CN114507669B - 点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白的应用，属于基因工程领域。根据本发明提供的RpSDP基因的dsRNA制剂，将其导入点蜂缘蝽体内，可有效地杀灭点蜂缘蝽，避免其为害农作物。本发明特异地针对点蜂缘蝽，对哺乳动物、鱼虾类、天敌昆虫和授粉昆虫无害，具有见效快、致死率高、环境友好等优势。

Description

点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，涉及一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP的dsRNA合成、dsRNA导入点蜂缘蝽体内以及该基因在防治点蜂缘蝽相关病虫害中的应用。
背景技术
点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)是大豆田间常见的刺吸式害虫，主要通过其刺吸式口器持续刺吸植株和种子汁液来获取养分。点蜂缘蝽的持续取食会导致大豆植株的发育不良甚至死亡，且受到侵害的大豆种子也往往无法正常发育，最终导致大豆的减产。目前点蜂缘蝽的防控以化学农药为主，而传统农药的大面积使用不仅造成严重的环境问题，还使得点蜂缘蝽产生了抗药性，不利于农业的可持续发展。因此，开发新的点蜂缘蝽防治技术是解决当前化学农药滥用的良好途径。
RNA干扰技术是近年来生命科学研究的热点。它通过小分子双链RNA特异性地降解或抑制靶标基因mRNA表达，进而抑制或关闭特定基因。RNA干扰技术具有高特异性、高效率、便于操作等优点。目前，该技术已广泛应用于多种农业害虫的防控，即通过向昆虫体内导入特异的dsRNA，使得昆虫的特定功能丧失从而控制害虫的为害。近年来，已有研究人员借助RNA干扰技术以点蜂缘蝽为实验材料进行相关功能研究，例如：TOMOKO IKENO团队研究了生物钟基因Clock在Riptortus pedestris的昼夜节律中的作用和繁殖滞育的光周期调控(TOMOKO IKENO et al，2013),Jang团队发现Duox表达的气管特异性，通过RNAi干扰下调该基因导致其呼吸系统的崩溃(Seonghan Jang et al，2021)；然而，这些研究更多的是机理性研究，应用性不强，目前仍缺乏更有效、更环保的点蜂缘蝽病虫害防治技术；基于上述现有技术的缺陷，本专利发明人通过靶向对点蜂缘蝽生存必须的突触融合蛋白结合蛋白(syntaxin-binding protein，SDP)基因，建立点蜂缘蝽的RNA干扰系统以及点蜂缘蝽SDP(RpSDP)基因突变体；SDP广泛参与昆虫的囊泡运输和神经递质分泌，在昆虫神经递质传导过程中的发挥重要作用；发明人首次测定了点蜂缘蝽基因组(HUANG et al，2021)，本发明在此基础上鉴定了点蜂缘蝽的RpSDP基因，通过建立点蜂缘蝽的RNA干扰系统以及点蜂缘蝽RpSDP基因突变体，为点蜂缘蝽的防治提供序列和数据基础。
发明内容
本发明克隆点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP的部分序列，通过体外合成方法获得RpSDP基因的dsRNA，并将其导入点蜂缘蝽体内。沉默RpSDP基因能够显著降低点蜂缘蝽在大豆植株上的存活率，从而达到防控点蜂缘蝽的目的。
一方面，本发明涉及一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其组成；
另一方面，本发明一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所编码的氨基酸或与SEQ ID NO:1编码的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成；
另一方面，本发明还涉及一种RpSDP基因的克隆方法，步骤包括：
(1)取点蜂缘蝽若虫，Trizol法提取总RNA，并利用点蜂缘蝽总RNA为模板合成cDNA第一条链；
(2)以点蜂缘蝽cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和序列如SEQID NO.3所示的下游引物进行PCR扩增，得到含有的基因片段序列如SEQ ID NO:4所示的PCR扩增产物；
(3)将上述扩增获得的基因片段连接克隆载体，转化到大肠杆菌TG1，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，获得含有目的基因的单克隆菌落；
(4)将单克隆菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养内扩大培养，抽提含有目的基因的质粒；
(5)以质粒为模板，以序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和以序列如SEQ IDNO.6所示的下游引物进行PCR扩增，获得大量的、单一的含有T7启动子的基因片段；
另一方面，本发明涉及一种RpSDP基因的dsRNA合成方法，具体步骤包括：
(1)以PCR扩增获得的基因片段为DNA模板合成dsRNA，反应体系为：2μl 10×Reaction Buffer，2μl ATP solution，2μl UTP solution，2μl CTP solution，2μl GTPsolution，2μl enzyme mix，1μg DNA模板，并用无RNase水补齐到20μl，反应体系配好后混匀，37℃反应过夜；
(2)向反应体系加入1μl TURBO DNase，37℃反应15min；
(3)将反应后的样品在65℃变性5min；
(4)用Nanodrop测定dsRNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳确定dsRNA质量。
另一方面，本发明还涉及一种dsRpSDP导入点蜂缘蝽的方法，包括：
(1)将合成的dsRpSDP装载入玻璃毛细管；
(2)利用显微注射的方法将dsRpSDP导入点蜂缘蝽体内；
(3)待点蜂缘蝽苏醒后，将其转移到种有大豆植株的笼子里。
另一方面，本发明还涉及一种RpSDP基因的沉默效率检测方法，具体步骤包括：
(1)取经dsRNA处理后的点蜂缘蝽，提取RNA并反转录获得点蜂缘蝽的cDNA；
(2)通过定量PCR方法检测样品中RpSDP基因的表达水平；
(3)利用2-ΔΔCt法计算点蜂缘蝽RpSDP基因的相对表达量，比较不同处理组之间的差异。
另一方面，本发明还涉及特异性抑制RpSDP基因表达的dsRNA，其由前述方法合成；
在一些实施方案中，本发明还涉及一种体外细胞，其含有所述dsRNA；
在一些实施方案中，本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述dsRNA以及药学可接受的载体；
在一些实施方案中，本发明还涉及所述dsRNA及其相关药物组合物在制备杀虫剂中的用途；
另一方面，本发明还涉及一种点蜂缘蝽防治方法，其特征是，将所述dsRNA或者包含dsRNA的药物组合物或杀虫剂喂食点蜂缘蝽；
本发明至少取得了以下有益效果为：
本发明首次鉴定了SDP基因，通过实验证据验证其功能，并获得RpSDP基因的dsRNA，将其导入点蜂缘蝽沉默RpSDP基因后，能够显著降低点蜂缘蝽在大豆植株上的存活率。本发明明确了RpSDP基因在点蜂缘蝽基本生命活动中的重要作用，为点蜂缘蝽的防治以及大豆抗虫育种的培育提供了理论依据和现实策略。
附图说明：
图1：RpSDP片段(602bp)PCR扩增的实验结果
图2：RpSDP基因dsRNA合成的实验结果
图3：将RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽的沉默效率实验结果。
图4：将RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽的生存率实验数据。
实施例：
实施例1点蜂缘蝽RpSDP基因片段克隆
1.点蜂缘蝽RpSDP基因片段扩增
(1)取点蜂缘蝽成虫或若虫，将其放入1ml Trizol(Takara)中充分研磨；随后加入400μl氯仿剧烈混匀后12,000rpm 4℃离心15分钟，小心吸取最上面的水相液体，并转移至新离心管；加入等体积的异丙醇，混匀后在室温静置10分钟；随后12,000rpm离心10分钟，弃上清后向沉淀加入1ml 75％乙醇；9600rpm4℃离心5分钟后弃上清，并向沉淀中加入适量的无RNase水；用NanoDrop测定RNA浓度；
(2)使用ReverTra Ace q PCR RT Master with gDNA remover试剂盒对提取的点蜂缘蝽总RNA进行反转录：首先，将总RNA在65℃变性5min；取1μg总RNA，加入2μl 4×DNMaster Mix，并用无RNase水补齐到8μl；混匀后在37℃孵育5min以去除污染的基因组DNA；接着，往体系内加入2μl 5×RT Master Mix；混匀后在37℃孵育1h最后，98℃变性5min，使反转录酶失活并最终获得点蜂缘蝽cDNA；
(3)根据RpSDP基因序列全长设计引物如表1所示，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
表1
Figure BDA0003295886110000041
(4)以点蜂缘蝽cDNA为模板，利用表1所示引物，对目的基因进行PCR扩增，具体扩增体系为：2×
Figure BDA0003295886110000042
Max Buffer 25μl，dNTP Mix(10mM each)1μl，/>
Figure BDA0003295886110000051
Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，上下游引物各1μl，点蜂缘蝽cDNA模板2μl，最后用ddH2O补齐至50μl。PCR扩增条件为：95℃3分钟；95℃15秒，60℃1分钟，35个循环；72℃10分钟。
2.点蜂缘蝽RpSDP基因单克隆菌株获取
(1)利用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物(图1)，并用刀片切取目的片段；
(2)使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工生物，货号：SK8131)回收目的DNA：从琼脂糖凝胶中将含有目的片段的琼脂糖切下,放入离心管中；加入5倍体积胶溶解液BufferB2，70℃水浴10分钟；将溶解好的胶溶液加入吸附柱中，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μl wash solution，9,000g离心30秒，弃废液；空吸附柱9,000g离心1分钟；将吸附柱放入新的离心管中,在吸附柱中央加入30μl ddH2O；10,000g离心2分钟，最终获得纯化后的点蜂缘蝽RpSDP基因DNA片段；
(3)使用平末端克隆试剂盒(北京擎科生物有限公司)将点蜂缘蝽RpSDP基因的DNA片段连接到pClone007载体：在0.2ml离心管中依次加入1μl点蜂缘蝽RpSDP基因DNA片段，1μl pClone007 Blunt simple载体；1μl 10Xbuffer，最后用ddH2O补齐至10μl，将样品混匀后在25℃反应5分钟；
(4)将连接产物加入到感受态中，用手轻弹管壁，冰浴30分钟；将离心管转移到42℃水浴90秒，迅速拿出在冰上静置2分钟；在离心管中加入500μl无抗LB培养基，180rpm摇1小时；取100-200μl菌液涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板上；
(5)挑取单菌落至1ml含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，180rpm摇6小时，菌液进行菌落PCR，反应体系为：2×
Figure BDA0003295886110000052
Max Buffer 12.5μl，dNTP Mix(10mM each)0.5μl，
Figure BDA0003295886110000053
Max Super-Fidelity DNA Polymerase0.5μl，上下游引物各0.5μl，菌液1μl，最后用ddH2O补齐至25μl。PCR扩增条件为：95℃3分钟；95℃15秒，60℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；
(6)利用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，挑选重组克隆，送杭州有康生物科技有限公司进行测序，得到602bp的点蜂缘蝽RpSDP序列，所得序列如SEQ ID NO:4所示。该序列是根据全长设计的RpSDP序列片段，已通过桑格测序确认，用于RNAi模板合成。
实施例2：点蜂缘蝽RpSDP基因的dsRNA合成
1.T7引物PCR扩增与纯化
(1)以含有RpSDP基因的重组质粒或菌液为模板，利用带T7启动子序列的引物(表2所示)扩增目的基因，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，扩增体系为2×
Figure BDA0003295886110000061
Max Buffer 100μl，dNTP Mix(10mM each)4μl，/>
Figure BDA0003295886110000062
Max Super-Fidelity DNAPolymerase 4μl，上下游(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)各4μl，重组质粒或菌液4μl，最后用ddH2O补齐至200μl。PCR扩增条件为：95℃3分钟；95℃15秒，60℃1分钟，35个循环；72℃10分钟。
表2
Figure BDA0003295886110000063
(2)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳分离，并通过DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，最终获得大量的、单一的含有T7启动子的RpSDP基因片段。
2.dsRNA的合成与纯化
使用诺唯赞生物技术有限公司的T7 High Yield RNA转录试剂盒(TR102Version21.1)合成和纯化RpSDP基因的dsRNA，具体方法如下：
(1)以PCR扩增获得的RpSDP基因片段为DNA模板合成dsRNA，反应体系为：2μl 10×Reaction Buffer，2μl ATP solution，2μl UTP solution，2μl CTP solution，2μl GTPsolution，2μl enzyme mix，1μg DNA模板，并用无RNase水补齐到20μl，反应体系配好后混匀，37℃反应过夜；
(2)向反应体系加入1μl TURBO DNase以消除反应体系中的DNA，37℃反应15min；
(3)将反应后的样品在65℃变性5min；
(4)用Nanodrop测定dsRNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳确定dsRNA质量(图2)；
(5)将RpSDP基因的dsRNA储存于80℃备用。
实施例3：RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽对昆虫存活率的影响
利用显微注射法将RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽体内，具体方法如下：
(1)取点蜂缘蝽若虫。将其用CO2麻醉10s；
(2)利用毛细管拉针仪(P 97,Sutter Instrument)将玻璃毛细管(武汉微探科学仪器有限公司)拉到合适尺寸，所用程序参数设定为：heat＝800pull＝150vel＝150time＝80；
(3)用微量加样头(Eppendorf)分别将GFP和RpSDP基因的dsRNA注入到玻璃毛细管；
(4)将加完样的玻璃毛细管安装至显微注射仪(Eppendorf)，在体视镜下将dsRNA导入点蜂缘蝽体内，显微注射仪参数设定为：注射压强1300pah，注射时间0.3s，补偿压力10pah；
(5)利用同样的方法，将水母绿色荧光蛋白基因(Aequorea victoria greenfluorescent protein，GFP)的dsRNA导入点蜂缘蝽体内作为阴性对照；
(5)待导入dsRNA的点蜂缘蝽苏醒后，将其移至大豆植株上，每组大豆放10头点蜂缘蝽，做6组重复，每日统计死亡率，点蜂缘蝽饲养条件为：温度26℃±0.5℃，相对湿度50％±5％，光周期为16h:8h(白天:黑夜)；
(6)实验结果如图3所示，导入SDP基因dsRNA的点蜂缘蝽(RpSDP)存活率显著低于对照(dsGFP)(p<0.01)，说明SDP基因对点蜂缘蝽的存活十分重要，相关dsRNA对点蜂缘蝽防治具有潜在的应用价值。
实施例4 RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽对RpSDP基因的沉默效率
将RpSDP基因的dsRNA导入点蜂缘蝽后第3天，收集点蜂缘蝽，测定RpSDP基因的表达水平，具体方法如下：
(1)将收集的点蜂缘蝽研磨，用Trizol法提取总RNA，并用ReverTra Aceq PCR RTMaster with gDNA remover试剂盒反转录获得点蜂缘蝽的cDNA；
(2)利用Primer Premier 6.0软件，设计点蜂缘蝽RpSDP基因(SEQ ID NO.7和SEQID NO.8)和肌动蛋白actin基因(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)的定量引物，如表3所示，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，
表3
Figure BDA0003295886110000071
Figure BDA0003295886110000081
(3)以点蜂缘蝽的cDNA为模板，使用iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix(上海翌圣生物科技有限公司)荧光定量检测试剂测定点蜂缘蝽RpSDP基因的表达水平，反应体系配置如下：6.8μl H2O，10μl 2×SYBR Green Supermix，0.6μl正向引物，0.6μl反向引物，2μl cDNA模板。在Roche Light
Figure BDA0003295886110000082
480Real-Time PCR System运行以下程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，变性和延伸共40个循环；每对引物均设置一个无RNase水的阴性对照；
(4)以点蜂缘蝽actin基因为内参，利用2-ΔΔCt法计算点蜂缘蝽RpSDP基因的表达水平(Livak et al,2001)，Student’s t-test检验不同处理组之间的差异显著性；
(5)实验结果如图4所示，导入SDP基因dsRNA的点蜂缘蝽的RpSDP基因表达水平显著低于对照，说明SDP基因dsRNA对点蜂缘蝽RpSDP基因具有较高的沉默效率。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化，因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波大学
<120> 点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用
<130> CP121130997C
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcgctga aggctctggt tgggcaaaaa attatgaatg atgctataaa acagaaaagg 60
aaagcaaaag aagtagaatg gcgagtttta gttgtggatc agcttgctat gagaatgata 120
tcagcctgct gcaaaatgca tgaaatctca gctgaggggt taaccattgt tgaagatatc 180
aataaaaaga gagagcccct tcctacaatg gaggctgtgt acttgattac gcccagtgaa 240
aaatcagtac atgctctaat gaatgatttc agctctccta atcgaacaat gtacagagcc 300
gcccatgttt atttcacaga agtctgtcag gaagagttgt ttaacgaact gtgcaaatct 360
tatgctgcaa gaaaaataaa gaccctgaaa gaaatcaaca ttgctttttt gccctatgag 420
agtcaggtat tttctcttga tgctcctgag acctttcagt gcttctataa tcagtcttta 480
gccaacagcc gtctagcaaa catggaaaga attgcagaac aagttgcaac tctgtgtgct 540
acgctaggag aatatccatc tgttcgatac aggagtgatt tccccaaaaa tgtggagcta 600
gcccagatta ttcagcaaaa actggatgct tataaagctg atgagcctac aatgggcgaa 660
ggtccagaga agtctcggtc acagctgctc atcttagata ggggatttga tgctgtttct 720
ccacttcttc atgaacttac tcttcaggct atggcatatg atttgcttcc aatagagaat 780
gatgtgtaca agtatgaagc aacagctggc gctccagaaa aggaagttct ccttgatgaa 840
aatgatgagc tttgggttga attacgacat cagcacatag ctgttgtttc ccaaaatgtt 900
acaaagaatt taaagaagtt cattgagtca aagagaatgc cacaagggga taaacaatcc 960
atgagagatc tgagccaaat gatcaaaaaa atgcctcagt accagaagga attaagtaaa 1020
tattccaccc atcttcacct tgcagaagat tgcatgaagg tctatcaagg atatgttgac 1080
aagctctgta aagttgaaca ggatttggct atgggaactg atgctgaagg tgaacgtatc 1140
aaggatcaca tgaggaatat agtccctata ctcttagacc aggctgtctc taactatgac 1200
aagatgagaa taatccttct ctatgctctc tccaagaatg gaatatcaga agaaaattta 1260
aataagcttg ttcaacatgc ccaaattcag cctcatgaga agcaagctat cactaatctg 1320
ggtaaccttg gactgaatgt agttgttaat ggaaatcgtt tgaagatcca tcaacctaca 1380
aggaaagaaa gaataactga acaaacttat caaatgtccc ggtggacacc tgtagtcaag 1440
gatcttatgg aagattgtat tgatgacaag cttgatataa aacattttcc atttttagct 1500
ggcagagctg caacctctgg ctaccaagct ccatccagtg ttcgctatgg tcattggcat 1560
aaagacaaag gtcagcaaac agtaaagaat gttcctcgcc ttatcgtatt tatcattgga 1620
ggcatgagtt tctctgaaat acgatgtgcc tatgaagtca ccaatgccgt caaaaactgg 1680
gaagtgatta tgggctcttc tcacatcctt actccagaag acttcctcag taatctctcc 1740
aacctcagca attag 1755
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtggatcag cttgctatga g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agatgagcag ctgtgaccga g 21
<210> 4
<211> 602
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtggatcag cttgctatga gaatgatatc agcctgctgc aaaatgcatg aaatctcagc 60
tgaggggtta accattgttg aagatatcaa taaaaagaga gagccccttc ctacaatgga 120
ggctgtgtac ttgattacgc ccagtgaaaa atcagtacat gctctaatga atgatttcag 180
ctctcctaat cgaacaatgt acagagccgc ccatgtttat ttcacagaag catgccctga 240
acaactgttc gaaactcttt gtcatgctag agttgcaaaa tacattaaga ctttgaagga 300
gataaacatt gcttttattc catatgaaca gcaggtattt tctcttgatg ctcctgagac 360
ctttcagtgc ttctataatc agtctttagc caacagccgt ctagcaaaca tggaaagaat 420
tgcagaacaa gttgcaactc tgtgtgctac gctaggagaa tatccatctg ttcgatacag 480
gagtgatttc cccaaaaatg tggagctagc ccagattatt cagcaaaaac tggatgctta 540
taaagctgat gagcctacaa tgggcgaagg tccagagaag tctcggtcac agctgctcat 600
ct 602
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatacgact cactataggg tgtggatcag cttgctatga g 41
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taatacgact cactataggg agatgagcag ctgtgaccga g 41
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtgttcgcta tggtcattg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagtcttctg gagtaaggat g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctcctgagtc aagcacaata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcatcacacc ttctacaatg 20

Claims (2)

1.一种特异性抑制RpSDP基因表达的dsRNA在制备杀虫剂中的用途，
所述dsRNA的通过以下步骤获得：
（1）取点蜂缘蝽若虫，Trizol法提取总RNA，并利用点蜂缘蝽总RNA为模板合成cDNA第一条链；
（2）以点蜂缘蝽cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和序列如SEQ IDNO.3所示的下游引物进行PCR扩增，得到含有的基因片段序列如SEQ ID NO:4所示的PCR扩增产物；
（3）将上述扩增获得的基因片段连接克隆载体，转化到大肠杆菌TG1，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，获得含有目的基因的单克隆菌落；
（4）将单克隆菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养内扩大培养，抽提含有目的基因的质粒；
（5）以质粒为模板，以序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和以序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物进行PCR扩增，获得大量的、单一的含有T7启动子的基因片段；
（6）以步骤（5）所述基因片段为DNA模板合成dsRNA，反应体系为：2 µl 10×ReactionBuffer，2 µl ATP solution，2 µl UTP solution，2 µl CTP solution，2 µl GTPsolution，2 µl enzyme mix，1 µg DNA模板，并用无RNase水补齐到20 µl，反应体系配好后混匀，37℃反应过夜；
（7）向反应体系加入1 µlTURBO DNase，37℃反应15 min；
（8）将反应后的样品在65℃变性5 min；
（9）用Nanodrop测定dsRNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳确定dsRNA质量。
2.一种点蜂缘蝽防治方法，其特征是，将特异性抑制RpSDP基因表达的dsRNA喂食点蜂缘蝽，所述dsRNA通过权利要求1所述的步骤（1）到（9）获得。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104987376A (zh) * 2015-08-08 2015-10-21 中国农业科学院植物保护研究所 绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用
CN106520792A (zh) * 2016-10-18 2017-03-22 华中农业大学 一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白
CN109757438A (zh) * 2019-01-29 2019-05-17 河北省农林科学院植物保护研究所 一种人工饲养点蜂缘蝽的方法

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