JP2014529396A - パスツレラワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、哺乳動物又は鳥類における細菌性パスツレラ感染症を治療及び/又は予防するためのN-グリコシル化タンパク質であって、タンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化N-X-S/Tコンセンサス配列を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体である、N-グリコシル化タンパク質に関する。また、本発明は、細菌性パスツレラ感染症を有するか、発症しやすい哺乳動物又は鳥類を治療及び/又は保護するための対応する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記N-グリコシル化タンパク質を生産する方法を記載する。

Description

本発明は、哺乳動物又は鳥類における細菌性パスツレラ感染症を治療及び/又は予防するためのN-グリコシル化タンパク質であって、タンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化N-X-S/Tコンセンサス配列を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体である、N-グリコシル化タンパク質に関する。また、本発明は、細菌性パスツレラ感染症を有するか、発症しやすい哺乳動物又は鳥類を治療及び/又は保護するための対応する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、前記N-グリコシル化タンパク質を生産する方法について記載する。
パスツレラ科は、アクチノバチルス(Actinobacillus)、アグリゲイティバクター(Aggregatibacter)、アビバクテリウム(Avibacterium)、バスフィア(Basfia)、ビベルスティニア(Bibersteinia)、シェロノバクター(Chelonobacter)、ガリバクテリウム(Gallibacterium)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ヒストフィルス(Histophilus)、ロネピネラ(Lonepinella)、マンヘミア(Mannheimia)、ニコレテラ(Nicoletella)、パスツレラ(Pasteurella)、フォコエノバクター(Phocoenobacter)及びボルクリバクター(Volucribater)属を含む、グラム陰性プロテオバクテリアの多くの様々なファミリーを含む。これらの属に示した一部の種、例えばヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)又はマンヘミア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)はヒト又は動物の重要な病原体であるが、他の種はほとんどが上気道における、動物及びヒトの粘膜の共生細菌である。ヘモフィルス・インフルエンザは、ヒトの様々な呼吸器疾患の病因となっており、子どもにおいては髄膜炎の病因としても知られている。別のパスツレラ科はヒトにおいて歯肉炎及び軟性下疳を誘発し、別の多くのパスツレラ科は重要な獣医学上の病原体であって、例えばマンヘミア・ヘモリチカはウシの気管支肺炎の病因であり、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae)はヒツジ肺炎の病因であり、又はヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)はブタの重度の多発性漿膜炎の病因である。
グリコシル化ヘモフィルス・インフルエンザHMW1アドヘシンは、ヘモフィルス・インフルエンザ疾患の病因における重要な初期段階で、呼吸上皮細胞への接着を媒介する。HMW1中のすべてのグリコシル化部位はアスパラギン残基である。グリコシル化酵素はHMW1Cと呼ばれるタンパク質であり、グルコース及びガラクトースを転移し、さらにヘキソース-ヘキソース結合を形成する。アクチノバチルス・プリューロプニューモニアタンパク質のApHMW1Cは、HMW1Cと高レベルの相同性を共有する。ApHMW1CはN-グリコシルトランスフェラーゼ活性を有し、グルコースとガラクトースをタンパク質HMW1のアスパラギン部位へ転移する。さらに、ApHMW1CはHMW1Cの欠失を補完し、全細菌でHMW1グリコシル化と接着活性を媒介する。しかしこれまでのところ、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアでのタンパク質のグリコシル化を示す証拠はない(Choi et al., PLoS ONE 5(12): e15888. doi:10.1371/journal.pone.0015888, 2010)。
アクチノバチルス・プリューロプニューモニアゲノムのファージ発現ライブラリーがスクリーニングされ有望なワクチン成分が同定された。免疫反応性ファージ内のオープンリーディングフレームがコンピューターで分析され保存型外膜タンパク質が同定されたが、そのうちの4つ、すなわちcomL、lolB、IppC及びompAは、抗原性の高度に保存されたin vivo発現外膜タンパク質であった。しかし、検出可能な特異的抗体応答にもかかわらず、これらのタンパク質はいずれもブタ保護試験において同種のアクチノバチルス・プリューロプニューモニア株のコロニー形成と感染からブタを保護することができないことが個別に証明された(Oldfield et al., Vaccine 26, 1942-1954, 2008)。
ブタ保護試験において、組換え型AasPに対する検出可能な特異的抗体応答、スブチリシン様のセリンプロテアーゼ及びアクチノバチルス・プリューロプニューモニアの保存された外膜局在自動トランスポータータンパク質が誘導された。しかし、そのワクチンはコロニー形成、感染又は重度の臨床疾患からブタを保護することができず、その結果、同種のアクチノバチルス・プリューロプニューモニア株の攻撃を受けることが明らかにされた(Oldfield et al., Vaccine 38:5278-83, 2009)。
ブタのウシ肺疫はアクチノバチルス・プリューロプニューモニア感染が原因であり、畜産業に多大な経済的損失をもたらす。農畜産業において抗生物質の使用低減が要望されたため、病気予防のより安全でコスト効率の高い効果的手法としてワクチン接種が始まった。表面の多糖に基づいて、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアの15種のセロタイプが識別されている(Blackall et al., Vet Microbiol 84, 47-52, 2002)。セロタイプが多いことから有効なワクチン接種が困難となっていた。死滅全細胞ワクチンは致死率を下げるが、セロタイプ特異的な免疫しかもたらさない(Nielsen, Nord Vet Med 36, 221 -234, 1984)。しかし、1つのセロタイプによる自然感染又は実験的感染があると一般に異種攻撃感染から保護され、このことは交差防御能があって、感染中に暴露されるが、死滅全細胞調製物中には保持されない、共通抗原が存在することを示唆している(Haesebrouk et al., Vet Microbiol 52, 277-284, 1996)。また各種の精製抗原、例えば、Apx毒素(Devenish et al., Infect Immun 58, 3829-3832,1990)、リポ多糖(Rioux et al., Res Vet Sci 65, 165-167, 1998)及び外膜タンパク質、例えばOmlA(Gerlach et al., Infect Immun 61 , 565-572 , 1993)、TbpA (Rossi-Campos et al., Vaccine10, 512-518, 1992)、AasP (Oldfield et al., Vaccine 27, 5278-5283, 2009)、ComL, LolB, LppC及びOmpA (Oldfield et al., Vaccine 26, 1942-1954, 2008)がワクチン候補として研究されてきた。一般的に、異なるセロタイプの間で保存されている単一タンパク質による免疫化は特異的防御免疫応答を生じるが、弱い防御免疫応答である。Apx毒素をベースとしたワクチンは臨床症状を軽減することができるが、部分的な保護しか提供できず、このことから有効な交差防御能のあるワクチンには数種類の抗原が必要とされ得ることが示唆される。最近の市販ワクチンであるPorcilis APP(Intervet;現在Merck Animal Health)は、42-kDa外膜タンパク質と、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア株によって産生されるApxI、ApxII及びApxIIIの3種のトキソイドを含んでいる。この製品は、急性疾患の予防には有効であると考えられるが、コロニー形成は阻止できず、交差防御も広範囲ではない(Tumamao et al., Aust Vet J 82, 773-780, 2004a, 2004b)。
パスツレラ科ファミリー由来の種に対する別の市販ワクチン剤としては「Bovigrip」(Intervet;現在Merck Animal Health)が挙げられるが、これは不活性化マンヘミア・ヘモリチカで部分的に構成されるウシワクチンである。またこの種には、ワクチン剤の「Pastobov」(Merial)及び「RispovalPasteurella」(Pfizer)が含まれる。
Choi et al., PLoS ONE 5(12): e15888. doi:10.1371/journal.pone.0015888, 2010 Oldfield et al., Vaccine 26, 1942-1954, 2008 Oldfield et al., Vaccine 38:5278-83, 2009 Blackall et al., Vet Microbiol 84, 47-52, 2002 Nielsen, Nord Vet Med 36, 221 -234, 1984 Haesebrouk et al., Vet Microbiol 52, 277-284, 1996 Devenish et al., Infect Immun 58, 3829-3832,1990 Rioux et al., Res Vet Sci 65, 165-167, 1998 Gerlach et al., Infect Immun 61 , 565-572 , 1993 Rossi-Campos et al., Vaccine10, 512-518, 1992 Oldfield et al., Vaccine 27, 5278-5283, 2009 Tumamao et al., Aust Vet J 82, 773-780, 2004a, 2004b Mohorko et al., J Inherit Metab Dis. 2011 Aug;34(4):869-78 Nothaft H, Szymanski CM: Nat Rev Microbiol. 2010 Grass et al., Mol Microbiol. 2003 May;48(3):737-51 Schwarz et al., 2011 , J Biol Chem. 2011 Oct 7; 286(40):35267-74 H. C. Ansel and N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990) Pastoret et al., Veterinary Vaccinology, Elsevier March 1999 Hanahan1983; J MolBiol166(4): 557-80 Herrero, M., V. de Lorenzo, et al. (1990). J Bacteriol172(1 1 ): 6557-67. Miller, V. L. and J. J. Mekalanos (1988). J Bacteriol170(6): 2575-83 Lefebre, M. D. and M. A. Valvano (2002),Appl Environ Micro-biol68(12): 5956-64 Schulz H, Hennecke H, Thony-Meyer L. (1998) Science. Aug 21 ;281 (5380):1 197-200 Schwarz et al., Nat Chem Biol 2010 Apr;6(4):264-6 Kunzler M et al, Methods Enzymol. 2010;480:141 -50 Lizak C et al., Nature. 2011 Jun 15 ;474(7351 ):350-5 Schwarz et al., J Biol Chem. 2011 Oct 7 ;286(40):35267-74 Cawthraw S et al., 1994 Avian Diseases 38:341-349 Clarke et al. (2008) Embo J27, 2780-2788 Kohda et al. (2007) Glycobiology17, 1 175-1 182 Hansen et al. (2008) Biopolymers89, 1179-1193 Chen, M. M., Glover, K. J., and Imperiali, B. (2007) Biochemistry46, 5579-5585
上記の観点から、本発明の目的は、好ましくは急性疾患の予防に有効であり、コロニー形成を阻止し、さらに異なるセロタイプの間で幅広い交差防御能を有する、パスツレラ科ファミリーのメンバーが病因である感染、特にヘモフィルス、ヒストフィルス、マンヘミア及びアクチノバチルスのメンバーが病因の感染を治療及び/又は予防するためのワクチンを提供することである。特に、本発明の目的は、哺乳動物及び鳥類、特に家畜及びペット動物におけるアクチノバチルス・プリューロプニューモニア、マンヘミア・ヘモリチカ、ヘモフィルス・パラスイス及びヒストフィルス・ソムニ(Histophilus somni)感染を治療及び/又は予防するための安全で、コスト効率が良く、効果的なワクチンを提供することである。さらに、本発明の目的は、哺乳動物及び鳥類のパスツレラ感染を分析する方法を提供することである。
上記目的は、哺乳動物又は鳥類における細菌性パスツレラ感染症を治療及び/又は予防するN-グリコシル化タンパク質であって、タンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化N-X-S/Tコンセンサス配列(配列中、Xはプロリンではない)を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体である、N-グリコシル化タンパク質を提供することにより解決される。
好ましい実施形態において、パスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体は、アクチノバチルス、アグリゲイティバクター、アビバクテリウム、バスフィア、ビベルスティニア、シェロノバクター、ガリバクテリウム、ヘモフィルス、ヒストフィルス、ロネピネラ、マンヘミア、ニコレテラ、パスツレラ、フォコエノバクター及びボルクリバクターのパスツレラタンパク質、好ましくはアクチノバチルス、ヒストフィルス、ヘモフィルス、マンヘミアのタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア、ヘモフィルス・パラスイス、ヒストフィルス・ソムニ及びマンヘミア・ヘモリチカのタンパク質の群から選択される。
基本的に、1種又は複数のコンセンサス配列N-X-S/T(配列中、Xはプロリンではない)を含む任意のタンパク質は、単糖、少糖又は多糖を特徴とするグリカンへのN-結合に適している。真核生物においては、コンセンサス配列でのタンパク質と糖のこの結合は小胞体中の酵素複合体オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって促進されるが(例えば、総説はMohorko et al., J Inherit Metab Dis. 2011 Aug;34(4):869-78を参照)、細菌においては、この反応はペリプラズム中の拡張型コンセンサス配列D/E-X1-N-X2-S/T(配列中、X1及びX2はいずれもプロリンではない;配列番号35)上の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより行われる(総説については、Nothaft H, Szymanski CM: Nat Rev Microbiol. 2010を参照)。さらに、パスツレラ科のメンバーにおいては、コンセンサス配列N-X-S/T(配列中、Xはプロリンではない)は、細胞質でグリコシル化され得ることが示唆されている(Grass et al., Mol Microbiol. 2003 May;48(3):737-51;Choi et al., PLoS ONE 5(12):e15888. doi:10.1371/-journal.pone.0015888, 2010;Schwarz et al., 2011 , J Biol Chem. 2011 Oct 7; 286(40):35267-74)。
パスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体という用語は、少なくとも1つのグリコシル化N-X-S/Tコンセンサス配列(配列中、Xはプロリンではない)を有する、天然のパスツレラタンパク質並びにその機能性断片及び誘導体を包含する。本発明による「パスツレラタンパク質の機能性断片又は誘導体」という用語は、そのアミノ酸配列が、例えばアミノ酸残基の付加、置換及び/又は欠失によって、化学的又は遺伝学的に修飾されており、且つ/又はその原子及び/又は官能性化学基の少なくとも1つが、例えば付加、除去、再構成、酸化、還元などによって、化学的に修飾されている任意の天然パスツレラタンパク質、その断片又は誘導体を、断片又は誘導体が、グリコシル残基を受けとることが可能な少なくとも1つのコンセンサス配列を有し、且つ哺乳動物又は鳥類における免疫応答、例えば抗体産生、TH1及び/又はTH2応答を提供する限り、含むことを意味する。好ましくは、本発明によるパスツレラタンパク質の機能性断片又は誘導体は少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%の天然パスツレラタンパク質に対するアミノ酸配列同一性を有する。
N-グリコシル化に適するコンセンサス配列を有するタンパク質がパスツレラ科に豊富であることに注目されたい。そのように豊富であることを説明するため、また本発明で使用するタンパク質の好ましい実施形態について記載するために、タンパク質の例示リストを実施例の項目の最後に表1として提供する。
好ましくは、パスツレラタンパク質は分泌タンパク質であり、好ましくはオートトランスポータータンパク質、LPSアセンブリータンパク質、赤血球凝集素/溶血素様タンパク質、又はRTX毒素であり、さらに好ましくはパスツレラオートトランスポーターアドヘシン又はパスツレラLPSアセンブリータンパク質である。
さらに好ましい実施形態においては、パスツレラタンパク質はオートトランスポータータンパク質であり、好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア又はマンヘミア・ヘモリチカのオートトランスポータータンパク質であり、さらに好ましくはオートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、ataCに対して少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するその機能性断片、相同体又は誘導体である。
また、好ましくは、本発明のN-グリコシル化タンパク質として使用するためのタンパク質は、2つ以上の、好ましくは少なくとも2〜50、さらに好ましくは少なくとも2〜30、最も好ましくは少なくとも5〜20のコンセンサス配列を有する。
よりさらに好ましい実施形態においては、N-グリコシル化タンパク質は次からなる群:
(1)オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、
(2)推定上の特性決定されていないタンパク質[APP6_1216]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型6型Femo株(アクセッション番号D9P9E6_ACTPL;配列番号2)、
(3)オートトランスポーターアドヘシン[ataB]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GZU4_ACTP7;配列番号3)、
(4)オートトランスポーターアドヘシン[APP2_0255]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型2型4226株(アクセッション番号D9P3A1_ACTPL;配列番号4)、
(5)オートトランスポーターアドヘシン[APL_0443]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ5b(L20株)(アクセッション番号A3MZG1_ACTP2;配列番号5)、
(6)推定上の特性決定されていないタンパク質[APP6_2139]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型6型Femo株(アクセッション番号D9PD81_ACTPL;配列番号6)、
(7)オートトランスポーターアドヘシン[APL_0104]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ5b(L20株;配列番号7)、
(8)オートトランスポーターアドヘシン[appser10_1320]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型10型D13039株(アクセッション番号E0F1W7_ACTPL;配列番号8)、
(9)オートトランスポーターアドヘシン[appser10_5000]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型10型D13039株](アクセッション番号E0F2X9_ACTPL;配列番号9)、
(10)オートトランスポーターアドヘシン[ataA]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GZU3_ACTP7;配列番号10)、
(11)ATファミリーオートトランスポーター/アドヘシン[MHA_1367]マンヘミア・ヘモリチカPHL213(アクセッション番号A7JTA5_PASHA;配列番号11)、
(12)可能性のあるオートトランスポーター/アドヘシン[MHA_2701]マンヘミア・ヘモリチカPHL213(アクセッション番号A7JWY1_PASHA;配列番号12)、
(13)ATファミリーオートトランスポーター/アドヘシン[COK_1394]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P8A5_PASHA;配列番号13)、
(14)オートトランスポーターアドヘシン[COK_0898]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P6W7_PASHA;配列番号14)、
(15)オートトランスポーターアドヘシン[COK_1916]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P9S1_PASHA;配列番号15)、
及び同一種の異なる株又はセロタイプにおけるその相同体から選択される。
本発明のタンパク質のN-結合グリカンは広範囲で変わり得るが、好ましくはグルコース分子及び/又はガラクトース分子からなる。
好ましくは、N-結合グリカンは、β-Glc/β-Gal、(β-Glc/β-Gal)-1,6-(α-Glc/α-Gal)n(式中、nは少なくとも1、好ましくは1から10、好ましくは1から6、さらに好ましくは2〜5である)、さらに好ましくはβ-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc及びβ-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glcからなる群から選択される。
特に好ましい実施形態においては、N-グリコシル化タンパク質は、全N-X-S/Tコンセンサス配列の少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも70%がグリコシル化されており、好ましくはグルコシル化されており、さらに好ましくはβ-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glcによってグルコシル化されている、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、ataCに対して少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するその機能性断片又は誘導体である。
最も好ましい実施形態においては、本発明によるN-グリコシル化タンパク質は、
(i)好ましくはアミノ酸1866〜2516(配列番号16)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
(ii)好ましくはアミノ酸61〜984(配列番号17)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
(iii)好ましくはアミノ酸51〜2428(配列番号18)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
(iv)好ましくはアミノ酸1866〜2428(配列番号19)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片であって、
(i)、(ii)、(iii)及び(iv)が、
(a)断片(i)に関する1〜14、好ましくは少なくとも2〜10、さらに好ましくは2〜8のコンセンサス配列N-X-S/T、
(b)断片(ii)に関する1〜9、好ましくは少なくとも2〜8、さらに好ましくは2〜5のコンセンサス配列N-X-S/T、
(c)断片(iii)に関する1〜73、好ましくは少なくとも2〜50、さらに好ましくは5〜20のコンセンサス配列N-X-S/T、及び
(d)断片(iv)に関する1〜13、好ましくは少なくとも2〜10、さらに好ましくは2〜8のコンセンサス配列N-X-S/T
でN-グリコシル化されており、好ましくはグルコシル化されており、さらに好ましくはβ-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glcによってグルコシル化されている。
本発明によるN-グリコシル化タンパク質は、N-グリコシル化の一般的な性質により、急性疾患の予防に有効で、かなりの程度までコロニー形成を阻止し、パスツレラ科の種の様々なセロタイプの間での交差防御能が広範囲であることが予想される。理論により拘束するものではないが、パスツレラタンパク質、その機能性断片及び誘導体のN-グリコシル化は抗原の認識を改善し、近縁種での実質的な免疫応答を提供するTh1及びTh2ヘルパー細胞に顕著な効果をもたらし、それによって、種間の交差防御が生じると推定される。
さらなる態様において、本発明は製薬上有効な量の本発明の少なくとも1種のN-グリコシル化タンパク質と、場合により1種又は複数種の製薬上許容可能な担体及び/又はアジュバントとを含む医薬組成物に関する。
本明細書に記載のN-グリコシル化タンパク質の医薬用剤形は、当業者に公知の製薬上許容可能な担体及び/又はアジュバントを含む。これらの担体及びアジュバントとしては、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、水、塩、電解質、セルロース系物質、ゼラチン、水、ワセリン、動物油又は植物油、鉱物油又は合成油、食塩水、デキストロース又は別の糖及びグリコール化合物、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール、酸化防止剤、乳酸塩などが挙げられる。好ましい剤形としては錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、エマルション、再形成可能な粉末及び経皮パッチが挙げられる。剤形の製造方法は公知であり、例えば、H. C. Ansel and N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)、特にPastoret et al., Veterinary Vaccinology, Elsevier March (1999)を参照されたい。用量レベル及び要件は当技術分野で十分に認識されており、当業者によって特定患者に適する利用可能な方法及び技術から選択することができる。当業者による評価の際、特定要因に応じて低用量又は高用量が必要とされることがあり得る。例えば、特定用量及び治療計画は、患者の(ヒト又は動物の)一般的健康プロファイル、患者の疾患の重症度及び経過又はそれに対する素因、並びに治療する内科医又は獣医の判断などの要因に依存する。
さらなる態様において、本発明は、本発明のN-グリコシル化タンパク質を生産する方法であって、
(i)N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)と、少なくとも1つのN-X-S/Tコンセンサス配列(配列中、Xはプロリンではない)を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体とを発現する、細胞、好ましくは原核細胞、さらに好ましくは大腸菌(E. coli)細胞を用意する工程と;
(ii)前記パスツレラタンパク質のN-結合グリコシル化、好ましくはグルコシル化をもたらす条件下で前記細胞を培養する工程と;
(iii)場合によりN-結合グリカンのグリコシル伸長を行うための、好ましくはグルコース残基を含有する伸長を行うためのグリコシルトランスフェラーゼを同時発現させる工程と;
(iv)場合によりN-グリコシル化タンパク質を精製する工程
とを含む、方法を対象とする。
本発明の上記方法を実施するための好ましい細胞は、大腸菌細胞であり、好ましくはDH5α、BL21、Top10、W3110、CC118λpir、Sm10λpir、TG1及びXL1Blue(Hanahan1983; J MolBiol166(4): 557-80; Herrero, M., V. de Lorenzo, et al. (1990). J Bacteriol 172(11): 6557-67.; Miller, V. L. and J. J. Mekalanos (1988). J Bacteriol 170(6): 2575-83)からなる群から選択されるものである。NGT及びパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体の発現は、多くの一般的な異なる複製開始点の発現ベクター及びクローニングベクター等、例えばpACYC184、pBR322、pET22、pET24、pMLBAD、pBAD、pBlue-script及びpEC415(Lefebre, M. D. and M. A. Valvano (2002), Appl Environ Micro-biol68(12): 5956-64; Schulz H, Hennecke H, Thony-Meyer L. (1998) Science. Aug 21 ;281 (5380):1197-200)を用いて促進することができる。
本発明の方法の培養工程は、微生物学分野の当業者に公知の標準実験条件下で細菌細胞を増殖させることにより、例えばNGTの遺伝子及びコンセンサス配列含有のパスツレラタンパク質の遺伝子をコードしているプラスミドを含有する大腸菌細胞を、適合する発現プラスミドの存在を選択するために添加される適切な抗生物質を補充したLuria-Bertani培地中で増殖させることにより実施される。所望により、プラスミド由来の目的遺伝子の転写は、分子生物学で一般に使用されている適切な誘導剤、例えばイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)又はアラビノースなどの添加によって誘導することができる(Schwarz et al., Nat Chem Biol 2010 Apr;6(4):264-6; Kunzler M et al, Methods Enzymol. 2010;480:141-50; Lizak C et al., Nature. 2011 Jun 15 ;474(7351):350-5)。
例えば、グリコシル残基がさらに伸長された本発明のN-グリコシル化タンパク質を生産するために、α6GlcTを、適合する発現プラスミドの存在を選択するために添加された適切な抗生物質を補充したLuria-Bertani培地中で、NGTの遺伝子、α6GlcT及びコンセンサス配列含有のパスツレラタンパク質の遺伝子をコードしているプラスミドを含有する大腸菌細胞において同時発現させることができる。所望により、プラスミド由来の目的遺伝子の転写は、上記で例示した適切な誘導剤の添加によって誘導することができる。
N-グリコシル化タンパク質の精製は、生化学及び分子生物学で通常実施されている一般的な方法、例えば細胞分画、析出又はアフィニティークロマトグラフィーによって行うことができる。良質なタンパク質調製物が得られることからアフィニティークロマトグラフィーが好ましい。アフィニティークロマトグラフィーによる目的タンパク質の精製は、例えばタンパク質のN末端又はC末端に様々なヒスチジン残基を付加してNi2+イオンを含有するクロマトグラフィーカラムへのタンパク質結合を促進することにより行うか、又はカラム材料上の陽荷電アミノ酸又は負荷電アミノ酸と目的タンパク質とを相互作用させることにより行うことができる(Schwarz et al., Nat Chem Biol 2010 Apr;6(4):264-6; Kunzler M et al, Methods Enzymol. 2010;480:141-50; Lizak C et al., Nature. 2011 Jun 15;474(7351):350-5)。
N-糖タンパク質自体、パスツレラタンパク質、その機能性断片及び誘導体、並びにN-結合グリカンに関して上記に詳述した、本発明に係るN-グリコシル化タンパク質の好ましい実施形態は、上記の本発明の方法によって生産されるタンパク質及び出発原料に同様に適用される。さらに、工程(iii)で使用されるグリコシルトランスフェラーゼがパスツレラタンパク質、好ましくはアクチノバチルス、ヘモフィルス、ヒストフィルス及びマンヘミアのタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヒストフィルス・ソムニ及びマンヘミア・ヘモリチカ由来のタンパク質、最も好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア由来のα6GlcT(Schwarz et al., J Biol Chem. 2011 Oct 7;286(40):35267-74)から選択されるのが好ましいことに留意されたい。
さらなる態様において、本発明は、細菌性パスツレラ感染症を診断する方法であって、
(i)細菌性パスツレラ感染症にかかっている疑いのある哺乳動物又は鳥類から採取した、好ましくは血液、唾液、涙液、尿及び/又は糞便から選択される試料を用意する工程と、
(ii)前記試料、その成分又は誘導体と、本発明のN-グリコシル化タンパク質とを、抗体結合を可能にする条件下で接触させる工程と、
(iii) 本発明のN-グリコシル化タンパク質への、前記試料、その機能性成分又は誘導体の結合を測定する工程
とを含む、方法に関する。
上記文脈における「試料、その機能性成分又は誘導体」という用語は、試料、例えば血液を部分的に精製及び/又は誘導体化することができることを意味する。例えば、血液の血清分画は、血液試料の機能性成分として使用することができる。試料中に本来存在する抗体を依然として含有している試料の任意の画分、成分又は誘導体は、本発明の診断方法の実施に使用することができる。
本発明のN-グリコシル化タンパク質は、パスツレラ感染後の哺乳動物及び鳥類、好ましくは家畜で流行している抗体を検出する診断手段として使用することができる。これらの抗体は本発明のN-グリコシル化タンパク質に結合することが可能で、しかもこの結合は適切な一般的方法によって検出することができる。例えば、分子生物学者に公知の方法を用いて、96ウェル又は394ウェル型のポリスチレンのような非反応性ポリマー製のプレートに本発明のN-グリコシル化タンパク質を結合させることにより検出できる。動物抗体と一緒に本発明のN-グリコシル化タンパク質をインキュベーションした後、N-グリコシル化タンパク質に結合されていない抗体を洗い流し、一方、本発明のN-グリコシル化タンパク質に結合された抗体は、適切な二次抗体を用いて検出し、パスツレラによる感染中及び感染後に流行している抗体のアイソタイプを決定することができる(Cawthraw S et al., 1994 Avian Diseases 38:341-349)。
別の態様では、本発明は、細菌性パスツレラ感染症を有するか、発症しやすい哺乳動物又は鳥類を治療及び/又は保護する方法であって、治療上有効な量の少なくとも1種のN-糖タンパク質、その機能性断片若しくは誘導体又は本発明の医薬組成物を、それを必要としている患者、鳥類又は哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
好ましい実施形態においては、投与されるN-グリコシル化タンパク質は、パスツレラタンパク質であり、好ましくはアクチノバチルス、アグリゲイティバクター、アビバクテリウム、バスフィア、ビベルスティニア、シェロノバクター、ガリバクテリウム、ヘモフィルス、ヒストフィルス、ロネピネラ、マンヘミア、ニコレテラ、パスツレラ、フォコエノバクター及びボルクリバクター属由来のタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス、ヘモフィルス、ヒストフィルス及びマンヘミア属のタンパク質、最も好ましくは、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヒストフィルス・ソムニ及びマンヘミア・ヘモリチカ由来のタンパク質である。
治療用途及び/又は予防用途に関し、本発明の医薬組成物は任意の慣用の方法で任意の慣用の剤形により投与することができる。投与経路は、以下に限定されるものではないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔内投与、滑液内投与、点滴投与、舌下投与、経皮投与、経口投与(例えば錠剤、胃管栄養)、局所投与、又は吸入による投与が挙げられる。好ましい投与様式は経口投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与及び鼻腔内投与であり、最も好ましくは筋肉内投与及び皮下投与である。
本発明のN-グリコシル化タンパク質は単独で投与するか、或いは、他の活性成分を含めた、医療上有効な化合物の安定性及び/又は免疫性を高めるアジュバント、含有されている医薬組成物の投与を促進するアジュバント、分解性又は分散性を高めるアジュバント、細胞、例えば医療上有効な化合物を生産する細胞が関与している場合には、増殖活性を高めるアジュバント、並びに補助療法を提供するアジュバントなどと組み合わせて投与することができる。
以下の表、図及び実施例は、本発明の単なる例示であって、決して添付の特許請求の範囲に示した本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
推定上のグリコシルトランスフェラーゼによるtamra-標識ペプチドの修飾を示す電気泳動法を示す図である。反応生成物はトリシン-SDS-PAGE分析によって単離され、蛍光シグナルは画像解析器によって得た。 グリコシル化生成物のトリシン-SDS-PAGE分析を示す図である。Tamra-標識ペプチドは、EDTAの存在下又は非存在下でNGT及び異なるUDP単糖供与体と共にインキュベートした。 NGTとUDP-グルコース(中央の図)又はUDP-ガラクトース(下の図)の存在下におけるtamra-ペプチド(上の図)のMALDI質量分光分析法を示す図である。 α6GlcT及び異なるUDP単糖供与体と共にインキュベートした、グルコシル化tamra-標識ペプチドのトリシン-SDS-PAGEを示す図である。 グルコシル化生成物のMALDI-MS分析によって、グルコシルトランスフェラーゼα6GlcTが1:1000の受容体:供与体比の存在下で6ユニット以下のグルコースでN-結合グルコースを伸長することを示す図である。 NGTの存在下(レーン1)及び非存在下(レーン2)で切断型Atac(cAtaC)を発現する大腸菌の全細胞抽出液のイムノブロットを示す図である。NGTとの同時発現におけるcAtaCの移動度シフトと安定化に注目されたい(レーン1)。 NGTの存在下(レーン1)及び非存在下(レーン2)で切断型Atac(cAtaC)を発現する大腸菌の全細胞抽出液のイムノブロットである。検出に使用した血清は、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア陰性ブタ(左)由来又はアクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ9に感染させたブタ由来である。APP陽性血清のグリコシル化特異的応答に注目されたい。 NGTの存在下及び非存在下でグリコシル化に対する異なる基質タンパク質を発現する大腸菌の全細胞抽出液のイムノブロットを示す図である。図のすべての部分の左側の図は、タンパク質の存在に対する抗-His4抗体による検出を示し、右側の図は抗N-グルコース血清による検出を示す。A:切断型マンヘミア・ヘモリチカCOK1394、B:切断型マンヘミア・ヘモリチカCOl1702、C:scAtaCと呼ばれるアクチノバチルス・プリューロプニューモニアAtaCの短縮切断型形態、D:アクチノバチルス毒素ApxI及びApxII。 グリコシル化scAtaC又は非グリコシル化scAtaC又はアジュバントで免疫したブタのELISA分析を示す図である。グリコシル化scAtaCで免疫した動物のグリコシル化特異的応答の反応に注目されたい。
(実施例)
材料及び方法
制限酵素はFermentasから購入した。T4DNAリガーゼはNEBから入手した。UDP-Glc、UDP-GlcNAc及びUDP-GalNAcはシグマから入手した。UDP-GalはVWR Internationalから入手した。合成ペプチドはJPT Peptide Technologiesから購入した。
プラスミドの構築
大腸菌DH5αをクローニング用の宿主として選択した。ngt ORFは、テンプレートとしてエルシニア・エンテロコリチカ(Y.enterocolitica)8081株、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアL20株又はアクチノバチルス・プリューロプニューモニアAP76株から得たゲノムDNAを使用して、PCRにより増幅した。ngt遺伝子含有断片をXhoIで切断し、NdeIで予じめ消化した、pEC(AcrA-cyt)へ連結し、クレノウ断片で処理することにより平滑末端化し、XhoIで消化した。すべてのORFは、C末端のヘキサヒスチジンタグを有するフレーム中にあった。全プラスミド構築物は関連断片(Microsynth AG)を配列決定することにより確認した。
タンパク質発現、精製及び分析
関連タンパク質の発現用プラスミドを保持する大腸菌DH5α細胞は、LB培地中で37℃にて1Lの容量中で増殖させた。アンピシリン(100mg/l)又はクロラムフェニコール(25mg/l)は、必要に応じて培地に添加した。培養物が0.5OD/mlに達したら、0.2%のアラビノース又は1mMのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、1mMのEDTAと1g/lのリゾチームを補充した30mMトリスpH8 300mMのNaClに再懸濁し、4℃で1時間インキュベートした。MgCl2及びDNase I(Roche)を加えてそれぞれ最終濃度を5mM及び0.1mg/mlにした。細胞をフレンチプレスによって破壊した。抽出物を4℃で150,000gにて30分間回転させた。上清に20mMのイミダゾールを加え、HisTrapカラム(GE Healthcare)にロードした。精製は発売元による指示に従って行った。XcOGTの精製は公知の方法によって行った(Clarke et al. (2008) Embo J27, 2780-2788)。バッファーの25mMトリスpH7.2 150mMのNaClへの交換はHiTrap脱塩カラム(GE Healthcare)を使用して、ゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。タンパク質をSDS-PAGEによって分析し、280nmでの吸光度測定により定量した。
合成ペプチドのグリコシル化分析
異なる糖供与体又はペプチド受容体を使用する酵素活性は、最終容量50μlのトリス緩衝液(pH7.2、25mM)中で1.4μg(0.46μΜ)のNGT及び/又はα6GlcTを使用して評価した。受容体ペプチド及び糖供与体は1:100のモル比で混合した。グリコシル化反応は30℃で16時間実施した。塩及び酵素の除去については、ペプチドをC18カートリッジ(Sep-Pak Cartridge, Waters)又はC18 zip-tip(Millipore)に結合させ、0.1%のギ酸で洗浄し、70%アセトニトリル0.1%ギ酸の溶液で溶出した。反応生成物の分析はMALDI-TOF/TOF質量分析、NMR、又はゲル電気泳動のいずれかにより実施した。電気泳動法については、tamra-標識ペプチドに還元試料緩衝液(0.0625Mのトリス-HCl、pH6.8、2%SDS(v/w)、5%β-メルカプトエタノール(v/v)、10%グリセロール(v/v)、0.01%ブロモフェノールブルー(w/v))を加え、5分間95℃で沸騰させ、トリシン-SDS-PAGE(11)により単離させた。蛍光はRX Imager(BioRad)によって得た。
タンパク質のグリコシル化分析
AcrA50μgを、30℃で16時間、25mMのTris pH7.2 150mMのNaClに溶解させた1mM UDP-GIc及び1.4μg NGTと共にインキュベートした。試料を37℃で一晩トリプシン(Promega)を用いて消化した。ペプチドは塩を除去するためC18カートリッジに結合させ、70%アセトニトリル0.1%ギ酸溶液で溶出し、MS分析に供した。
(実施例1)
アクチノバチルス・プリューロプニューモニアとエルシニア・エンテロコリチカHMW1C相同体はDANYTKペプチドを修飾する
エルシニア・エンテロコリチカ8081株、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアL20株、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアAP76株及びキサントモナス・カンペストリス(X.campestris)ATCC 33913から得たHMW1C相同体を大腸菌で発現させ精製した。グリコシルトランスフェラーゼ活性についてそれらのタンパク質を試験するために、OST活性の分析用に開発されたin vitroアッセイ(Kohda et al. (2007) Glycobiology17, 1 175-1182)を適用した。精製タンパク質は、UDP-Glu及び蛍光色素、カルボキシテトラメチルローダミン(tamra)によりN末端が標識化されているヘキサペプチドDANYTK(配列番号20)とインキュベートした。トリシン-SDS-PAGEにより反応生成物を単離し蛍光シグナルを検出した後、tamra標識ペプチドで修飾されたエルシニア・エンテロコリチカと2つのアクチノバチルス・プリューロプニューモニア相同体が電気泳動移動度のシフトによって視覚化された(図1)ことが確認された。反対に、XcOGTは、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc又はUDP-GalNAcの存在下においてこの受容体ペプチドに対してグリコシルトランスフェラーゼ活性を示さなかった(データは示さず)。下記において、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアAP76株酵素に注目する。
アクチノバチルス・プリューロプニューモニアHMW1C相同体は基質としてGlc及びGalを認識する
次に、in vitroにおけるこのNGT供与体の特異性を分析した。酵素は、DANYTK(配列番号20)ペプチドに、グルコース又はガラクトース(ただしGlcNAcではない又はGalNAcではない)を移した(図2)。100倍のモル比の供与体:受容体の存在下において、グリコペプチドへの変換はUDP-Glcの存在下で定量的であるが、UDP-Galの存在下ではぎりぎりであった。重要なことに、NGTは、EDTAの存在下でペプチドをグリコシル化し、このことからグリコシル転移に金属イオンは不必要であることが示唆される。また、反応生産物を質量分析によってモニタリングした(図3)。未修飾のtamra-DANYTKの分析からtamra-DANYTK(計算値MW:1122.19Da:実測値1122.49Da)、及び副生成物tamra-(DANYTK)2(計算値MW:1814.50Da、実測値MW:1813.78Da)と一致する2つの主要種が得られた。NGT及びUDP-Glcとインキュベーションした後、tamra-DANYTK-Glc(計算値MW:1284.35Da、実測値MW:1284.58Da)及びtamra-(DANYTK)2-Glc(計算値MW:1975.66Da、実測値MW:1975.88Da)に対応する種が検出された。類似の結果がUDP-Galとのインキュベーションの後に得られた。すべての場合において、アスパラギン残基への単一のヘキソース成分の付加が認められた。
アクチノバチルス・プリューロプニューモニアはN-結合グルコースを伸長する前進性グルコシルトランスフェラーゼをコードしている
アクチノバチルス・プリューロプニューモニアAP76株のNGTをコードするゲノム領域を調査した。この領域は、マンニトールの取り込みと、そのグルコサミン-6-リン酸、2つのイソメラーゼ、ヌクレオシダーゼ及びメチルチオトランスフェラーゼへの変換に関与している推定上のタンパク質をコードする遺伝子を含有している。興味深いことには、ORFに隣接するngtは推定上のグリコシルトランスフェラーゼ(APP7_1696)をコードしている。C-末端が標識化されているタンパク質を大腸菌で発現させた。NGT反応のtamra-標識生成物と精製タンパク質をインキュベートした場合、グリコペプチドの合成を示すトリシン-SDS-PAGE上の移動度に変化があることが検出された(図4)。この修飾は、UDP-Gal、UDP-GlcNAc又はUDP-GalNAcの存在下ではなくUDP-Glcの存在下で生じた。グルコシルトランスフェラーゼ活性はカチオン非依存性であるように思われる。反応生成物をMSによって分析し、1:100の受容体:供与体比の存在下で2つのグルコース成分の付加を確認した。特に、6以下のグルコース単位の付加が過剰な供与体の存在下でグルコシルトランスフェラーゼの量の増加に伴って認められた(図5)。グルコシル化ペプチドに対応する前駆イオンのMS/MS分析(m/z=1446.61, 1608.68, 1770.74, 1932.80, 2094.86及び2256.93)は、修飾型tamra-DANYTK(配列番号20)に匹敵する断片化を示した(データは示さず)。
反応生成物の化学構造を決定するため、グリコペプチドをNMRスペクトロスコピーによって分析した。1H-13C HSQCスペクトルは、異なる3つのグルコースユニットのシグナルを示した(データは示さず)。新しい2つのシグナルが、Asn-結合グルコースから始まる〜82ppmのシグナルで既に認められている以外に、〜100ppmのアノマー領域で確認された。これらのシグナルは2D TOCSYとJカップリングを介した1H-13C長距離相関に帰属させた。N-結合グルコースに属するシグナルの第1のセットは、単一グルコース単位(C6:63.3ppm)のみが持つ最初のグリコペプチドとは異なる、68.3ppmのC6化学シフトを示した。これからO6での炭水化物結合が示唆された。第2のグルコース単位のシグナルは末端グルコース(C6:63.2ppm)に由来するものであり、その化学シフトはGlc-α1,6-Glcのシフトに一致する。第3のシグナルのセットは、一方のサイドでα1,6-結合されている架橋グルコース単位の化学シフトを示した。既に報告されているGlc-α1,6-Glc-α1,6-Glcの化学シフト(Hansen et al. (2008) Biopolymers89, 1179-1193)が末端の架橋グルコースの実験データとまさに一致しており、2つのα1,6-結合グルコース残基に関する確固たる所見を示すものである。アルゴリズムCASPER (26)で計算した化学シフトはさらにその帰属を支持した。したがって、APP7_1697遺伝子は、NGT反応の生成物を伸長する前進性α1,6-グルコシルトランスフェラーゼ(α6GlcT)をコードしている。
NGTはOSTにオーバーラップしている受容体部位特異性を示す
異なる位置(N末端、中央、C末端)にN-X-S/Tコンセンサス配列を含有している酵母由来のモデル糖タンパク質を示す様々なペプチドのグリコシル化を試験した。これらは以下のとおりであった:酵母糖タンパク質PRY3のアミノ酸(AA)100-120、GASのAA 268-288、EXG2のAA 102-117、PLB2のAA 212-226、PDl1のAA 412-434及びAPE3のAA 352-374。N-X-S/T部位でのグリコシル化がすべてのペプチドに対して認められた(データは示さず)。MS/MSによる発明者らの分析は定量的ではなかったが、ペプチド内のコンセンサス配列の位置はグリコシル化に影響を及ぼさないように思われ、しかも、+2位置でのS又はTに対する配列選好性は認められなかった。さらに、N-X-S/T配列はNGTによって認識される最小の主要受容体コンセンサスであると考えられた。重要なことには、カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)由来の細菌性OST(Chen, M. M., Glover, K. J., and Imperiali, B. (2007) Biochemistry46, 5579-5585)に関してin vitroで同定されている公知の基質のDQNAT(配列番号21)又はDFNVT(配列番号22)などのショートペプチドのグリコシル化(データは示さず)は、検出されなかった。
要約すると、本発明を導く上記の実験研究は、N-グリコシル化タンパク質が、自然界全体で、特に細菌中で十分に確認されている任意のコンセンサス部位を含有するタンパク質から実質的に生産され得ることを証明している。
(実施例2)
アクチノバチルス・プリューロプニューモニア及びマンヘミア・ヘモリチカのNGTは異種タンパク質をグリコシル化する
パスツレラNGTのタンパク質基質特異性をさらに検証するために、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア又はマンヘミア・ヘモリチカ由来のNGTを異なる基質タンパク質の存在下において大腸菌細胞中で発現させた。例示目的で使用したタンパク質は、マンヘミア・ヘモリチカタンパク質COK_1394及びCOl 1702の切断型形態、並びにさらにscAtaCと呼ばれるcAtaCの切断型形態であった。これらの構築物のクローニングは表2に記載しており、その中にオリジナルのクローニングベクター及び発現プラスミドの起源も記載している。より詳細には、BL21(DE3)細胞は、以下のプラスミドの組み合わせ:
a) pMLBAD + pET24b-COK_1394-HIS10
b) pMLBAD - Mh.NGTmyc + pET24b-COK_1394-HIS10
c) pMLBAD - AP1697myc + pET24b-COK_1394-HIS10
d) pMLBAD + pET24b-COI_1702-HIS10
e) pMLBAD - AP1697myc + pET24b-COI_1702-HIS10
f) pMLBAD - Mh.NGTmyc + pET24b-COI_1702-HIS10
g) pMLBAD - AP1697myc + pET24b-ApxI
h) pMLBAD - AP1697myc + pET24b-ApxII
i) pMLBAD - AP1697myc + pET24b (コントロール)
j) pMLBAD + pET24b (コントロール)
の1つで形質転換し、これらのプラスミドによってコードされているタンパク質の発現とグリコシル化を試験した。細胞は、一晩培養物からOD600/mlが0.05になるまで接種した。OD600/ml=0.3-0.5まで振盪しながら37℃でインキュベーションした後、最終濃度0.2%までアラビノースを添加することによりNGTの発現を誘導し、細胞培養物を37℃に戻した。2時間後、IPTGを最終濃度0.5mMまで添加した。さらに37℃で4時間成長させた後、細胞をスパンダウンし、SDS-PAGEとその後のイムノブロットで分析するために調製した:一細胞系当たり1OD600を室温にて2分間10.000gで遠心分離して回収した。上清を廃棄し、100μl×Lammli試料緩衝液中にペレットを再懸濁し、95℃で10分間インキュベートした。イムノブロットをモノクローナルマウス抗-His4抗体(Qiagen)で実施し、基質タンパク質をヒトグリカン特異的血清SR168(AM Papini, Florenceから無料提供)とともに検出した。結合抗体の検出は、第1抗体に関して抗マウス-IgG-HRP複合体で実施し、後の主要な抗体に関しては抗ヒト-IgG-HRP複合体で実施した。結合複合体はECL(GE Healthcare)を用いてインキュベーションを行って視覚化した。
高収量のグリコシル化HIS10-scAtaCを得るため、このタンパク質は、pEC415中で又はNGTを含有していないpEC415を対照として、アクチノバチルス・プリューロプニューモニアNGTと組み合わせたpMLBAD-プラスミド上でDH5α細胞にて共発現させた。上記のCOK_1394及びCOI_1702-発現に関する菌株と同様に、最終濃度0.2%までのアラビノース添加によるscAtaCの誘導は、OD600/ml=0.3-0.5であった。誘導後に細胞を6時間成長させ、その後採取した。SDS-PAGEによりタンパク質の検出を行い、別のタンパク質について上記で記載したようにしてイムノブロットを実施した。図8に示したように、すべてのタンパク質が抗-His4イムノブロットによって検出され、これによって誘導後のタンパク質の存在が示唆された(図8A、B、Cの左側の図)。NGTの存在において、より高い分子量へのシフトは抗N-グルコース特異的血清SR168で認められた(図8A、B、Cの右側の図)。これはグルコースを添加した結果であった。まとめると、実験からは、in vivoにおいても、パスツレラNGTはタンパク質基質に関して広域の基質特異性を有していること、また、それは様々なタンパク質のグリコシル化に利用することができることが明らかである。
(実施例3)
グリコシル化タンパク質COK1394及びscAtaCと対照の非グリコシル化scAtaCの免疫性をコブタにおいて試験した。タンパク質は、N-末端のHis10-タグを用いてNi-NTA-アガロースにより精製した。
簡単に説明すると、誘導細胞の細胞ペレットを40mlの30mM TrisHCl、pH8、300mMのNaCl、完全EDTA-フリーの1xプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche、カタログ番号11873580001)、0.1mg/mlのDNaseI(Fermentas)中に再懸濁し、フレンチプレスを使用して細胞を破壊した。2回の遠心分離工程(4℃で3860gを10分間、続いて4℃で15.000gを30分間)を行い、細胞の可溶性分画を得た。これを、30mMのTrisHCl pH8、300mMのNaCl中で平衡化したHis-Trap HP 1mlカラムにロードした。カラムは17mlの30mM TrisHCl, pH8、300mMのNaCl、30mMイミダゾールを用いてAekta FPLC-System(Amersham Biosciences)上で洗浄した後、結合されている標的タンパク質を30mMのTrisHCl、pH8、200mMのNaCl中の200mMイミダゾールで1ml画分中に溶出させた。溶出画分をプールし、一晩4℃で30mMのTrisHCl, pH8、300mMのNaClに対して透析した(Spectra/Por 25K MWCO; Spectrum Labs)。グリコシル化タンパク質に対して、NGT由来のグリコシル化タンパク質を単離するために、変性条件下でのさらなる精製工程を含んでいた。この目的に関して、グリコシル化タンパク質の透析物を6M尿素+10mMのDTTに調節し、60℃で60分間インキュベートし、その間にDTTを30分後に最終濃度が10mMまで再度加えた。すべての下記の工程はRTで行った。30mMのTrisHCl、pH8、300mMのNaCl中の6M尿素、10mM DTTで平衡化した1mlの自己充填Ni-NTAアガロースカラム上に試料を加えた。試料をロードした後、30mMのTrisHCl、pH8、300mMのNaCl中の6M尿素、10mM DTTの20mlでカラムを洗浄した後、30mMのTrisHCl、pH8、300mM NaCl中の6M尿素、10mM DTT、30mM イミダゾールの20mlで洗浄する工程と、30mM TrisHCl、pH8、300mM NaCl中の6M尿素、10mM DTT、40mM イミダゾールの20mlで洗浄する別の工程を行った。30mM TrisHCl, pH8、300mM NaCl中の6M尿素、10mM DTT、100mM イミダゾールを用いて結合タンパク質を1mlの画分中に溶出させた。溶出画分をプールし、30mM TrisHCl、pH8、300mM NaClに対して4℃で一晩透析した(Spectra/Por 25K MWCO; Spectrum Labs)。動物実験のためにタンパク濃度をBCAアッセイにより測定し、一晩タンパク質を凍結乾燥用のチューブ1本当たり800μgにアリコートした。動物へ注射するため、凍結乾燥したタンパク質を2mlのDiluvac forte(Merck)中に再懸濁した。
動物実験は、スイス当局(Kantonales Veterinaramt, Zurich, Switzerland,ライセンス番号177/2011)によって承認されており、法的要件に従って行った。8週齢のコブタに餌と水を適宜与えた。18匹の動物を、別々の群:4匹の動物にアジュバント(Diluvac Forte, Merck)を筋肉内注射、4匹の動物にグリコシル化scAtaC(800μg/ブタ)を筋肉内注射、4匹の動物にグリコシル化していないscAtaC(800μg/ブタ)に筋肉内注射、6匹の動物にグリコシル化COK1394(800g/ブタ)を筋肉内注射する群へ無作為に分けた。いずれの動物も注射に対する有害作用やアレルギー反応はなかった。一次注射の4週間後、血液を採取し、血清を調製した。注射したタンパク質に対する抗体に関してELISAにより血清を試験した。ELISAは以下のように実施した。グリコシル化及び非グリコシル化のウェルにつきscAtaC(両方ともN-末端His10-tagを有する)、500ngタンパク質を含むプレートを4℃で一晩コーティングした。翌日、コーティング溶液中のタンパク質を廃棄した。PBS+0.05%Tween-20で1回洗浄した後、プレートを1時間室温でPBS+0.05%Tween-20中の5%ミルクでブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄した後、1時間RTでPBS+0.05%Tween-20中の5%ミルクで1:400に希釈した血清を用いてプレートをインキュベートした。血清をそれぞれグリコシル化scAtaC及び非グリコシル化scAtaCに対して二連で試験する方法で、血清をプレート上に分配した。この1時間のインキュベーションを行った後、血清を廃棄し、プレートをPBS+0.05%Tween-20で5回洗浄した。血清中の結合抗体を検出するため、次いで、PBS+0.05%Tween-20中の5%ミルクで1:1000に希釈した抗ブタ-IgG-HRP複合体(Santa Cruz #sc-2463)でプレートを1時間室温でインキュベートした。この複合体とのインキュベーションを行った後、溶液を廃棄し、プレートをPBS+0.05%Tween-20で5回洗浄した。結合複合体を視覚化するため、プレートをABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸;0.03%のH2O2を添加して70mMのホスホクエン酸緩衝液pH4.2中最終濃度1mMとする)で発色させ、200秒間20秒毎に405nmで吸収を測定することによって、発色の最大速度(Vmax)を求めた。次いで、グリコシル化scAtaC及び非グリコシル化scAtaC上の各血清に関するこの値の平均及び標準偏差を計算しプロットした。3匹のコブタの実施例データを図9に示す。グリコシル化scAtaCを注射したコブタの血清は、グリコシル化scAtaCに対して反応が良好であり、非グリコシル化scAtaCについてはシグナルが少なかった。したがって、グリコシル化scAtaCを注射することにより抗グリカン抗体を包含する免疫応答が得られる。コブタに非グリコシル化scAtaCを注射した場合、グリコシル化scAtaCと非グリコシル化scAtaCから得られたシグナルはほぼ等しかった。これは、生産された抗体がscAtaCのタンパク質部分に対して指向性があることを示唆するものである。アジュバントを注射した動物の血清を試験した場合、グリコシル化scAtaC及び非グリコシル化scAtaCに対してバックグラウンド反応だけが検出可能であった。この動物においてこれらのタンパク質に対する免疫応答はなかった。

Claims (14)

  1. 哺乳動物又は鳥類における細菌性パスツレラ感染症を治療及び/又は予防するためのN-グリコシル化タンパク質であって、タンパク質が、少なくとも1つのグリコシル化N-X-S/Tコンセンサス配列(配列中、Xはプロリンではない)を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体である、N-グリコシル化タンパク質。
  2. パスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体が、アクチノバチルス(Actinobacillus)、アグリゲイティバクター(Aggregatibacter)、アビバクテリウム(Avibacterium)、バスフィア(Basfia)、ビベルスティニア(Bibersteinia)、シェロノバクター(Chelonobacter)、ガリバクテリウム(Gallibacterium)、ヘモフィルス(Haemophilus)、ヒストフィルス(Histophilus)、ロネピネラ(Lonepinella)、マンヘミア(Mannheimia)、ニコレテラ(Nicoletella)、パスツレラ(Pasteurella)、フォコエノバクター(Phocoenobacter)及びボルクリバクター(Volucribater)属から選択され、好ましくはアクチノバチルス、ヘモフィルス、ヒストフィルス、マンヘミアのタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・インフルデンザ(Haemophilus influenzae)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ヒストフィルス・ソムニ(Histophilus somni)及びマンヘミア・ヘモリチカ(Mannheimia haemolytica)のタンパク質から選択される、請求項1に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  3. パスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体が、分泌タンパク質、好ましくはオートトランスポータータンパク質、LPSアセンブリータンパク質、赤血球凝集素/溶血素様タンパク質、又はRTX毒素、さらに好ましくはパスツレラオートトランスポーターアドヘシン又はパスツレラLPSアセンブリータンパク質から選択される、請求項1又は2に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  4. パスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体が、オートトランスポータータンパク質であり、好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニアのオートトランスポータータンパク質であり、さらに好ましくはオートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、ataCに対して少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するその機能性断片又は誘導体である、請求項1から3のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  5. 次からなる群、すなわち:
    (1)オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、
    (2)推定上の特性決定されていないタンパク質[APP6_1216]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型6型Femo株(アクセッション番号D9P9E6_ACTPL;配列番号2)、
    (3)オートトランスポーターアドヘシン[ataB]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GZU4_ACTP7;配列番号3)、
    (4)オートトランスポーターアドヘシン[APP2_0255]アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型2型4226株(アクセッション番号D9P3A1_ACTPL;配列番号4)、
    (5)オートトランスポーターアドヘシン[APL_0443][アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ5b(L20株)](アクセッション番号A3MZG1_ACTP2;配列番号5)、
    (6)推定上の特性決定されていないタンパク質[APP6_2139][アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型6型Femo株](アクセッション番号D9PD81_ACTPL;配列番号6)、
    (7)オートトランスポーターアドヘシン[APL_0104][アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ5b(L20株)](配列番号7)、
    (8)オートトランスポーターアドヘシン[appser10_1320][アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型10型D13039株](アクセッション番号E0F1W7_ACTPL;配列番号8)、
    (9)オートトランスポーターアドヘシン[appser10_5000][アクチノバチルス・プリューロプニューモニア血清型10型D13039株](アクセッション番号E0F2X9_ACTPL;配列番号9)、
    (10)オートトランスポーターアドヘシン[ataA]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GZU3_ACTP7;配列番号10)、
    (11)ATファミリーオートトランスポーター/アドヘシン[MHA_1367]マンヘミア・ヘモリチカPHL213(アクセッション番号A7JTA5_PASHA;配列番号11)、
    (12)可能性のあるオートトランスポーター/アドヘシン[MHA_2701]マンヘミア・ヘモリチカPHL213(アクセッション番号A7JWY1_PASHA;配列番号12)、
    (13)ATファミリーオートトランスポーター/アドヘシン[COK_1394]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P8A5_PASHA;配列番号13)、
    (14)オートトランスポーターアドヘシン[COK_0898]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P6W7_PASHA;配列番号14)、
    (15)オートトランスポーターアドヘシン[COK_1916]マンヘミア・ヘモリチカセロタイプA2 str.BOVINE(アクセッション番号E2P9S1_PASHA;配列番号15)、
    及び同一種の異なる株又はセロタイプにおけるその相同体から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  6. N-結合グリカンがβ-Glc/β-Gal、(β-Glc/β-Gal)-1,6-(α-Glc/α-Gal)n(式中、nは少なくとも1、好ましくは1から10、好ましくは1から6、さらに好ましくは2〜5である)、さらに好ましくはβ-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc、β-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc及びβ-Gal-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glcからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  7. オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)、ataCに対して少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するその機能性断片又は誘導体であり、全N-X-S/Tコンセンサス配列の少なくとも10%、好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも70%が、グリコシル化されており、好ましくはグルコシル化されており、さらに好ましくはβ-Glc-α1,6-Glc-α1,6-Glcによってグルコシル化されている、請求項1から6のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  8. (i)好ましくはアミノ酸1866〜2516(配列番号16)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
    (ii)好ましくはアミノ酸61〜984(配列番号17)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
    (iii)好ましくはアミノ酸51〜2428(配列番号18)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片;
    (iv)好ましくはアミノ酸1866〜2428(配列番号19)を含む、オートトランスポーターアドヘシン[ataC]アクチノバチルス・プリューロプニューモニアセロタイプ7(AP76株)(アクセッション番号B3GX20_ACTP7;配列番号1)の断片
    であって、(i)、(ii)、(iii)及び(iv)が、
    (a)断片(i)に関する、1〜14、好ましくは少なくとも2〜10、さらに好ましくは2〜8のコンセンサス配列N-X-S/T、
    (b)断片(ii)に関する、1〜9、好ましくは少なくとも2〜8、さらに好ましくは2〜5のコンセンサス配列N-X-S/T、
    (c)断片(iii)に関する、1〜73、好ましくは少なくとも2〜50、さらに好ましくは5〜20のコンセンサス配列N-X-S/T、及び
    (d)断片(iv)に関する、1〜13、好ましくは少なくとも2〜10、さらに好ましくは2〜8のコンセンサス配列N-X-S/T
    でN-グリコシル化されており、好ましくはグルコシル化されており、さらに好ましくはGlc-α1,6-Glc-α1,6-Glcによってグルコシル化されている、請求項1から7のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質。
  9. 製薬上有効な量の請求項1から8に記載の少なくとも1種のN-グリコシル化タンパク質と、場合により1種又は複数種の製薬上許容可能な担体及び/又はアジュバントとを含む医薬組成物。
  10. 下記の工程、すなわち:
    (i)N-グリコシルトランスフェラーゼ(NGT)と、少なくとも1つのN-X-S/Tコンセンサス配列(配列中、Xはプロリンではない)を有するパスツレラタンパク質、その機能性断片又は誘導体とを発現する、細胞、好ましくは原核細胞、さらに好ましくは大腸菌細胞を用意する工程と;
    (ii)前記パスツレラタンパク質のN-結合グリコシル化、好ましくはグルコシル化をもたらす条件下で前記細胞を培養する工程と;
    (iii)場合によりN-結合グリコシルのグリコシル伸長を行うための、好ましくはグルコシル残基の伸長を行うためのグリコシルトランスフェラーゼを同時発現させる工程と;
    (iv)場合によりN-グリコシル化タンパク質を精製する工程
    とを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質を生産する方法。
  11. ステップ(iii)におけるグリコシルトランスフェラーゼが、パスツレラタンパク質、好ましくはアクチノバチルス、ヘモフィルス、ヒストフィルス及びマンヘミアのタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヒストフィルス・ソムニ及びマンヘミア・ヘモリチカ由来のタンパク質、最も好ましくはアクチノバチルス・プリューロプニューモニア由来のα6GlcTから選択される、請求項10に記載の方法。
  12. 細菌性パスツレラ感染症を診断する方法であって、
    (i)パスツレラ感染症にかかっている疑いのある哺乳動物又は鳥類から採取した、好ましくは、血液、唾液、涙液、尿及び/又は糞便から選択される試料を用意する工程と、
    (ii)前記試料、その機能性成分又は誘導体と、請求項1から8のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質とを、抗体結合を可能にする条件下で接触させる工程と、
    (iii)請求項1から8のいずれか一項に記載のN-グリコシル化タンパク質への前記試料、その機能性成分又は誘導体の結合を測定する工程
    とを含む、方法。
  13. 細菌性パスツレラ感染症を有するか、発症しやすい哺乳動物又は鳥類を治療及び/又は予防する方法であって、治療上有効な量の請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1つのN-グリコシル化タンパク質又は請求項9に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
  14. N-グリコシル化タンパク質が、パスツレラタンパク質、好ましくはアクチノバチルス、アグリゲイティバクター、アビバクテリウム、バスフィア、ビベルスティニア、シェロノバクター、ガリバクテリウム、ヘモフィルス、ヒストフィルス、ロネピネラ、マンヘミア、ニコレテラ、パスツレラ、フォコエノバクター及びボルクリバクター属由来のタンパク質、さらに好ましくはアクチノバチルス、ヘモフィルス、ヒストフィルス及びマンヘミアのタンパク質、最も好ましくは、アクチノバチルス・プリューロプニューモニア、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヒストフィルス・ソムニ及びマンヘミア・ヘモリチカ由来のタンパク質である、請求項12又は13に記載の方法。
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