通常是无菌的，并且当适于注射使用时，其流动性应达到易于注射的程度。它在制造和储存条件下应该稳定并且应该防止诸如细菌和真菌的微生物污染作用。该载剂可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其适合的混合物。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌溶液可通过将所需量的活性化合物(例如，本文所述的Pn3Pase蛋白或编码该蛋白的多核苷酸)掺入含有药物组合物中常规使用的成分中的一种或组合(根据需要)的适当溶剂中，接着进行过滤除菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有碱性分散介质和任何其他适当成分的无菌媒介物中来制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生活性成分加上来自其先前的灭菌溶液的任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物随赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊剂)的形式使用。口服组合物也可以使用流体载剂制备。药物相容性粘合剂和/或有用材料可作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖，崩解剂，诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或氢化植物油(Sterotes)；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。

对于通过吸入施用(例如，局部施用)，活性化合物可以从加压容器或分配器(其中含有合适的推进剂，例如气体(诸如二氧化碳))或喷雾器以气溶胶喷雾形式递送。

全身性施用还可以通过经粘膜的或经皮的方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在该配制品中使用适合有待渗透的障碍的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且对于经粘膜施用而言包括，例如洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。

在施用编码重组蛋白的多核苷酸的那些实施例中，可以使用任何适于施用多核苷酸药剂的方法，诸如基因枪、生物注射器和皮肤贴剂，以及无针方法，诸如微粒DNA疫苗技术(Johnston等人，美国专利号6,194,389)。

可以将这些活性化合物与保护化合物免于从体内快速消除的载剂一起制备，诸如控释配制品，包括植入物。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品可以使用标准技术制备。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。

活性化合物的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过标准制药程序测定，例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的程序来测定。毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且可以表示为LD50/ED50比率。表现出高治疗指数的重组蛋白是优选的。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列用于人类的剂量。优选此类化合物的剂量处于包括ED50在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。该剂量可根据所采用的剂型和所使用的施用途径在该范围内变化。对于本文所述方法中使用的化合物，可以由动物模型初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制一剂量以达到循环血浆浓度范围，该范围包括IC50(试验化合物实现疾病(诸如肥胖)体征半数最大抑制的浓度)。此类信息可用于更准确地测定人类中的有用剂量。血浆水平可以使用常规方法测量。

可以每天一次或多次至每周一次或多次施用组合物，包括每隔一天一次。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，包括但不限于病状的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。而且，用有效量的活性化合物治疗受试者可以包括单一治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。

使用方法

还提供了方法。在一个实施例中，一种方法是用于制备本文所述的Pn3Pase蛋白。在一个实施例中，该方法包括在合适的条件下孵育细胞以表达Pn3Pase蛋白。该细胞可以是但不限于产生Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞或天然存在的细胞。天然存在的细胞的实例是类芽孢杆菌菌株，诸如类芽孢杆菌的种32352。任选地，该方法包括将包含编码Pn3Pase蛋白的编码区的载体引入宿主细胞中。在一个实施例中，该方法包括从细胞或培养基中分离或纯化Pn3Pase蛋白。在Pn3Pase蛋白包括可用于分离或纯化该蛋白的附加氨基酸的那些实施例中，该方法还可包括从该Pn3Pase蛋白上裂解附加氨基酸。

在一个实施例中，一种是用于裂解Pn3P分子的方法。在一个实施例中，该方法包括将Pn3P分子暴露于Pn3Pase蛋白。P3nP分子可以是肺炎链球菌微生物的一部分，例如Pn3P分子可以是肺炎链球菌的荚膜多糖，或者Pn3P分子可以是与肺炎链球菌微生物分开的，例如Pn3P分子可以是分离的。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。在一个实施例中，Pn3P分子在体内，而在另一个实施例中，Pn3P分子在体外。

在一个实施例中，一种方法是用于减少肺炎链球菌表面的III型荚膜多糖的量。该方法包括使其表面上存在III型荚膜多糖的肺炎链球菌与Pn3Pase蛋白接触。Pn3Pase蛋白可以分离或纯化，并且可以存在于组合物中。在一个实施例中，接触可包括将微生物暴露于表达Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。接触可以在适于酶水解III型荚膜多糖的条件下。任选地，和未与Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比，III型荚膜多糖的量减少的肺炎链球菌对巨噬细胞吞噬作用的敏感性增加、补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用增加、或其组合。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物在体内，而在另一个实施例中，肺炎链球菌微生物在体外。

在一个实施例中，一种方法是用于增加至少一种补体成分在肺炎链球菌表面的沉积。该方法包括使其表面上存在III型荚膜多糖的肺炎链球菌与Pn3Pase蛋白接触。Pn3Pase蛋白可以分离或纯化，并且可以存在于组合物中。在一个实施例中，接触可包括将微生物暴露于表达Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。接触可以在适于酶水解III型荚膜多糖的条件下。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物在体内，而在另一个实施例中，肺炎链球菌微生物在体外。

在一个实施例中，一种方法包括治疗受试者中由肺炎链球菌引起的感染。本文所述方法中使用的受试者可以是动物，诸如但不限于鼠类(例如小鼠或大鼠)或人。该方法包括向患有由肺炎链球菌引起的感染的动物施用有效量的组合物。任选地，该方法可以包括确定引起感染的肺炎链球菌是否已经减少。确定感染是否是由肺炎链球菌引起的方法是常规的并且是本领域中已知的。感染可以是局部的或全身性的。局部肺炎链球菌感染的实例是鼻腔例如鼻咽的定植。在一个实施例中，本文所述组合物的局部施用可用于减少受试者的鼻咽定植。肺部的局部肺炎链球菌感染的另一个实例，例如肺炎球菌性肺炎。在一个实施例中，通过例如气溶胶局部施用组合物可用于减轻受试者的肺炎球菌性肺炎。全身性肺炎链球菌感染的实例是受试者的血液中存在肺炎链球菌(例如，菌血症或败血症)。在一个实施例中，肠胃外施用组合物可用于减少受试者的全身性肺炎链球菌感染。在本披露的这一方面，本披露的组合物的“有效量”是能够在接受者中引起所需反应的量，该反应例如为受试者中存在的肺炎链球菌的量减少。减少可以是受试者的鼻咽、肺部或血液中的肺炎链球菌的数量减少。减少可以是与施用该组合物之前的受试者相比，该受试者体内减小至少2倍、至少3倍或至少4倍。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。

在另一个实施例中，一种方法包括治疗动物中可由肺炎链球菌感染引起的某些病状的一种或多种症状。肺炎链球菌感染会引起侵袭性肺炎球菌病。由侵袭性肺炎球菌病引起的病状的实例包括肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎、菌血症和败血症。与这些病状相关的症状包括畏寒、咳嗽、呼吸促迫、呼吸困难、胸痛(肺炎)、落枕、发烧、头痛、精神错乱和畏光(肺炎球菌性脑膜炎)，以及精神错乱、呼吸短促、心律加快、疼痛或不适、过度出汗、发烧和战粟(败血症)。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。

这些病状中的一种或多种的治疗可以是预防性的，或替代性地，可以在本文所述病状发展后开始。例如，在受试者表现出由肺炎链球菌引起的病状的症状之前开始的预防性治疗在本文中称为对“处于发展该病状的风险”的受试者的治疗。通常，“处于发展病状的风险”的动物是可能暴露于引起该病状的肺炎链球菌的动物。因此，组合物的施用可以在本文所述的病状发生之前、期间或之后进行。病状发展之后开始的治疗可导致其中一种病状的症状严重程度降低，包括完全消除这些症状。在本披露的这个方面，“有效量”是有效预防病状的症状表现、减轻病状的症状严重程度和/或完全消除这些症状的量。在一个实施例中，肺炎链球菌微生物是血清型3。

可以根据标准方法测试本文所述的组合物的效力。例如，很好地确立了小鼠用作人类肺炎链球菌感染的实验模型的用途。

试剂盒

本披露还提供了用于制备Pn3Pase蛋白的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒包括足以转化细胞的量的载体，该载体包含编码Pn3Pase蛋白的编码区。在一个实施例中，试剂盒在合适的包装材料中包括基因修饰细胞，该基因修饰细胞包含编码Pn3Pase蛋白的编码区。

在另一个实施例中，本披露还提供了涉及使用Pn3Pase蛋白的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒在合适的包装材料中包括分离或任选纯化的Pn3Pase蛋白。

任选地，还包括其他试剂，诸如缓冲剂或药学上可接受的载剂(在其组成组分中制备或存在的，其中一种或多种组分可以预混合，或者所有组分都可以是分开的)等等。在一个实施例中，蛋白、载体或基因修饰细胞可以与缓冲剂一起存在，或者可以存在于分开的容器中。通常还包括包装成分的使用说明。

如本文所用，短语“包装材料”是指用于储藏该试剂盒内容物的一种或多种物理结构。通过已知方法构建该包装材料，优选地提供一种无菌、无污染物的环境。包装材料具有标签，标签表明内容物可用于转化细胞或产生Pn3Pase蛋白。另外，包装材料含有表明如何使用试剂盒中的材料的说明。如本文所用，术语“包装”是指能够将载体或基因修饰细胞保持在固定限度内的固体基质或材料，诸如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以包括用于容纳适量Pn3Pase蛋白的玻璃或塑料小瓶。“使用说明”通常包括描述试剂浓度或至少一种方法参数的有形表达。

说明性方面

方面1.一种基因修饰细胞，该基因修饰细胞包含成熟Pn3Pase蛋白，其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

方面2.一种基因修饰细胞，该基因修饰细胞包含含有编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列，并且其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

方面3.如方面1或2所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

方面4.如方面1-3中任一项所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

方面5.如方面1-4中任一项所述的基因修饰细胞，其中该细胞是真核细胞。

方面6.如方面1-5中任一项所述的基因修饰细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

方面7.如方面1-6中任一项所述的基因修饰细胞，其中该细胞是原核细胞。

方面8.如方面1-7中任一项所述的基因修饰细胞，其中该细胞是大肠杆菌。

方面9.如方面1-8中任一项所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含异源氨基酸序列。

方面10.如方面1-9中任一项所述的基因修饰细胞，其中该异源氨基酸序列包含标签。

方面11.一种组合物，该组合物包含如方面1-10中任一项所述的基因修饰细胞。

方面12.一种组合物，该组合物包含分离的成熟P3nPase蛋白，其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

方面13.如方面1-12中任一项所述的组合物，其中该蛋白是纯化的。

方面14.一种组合物，该组合物包含分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码成熟Pn3Pase蛋白的编码区，并且其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

方面15.如方面12-14中任一项所述的组合物，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

方面16.如方面12-15中任一项所述的组合物，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

方面17.如方面11-16中任一项所述的组合物，其中该组合物包含药学上可接受的载剂。

方面18.一种方法，该方法包括：在适于具有Pn3Pase活性的蛋白表达的条件下孵育细胞，其中该细胞包含含有编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列，其中该蛋白具有Pn3Pase活性，并且其中该细胞表达该成熟Pn3Pase蛋白。

方面19.如方面18所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

方面20.如方面18-19中任一项所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

方面21.如方面18-20中任一项所述的方法，其中该细胞是基因修饰细胞，并且该多核苷酸是外源多核苷酸。

方面22.如方面18-21中任一项所述的方法，该方法进一步包括分离该蛋白。

方面23.如方面18-21中任一项所述的方法，该方法进一步包括纯化该蛋白。

方面24.如方面18-21中任一项所述的方法，其中该细胞是真核细胞。

方面25.如方面18-24中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

方面26.如方面18-25中任一项所述的方法，其中该细胞是原核细胞。

方面27.如方面18-26中任一项所述的方法，其中该原核细胞是大肠杆菌。

方面28.如方面18-27中任一项所述的方法，其中该蛋白包含异源氨基酸序列。

方面29.如方面18-28中任一项所述的方法，其中该异源氨基酸序列包含标签。

方面30.一种方法，该方法包括：

使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白接触，其中该接触是在适于酶水解III型荚膜多糖的条件下进行的，其中该肺炎链球菌表面上III型荚膜多糖的量和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比减少。

方面31.一种用于增加至少一种补体成分在肺炎链球菌表面的沉积的方法，该方法包括：

使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白接触，其中至少一种补体成分在该肺炎链球菌表面的沉积和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比增加。

方面32.如方面30或31所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

方面33.如方面30-32中任一项所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

方面34.如方面30-33中任一项所述的方法，其中该肺炎链球菌存在于适于该肺炎链球菌复制的条件中。

方面35.如方面30-34中任一项所述的方法，其中该成熟Pn3Pase蛋白是分离的Pn3Pase蛋白。

方面36.如方面30-35中任一项所述的方法，其中该接触包括将该肺炎链球菌暴露于表达该成熟Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。

方面37.如方面30-36中任一项所述的方法，其中该肺炎链球菌和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比，对巨噬细胞吞噬作用的敏感性增加、补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用增加、或其组合。

方面38.如方面30-37中任一项所述的方法，其中该肺炎链球菌存在于受试者中。

方面39.一种用于治疗受试者的感染的方法，该方法包括：

向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

方面40.一种用于治疗受试者的症状的方法，该方法包括：

向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

方面41.一种用于减少受试者中的定植的方法，该方法包括：

向受血清型3肺炎链球菌定植或处于受血清型3肺炎链球菌定植的风险中的受试者施用有效量的包含具有P3nPase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

方面42.如方面39-41中任一项所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

方面43.如方面39-42中任一项所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

方面44.如方面39-43中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

方面45.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，用于在治疗中使用。

方面46.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，作为药剂使用。

方面47.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，用于在病状治疗中使用。

方面48.本文披露的成熟Pn3Pase蛋白用于制备治疗肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎、菌血症、败血症或其组合的药剂的用途。

方面49.包含本文所述的成熟P3nPase蛋白的组合物，用于在治疗或预防由血清型3肺炎链球菌引起的感染或症状中使用。

方面50.一种蛋白、组合物或方法，该蛋白、组合物或方法包括本文所述的一个或多个特征。

实例

本发明通过以下实例来说明。应该理解的是，具体实例、材料、量和程序应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。

实例1

类芽孢杆菌属物种32352的肺炎链球菌3型荚膜特异性糖基水解酶基因的鉴定

摘要

1930年代初，从新泽西州土壤中腐烂的有机质中分离出了‘环状芽孢杆菌约旦菌株32352’。这种土壤细菌产生能够降解肺炎链球菌(Spn)的3型荚膜多糖(Pn3P)的酶。这种酶(Pn3Pase)的早期报道证明了其受Pn3P的可诱导性和对Pn3P的特异性。后来的许多研究都在研究Pn3P生物合成及其抗原特性时采用了Pn3Pase。我们着手克隆这种酶以进行重组表达。我们首先对这一细菌物种的基因组进行了测序，并将产生Pn3Pase的细菌重新分类为“类芽孢杆菌属物种32352”。在这里，我们通过基于质谱的蛋白质组学鉴定了Pn3Pase基因。我们克隆基因用于重组表达，并表征Pn3P酶促解聚后生成的寡糖产物。我们检查了Pn3Pase对活的、正在生长的3型Spn的影响，因此可以将其作为抗这种高毒力血清型Spn的潜在治疗剂进行研究。

1930年，Avery和Dubos从取自蔓越莓沼泽的土壤中分离出一种生物，该生物能够解聚肺炎链球菌3型荚膜多糖(Pn3P)，该多糖是-3)βGlcA(1-4)βGlc的线性聚合物(1-(1,2)。在Pn3P存在下可诱导这种酶(Pn3Pase)的表达，并且该细菌能够以Pn3P作为唯一碳源生长。他们将这种细菌描述为形成孢子的、革兰氏阴性需氧杆菌，带有周生鞭毛。几年后，Sickles和Shaw分离出另外两个类似的菌株，这些菌株展示出靶向Pn3P的相同酶活性(3，4)。这些菌株命名为沼泽芽孢杆菌(Bacilluspalustris)，之后被公认为与环状芽孢杆菌同义(4-6)。除Pn3Pase以外，这些菌株还展示出产生能够解聚肺炎链球菌荚膜血清型2和8的能力，但无细胞提取物中的可溶性蛋白对这些多糖没有活性(3，7)。这些菌株和酶有许多可能的实际应用。例如，研究人员在检查Pn3P的生物合成及其抗原和免疫学特性时应用了Sickles和Shaw的Pn3Pase酶(8-11)。

我们从美国典型培养物保藏中心获得了‘环状芽孢杆菌约旦菌株32352’(即Sickles和Shaw菌株)，并对其基因组进行了测序(12)。16S rRNA分析揭示这种细菌属于类芽孢杆菌科(Paenibacillae)的属，现已鉴定为类芽孢杆菌属物种32352(Pbac)。自1991年确定以来，类芽孢杆菌属物种就受到越来越多的关注(13)。这些微生物是催化各种反应的胞外酶的丰富来源，这些酶已在许多农业和医学应用中展示出实用性(14-19)。类芽孢杆菌属物种32352基因组的碳水化合物活性酶注释数据库(dbCAN)指出了7200个预测基因中的665个碳水化合物活性条目，其中252个显示出糖基水解酶或多糖裂解酶样结构(20)。

我们着手测定产生Pn3Pase的基因的同一性，以表达和利用该酶独特的Pn3P特异性活性。我们假定这种酶作为血清型3肺炎链球菌感染的治疗剂的潜在用途。荚膜多糖(CPS)是3型菌株的主要毒力因子，因为无荚膜的突变体无法定植(21)。CPS的毒力机制是通过抵抗或抑制宿主巨噬细胞的吞噬作用来帮助Spn逃避免疫系统，同时还限制粘液介导的清除(22)。当前的13价疫苗(PCV13)的Pn3P组分诱导对血清型3的可变免疫反应(23，24)。与其他血清型相比，接种PCV13的个体需要对血清型3具有更高的调理吞噬测定血清滴度(25)。尽管当前有针对Spn的疫苗接种计划，但它仍然是世界上最致命的病原体之一。除疫苗接种和抗生素递送外，还必须考虑替代性治疗方法来对抗这些和其他有荚膜的病原体。

这里描述了通过以补充Pn3P的最小培养基生长的培养物上清液制剂的蛋白质组学鉴定类芽孢杆菌Pn3Pase。我们已经克隆了Pn3Pase基因并在大肠杆菌中表达了活性酶。我们已经表征了寡糖产物，并优化了Pn3P解聚的条件。我们评估了该酶降解活的毒力3型Spn菌株上的荚膜的能力，以开始将Pn3Pase作为一种潜在治疗剂进行研究。

结果

Pn3P的利用诱导组织成基因座的基因的表达

我们首先在含有2％葡萄糖或Pn3P作为唯一碳源的最小M9培养基中培养Pbac。通过OD 600nm监测Pbac生长14小时，以实现最大的Pn3Pase产量(图3A)。Pbac能够生长和利用Pn3P及葡萄糖，但无法利用纤维素。将来自这些培养物的上清液浓缩20倍，并通过考马斯染色使蛋白可视化。在Pn3P生长条件下，观察到了突出的～55kDa条带(图3B)。通过溶液中胰蛋白酶消化和LC-MS对这些样品进行蛋白质组学分析，鉴定出两个样品中均存在许多蛋白。但是，如表1突出显示，两种蛋白在Pn3P生长条件下显著富集。

这两种Pn3P诱导的Pbac蛋白似乎组织成利用Pn3P的基因座(图3C)，该基因座由ABC型多糖转运系统、透性酶组分(Pbac_3556)、可能的ABC转运体透性酶蛋白ytcP(Pbac_3555)、脂蛋白(Pbac_3554)、DNA结合反应调控因子、AraC家族(Pbac_3553)、具有s层同源区、glug基序、ig基序的多结构域蛋白(Pbac_3552)和假定蛋白(Pbac_3551)组成。由于这些蛋白中的两种在Pn3P生长条件下更为丰富，因此我们通过RT-PCR比较了该基因座的三个基因与葡萄糖和Pn3P样品中通常表达的表层蛋白(Pbac_1521)的转录。随着Pn3P的利用，基因3551、3552和3554的转录增加～130倍，而在这两种条件下Pbac_1521的mRNA表达没有变化(图3D)。

Pn3Pase鉴定和结构域分析

克隆Pbac_3554、Pbac_3552和Pbac_3551，并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达，以确定负责Pn3P解聚酶活性的上调基因产物。具有图4A所示的一级氨基酸序列的假定蛋白Pbac_3551(登录号WP_079915027)展示出氚放射性同位素标记的Pn3P快速有效地水解，如通过尺寸排阻色谱法分离反应产物时每分钟转变为低分子量寡糖的计数所示(图4B)。进行重组Pn3Pase与未标记Pn3P的反应，点在PVDF膜上，并用Pn3P单克隆抗体探测。在Pn3Pase处理Pn3P 4小时后，与单克隆抗体的反应性完全消失(图4C)。

Pbac_3551的翻译蛋白序列为1,545个氨基酸。通过SignalP 4.1服务器(26)预测从残基1-40裂解信号肽将产生164.1kDa的成熟蛋白。通过InterPro在线软件(27)进行的蛋白序列分析和分类识别了与糖苷水解酶家族39(氨基酸180-353)、半乳糖结合结构域类似物(氨基酸621-765)、与内切1,3-1,4-β葡聚糖酶具有结构相似性的功能未知的结构域DUF1080(氨基酸781-950)和伴刀豆球蛋白A样凝集素/葡聚糖酶结构域(氨基酸1,209-1,348)的同源性(图4D)。虽然该酶的区段显示出与许多碳水化合物活性蛋白的某些同源性，但是在该酶的长度上不存在与已知糖基水解酶家族的整体同源性。

寡糖产物的表征

通过尺寸排阻色谱法分离Pn3Pase水解的寡糖产物。该水解产生了两个主要产物峰，在Superdex肽柱中较晚洗脱，对应于四糖和六糖(图5A-C)。通过电喷雾电离质谱法确认这些峰的特性为四糖(图5B)和六糖(图5C)。质谱数据汇总于表2。

图6中呈现了通过NMR波谱法对寡糖产物的表征。所有异头质子信号均分配在四糖和六糖的代表性¹HNMR波谱中(图6)。残基A、C和E在～4.70ppm的异头质子信号与HOD峰重叠(图6A、4D)，但出现在2D HSQC波谱中(图6B、E)。B-1和D-1的³J_HH耦合常数为8.22Hz，证明是β-键合。5.15(³J_HH＝3.69)和4.58(³J_HH＝8.05)ppm的信号分别对应于GlcA残基F的α-和β-构型。结合HSQC和COSY实验(图6C、F)，我们能够鉴定F-5的质子信号具有高化学位移(～4.05ppm)，表明GlcA残基(F)处于碳水化合物链的还原性末端。这些数据证明，Pn3Pase裂解多糖链中葡萄糖醛酸与葡萄糖之间的β(1-4)键合。

Pn3Pase活性分析

使用氚化Pn3P和重组Pn3Pase进行时程实验，以了解这种酶促降解是通过内切还是外切裂解进行的。在进行给定时间后，通过尺寸排阻色谱法分离反应产物。低分子量寡糖是在反应早期产生的(图7A)。随时间推移，寡糖洗脱体积的CPM增加，且高分子量聚合物的CPM相应降低，表明外切型裂解(图7A)优先产生四糖和六糖(图5A)。随时间推移，峰从左到右的逐渐位移将表明真正的随机内切裂解。

在pH 6.0、7.2和8.0的三种不同缓冲液中进行两小时的反应，通过对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)方法(43)检测还原性末端葡萄糖醛酸的浓度，以确定Pn3Pase的最佳反应条件。Pn3Pase在pH 7.2的磷酸钠缓冲液中显示出比在pH 6.0的MES缓冲液中略佳的活性，但在pH 8.0的Tris缓冲液中在pH 8.0的Tris缓冲液中表现显著更差(图7B)。使用Mg²⁺和Ca²⁺进行重点在于金属离子依赖性的进一步优化。Pn3Pase对Ca²⁺显示出浓度依赖性的偏好，因为它在10mM Ca²⁺的存在下产生更高浓度的还原性末端GlcA(图7C)。

Pn3Pase从正在生长的3型肺炎链球菌上去除荚膜

将3型WU2菌株与添加到生长培养基中的100μg/ml重组酶一起培养10小时，以开始评估Pn3Pase处理正在生长的3型肺炎链球菌的作用。如图8A所示，Pn3Pase处理细胞对细菌生长未展示出不利的生长或细胞毒性作用。另外，以两小时为间隔获得了同等的CFU值(数据未示出)。

然后通过竞争ELISA检查在2μg/ml或10μg/ml Pn3Pase存在下生长的细菌细胞，以确定该酶是否导致正在生长的培养物的荚膜有效脱落。处理后，使用不同浓度的固定全细胞与Pn3P特异性抗体竞争结合Pn3P包被的板。由于缺少荚膜，无荚膜的WU2突变株(JD908)在5x 10⁵CFU/ml浓度下显示出最小抑制，而在5x 10⁴CFU/mL浓度下显示无抑制(图8B)。经热灭活的Pn3Pase处理的细胞展示出最高的抑制百分比，因为细胞表面应完全受CPS装饰(图8B)。采用活性Pn3Pase处理，对抗体结合的抑制作用开始以Pn3Pase浓度依赖性的方式降低(图8B)，表明该酶经过精心设计，可以从活的、正在生长的3型肺炎链球菌上剥离荚膜。

进行时程实验，其中细菌细胞生长到对数中期，悬浮在PBS中，并用1μg/mlPn3Pase处理0、1、2或4小时。鉴于WU2菌株不能在这些条件下活跃生长并产生大量新的CPS，因此本实验降低了Pn3Pase剂量。在PBS中，Pn3Pase的酶活性也比在THY培养基中略佳(数据未示出)。在给定的时间点，将经过处理的细胞固定并如上所述通过竞争ELISA检查。无荚膜的WU2突变株(JD908)同样由于缺少荚膜，在5x 10⁵CFU/ml浓度下显示出极小抑制作用，而在5x 10⁴CFU/mL浓度下显示无抑制作用(图8C)。未处理的细胞表现出最高的抑制百分比，表明细胞表面完全受CPS装饰(图8C)。随着Pn3Pase孵育时间的增加，抗体结合的抑制作用开始显著降低(图8C)，在处理2和4小时后表现为基本上无荚膜。

通过透射电子显微镜检查目测经Pn3Pase处理的细胞，并将其与未处理的和无荚膜的突变株进行比较。未处理的细胞在其表面上显示出厚的完整CPS包衣(图8D左上方)。正如预期的，无荚膜的突变体没有CPS(图8D右上方)。经酶处理的细胞的荚膜层在大多数情况下表现出最小厚度(图8D左下方)，而一些看起来好像它们是无荚膜的(图8D右下方)。

讨论

当对许多先前定义为芽孢杆菌属的菌株进行16S rRNA基因序列的系统发育分析时，类芽孢杆菌属(按拉丁文直译，“几乎是芽孢杆菌”)与真正的芽孢杆菌属物种截然不同(6)。序列分析显示，几个细菌菌株被归类为该属，需要重新分配。属于该属物种已经从水生(29)到沙漠环境(30)，以及从温泉(31)到严寒地区(32)的各种生态位(28)中获得。在土壤(3，33)和植物根部环境(34)中发现了许多类芽孢杆菌属物种，然而，从人类样品中也分离出许多(35)。类芽孢杆菌属物种是多种农业、生物医学和工业产品的丰富来源(28)。显示出许多活性的胞外酶(36)用于生产多种工业上重要的材料(28)。这些种中的许多是已在农业上用于促进作物生长的有效固氮生物(37)。另外，新型抗微生物肽和从类芽孢杆菌中获得的化合物的保护作用已得到证明(38)。

虽然从土壤中分离出类芽孢杆菌属物种32352(3)，但是质疑进化压力以获得能够作用于人类病原体Spn CPS的酶的恰当的。基于早期研究，该特定菌株显示出降解三种不同的肺炎球菌CPS的能力(3，9)。这些是否是酶的天然底物，或其他土壤微生物或植物物质是否具有相似的聚糖残基和键合仍有待研究。

然而，最初获得的类芽孢杆菌属物种32352已使此处描述的Pn3Pase适应于在其代谢中起重要的功能作用。Torriani和Pappenheimer对这个种的早期报道表明，通过在生长培养基中添加Pn3P能够诱导培养物上清液中的Pn3Pase活性(7)。“可诱导性”与Avery和Dubose的发现相反，即Pn3Pase的形成仅在Pn3P作为唯一碳源存在的条件下发生(2)。这里，我们证明虽然细菌生长不需要Pn3P，但它可以用作唯一的营养来源。而且，我们的数据表明Pn3P在Pbac培养基中的存在会诱导Pn3Pase表达。

我们尝试从该菌株的诱导培养物中纯化出数毫克量的活性天然Pn3Pase未成功，但是可以在这些培养物上清液制剂中检测到Pn3P解聚活性。在这项研究中，我们已经从类芽孢杆菌属物种32352中鉴定并克隆了Pn3Pase基因。我们已经对寡糖产物进行了充分表征，并且我们已经证实Pn3Pase可以从活的、正在生长的Spn上快速剥离CPS。未来的研究将评估该酶作为血清型3Spn感染的治疗的实用性。当前的疫苗接种和抗生素施用效率低下，使得发现控制这些和其他有荚膜的病原体的替代治疗方法成为必要。

实验程序

细菌菌株和生长条件

将类芽孢杆菌属物种32352(ATCC 14175)在37℃下在含有5％绵羊血的胰酶大豆琼脂(哈帝诊断(Hardy Diagnostics))上，或在含有1mM MgSO₄、1mM生物素、1mM硫胺素和作为唯一碳源的2％葡萄糖(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))或Pn3P粉末(ATCC 172-X)的基本培养基(M9天惠华(M9Teknoba))中进行有氧振荡培养。将来自Moon Nahm(阿拉巴马大学伯明翰分校)的慷慨礼物3型肺炎链球菌(WU2菌株)和无荚膜衍生物(JD908)在37℃下在含有5％绵羊血的胰酶大豆琼脂(TSAB)上，或在Todd Hewitt肉汤加0.5％酵母提取物(THY)(BD生物科学(BDBiosciences))中进行有氧培养而无需振荡。

培养物上清液的蛋白质组学

如上所述，在5ml含2％(w/v)碳源的基本培养基M9中培养类芽孢杆菌属物种32352。在对数中期(OD600 nm 0.6)收获细菌培养物。使培养物上清液通过0.45μm针头过滤器，并使用截留分子量为10K的microsep高级离心装置(颇尔(Pall))将培养物上清液浓缩至1/20的培养物体积。通过二喹啉甲酸测定法测定蛋白浓度。如前所述(39)进行溶液中胰蛋白酶消化。简言之，将20μg来自培养物上清液的蛋白通过在56℃下与10mM DTT一起孵育1小时而还原，接着在室温下于黑暗中用55mM碘乙酰胺进行羧酰胺甲基化45分钟，然后在37℃下在40mM碳酸氢铵中用1g测序级胰蛋白酶(普洛麦格(Promega))消化过夜。通过添加1％三氟乙酸并在冰上孵育30分钟来终止胰蛋白酶消化。使用C18离心柱(G生物科学(GBiosciences))纯化所得肽，干燥并在0.1％甲酸中重构。使用赛默科技(ThermoScientific)UltiMate 3000系统，在15cm Acclaim^TMPepMap^TMRSLC C18柱(2μm粒径，75μmID)上，使用由1％-100％溶剂B(80％乙腈，0.1％甲酸)组成的180分钟线性梯度在130分钟内以200nL/分钟的流速分离这些肽。将分离的肽直接洗脱到Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))的纳米喷雾离子源中。不锈钢发射器喷雾电压设为2200V，离子传输管的温度设为280℃。使用Orbitrap检测，从m/z 200至2000以60,000的分辨率获取完整的MS扫描，并且在离子阱中对于“最高速度”模式中的最强离子，使用Thermo Xcalibur Instrument Setup 3.0获取通过碰撞诱导的解离(38％碰撞能)而片段化之后的MS²扫描。在Proteome Discoverer 1.4(赛默飞世尔科技)中使用SEQUEST搜索快速注释服务器(40)(RAST)注释的类芽孢杆菌属物种32352的基因组数据库中的原始波谱，完整MS肽容差为10ppm且MS2肽容差为0.3Da。在搜索参数中允许+57.021Da的恒定修改(半胱氨酸残基的羧酰胺甲基化)和+15.995Da的动态修改(甲硫氨酸残基的氧化)。以1％的错误发现率过滤结果进行肽分配。

基因表达

通过RT-PCR进行来自Pn3P诱导基因座的转录物表达水平的比较。如上所述，在5ml含2％(w/v)碳源的基本培养基中培养类芽孢杆菌属物种32352。在对数中期(OD 600nm0.6)收获三份细菌培养物，使用E.N.Z.A.细菌RNA试剂盒纯化RNA，接着如前所述从污染性基因组DNA中进行TRIzol(赛默飞世尔科技)提取RNA(41)。使用nanodrop评估RNA纯度，并使用iscript CDNA合成试剂盒(伯乐公司(BioRad))将1μg RNA用于逆转录反应。在含有iQSYBR绿色主混合物(green mastermix)的MyiQ系统(伯乐公司(BioRad))上，在96孔板中进行实时定量PCR。RT-PCR中使用的引物列于表3。反应在20μl中进行，由10μl SYBR绿色混合物、20ng cDNA和1μM引物混合物组成。反应条件为95℃ 180秒，接着进行45个以下循环：95℃持续10秒、55℃持续20秒和72℃持续30秒。将数据归一化为16S rRNA转录物水平，表达水平的变化按照与含有葡萄糖补充剂的基本培养基的培养物相比的倍数变化来计算。

表3.所用的寡核苷酸。

重组Pn3Pase的产生

使用带有含突出端的B位点的2x铂superfi主混合物(赛默飞世尔科技)，从类芽孢杆菌属物种32352基因组DNA(DNeasy血液和组织试剂盒，凯杰(Qiagen))扩增Pbac_3551(参考序列WP_079915027)、Pbac_3552(参考序列WP_079915028)和Pbac_3554(参考序列WP_079915030.1)的编码区(减去预测信号肽和终止密码子)以促进通过BP反应(赛默飞世尔科技)通路克隆(42)到pDONR221中。用于克隆的引物列于表3。在DH5α转化和DNA序列确认后，进行LR克隆酶反应，将该基因插入到pET-DEST42(赛默飞世尔科技)目的载体中，用于在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达带有羧基端His₆标签的融合蛋白。经pET-DEST42-“Pn3Pase”质粒转化的BL21(DE3)细胞在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下生长，并通过600nm吸光度监测细胞密度。一旦OD 600nm达到0.6，就将细胞转移至25℃，通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷至1mM的终浓度而诱导蛋白表达，并且使细胞培养物孵育8小时(直到A₆₀₀达到～1.1)。通过离心收获细胞。然后在30℃下使细胞重悬于含1mg/ml溶菌酶的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2)中20分钟，探针超声处理2分钟(开20秒，关10秒，循环四次)，在4℃下通过17,000×g离心澄清1小时，使其通过0.45μm针头过滤器。在4℃下用Ni²⁺-NTA树脂纯化重组Pn3Pase，用300mM咪唑洗脱，并将缓冲液更换为pH7.2的PBS。通过二喹啉甲酸测定法测定蛋白浓度。通过在免染tris-甘氨酸凝胶(伯乐公司)上使用凝胶doc EZ成像仪(伯乐公司)目测蛋白来评估纯度。

酶测定

氚化Pn3P测定-通过将2μg/ml重组蛋白或热灭活的对照与10μg/ml³H-Pn3P一起在PBS中孵育来测定针对3型荚膜多糖的重组酶活性。2小时后，通过在100℃下加热5分钟来终止反应。在NGC发现者FPLC系统(伯乐公司)上的superdex肽10/300GL柱(GE)上分离反应混合物。收集1ml的级分，并且在Tri-Carb 2910TR液体闪烁分析仪(珀金埃尔默(PerkinElmer))中计数每个级分每分钟的计数。通过相同的方法分析时程实验。

还原性末端糖测定-通过使用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)方法(43)测量还原性末端的增加来测定重组Pn3Pase水解活性。将在50mM MOPS-NaOH(pH 6.0)、50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)或20mM Tris-HCl(pH 8.0)中含有20μg Pn3P和1μg重组Pn3Pase的反应混合物(200μl)在37℃下孵育1小时，然后在100℃加热5分钟以终止。将反应混合物(40μl)与120μl的1％(w/v)PAHBAH-HCL溶液混合，在100℃下加热5分钟。于透明底部96孔微孔板中，在Biotek synergyH1酶标仪上测量405nm的吸光度。基于在相应缓冲液中通过相同方法生成的GlcA标准曲线计算还原糖的浓度。类似地，在磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中添加MgCl₂或CaCl₂进行金属依赖性测定。

寡糖分析

将Pn3P粉末(2mg)与100μg的Pn3Pase一起在37℃下孵育48小时。通过在100℃下加热5分钟来终止反应，并上样到Superdex肽10/300GL柱(GE)上。在磷酸盐缓冲盐水中以1ml/分钟的流速分离产物并通过折射率进行监测。收集级分(0.5ml)，纯化寡糖峰，在填充的细P2柱(伯乐公司)上脱盐至水中。将脱盐的寡糖冻干，并进行ESI-MS质量测定和NMR结构和还原性末端鉴定。

NMR-将寡糖溶解于400μL ²H₂O(99.9％，密苏里州圣路易斯，西格玛-奥德里奇)中并冻干三次以去除可交换的质子。将样品重新溶解在400μl 99.96％²H₂O中，并转移到NMR微型管中。¹H谱、¹³C谱、¹H-¹H相关谱(COSY)和¹H-¹³C异核单量子相干谱(HSQC)实验全部在带有Topspin 2.1.6软件的Bruker600或800MHz光谱仪上以298K进行。

Pn3Pase处理3型肺炎链球菌

将TSAB板上的新鲜3型肺炎链球菌(WU2)和无荚膜衍生物(JD908)集落接种到THY肉汤中至0.1OD，并如上所述进行培养。在10小时的过程中通过测量OD 600nm监测在100μg/ml Pn3Pase存在下的WU2生长。连同无荚膜衍生物一起，在2μg/ml、10μg/ml或10μ/ml热灭活的Pn3Pase存在下生长的WU2生长6小时，连续稀释并平板接种以测定集落形成单位。通过离心收集培养物，在PBS中洗涤，于冰上在2％多聚甲醛中固定20分钟，再洗涤一次，并悬浮在1ml PBS中。对于时程实验，使WU2和无荚膜菌株生长至对数中期(OD 600nm为0.6)，通过离心收获，在PBS中洗涤，然后悬浮在1ml PBS中。添加1μg/ml Pn3Pase，并在37℃下孵育1、2或4小时。将经过处理的细胞连续稀释，并平板接种以测定集落形成单位，于冰上在2％多聚甲醛中固定20分钟，再洗涤一次，并悬浮于1ml PBS中。

竞争ELISA

在室温下，用在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中的5μg/ml Pn3P包被ELISA板(96孔，能肯(Nunc))过夜。使用Biotek405/LS微孔板洗板机，用PBS+0.1％吐温(PBS-T)20将板洗涤4次。在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时后，在室温下将微孔板与固定的、经处理的细胞一起孵育2小时，这些细胞与Pn3P特异性抗血清在PBS-T中预孵育了30分钟。洗涤板，然后在室温下与1:2000稀释的山羊抗小鼠IgG-AP(南方生物技术(Southern Biotech)#1030-04)在PBS-T中孵育2小时。洗涤后，将板在37℃下用2mg/ml磷酸酶底物(西格玛S0942)在1MTris 0.3mM MgCl₂中孵育～30分钟。在Biotek synergy H1酶标仪上测量405nm的吸光度。通过((未抑制_OD405-受抑制_OD405)/未抑制_OD405)×100来计算抗体结合的抑制百分比。

电子显微镜检查

由佐治亚大学的佐治亚电子显微镜核心机构根据Hammerschmidt等人(44)的改进方法进行电子显微镜检查。于冰上将经过处理的细胞在PBS缓冲液中的2％戊二醛和0.15％钌红中固定1小时，然后用含有0.15％钌红的缓冲液漂洗2次，每次漂洗15分钟。然后在室温下将细胞在含有0.15％钌红的缓冲液中的1％四氧化锇中固定1小时，接着在含有0.15％钌红的缓冲液中漂洗两次，每次漂洗15分钟。将团块在分级乙醇系列(30％、50％、75％、95％、100％和100％)中脱水，在100％丙酮中更换两次，每个步骤15分钟。然后用25％的Spurr树脂和75％的丙酮浸润团块2小时，接着用50％的Spurr树脂和50％的丙酮，75％的Spurr树脂和25％的丙酮，100％的Spurr树脂依次浸润，然后使其在70℃烘箱中聚合24小时。用Diatome钻石刀将样品切成60nm，并在狭缝网格上挑取。网格用几滴乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染，各5分钟，并在两次染色间期用H₂O漂洗30秒。使用在80kV下工作的JEOL JEM1011TEM(美国马萨诸塞州皮博迪市日本电子株式会社(JEOL USA,Peabody,MA))对样品进行评估。

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实例2

酶水解肺炎球菌荚膜多糖致使细菌易受宿主防御

摘要

尽管进行了一个世纪的研究，但肺炎链球菌(Spn)仍然是主要的人类病原体，引起许多疾病，诸如肺炎、脑膜炎和中耳炎。像许多有荚膜的病原体一样，Spn的荚膜多糖(CPS)是在哺乳动物宿主中定植和毒力的关键组分。这项研究旨在评价糖苷水解酶Pn3Pase靶向3型Spn的CPS的保护作用，3型Spn是毒力最强的血清型之一。我们已经评估了Pn3Pase降解3型活菌株上的荚膜的能力。通过体外测定，我们观察到Pn3Pase处理增加了细菌对巨噬细胞吞噬作用的敏感性和补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用。我们已经证明体内Pn3Pase处理减少鼻咽定植，并保护小鼠免受3型Spn引起的败血症。由于血清型分布的转变增加，耐药菌株的增加以及对包括疫苗的血清型的免疫反应不良，有必要研究抗击肺炎球菌感染的方法。这项研究在分子、细胞和系统水平上评价了肺炎球菌CPS与宿主的相互作用，并提供了针对Spn引起的疾病通过酶水解CPS进行的替代治疗方法。

简介

肺炎链球菌(Spn)，是肺炎、脑膜炎和中耳炎的致病因子，仍然是对人类健康的主要威胁。这种细菌可以作为正常共生微生物区系的一部分，稳定地定植于人类鼻咽(1-3)。尽管无症状携带，但定植是主要的传播模式，也是引发疾病的关键步骤(4，5)。大多数Spn菌株在宿主内存活和具有充分致病性的关键组分是荚膜多糖(CPS)(6，7)。CPS是包被细菌整个表面的大而独特的多糖结构。荚膜通过抵抗或抑制宿主巨噬细胞的吞噬作用来帮助Spn逃避宿主免疫系统，同时还限制粘液介导的清除(8-11)。Spn具有90多种独特的荚膜血清型，每一种在单糖组成和键合以及其他修饰(诸如乙酰化)方面都不同(12)。在细菌毒力、表面可及性和抗原性方面的CPS需要，使其成为100多年来疫苗接种研究的目标(12-16)。在提高通过与蛋白载剂结合而利用CPS的肺炎球菌疫苗的免疫原性和功效方面已取得了巨大进步(17，18)。当前的肺炎球菌疫苗旨在针对一些最相关的临床血清型提供血清型特异性保护(12，13)。7价和13价肺炎球菌结合型疫苗PCV7和PCV13(Prevnar；辉瑞(Pfizer))的使用已经取得了重大成功；显著降低了接种和未接种群体的侵袭性肺炎球菌病(IPD)发生率(15，19-22)。

虽然结合型疫苗已有效预防由包括的大多数血清型引起的携带和IPD，但血清型3除外。当前PCV13的3型肺炎球菌多糖(Pn3P)组分诱导对Spn血清型3的免疫反应(23-25)。Pn3P是-3)βGlcA(1-4)βGlc(1-二糖重复单元的线性聚合物，平均分子量>400kDa(26，27)。值得注意的是，血清型3与其他血清型相比，需要显著更高的血清滴度才能调理吞噬性杀伤Spn(12，28，29)。与其他肺炎球菌血清型相比，许多动物模型和流行病学研究已将3型菌株与增加的毒力和死亡风险相关联(30-32)。最近的病例报告证明了由血清型3引起的致命性IPD病例，突出与这种侵袭性血清型相关的并发症增加且结果普遍较差(33)。另外，最近的数据表明，在30％的IPD病例中，Spn菌株对一种或多种抗生素具有抗性(34)。疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)预测Spn的抗生素抗性特征会增加(35，36)。

疫苗接种不能对这种主要人类病原体的最具攻击性的血清型提供充分保护，使得紧急探索3型肺炎球菌感染的替代方法成为必要。这以及抗生素抗性菌株的流行(37，38)使我们重新审视了Avery和Dubos的早期研究，他们发现了一种产生水解Pn3P的酶的土壤细菌(39-41)。先前，我们已经将该细菌鉴定为类芽孢杆菌属物种，克隆了其3型特异性糖基水解酶Pn3Pase，并对其降解产物进行了表征(26，42)。鉴于血清型3Spn的持续流行和严重程度，我们推测了这种纯化蛋白作为高毒力血清型3感染治疗剂的潜在用途。在这里，我们研究了Pn3Pase降解活的3型毒力Spn菌株上的荚膜，并因此致使细菌对宿主免疫清除敏感的能力。

材料和方法

细菌菌株和生长条件

将来自MoonNahm(阿拉巴马大学伯明翰分校)的慷慨礼物3型肺炎链球菌(WU2菌株)和无荚膜衍生物(JD908)(60，61)在37℃下在含有5％绵羊血的胰酶大豆琼脂(TSAB)上，或在Todd Hewitt肉汤加0.5％酵母提取物(THY)(BD生物科学)中进行有氧培养而无需振荡。

小鼠

从塔康生物科学(Taconic Biosciences)(纽约哈德逊(Hudson,NY))获得八周龄的雌性BALB/c小鼠，并饲养在佐治亚大学的中央动物机构中。将小鼠关在微型隔离笼中，并在BSL-2罩下进行处理。

重组Pn3Pase的产生

如前所述，进行较小修改，产生Pn3Pase(26)。简言之，经pET-DEST42-“Pn3Pase”质粒转化的BL21(DE3)细胞在补充有100μg/ml氨苄青霉素的Terrific肉汤中在37℃下生长，并通过600nm吸光度监测细胞密度。一旦OD 600nm达到1.0，就将细胞转移到18℃。通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷至1mM的终浓度而诱导蛋白表达，并且使细胞培养物孵育18小时。通过离心收集细胞，重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2)中，并通过压力裂解进行裂解。裂解物通过在4℃下以17,000×g离心1小时进行澄清，然后通过0.45μm针头过滤器。在4℃下用Ni2+-NTA树脂纯化重组Pn3Pase，用300mM咪唑洗脱，并将缓冲液更换为pH7.2的PBS。根据制造商的说明，通过二喹啉甲酸测定法测定蛋白浓度。通过考马斯染色评价纯度。

Pn3Pase处理3型肺炎链球菌

将TSAB板上的新鲜3型肺炎链球菌(WU2)和无荚膜衍生物(JD908)集落接种到THY肉汤中至0.1OD 600nm，并如上所述进行培养。在10小时的过程中通过测量OD 600nm监测在100μg/ml Pn3Pase存在下的WU2生长。WU2在2μg/ml、10μg/ml或10μ/ml热灭活的Pn3Pase存在下生长6小时，连续稀释并平板接种以测定集落形成单位。通过离心收集培养物，在PBS中洗涤，于冰上在2％多聚甲醛中固定20分钟，再洗涤一次，并悬浮在1ml PBS中。对于时程实验，使WU2和无荚膜菌株生长至对数中期(OD 600nm为0.6)，通过离心收获，在PBS中洗涤，然后悬浮在1ml PBS中。然后，添加1μg/ml Pn3Pase，并在37℃下孵育1、2或4小时。将经过处理的细胞连续稀释，并平板接种以测定集落形成单位，于冰上在2％多聚甲醛中固定20分钟，再洗涤一次，并悬浮于1ml PBS中。

竞争ELISA

在室温下，用在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.0)中的5μg/ml Pn3P包被ELISA板(96孔，能肯)过夜。使用Biotek 405/LS微孔板洗板机，用PBS+0.1％吐温(PBS-T)20将板洗涤4次。在室温下用PBS中的1％BSA封闭1小时后，在室温下将微孔板与固定的、经处理的细胞一起孵育2小时，这些细胞与Pn3P特异性抗血清在PBS-T中预孵育了30分钟。洗涤板，然后在室温下与1:2000稀释的山羊抗小鼠IgG-AP(南方生物技术#1030-04)在PBS-T中孵育2小时。洗涤后，将板在37℃下用2mg/ml磷酸酶底物(西格玛S0942)在1M Tris 0.3mM MgCl2中孵育～30分钟。在Biotek synergy H1酶标仪上测量405nm的吸光度。通过((未抑制_OD405-受抑制_OD405)/未抑制_OD405)×100来计算抗体结合的抑制百分比。

电子显微镜检查

由佐治亚大学的佐治亚电子显微镜核心机构根据Hammerschmidt等人(62)的改进方法进行电子显微镜检查。于冰上将经过处理的细胞在PBS缓冲液中的2％戊二醛、2％多聚甲醛、0.075M赖氨酸-乙酸盐和0.075％钌红中固定1小时，然后用含有0.15％钌红的缓冲液漂洗2次，每次漂洗15分钟。然后在室温下将细胞在含有0.15％钌红的缓冲液中的1％四氧化锇中固定1小时，接着在含有0.15％钌红的缓冲液中漂洗两次，每次漂洗15分钟。将团块在分级乙醇系列(30％、50％、75％、95％、100％和100％)中脱水，在100％丙酮中更换两次，每个步骤15分钟。然后用25％的Spurr树脂和75％的丙酮浸润团块2小时，接着用50％的Spurr树脂和50％的丙酮，75％的Spurr树脂和25％的丙酮，100％的Spurr树脂依次浸润，然后使其在70℃烘箱中聚合24小时。用Diatome钻石刀将样品切成60nm，并在狭缝网格上挑取。网格用几滴乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染，各5分钟，并在两次染色间期用H2O漂洗30秒。使用在80kV下工作的JEOL JEM 1011TEM(美国马萨诸塞州皮博迪市日本电子株式会社(JEOL USA,Peabody,MA))对样品进行评估。

吞噬作用

洗涤对数中期的WU2和JD908(无荚膜)培养物，并在室温下用10μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色30分钟。同时用2μg/ml的活性或热灭活的Pn3Pase处理WU2菌株。充分洗涤细菌细胞团块，悬浮在1ml无菌PBS中。将10⁷个细菌添加到24孔板中含有活性或热灭活的幼兔补体(Pel-Freez)的鼠白血病病毒转化的巨噬细胞系RAW 264.7(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC))的融合单层中并在37℃下孵育1小时。用PBS洗涤孔4次以去除细胞外细菌。在4℃下用2％多聚甲醛固定巨噬细胞15分钟，并从平板上移除。为了进行显微镜检查，在室温下将细胞与1/500稀释的生物素化小麦胚芽凝集素在1％牛血清白蛋白中孵育30分钟，然后与1/1000稀释的链霉亲和素APC(百进生技公司(Biolegend))进行30分钟室温孵育。细胞用40倍物镜成像。在Beckman Cytoflex S细胞仪上进行流式细胞术，并通过FlowJo进行分析。通过散点图在巨噬细胞群上进行细胞门控。非CFSE标记的对照用于门控高荧光细胞群。如上所述，添加活性补体，进行Pn3Pase剂量依赖性实验。

补体沉积

如前所述(63)进行补体沉积测定。将细菌的3型WU2和无荚膜(JD908)菌株重悬于PBS中的3％BSA中。等分试样(在96孔圆底板上的一式两份孔中)用Hoechst 33342染色，并在37℃下用5或50μg/ml的灭活或功能性Pn3Pase处理1小时。将正常小鼠血清(1:10稀释)添加到样品中，在37℃下保持30分钟。洗涤细胞，并在4℃下用针对小鼠补体的FITC偶联的山羊抗体(加利福尼亚州圣塔安娜安倍医疗器械公司(MP BioMedical,Santa Ana,CA))染色30分钟。样品用PBS中的3％BSA洗涤，并重悬于2％多聚甲醛中以固定。然后用流式细胞术分析样品。由Hoechst阳性细胞的门控来计算FITC-A的平均荧光强度(MFI)。

修改的OPA

如前所述进行调理吞噬性杀伤测定，有修改(43)。简言之，在37℃下在96孔圆底板中的一式两份孔中，在调理缓冲液B(OBB，含Ca++/Mg++的无菌1X PBS，0.1％明胶和5％热灭活的FetalClone)中，在有或无Pn3Pase(灭活的或功能性的，浓度为5或50ug/ml)的情况下孵育3型WU2和无荚膜(JD908)菌株1小时或4小时。将人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60(弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC)在含10％热灭活的FetalClone(海克隆(HyClone))和1％L-谷氨酰胺的RPMI中培养。在进行OPA测定之前，使用0.6％N,N-二甲基甲酰胺(DMF，飞世尔(Fisher))使HL-60细胞分化三天，收获并重悬于OBB中。将活性或热灭活的(无补体)幼兔补体(Pel-Freez)以1:5的最终体积添加到HL-60细胞中。将HL-60/补体混合物添加到5×10⁵个细胞/孔的血清/细菌中(对于对照，未添加HL-60/补体；而是添加等体积的OBB缓冲液)。将最终反应物在37℃下孵育1小时。通过在冰上孵育样品大约20分钟来终止反应。然后，将各10μl的反应物稀释至50μl的最终体积，一式两份平板接种到血琼脂板上。将板在厌氧条件下于30℃孵育过夜，并于第二天计数。将每个重复反应归一化为对照样品获得的平均值(无HL-60细胞的反应，存活率100％)，计算存活百分比。

小鼠鼻内定植

基本上如Puchta等人(64)所述进行鼻内定植。用无菌PBS洗涤对数中期WU2培养物，并以10⁸CFU/ml或10⁶CFU/10μl的浓度悬浮。如前所述，为多组5至10只未麻醉的8周龄雌性BALB/c小鼠(塔康(Taconic))鼻内接种10⁶CFU/10μl。在第0、3和7天，用10μl作为媒介物的PBS对小鼠进行接种，或在第0天、第0和3天或第0、3和7天通过施用50μg在10μl PBS中的Pn3Pase来处理小鼠。在第10天，通过用PBS冲洗鼻咽，将25号针插入气管以使500μl通过鼻孔排出，获得鼻灌洗液。将连续稀释的鼻灌洗液平板接种在含5％绵羊血的胰酶大豆琼脂(TSAB)上，以对集落形成单位计数。根据制造商的说明进行夹心ELISA(百进生技公司小鼠ELISA MAX)，以测定灌洗液中的IL-6和TNFα细胞因子水平。

小鼠败血症攻击

用无菌PBS洗涤对数中期WU2培养物，并以5×10³CFU/100μL的浓度悬浮。为多组4只未麻醉的8周龄雌性BALB/c小鼠(塔康)腹膜内(I.P.)注射5×10³CFU。在0时或在感染后立即为对照小鼠腹膜内注射5μg在100μL PBS中的热灭活Pn3Pase。在感染后0时、12或24小时，为经过处理的小鼠腹膜内施用溶于100μL PBS中的0.5μg或5μg Pn3Pase。每12小时监测一次动物。

结果

Pn3Pase从正在生长的3型Spn上去除荚膜

将有荚膜的3型WU2菌株与添加到生长培养基中的重组酶一起培养10小时，并通过测量600nm的OD来监测细菌生长，以评估Pn3Pase处理对正在生长的3型Spn的影响。Pn3Pase处理细胞对细菌未展示出不利的生长或细胞毒性作用(图9A)。在同一实验中，我们以两小时的间隔获得了酶处理组和未处理组的同等CFU值(数据未示出)。为了评估酶处理对细菌存活率的直接影响，分离出对数期培养物并将其悬浮在含有活性或热灭活Pn3Pase的无营养缓冲液中。经酶处理的细胞在8小时的时程中显示出与灭活和PBS对照同等的计数(图9B)。

然后通过竞争ELISA检查在Pn3Pase存在下生长的细菌细胞，以确定该酶是否导致正在生长的培养物的荚膜有效去除。处理后，使用两个不同浓度的固定全细胞与Pn3P特异性抗体竞争结合Pn3P包被的板。无荚膜的WU2突变菌株(JD908)由于缺少荚膜，对抗体结合显示出极小的抑制作用或没有抑制作用。经热灭活的Pn3Pase处理的细胞展示出最高的抑制百分比，因为细胞表面应完全受CPS装饰。采用活性Pn3Pase处理，对抗体结合的抑制作用开始以Pn3Pase浓度依赖性方式降低(图10A)，表明该酶从活的、正在生长的3型Spn上剥离荚膜。

进行时程实验，其中细菌细胞生长到对数中期，悬浮在PBS中，并用Pn3Pase处理0、1、2或4小时。鉴于WU2菌株不能在这些条件下活跃生长，因此不能产生大量新的CPS，本实验将Pn3Pase剂量降至1μg/ml。在每个时间点，将经过处理的细胞固定并如上所述通过竞争ELISA检查。无荚膜的WU2突变菌株(JD908)同样由于缺少荚膜，显示出极小的抑制作用或没有抑制作用。未处理的细胞表现出最高的抑制百分比，表明细胞表面完全受CPS装饰。随着Pn3Pase孵育时间的增加，抗体结合的抑制作用开始显著降低，在处理2或4小时后表现为基本上无荚膜(图10B)。

通过透射电子显微镜术目测经Pn3Pase处理的细胞，并将其与经热灭活的Pn3Pase处理的细胞进行比较。经热灭活的酶处理的细胞在其表面上显示出厚而完整的CPS包衣(图10C)，这无疑与无荚膜的突变体(图10D)截然不同。经酶处理的细胞的荚膜层几乎没有荚膜(图10E)，表现为无荚膜。

Pn3Pase处理3型Spn允许吞噬细胞摄取和杀伤

CPS的主要毒力机制是为细菌提供抵抗宿主吞噬细胞吞噬作用的能力(1，6)。为了研究Pn3Pase处理对体外巨噬细胞摄取的影响，我们用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)对对数中期细菌培养物进行染色，然后用Pn3Pase处理，接着与RAW 264.7巨噬细胞一起孵育。然后将巨噬细胞充分洗涤并通过荧光显微镜术成像(图11A)。通过流式细胞术定量巨噬细胞的细菌摄取程度。巨噬细胞对经酶处理的细菌摄取比有荚膜的菌株显著更多。然后，我们测定了荧光巨噬细胞的百分比，荧光巨噬细胞的百分比代表荧光细菌的吞噬作用(图11C-D)。与热灭活的Pn3Pase一起孵育的有荚膜的3型菌株具有极少荧光标记的吞噬细胞，而巨噬细胞对经Pn3Pase处理的细菌的摄取与无荚膜的突变菌株一样有效。正如在补体存在下细菌摄取更高所证明的那样，摄取部分依赖于补体(图11C)。Pn3Pase处理致使细菌以剂量依赖性方式对RAW巨噬细胞的吞噬性吞没更敏感，而即使高剂量的灭活酶对细菌摄取也没有显著影响(图11D)。

肺炎球菌表面的补体沉积是有助于有效吞噬和清除的重要机制(10，11)。由于CPS为细菌提供了补体逃避特性(10，11)，我们研究了通过Pn3Pase处理去除荚膜对细菌表面C3b沉积的影响。用有活性或无活性的Pn3Pase处理有荚膜的3型WU2菌株。包括未处理的3型菌株和无荚膜的突变体作为附加对照。然后将细菌与正常小鼠血清一起孵育，洗涤，并用针对小鼠补体的FITC偶联抗体染色。然后用流式细胞术分析固定的样品。以剂量依赖性方式，Pn3Pase处理增加了补体在细菌表面的沉积，达到在无荚膜菌株上的沉积水平。补体与未处理或经灭活的Pn3Pase处理的细菌具有极少结合(图12)。

评估对Spn吞噬性杀伤作用的标准体外测定法是调理吞噬测定(OPA)，其中使HL-60细胞分化为嗜中性粒细胞，以吞没和清除抗体调理细菌。在许多疫苗研究中，该方法已广泛用于测量抗体反应的质量(43-48)。嗜中性粒细胞是针对肺部病原菌的先天免疫的最重要组分之一(49-51)。虽然这项研究的重点不是针对Spn的体液免疫反应，但我们已使用修改的OPA评价了补体介导的对经体外Pn3Pase处理的3型Spn的嗜中性粒细胞杀伤作用。将有荚膜的3型Spn与活性或热灭活的Pn3Pase一起孵育。将分化的HL-60细胞与活性或热灭活的补体预孵育。将HL-60细胞和补体的混合物添加到细菌中，并在37℃下孵育1小时。为了定量实验组中存活的细菌，将反应混合物平板接种并在第二天对CFU计数。将每个重复反应归一化为从不含嗜中性粒细胞的反应(用作对照样品)中获得的平均值(100％存活率)，计算存活百分比。未经酶处理的、有荚膜的3型菌株能够逃避嗜中性粒细胞的杀伤，显示出最大存活率，而无荚膜的突变菌株在与活性补体和嗜中性粒细胞一起孵育后，活力降低至近40％(图13)。Pn3Pase处理去除荚膜致使3型菌株对补体依赖性嗜中性粒细胞的杀伤敏感，与无荚膜的菌株相似(图13)。

Pn3Pase限制鼻咽定植

为了研究体内酶的保护能力，我们首先对BALB/c小鼠进行了鼻内定植实验。Spn的鼻部定植对于向侵袭性肺炎球菌病的过渡必不可少(4，5)。已经确定鼻内定植需要该菌株的荚膜(6)。因此，我们使用鼻部定植模型评估Pn3Pase通过去除定植3型菌株的荚膜而减少鼻咽中细菌定植的能力。我们首先确认无荚膜的突变体JD908未能定植于鼻咽(数据未示处)。然后，为多组小鼠鼻内接种10⁶个在10μl PBS中的对数期野生型(wt)的有荚膜的细菌。用Pn3Pase或缓冲液对照追踪所有接种物。在第0天，第0天和第3天或第0、3和7天向各组定量给予该酶，以评估多次施用的效果。对小鼠施安乐死，并在第10天对细菌载量进行定量。获得鼻灌洗液，连续稀释并平板接种以对细菌载量进行计数。经媒介物对照处理的小鼠定植的细菌载量比仅用单剂量的Pn3Pase处理的小鼠显著更高。施用两个或三个剂量的Pn3Pase使得大部分动物灌洗液中没有任何活细菌集落(图14A)。肺匀浆和血清样品未显示细菌负荷的证据(数据未示出)。通过ELISA测量鼻灌洗液中的标志性促炎细胞因子水平(52)。与经Pn3Pase处理的动物相比，经媒介物处理的小鼠具有显著增加的细胞因子IL-6和TNFα水平，这反映了该组中宿主对细菌负荷的持续炎症反应(图14B-C)(52)。在第0天即使在单剂量的Pn3Pase之后，在大多数动物中也观察到IL-6和TNFα的显著减少。单剂量组中细菌载量较高的小鼠导致该组细胞因子水平增加。

Pn3Pase保护小鼠免受致死性攻击

为了进一步评估Pn3Pase的保护能力并评价Pn3Pase作为治疗剂的实用性，我们采用腹膜内(I.P.)败血症模型(53，54)。使多组小鼠感染5×10³CFU的对数期WU2 3型Spn菌株。我们评估了在感染后0时、12或24小时施用的5μg或0.5μg单剂量的作用。用热灭活的酶处理的对照组在感染48小时内死亡。无论酶剂量或施用时间如何，所有处理组均未显示出疾病迹象，并且受到全面保护而免受I.P.攻击(图15)。

讨论

这项研究旨在评价碳水化合物降解酶(糖苷水解酶)Pn3Pase靶向病原细菌血清型3Spn的CPS的保护作用。Spn引起的侵袭性肺炎球菌病(IPD)一直以来都是对人类健康的主要威胁，其死亡率惊人。尽管有全球疫苗接种计划并使用了抗生素，但Spn仍然是全世界最致命的感染因子。肺炎球菌疫苗是凭经验生产的，并且具有可变/弱的免疫原性，特别是在老年人和免疫功能低下的个体中。针对IPD广泛使用抗生素已导致抗药性肺炎球菌菌株的传播(34，35)。这项研究针对IPD现有疫苗和抗生素解决方案的缺点提供了替代性靶向治疗方法。

首先，我们证明Pn3Pase可以有效地从活的肺炎球菌上去除荚膜，而对细胞没有杀菌作用。通过体外测定，我们观察到Pn3Pase处理增加了细菌对巨噬细胞系吞噬作用的敏感性。这些结果令人鼓舞，因为荚膜是使Spn抵抗宿主吞噬细胞的吞没的主要宿主免疫逃逸组分(9)。然后我们得出结论，酶处理显著增加了补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用。单剂量的Pn3Pase使3型Spn的鼠鼻咽定植显著减少，表明该酶可以起预防措施的作用以控制该血清型在高危群体中的定植。最后，进行腹膜内攻击以评估败血症模型中Pn3Pase的保护能力。值得注意的是，感染后24小时施用0.5μg的单个低剂量能够保护100％受攻击的小鼠免受细菌攻击，而经对照处理的动物存活不超过48小时。在该模型中Pn3Pase的强大保护能力证明，即使在低剂量下，宿主体内的酶活性也足以有效降解荚膜。

鉴于Pn3Pase对肺炎球菌感染具有治疗潜力，将需要解决与该酶的应用有关的实际问题，诸如免疫原性、施用途径和底物特异性(55)。我们对攻击实验中针对Pn3Pase产生的抗体滴度的初步评估未观察到针对有效剂量的酶产生的IgM或IgG反应。未来的研究将评价对Pn3Pase的体液和细胞免疫反应，并研究替代施用途径，诸如用于菌血症模型的静脉途径或用于肺炎模型的雾化喷雾途径。通过气溶胶喷雾递送至呼吸道的酶的有用实例是称为Pulmozyme的重组人脱氧核糖核酸酶，该酶用于减轻囊性纤维化患者由分泌的DNA引起的气道阻塞(56)。使用Pn3Pase作为治疗剂的另一个潜在问题是其对宿主聚糖的活性。需要评估Pn3Pase对与Pn3P结构相似的哺乳动物聚糖的松弛底物特异性。

除了Pn3Pase作为治疗性酶的高潜力外，从结构/功能的角度来看，这种糖基水解酶还具有独特的特性，因为它不属于当前确立的糖基水解酶碳水化合物活性酶(CAZY)家族(57)。对该蛋白结构特性的进一步检查可导致发现对其他独特细菌CPS具有活性的结构相似的酶。未来的研究将探索用于对抗其他流行性肺炎球菌血清型和其他有荚膜的致病细菌的酶的存在。基于早期研究，表达Pn3Pase的天然物种具有降解另外两种肺炎球菌CPS的能力(58，59)。虽然从土壤中分离出了表达Pn3Pase的类芽孢杆菌属物种(26，42，59)，但质疑这个种为何会进化为拥有此类能够降解人类病原体荚膜的酶是适宜的。这些是否是酶的天然底物，从而表明共同进化的关系，或其他土壤微生物或植物是否表达相似的聚糖残基和键合仍有待探索。

这里呈现的结果表明，CPS的酶水解可能是Spn和潜在的其他重要的有荚膜的病原体(诸如脑膜炎奈瑟球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))引起的疾病的有效替代或补充治疗方法。总的来说，这项研究是对糖苷水解酶Pn3Pase的保护作用的首次综合评价，Pn3Pase通过靶向荚膜多糖而使原本致命的细菌病原体变弱。

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本文引用的所有专利、专利申请和出版物，和以电子方式可获得的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSe中的核苷酸序列提交，和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中经注释的编码区的翻译)的完整披露内容通过援引以其全文并入本文。出版物中援引的补充性材料(如补充性表、补充性图、补充性材料和方法和/或补充性实验数据)同样地通过援引以其全文并入本文。在本申请的披露内容和通过援引并入本文的任何文件的披露内容之间存在任何不一致性的情况下，本申请的披露内容应当占据主导。仅出于清楚理解起见给出以上详细说明和实例。不应将其理解成不必要的限制。本披露不限于所显示和描述的这些精确细节，对于本领域技术人员而言明显的变化将包含在由权利要求书所限定的披露内容内。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示组分的量、分子量等的所有数字均应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非另外指出相反，否则在说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本披露所寻求获得的所需性质而变化。至少，并不是试图将等同原则限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。

尽管阐述本披露广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中列出的数值是尽可能精确地报告的。然而，所有数值固有地含有一个范围，该范围必然是其各自的测试测量中存在的标准偏差所产生的。

所有标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思，除非如此说明。

Claims (50)

1.一种基因修饰细胞，该基因修饰细胞包含成熟Pn3Pase蛋白，其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

2.一种基因修饰细胞，该基因修饰细胞包含含有编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列，并且其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

3.如权利要求1或2所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

4.如权利要求3所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5.如权利要求1或2所述的基因修饰细胞，其中该细胞是真核细胞。

6.如权利要求5所述的基因修饰细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

7.如权利要求1或2所述的基因修饰细胞，其中该细胞是原核细胞。

8.如权利要求7所述的基因修饰细胞，其中该细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求1或2所述的基因修饰细胞，其中该蛋白包含异源氨基酸序列。

10.如权利要求9所述的基因修饰细胞，其中该异源氨基酸序列包含标签。

11.一种组合物，该组合物包含如权利要求1或2所述的基因修饰细胞。

12.一种组合物，该组合物包含分离的成熟P3nPase蛋白，其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

13.如权利要求12所述的组合物，其中该蛋白是纯化的。

14.一种组合物，该组合物包含分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码成熟Pn3Pase蛋白的编码区，并且其中该蛋白具有Pn3Pase活性。

15.如权利要求12或14所述的组合物，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

16.如权利要求15所述的组合物，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

17.如权利要求12或14所述的组合物，其中该组合物包含药学上可接受的载剂。

18.一种方法，该方法包括：

在适于具有Pn3Pase活性的蛋白表达的条件下孵育细胞，其中该细胞包含含有编码区的多核苷酸，其中该编码区包含编码成熟Pn3Pase蛋白的核苷酸序列，其中该蛋白具有Pn3Pase活性，并且其中该细胞表达该成熟Pn3Pase蛋白。

19.如权利要求18所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

20.如权利要求19所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

21.如权利要求18所述的方法，其中该细胞是基因修饰细胞并且该多核苷酸是外源多核苷酸。

22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，该方法进一步包括分离该蛋白。

23.如权利要求18-21中任一项所述的方法，该方法进一步包括纯化该蛋白。

24.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中该细胞是真核细胞。

25.如权利要求24所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

26.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中该细胞是原核细胞。

27.如权利要求26所述的方法，其中该原核细胞是大肠杆菌。

28.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中该蛋白包含异源氨基酸序列。

29.如权利要求28所述的方法，其中该异源氨基酸序列包含标签。

30.一种方法，该方法包括：

使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白接触，其中该接触是在适于酶水解III型荚膜多糖的条件下进行的，其中该肺炎链球菌表面上III型荚膜多糖的量和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比减少。

31.一种用于增加至少一种补体成分在肺炎链球菌表面的沉积的方法，该方法包括：

使包含III型荚膜多糖的肺炎链球菌与具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白接触，其中至少一种补体成分在该肺炎链球菌表面的沉积和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比增加。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

33.如权利要求32所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

34.如权利要求30或31所述的方法，其中该肺炎链球菌存在于适于该肺炎链球菌复制的条件中。

35.如权利要求30或31所述的方法，其中该成熟Pn3Pase蛋白是分离的Pn3Pase蛋白。

36.如权利要求31或32所述的方法，其中该接触包括将该肺炎链球菌暴露于表达该成熟Pn3Pase蛋白的基因修饰细胞。

37.如权利要求31或32所述的方法，其中该肺炎链球菌和未与该Pn3Pase蛋白接触的肺炎链球菌相比，对巨噬细胞吞噬作用的敏感性增加、补体介导的嗜中性粒细胞杀伤作用增加、或其组合。

38.如权利要求31或32所述的方法，其中该肺炎链球菌存在于受试者中。

39.一种用于治疗受试者的感染的方法，该方法包括：

向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

40.一种用于治疗受试者的症状的方法，该方法包括：

向具有血清型3肺炎链球菌引起的感染或有该感染风险的受试者施用有效量的包含具有Pn3Pase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

41.一种用于减少受试者中的定植的方法，该方法包括：

向受血清型3肺炎链球菌定植或处于受血清型3肺炎链球菌定植的风险中的受试者施用有效量的包含具有P3nPase活性的成熟Pn3Pase蛋白的组合物。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中该蛋白包含与选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中氨基端氨基酸选自SEQ ID NO:2的残基2至64中的任一个，并且羧基端氨基酸是SEQ ID NO:2的残基1545。

43.如权利要求42所述的方法，其中该蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸41-1545具有至少80％同一性的氨基酸序列。

44.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

45.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，用于在治疗中使用。

46.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，作为药剂使用。

47.一种本文披露的成熟Pn3Pase蛋白，用于在病状治疗中使用。

48.本文披露的成熟Pn3Pase蛋白用于制备治疗肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、中耳炎、菌血症、败血症或其组合的药剂的用途。

49.包含本文所述的成熟P3nPase蛋白的组合物，用于在治疗或预防由血清型3肺炎链球菌引起的感染或症状中使用。

50.一种蛋白、组合物或方法，该蛋白、组合物或方法包括本文所述的一个或多个特征。

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