CN106520792A - 一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明属于昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白。本发明分离的中黑盲蝽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还包括中黑盲蝽基因RNA干扰序列的应用，所述的RNA干扰序列序列对中黑盲蝽基因具有良好的沉默效果。注射该干扰序列，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终导致了中黑盲蝽的生殖能力下降，可以用有效的控制其种群的发展。进一步，本发明的基因及蛋白可用于转基因抗虫植物的开发以及中黑盲蝽的生物防治。

Description

一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白
技术领域
本发明属于昆虫基因工程技术领域。具体涉及一种分离的中黑盲蝽基因及其编码的蛋白，该基因被命名为Fatty acyl-CoA reductase基因，本发明还包括包括一条中黑盲蝽基因的RNA干扰序列的应用，通过生物学验证，本发明克隆的基因的RNA干扰序列可用于转基因抗虫植物的开发。
背景技术
中黑盲蝽Adelphocoris suturalis(分类学上为半翅目：盲蝽科)是一种重要的多食性农业害虫，目前已记载的寄主植物有50科270种，主要寄主有棉花、小麦以及大豆等(姜玉英等，2015)。近年来，随着种植结构的调整，尤其是1997年转基因Bt棉的推广与普及，降低了棉田化学农药的施用次数和用量，导致盲蝽田间的种群数量剧增，使其由原来的次生害虫逐渐上升为主要害虫(Lu et al.,2008；Lu et al.,2010)。据统计盲蝽在2004、2005和2006年造成的产量损失分别为1991-1996年平均水平的7.77、6.58、8.81倍，并呈进一步蔓延和大面积灾变的发展趋势(陆宴辉和吴孔明，2008)。目前对于中黑盲蝽的防治还是以施用化学杀虫剂为主(刘仰青等，2007)。由于长期大量使用化学农药带来的环境压力以及抗药性等问题，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点。
Fatty acyl-CoA reductase的主要功能是催化脂酰辅酶A的还原反应最终生成脂肪醇类物质，广泛的存在于植物、无脊椎动物、昆虫、鸟类和哺乳动物中。近年来，人们发现Fatty acyl-CoA reductase在桡脚类动物(Teerawanichpan and Qiu,2012)，一些双翅目昆虫(Teerawanichpan and Qiu,2010；Teerawanichpan et al.,2010)，植物(Wang etal.,2015；Iven et al.,2016)以及鸟类(Hellenbrand et al.,2011)中参与了蜡酯的生物合成。在哺乳动物中，Fatty acyl-CoA reductase则是合成重要的代谢物质缩醛磷脂的关键酶酶类，Fatty acyl-CoA reductase基因的缺陷会直接影响中枢神经和软骨细胞的发育(Honsho et al.,2013)。在昆虫中，大量的研究表明Fatty acyl-CoA reductase是合成各种脂肪醇类信息素的关键酶类，对于物种的信息交流和生存十分重要(Lienard et al.,2014；Antony et al.,2015)。
目前，对于昆虫中Fatty acyl-CoA reductase的功能认知主要是其参与了各种脂肪醇类信息素的生物合成，对于其是否参与了其他重要的生命过程尚没有没有任何报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种分离的中黑盲蝽基因(该基因命名为Fatty acyl-CoA reductase)及其编码的蛋白。
本发明运用RNA干扰技术，通过体外注射中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA，发现抑制中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率。本发明首次发现Fatty acyl-CoA reductase的缺失会显著抑制中黑盲蝽的生殖能力，最终导致种群发展的衰退，为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人分离了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因，其cDNA序列如SEQID NO：1所示，序列全长为1563bp。
申请人分离了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因编码的蛋白，其蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，编码520个氨基酸残基。
基于上述基因的分离和克隆，本发明还提供了Fatty acyl-CoA reductase基因的RNA干扰序列，该干扰序列为双链RNA分子，利用特异性引物体外合成该序列的dsRNA，显微注射至中黑盲蝽新羽化雌虫体内。结果显示该序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达。进一步研究沉默Fatty acyl-CoA reductase基因对中黑盲蝽雌虫卵巢发育及生殖能力的影响，结果发现抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终影响了中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展。该干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。
合成dsRNA特异性引物的序列如下：
上游引物dsFACR-F：CAGGAGGCTCGGGGTTTATG
下游引物dsFACR-R：TATGCGGTGGAGACGTGAAC。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明首次发现了Fatty acyl-CoA reductase基因参与了中黑盲蝽的卵巢发育过程，Fatty acyl-CoA reductase基因表达的缺失显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终导致了中黑盲蝽的生殖能力下降和种群的衰退。该基因可用于开发防治盲蝽科昆虫的产品。
(2)本发明提供了一种中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的干扰序列，该序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，可利用该序列干扰Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，抑制中黑盲蝽的生殖能力，最终控制其种群的发展。可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。
(3)利用基因工程技术，可以将外源基因导入植物表达的载体，然后导入植物细胞，可以获得抗虫的转基因细胞和转基因植株。
更详细的技术方案及其发明效果参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的核苷酸序列(即其cDNA序列)，序列全长为1563bp。
序列表SEQ ID NO：2是中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因编码的蛋白质序列，编码520个氨基酸残基。
图1：Fatty acyl-CoA reductase基因功能验证流程图。
图2：pEASY-T1克隆载体结构示意图。
图3：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA后，Fatty acyl-CoAreductase基因的沉默效率。附图标记说明：图3中的a图：Fatty acyl-CoA reductase基因在脂肪体(FB)中的沉默效率；图3中的b图：Fatty acyl-CoA reductase基因在卵巢(O)中的沉默效率。其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组.
图4：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育的影响，附图标记说明：图4中的a图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢干重的影响；图4中的b图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢挂卵量的影响；图4中的c图：注射Fatty acyl-CoA reductase基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育级别的影响。其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoAreductase基因干扰序列dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组.
具体实施方式
下面实施例中所使用的技术，包括RNA的提取、cDNA合成，PCR扩增与检测，以及dsRNA合成等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内技术人员已知的常规技术。所使用的仪器设备、试剂等，除非本说明书特别注明，均为本领域技术人员可通过公关途径或商业途径获得。
实施例1中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的克隆与分析
(1)中黑盲蝽总RNA的提取：称取20mg的中黑盲蝽样品置于1.5ml无酶管中，利用一次性无酶研磨棒及液氮充分研磨后，使用Promega公司的SV total RNA isolation system提取试剂盒提取总RNA，详细步骤参照该试剂盒说明书。
(2)cDNA的合成：使用宝生物工程大连有限公司的PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒将上述步骤(1)中提取的总RNA合成cDNA模板(详细步骤参照该试剂盒说明书)。
(3)引物设计：利用转录组测序得到Fatty acyl-CoA reductase基因核酸序列(见SEQ ID NO：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成的引物如下：
上游引物序列FACR-F：5'-GCTCGTGCCAAACCAGTCAG-3'，
下游引物序列FACR-R：5'-ATCCACGTGGTTGGTGCTTG-3'。
以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(4)PCR扩增：利用上述引物FACR-F和FACR-R进行PCR扩增，PCR体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。
(5)PCR产物的克隆：利用TransGen公司的的pEASY-T1Simple Cloning Kit，按照说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体(见图2)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。
(6)序列分析：利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)将测序所得的Fattyacyl-CoA reductase基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，测序结果一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见SEQ ID NO：2)，结果显示，Fatty acyl-CoA reductase基因开放阅读框架全长1563bp，编码520个氨基酸残基，预测分子质量为58.9628KD，理论等电点为8.73。本发明进一步将其与其它昆虫的5条Fatty acyl-CoA reductase氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的Fatty acyl-CoA reductase蛋白特征。
实施例2 dsRNA合成
1.dsRNA模板的制备：
(1)根据实施例1中所获得的Fatty acyl-CoA reductase基因序列，通过siDirectversion 2.0预测dsRNA区域，并利用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计特异性扩增引物(5'-端加上T7promoter序列)，用于Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA片段的扩增，设计的特异性引物如下：
上游引物序列dsFACR-F：CAGGAGGCTCGGGGTTTATG，
下游引物序列dsFACR-R：TATGCGGTGGAGACGTGAAC。
利用上述引物dsFACR-F和dsFACR-R进行PCR扩增，PCR反应体系参照宝生物工程大连有限公司的Ex Taq酶使用说明书。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过TA克隆将其连接到pEASY-T1载体(见图2)上。
(2)利用AxyGen的AxyPrep Plasmid Miniprep kit试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，利用上述特异性引物dsFACR-F和dsFACR-R进行第二次PCR扩增，PCR体系和反应程序同上述(1)。
2.dsRNA模板的纯化
将第二次PCR的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作步骤如下：
(1)将需要纯化的材料用DEPC H2O定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。
(2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，充分震荡后，室温，12000rpm，离心10min。
(3)取上层相(约250μl)，置于新的无RNA酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(约550μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。
(4)4℃，12000rpm，离心15min，弃上清液。
(5)加入75％乙醇(用DEPC H2O配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。
(6)4℃，7500rpm，离心5min。
(7)弃上清液，风干沉淀，加入20μl DEPC H2O溶解沉淀。
(8)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。
3.dsRNA合成：
(1)dsRNA合成反应体系
dsRNA的合成反应体系见表1。
表1 dsRNA合成反应体系
轻弹混匀，瞬时离心。37℃，4小时。
(2)DNAse I消化DNA模板，按照比例加入如表2所述的试剂。
表2 DNAse I消化反应体系
充分混匀，瞬时离心，37℃，30min。
4.dsRNA纯化：
(1)将需要纯化的材料用DEPC H2O定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。
(2)加入150μl的水饱和酚和150μl氯仿，充分震荡后，4℃，12000rpm，离心15min。
(3)取上层相(约250μl)，置于新的无RNA酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(约700μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃静置过夜。
(3)4℃，12000rpm，离心30min，弃上清液。
(4)加入75％乙醇(DEPC H2O配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。
(5)4℃，7500rpm，离心5min。
(6)弃上清液，风干沉淀，加入20μl DEPC H2O溶解沉淀。
(7)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA质量，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。
(8)将dsRNA稀释成10μg/μl备用。
实施例3注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA后基因的沉默效率及其对中黑盲蝽生殖发育的影响。
以合成的dsGFP为对照，利用显微注射仪，将合成的dsRNA从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射入新羽化雌虫体内。
分别收集注射处理后5和10天的中黑盲蝽脂肪体及卵巢组织，提取总RNA，合成cDNA后，利用宝生物工程大连有限公司的Premix ExTaqTM II和Bio-Rad DetectioniQ2System.检测Fatty acyl-CoA reductase基因的沉默效应。
注射处理10天后，解剖并观察中黑盲蝽卵巢发育情况，20头虫子为一个处理组，统计并分析中黑盲蝽卵巢的挂卵量及其干重的变化。
分别解剖并观察注射处理1、5、10天后中黑盲蝽卵巢的发育级别，20头虫子为一个处理组，统计并分析注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽卵巢发育级别的影响。
将注射dsRNA处理后的雌虫与新羽化的雄虫一一配对，单独饲养，雄虫死亡及时补充新的性成熟的雄虫，分别统计产卵前期及产卵量，以35-45对虫子为一个处理组，分析注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽产卵前期及产卵量的影响。
分别收集注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组及注射GFP基因dsRNA的对照组交配雌虫所产卵粒，500-600粒卵为一个处理组，统计并分析注射Fattyacyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽卵的孵化率的影响。实施效果见表3。
试验结果及分析：
(1)注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA后该基因的沉默效率
qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA显著抑制了Fatty acyl-CoA reductase在脂肪体(见图3中的a图)及卵巢(见图3中的b图)内的表达。由此可见，该中黑盲蝽Fatty acyl-CoA reductase基因的干扰序列可显著抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达。
(2)注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽雌虫卵巢发育的影响
在实验室内，申请人利用体式显微镜(型号SMZ—t4，重庆奥特光学仪器有限责任公司)解剖并观察注射处理10天后中黑盲蝽卵巢发育情况，分别统计了卵巢的挂卵量及干重，结果显示，与对照组相比，注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA处理组的中黑盲蝽卵巢的干重和挂卵量分别下降了45.52％(见图4中的a图)和35.87％(见图4中的b图)。此外申请人还观察并统计了注射处理1、5、10天后中黑盲蝽卵巢发育级别的变化，结果显示，仅在注射处理5天时Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA处理组卵巢的发育级别显著低于与对照组。注射处理1和10天均无显著差异(见图4中的c图)。由此可见，注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA可显著减少了中黑盲蝽雌虫卵巢的挂卵量和干重，抑制了卵巢的发育。
(3)注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响
将注射dsRNA处理后的雌虫与新羽化的雄虫一一配对，单独饲养，雄虫死亡及时补充新的性成熟的雄虫，分别统计产卵前期及产卵量，结果显示，与对照组相比，注射Fattyacyl-CoA reductase基因dsRNA处理组的中黑盲蝽产卵量下降了51.51％，产卵前期则没有显著差异(见表3)。申请人同时收集了注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组及注射GFP基因dsRNA的对照组交配雌虫所产卵粒，观察并统计其孵化率，结果显示处理组卵的孵化率仅
表3注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响
表3说明：注射Fatty acyl-CoA reductase基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响。其中“ns”表示无显著差异；“*”表示p<0.05“**”表示p<0.01；“***”表示p<0.001。图中英文缩写含义：“dsFACR”表示注射Fatty acyl-CoA reductase基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组。为28.19％，与对照组相比下降了68.45％(见表3)。由此可见，抑制Fatty acyl-CoA reductase基因的表达，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量和干重，同时抑制了中黑盲蝽的产卵量和卵的孵化率，最终影响了中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。
主要参考文献
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Claims (6)

1.一种分离的中黑盲蝽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种分离的中黑盲蝽基因，它编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种扩增权利要求1所述的中黑盲蝽基因dsRNA片段的特异性引物，其序列如下所示：
上游引物dsFACR‐F：CAGGAGGCTCGGGGTTTATG，
下游引物dsFACR‐R：TATGCGGTGGAGACGTGAAC。
4.权利要求1所述的中黑盲蝽基因在防治中黑盲蝽和盲蝽科昆虫中的应用。
5.权利要求1所述的中黑盲蝽基因在中黑盲蝽转基因植物中的应用。
6.权利要求3所述的中黑盲蝽基因dsRNA片段的特异性引物在制备中黑盲蝽基因RNA干扰序列中的应用。
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