CN118165990A - 基于PRRSV基因组dsRNA的siRNA重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

基于PRRSV基因组dsRNA的siRNA重组质粒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于PRRSV基因组dsRNA的siRNA重组质粒及其构建方法和应用。通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组产生的siRNA基因片段进行测序分析，获得能够大量产生siRNA的片段，将得到的基因片段构建至真核表达载体质粒，制备重组质粒及其在猪繁殖与呼吸综合征的防治方面的应用，经实验证明，将重组质粒转染猪肺泡巨噬细胞后感染PRRSV，细胞中PRRSV复制量显著降低，PRRSV病毒的增殖被抑制。在使用仔猪进行的攻毒保护实验中，免疫组实验猪血液中具有更低的病毒载量，且实验组仔猪全部存活，攻毒对照组有实验猪死亡。因此，该重组质粒可作为种猪场净化PRRSV的候选物。

Description

基于PRRSV基因组dsRNA的siRNA重组质粒及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域，具体涉及基于PRRSV 基因组dsRNA的siRNA重组质粒及其构建方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），也被称为蓝耳猪病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的。PRRS是一种传染病，其主要特征是母猪繁殖障碍，公猪精液质量下降，仔猪和生长猪有严重的呼吸系统病症。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）作为PRRS的病原体，划分为两种，即PRRSV-1（欧洲型PRRSV）和PRRSV-2（北美型PRRSV）。
PRRSV是一种单股正链RNA病毒，该病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。PRRSV是一种有囊膜的病毒，似球状，直径45到65纳米，囊膜表面有纤突，相对平滑。PRRSV可在猪肺泡巨噬细胞上生长（PAM细胞），在PAM细胞上培养可出现细胞圆缩、聚集和崩解等明显的细胞病变（CPE）。PRRSV全基因组长度在14.9 kb ~ 15.5 kb之间，其5'端具有帽子结构（5'-Cap），3'端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构（3'-polyA），共含有9个开放阅读框（ORF），分别为1a、1b、2a、2b、3、4、5、6、7。相邻ORF间有重叠区域。PRRSV的主要结构蛋白包括GP5蛋白（囊膜糖蛋白）、M蛋白（基质蛋白）、N蛋白（核衣壳蛋白），次要结构蛋白则有GP2、GP3、GP4等。
接种疫苗是目前对抗传染性病毒的主要预防措施，但PRRSV在出现至今已经通过不断变异产生不同亚型的毒株，其展现出的高突变性对研制疫苗提出更高的要求。而研制疫苗既要考虑提高免疫原性产生强的保护能力又要求保证疫苗的安全性，同时要降低疫苗的生产成本，这使疫苗的研制困难重重。虽然目前的疫苗在一定程度上具有预防作用，但它们只能提供有限的保护，PRRSV仍然在不断传播，已经成为影响养猪业发展的重要病毒性传染病之一。
RNA干扰（RNA interference, RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫反义RNA的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，作用机制其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21~23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。RNAi技术先前已被证明可以有效地控制病毒复制。许多研究表明，靶向特定病毒基因的小干扰RNA能够显著抑制病毒复制，并表现出显著的抗病毒活性。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物体进化过程中相对保守的一种基因调控方式，该系统利用小片段沉默特定的mRNA的表达。RNAi系统自被发现以来，提供了一种通过靶向特定基因来调节靶基因表达的新方法并表现出了高靶向性和高效性。目前，RNAi系统主要被应用于治疗领域，包括对遗传性疾病、病毒性疾病、肿瘤疾病等治疗难度高的疾病的治疗。自2018年以来多种RNAi的药物通过临床试验并获得FDA批准，还有很多RNAi疗法已经进入了临床试验阶段。最后，RNAi疗法只需要提供siRNA，细胞中RNAi系统的其他组分结合siRNA就能调控靶基因。但在抵抗病毒方面也面临着一些问题，其中一个问题就是如何大量获得siRNA，并且由于RNA在普通环境中不稳定，在体外大量合成RNA直接免疫动物抵抗病毒的难度较高。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是通过大量合成能转录为一个RNA发卡结构（发卡结构中包含siRNA序列）的DNA质粒，质粒转入后会转录翻译为RNA发卡结构，这个结构被RNAi系统识别切割产生siRNA，从而进一步沉默病毒基因的表达。本发明通过对PRRSV毒株所产生的siRNA进行分析，筛选得到能够大量产生siRNA的PRRSV基因片段，构建重组质粒能更好的激活RNAi系统，产生更强的抗病毒效果，从一个更新的角度解决如何大量获得siRNA的技术问题，发现了siRNA应用于抗病毒的新方法。
本发明还要解决的技术问题是筛选分析得到一段能够大量产生siRNA的基因片段。
本发明还要解决的技术问题是提供一种具有抵抗PRRSV感染功能的能大量产生siRNA的重组质粒、重组细胞系或重组菌株及其构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了上述PRRSV基因片段、重组载体或重组细胞在制备防治PRRSV感染疾病的药物或疫苗中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种能大量产生siRNA的PRRSV基因片段，所述PRRSV基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌，其含有所述的PRRSV基因片段。
其中，所述重组载体是将所述的PRRSV基因片段导入到质粒中获得。
其中，所述重组细胞包括但不仅限于Marc145细胞、MA104细胞、猪肺泡巨噬细胞（PAM）。
本发明内容还包括所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
（1）通过分析筛选得到能大量产生siRNA并可有效抑制PRRSV复制的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段；
（2）将步骤（1）筛选的基因片段连接在质粒上，构建能高效产生siRNA的重组载体。
其中，步骤（1）的具体方法为通过对PRRSV毒株感染猪肺泡巨噬细胞后产生的21-23 bp的siRNA序列进行测序分析，然后使用snapgene软件将得到的PRRSV siRNA序列数据与PRRSV基因组序列进行比对分析，最后使用IGV软件将比对数据进行基因组数据可视化，得到1条PRRSV基因组序列上产生siRNA较多的区域即为SEQ ID NO.1所示的基因片段。
其中，步骤（1）还包括使用primer 6软件设计出针对此基因片段的上下游引物（应包含连接载体上下游的同源臂），以PRRSV基因组为模板，通过PCR方法扩增能够大量产生siRNA的PRRSV基因片段。
其中，步骤（2）的所述质粒包括真核表达载体，作为优选，所述真核表达载体包括但不仅限于pSliencer 4.1，其图谱见图1。
其中，步骤（2）的具备步骤包括：使用限制性内切酶在37 ℃条件下将载体质粒切开，通过琼脂糖凝胶电泳将切开的载体片段分离，并使用DNA琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒将切开的载体片段回收，然后将步骤（1）得到的能大量产生siRNA的基因片段通过overlap法与酶切处理后的载体连接。
作为优选，本发明进一步构建的重组质粒，命名为pSliencer 4.1 - siRNA，其含有能大量产生siRNA的PRRSV基因片段，其图谱见图2。
本发明内容还包括所述的能大量产生siRNA的PRRSV基因片段、所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备防治PRRSV感染疾病的药物或疫苗中的应用。
其中，所述siRNA的DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15或SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示。
其中，所述药物或疫苗的剂型为液体制剂，所述液体制剂为滴剂或注射剂。
其中，所述应用包括将所述的重组质粒用注射和/或滴鼻的方式作用于动物。
其中，本发明所述动物包括猪，作为优选，所述动物为1-2月龄仔猪。
具体地，本发明内容还包括可抑制PRRSV病毒复制的重组质粒的构建方法，具体包括以下步骤：
（1）根据pSliencer 4.1、PRRSV siRNA富集区基因的序列，分析选择合适的酶切位点，设计带同源臂的引物并扩增能大量产生siRNA的PRRSV基因片段序列。
（2）按上一步所筛选出的酶切位点利用限制性内切酶切开pSliencer 4.1载体质粒。
（3）利用Infusion酶将前两步中得到的能够大量产生siRNA的基因片段连接在pSliencer 4.1载体上，得到重组质粒pSliencer 4.1-siRNA（简称Ps-siRNA）。
（4）对上一步获得的重组质粒进行测序，选出正确连接的质粒，即为构建成功的重组质粒。
本发明内容还包括重组质粒的疫苗制备方法，具体包括以下步骤：
（1）用PBS缓冲液稀释重组质粒得到质粒缓冲液溶液；
（2）在室温环境下将上一步获得的溶液与ISA 206佐剂按等体积比例混合，500rpm搅拌20 min。
本发明内容还包括构建PRRSV感染模型，所述感染模型包括1-2月龄仔猪。
其中，所述PRRSV感染模型是将PRRSV病毒液通过滴鼻加注射的方式攻毒得到。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
1、本发明通过分析筛选首次得到了一段能够大量产生siRNA的PRRSV基因片段，该片段包含大量针对PRRSV的siRNA，最终能够获得大量的siRNA片段，可以作为抑制PRRSV复制的片段。
2、本发明构建了一种含能够大量产生siRNA的基因片段的重组质粒，并证明其在细胞模型和动物模型中都能降低病毒载量，可以作为研究RNA干扰系统和PRRSV入侵机制的良好工具，并可以作为一种防治PRRSV的候选物。
3、本发明提供了一种含能够大量产生siRNA的基因片段的重组质粒的构建方法，该方法能快速设计、制备含能够大量产生siRNA的基因片段的质粒且成本较低，该方法为研制疫苗提供了一种快速低成本的方案。
4、本发明的含有PRRSV基因片段的重组质粒在预防和治疗PRRSV感染的动物具备显著的作用，能够显著提高PRRSV攻毒仔猪的存活率。
附图说明
图1为用于重组PRRSV siRNA富集区基因的pSliencer 4.1载体；
图2为重组PRRSV siRNA富集区基因的pSliencer 4.1 - siRNA重组载体；
图3为pSliencer 4.1-siRNA重组载体细胞接毒实验的荧光定量检测结果；
图4为pSliencer 4.1-siRNA重组载体细胞接毒实验的WB结果；
图5为pSliencer 4.1-siRNA重组载体细胞接毒实验中影响RNAi通路中Ago 2蛋白的WB结果；
图6为pSliencer 4.1-siRNA重组载体在仔猪攻毒保护实验中病毒血症的荧光定量检测结果；
图7为pSliencer 4.1-siRNA重组载体在仔猪攻毒保护实验中实验猪存活情况结果；
图8为PRRSV病毒源A链siRNA富集区示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
细胞、病毒和质粒：猪肺泡巨噬细胞（PAM）由本实验室液氮保存。PRRSV病毒原液（由南京农业大学动物医学院提供），经测定病毒含量TCID50为106.0/ml。pSliencer 4.1质粒为从优宝生物公司购买的商品化质粒。
仪器和耗材：荧光定量分析仪；蛋白电泳仪；转膜仪；蛋白显影仪；CO2恒温细胞培养箱；细胞培养瓶；6孔培养板；12孔培养板。
试剂：Omega Endo-free Plasmid Mega Kit（南京鼎思生物有限公司）；ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme公司）；2 × Taq Plus Master Mix Ⅱ(Vazyme公司)；QuickCut™ Hind Ⅲ（Takara公司）；QuickCut™ BamH I（Takara公司）；DH5α Competent cell（Vazyme公司）；PSMF（Solarbio，China）；RIPA裂解液（Solarbio，China）；Immobilon-P PVDF膜（南京费尔特生物技术有限公司）；雅酶滤纸（博奥赛公司）；Scotch-Brite垫（麦高德公司）；胎牛血清（内蒙古奥普赛生物科技有限公司）；RPMI-1640培养基（gibco公司）；0.05%胰酶（碧云天生物技术有限公司）。
实施例1 PRRSV siRNA富集区基因片段的获得
首先，将液氮中保存的PAM细胞冻存管取出，在37℃水浴锅中不断快速摇晃，直至细胞液完全融化，用含10%胎牛血清（内蒙古奥普赛生物科技有限公司）的RPMI-1640培养液将细胞重悬，1000rpm离心5分钟，弃去上清，用含10%胎牛血清（内蒙古奥普赛生物科技有限公司）的RPMI-1640培养液将细胞沉淀重悬，进行计数，按照2×106个细胞/孔装入新的无菌6孔细胞培养板中，放入37℃ 5%CO2培养箱中进行培养。培养1天后，弃去上清液，将从-80℃冰箱中取出保存的PRRSV病毒原液按照0.5ml/孔加入孔中，置37℃吸附1小时后弃去上清液，每孔补加2ml含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37℃ 5%CO2培养箱中继续培养36小时，收集细胞作为样品。对样品中的21 - 23 bp的siRNA进行序列测定，得到PRRSV siRNA序列数据集，使用snapgene软件将得到的PRRSV siRNA序列数据集与PRRSV基因组序列进行比对分析，确定其在PRRSV的基因组上对应的位置，然后使用IGV软件将siRNA序列数据集对应在PRRSV基因组上的数据可视化后，分析病毒基因组上能够大量产生siRNA的片段区域，选择能产生最多siRNA的区域基因片段（ SEQ ID NO.1），使用primer 6软件设计出针对此片段的上下游扩增引物对，该扩增引物对应包含连接载体上下游的同源臂，使用2 × TaqPlus Master Mix Ⅱ（Vazyme公司）以提取的PRRSV核酸反转录的cDNA为模板，按下列PCR体系配制扩增体系，并按照扩增程序进行扩增，取部分扩增产物送生工生物公司测序，另一部分置-20℃冷冻保存，测序正确的样品即为得到目的基因。
扩增引物对序列如下：
pSliencer 4.1-siRNA：
F:5’-GGTTTAGTGAACCGTGGATCCCCAAATAACAACGGCAGGC -3’
R:5’-AAAAGATCCTTTATTAAGCTTTGCTGAGGGTGACGCTGTGG- 3’
PCR扩增体系如下：
表1
PCR反应条件如下：
表2
上述能大量产生siRNA的PRRSV基因片段序列如下：（SEQ ID NO.1）
CCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATAACGGCAAGTGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTTAACGGCACACTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAGAGCTGTTAAGCGAGGAGTGGTGAACCTTGTTAAATATGCCAAATAACAACGGCAGGCAGCAAAATAAAAAGAAGGGGGATGGCCAGCCAGTCAATCAGTTGTGCCAGATGTTGGGTAAGATTATCGCCCAACAGAGACAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAGAGTAAGAATAGAAACCCGGAGAAGCCCCATTTTCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGACATCACTTCACCCCTAGTGAGCGACAATTGTGTCTGTCGTCAATCCGGACTGCCTTT。
实施例2 抑制PRRSV病毒复制的重组质粒的构建
（1）pSliencer 4.1质粒是实验室购买的商品化质粒。
（2）根据pSliencer 4.1、能大量产生siRNA的PRRSV基因片段序列（SEQ ID NO.1），选择BamHⅠ和Hind Ⅲ作为酶切位点，以实施例1中获得的目的基因为模板进行PCR扩增，扩增引物对、PCR扩增体系和PCR反应程序参照实施例1中的扩增引物对序列、扩增体系和反应条件进行，获得目的基因扩增产物。
（3）使用QuickCut™ BamH I、QuickCut™ Hind Ⅲ限制性内切酶（Takara、Japan）在37℃条件下切开pSliencer 4.1质粒得到pSliencer 4.1线性化载体。
（4）使用ClonExpress II One Step Cloning Kit（vazyme，China）按照使用说明书方法将步骤（2）和步骤（3）中得到目的基因片段连接到pSliencer 4.1载体上，得到重组质粒。
连接程序如下：
表3 overlap连接程序表
连接体系如下：
表4 overlap 连接体系表
（5）取步骤（4）中得到的连接产物10μl，加入100μl DH5α Competent cell（Vazyme，China），冰上静置30 min，42 ℃水浴热激45 sec后，立即置于冰上冷却 3 min，加入500μl 不含抗生素LB培养基，37℃、220 rpm摇菌1h，将菌液均匀涂布在含氨苄抗性的固体LB平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
（6）在步骤（5）过夜培养的平板中挑取单菌落，加入1mL含氨苄抗性的LB液体培养基，置37℃ 摇床220 rpm摇菌6h后，分装500 μl菌液送生工生物公司测序，剩余菌液于4℃暂存。根据测序结果选出有正确连接的质粒的菌种，即成功构建重组质粒，将重组质粒命名为pSliencer 4.1-siRNA简称为Ps-siRNA。将含有正确的Ps-siRNA质粒的菌种命名为Ps-siRNA菌种。将暂存于4℃的剩余菌液加入5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，置37℃ 摇床220 rpm摇菌8h后，与提前准备好的已灭菌50%甘油按照1:1等体积混匀，按照1ml/管分装至1.5ml无菌离心管中，置-80℃冰箱保存。
实施例3 荧光定量检测重组质粒在细胞中抵抗PRRSV感染能力
将液氮中保存的PAM细胞冻存管取出，在37℃水浴锅中不断快速摇晃，直至细胞液完全融化，用含10%胎牛血清（内蒙古奥普赛生物科技有限公司）的RPMI-1640培养液将细胞重悬，1000rpm离心5分钟，弃去上清，用含10%胎牛血清（内蒙古奥普赛生物科技有限公司）的RPMI-1640培养液将细胞沉淀重悬，进行计数，按照1×106个细胞/孔装入新的无菌12孔细胞培养板中，放入37℃ 5%CO2培养箱中进行培养。培养1天后使用转染试剂Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent（yeasen，China）按说明书将构建好的Ps-siRNA质粒转染PAM细胞作为Ps-siRNA组，将未插入siRNA片段的pSliencer 4.1空载体质粒转染细胞作为Empty vector组，质粒转染浓度均为1μg/每孔，转染时间均为12h。不做任何处理的PAM细胞组作为BK组。转染12小时后弃去孔中培养液，使用RPMI-1640培养基洗去残留培养液，将PRRSV病毒液滴加入BK组、Empty vector组、Ps-siRNA组的每孔细胞作为BK+PRRSV组、Empty vector+PRRSV组、Ps-siRNA+PRRSV组，MOI为0.01。置于37℃吸附1小时，后补加1ml含2%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37℃ 5%CO2培养箱中继续培养。观察接毒36h时的细胞状态，并收集细胞样品，使用Trizol法提取细胞RNA，测定浓度后按反转录试剂盒Hifair®AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（yeasen，China）使用说明书将RNA反转录成cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（vyzam，China）进行荧光定量PCR，按荧光定量PCR体系表进行加样，随后按反应程序表使用荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。
荧光定量PCR的引物序列如下：
PRRSV：
Primer1：F：5’-TTGCTAGGCCGCAAGTAC- 3’
Primer2：R：5’-ACGCCGGACGACAAATGC -3’
荧光定量PCR体系如下：
表5 荧光定量PCR体系表
荧光定量PCR反应程序如下：
表6 荧光定量PCR反应程序表
将接毒后36h的孔板中的液体弃去，向孔中加入RIPA裂解液（Solarbio，China）（已提前加入PSMF），使用移液枪将细胞吹打脱离孔底。将样品用移液枪转移至新的离心管中，加入5×SDS上样缓冲液，沸水浴10min，得到细胞的蛋白样品。按使用说明配制聚丙烯酰胺凝胶并放入垂直电泳槽中，向电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液，将蛋白样品加入上样孔中，并在一空孔中加入蛋白质分子量Marker。接通电源，以90V的电压跑浓缩胶，待样品跑出浓缩胶后用130V 电压电泳分离蛋白质。将PVDF膜裁至比凝胶略大，用甲醇浸泡5 min，按照从负极到正极：Scotch-Brite垫（麦高德公司）、雅酶滤纸（博奥赛公司）、聚丙烯酰胺凝胶、PVDF膜（南京费尔特生物技术有限公司）、雅酶滤纸、Scothe-Brite垫的顺序制作转印三明治，并确保 PVDF 膜与凝胶之间无气泡。将转印夹层放入加入预冷的转膜液的转印槽中，连接电源，在冰浴条件下 110V电转60min，关闭电源。将 PVDF 膜放入封闭液中（含 5 %脱脂牛奶的1xTBST缓冲液），室温封闭 2 h。将 PVDF 膜用 TBST 清洗一次后对照maker蛋白大小切下对应大小的条带，分别放入用TBST稀释的对应一抗中，4℃孵育过夜。将 PVDF 膜从一抗中取出，用 TBST 清洗5次，每次8min。 将条带放入种属匹配的 HRP 标记的二抗中，室温孵育 2 h。 用 TBST 清洗条带5次，每次8min，使用ECL发光液，借助发光成像分析仪检测结果。
荧光定量PCR结果评价Ps-siRNA质粒在PAM细胞中抑制PRRSV复制的能力，图3 结果表明使用2-△△CT法分析各组每个样品目的基因相对GAPDH内参基因的表达量，在PAM细胞中相对于空白对照组，Ps-siRNA组的PRRSV载量比Empty vector组显著降低（p<0.001）。
Western blot实验结果表明，在体外细胞抗病毒实验中，Ps-siRNA重组质粒能起到抑制病毒复制的作用。图4实验结果说明，在细胞中Ps-siRNA组相比Empty vector组的PRRSV N蛋白量降低，进一步表明Ps-siRNA重组质粒能降低PRRSV的复制增殖。图5实验结果表明，Ps-siRNA重组质粒组相对与Empty vector组RNAi通路中的关键蛋白Ago 2蛋白含量增多，说明Ps-siRNA重组质粒抵抗病毒入侵的效果与RNAi通路存在联系。
实施例4 仔猪攻PRRSV保护实验
将实施例2中置-80℃冰箱保存的Ps-siRNA菌种取出1管解冻，取100μl接种10ml含有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，置于摇床中（220 rpm，37℃）培养24h，再将培养好的10mL菌液加入1000 mL含有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，置于摇床中（220 rpm，37℃）培养24h，使用Endo-free Plasmid Mega Kit（omega，南京鼎思生物有限公司）按说明书步骤提取无内毒素质粒。使用ISA 206佐剂包裹质粒，具体方式如下：用PBS缓冲液（PH7.4，浓度为0.01M）稀释重组质粒得到质粒缓冲液溶液，在室温条件下将溶液与ISA 206佐剂按等体积比例混合，500rpm搅拌20 min，作为核酸疫苗。筛选并购买21-28日龄未免疫蓝耳疫苗的PRRSV抗原抗体双阴性仔猪，通过颈部肌肉注射的方式将2 mL的Ps-siRNA质粒核酸疫苗接种Ps-siRNA组仔猪，将未插入siRNA片段的2 mL的pSliencer 4.1质粒核酸疫苗接种仔猪作为Empty vector组，不做处理正常饲养的仔猪作为BK组。Ps-siRNA组与Empty vector组均免疫两次，两次免疫间隔21天，二免21天后，通过滴鼻加肌肉注射的方式将Ps-siRNA组和Empty vector组的每头猪滴鼻2ml颈部肌肉注射2ml PRRSV细胞毒，正常饲养并每天观察。攻毒21天后，对实验猪进行采血，统计所有组实验猪存活情况，将所有存活的实验猪实施安乐死并进行无害化处理。试验结束后将攻毒后21天采集的血液样品用Trizol法提取RNA，使用反转录试剂盒Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（yeasen，China）按说明书将RNA反转录成cDNA，使用实施例3中的引物对，按实施例3中荧光定量PCR体系和反应程序，使用荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。
实验结果见图6、图7，图6结果表明，在仔猪攻毒保护实验中，攻毒后21天，Ps-siRNA重组质粒能显著降低仔猪血液中的病毒载量（p<0.001），在仔猪机体中抵抗PRRSV入侵。图7结果表明，在仔猪攻毒保护实验中，Ps-siRNA重组质粒能提高攻毒后仔猪的存活率，减少了PRRSV感染仔猪引起的发病死亡情况，对减少PRRSV感染死亡造成经济损失具有重大意义。

Claims (10)

1.一种能大量产生siRNA的PRRSV基因片段，其特征在于，所述PRRSV基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌，其特征在于，其含有权利要求1所述的PRRSV基因片段。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求1所述的PRRSV基因片段导入到质粒中获得。
4.权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过分析筛选得到能产生siRNA并可有效抑制PRRSV复制的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的基因片段；
（2）将步骤（1）筛选的基因片段连接在质粒上，构建能产生siRNA的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述质粒包括真核表达载体。
6.权利要求1所述的能大量产生siRNA的PRRSV基因片段、权利要求2所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备防治PRRSV感染疾病的药物或疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述siRNA的DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物或疫苗的剂型为液体制剂，所述液体制剂为滴剂或注射剂。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述的重组质粒用注射和/或滴鼻的方式作用于动物。
10.根据权利要求9所述的应用，其他在于，所述动物包括猪。
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