CN110295198A - 一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法及其应用，上述方法为：把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂南方小花蝽，观察饲喂过程中南方小花蝽的生物学变化，并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。本发明提供的评价方法建立在以植物为介导的RNAi转基因棉花对非靶标生物影响的安全评价基础之上，可以根据需求使用dsRNA的量使南方小花蝽暴露在适合浓度的dsRNA，且方法简单，适用性强，可以为转基因棉花安全评价提供可靠的依据。

Description

一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法及其应用
技术领域
本发明涉及昆虫分子生物学技术领域，尤其涉及一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法及其应用。
背景技术
随着转基因棉花种植面积不断的扩大，其发展也面临着各种挑战，单一抗性的转基因棉花虽然有效的防治了棉铃虫危害，但在农药使用不断减少的情况下盲蝽类害虫的种群数量急剧增加，逐渐上升为主要害虫；且棉铃虫对Bt棉的抗性也逐渐增强且Bt棉特异性不强，容易对非靶标生物造成影响；靶标害虫的抗性不断增强等问题。因此新技术的发展和运用对当前转基因棉花的发展十分重要。
RNAi在基因功能研究、基因治疗、新药物的研究等方面都被广泛应用，在转基因领域RNAi也被开发利用，RNAi类转基因植物通过植物表达特定双链RNA的转基因植物以沉默相应害虫的关键基因达到防治害虫的目的。与传统的转基因作物相比，利用植物为介导表达dsRNA的RNA干扰技术特异性高、成本低、更加环保友善，在改善植物品质和害虫防治中均有良好的应用前景
与传统的Bt转基因作物相同，RNAi生物技术作物也要面临潜在的环境风险，能否稳定地遗传、在生态系统中的竞争能力、基因飘逸、对其他非靶标生物的影响等都需要经过完善的风险评估。由于RNAi植物的特异性，其是否会沉默目标基因外的其他基因一直是重点考察的方面，如果靶标害虫的目标基因与环境中其他昆虫的同源性十分高时就很有可能发生非期望基因被沉默的情况。随着基因组数据测序的不断发展，人工合成dsRNA，设计科学合理的喂食实验为测定非靶标基因是否被沉默提供可靠的依据。
南方小花蝽，属半翅目昆虫花蝽科，是我国独有的天敌昆虫，南方小花蝽是棉田生态系统中一种重要的捕食性天敌，其若虫和成虫均可以捕食棉田中的蓟马、棉蚜、螨虫以及棉铃虫、棉红铃虫等多种鳞翅目害虫的卵和初孵幼虫，且南方小花蝽在棉田中的自然种群数量较大，在棉田生态系统中占据重要的位置。南方小花蝽与其捕食的几种重要害虫以及花粉是棉田生态系统中的几个十分关键的环节，且南方小花蝽有取食花粉的习性，会直接取食外源dsRNA表达量较高的花粉，因此在对转基因棉花进行生物安全评价时，天敌昆虫南方小花蝽是十分重要的非靶标评价生物。
在评价外dsRNA对南方小花蝽影响时，一般以对南方小花蝽最大暴露量的10倍以上的外源dsRNA来喂南方小花蝽，直接使用转基因植物花粉无法达到上述要求。
发明内容
针对上述问题，现提供一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法及其应用，该方法建立在RNAi类转基因棉花对非靶标生物影响的安全评价基础之上，并可根据需求使用dsRNA的量使南方小花蝽暴露在适合浓度的dsRNA下。
具体技术方案如下：
本发明的第一个方面是提供一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法，具有这样的特征，把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂南方小花蝽，观察饲喂过程中南方小花蝽的生物学变化，并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
上述的方法，还具有这样的特征，把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂3龄南方小花蝽10-15天，待南方小花蝽生长至成虫后喂食豆蚜，观察饲喂过程中南方小花蝽的生物学变化，并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
上述的方法，还具有这样的特征，把外源dsRNA(以表达中黑盲蝽(Adelphocorissuturalis)fatty acyl-CoA reductase(FAR)基因dsRNA(dsAsFAR)的转基因棉花为载体)均匀混入饲料中后直接饲喂3龄南方小花蝽10-15天，待南方小花蝽生长至成虫后喂食豆蚜，此为处理组；同时分别以正常饲料、混有dsGFP的饲料、混有南方小花蝽自身dsRNA(dsAsFAR)的饲料作为阳性组；通过比较南方小花蝽的生物学变化并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
上述的方法，还具有这样的特征，饲料为由蝇蛆粉、蛋黄、蜂蜜组成，且蝇蛆粉、蛋黄、蜂蜜的质量含量比为(23％-29％)：(33％-41％)：(16.5％-20.5％)。
如上所述，饲喂南方小花蝽的饲喂体系为：给3龄南方小花蝽饲喂混有dsRNA的饲料10-15天，饲喂过程中每12h更换一次饲料，保证南方小花蝽不会因饲料失水而难以取食；然后再将覆满豌豆蚜的蚕豆苗剪成段并进行饲喂，足量供应。
上述的方法，还具有这样的特征，生物学变化为生长发育情况、产卵情况、卵孵化情况。
本发明的第二个方面是提供一种上述方法在评价外源dsRNA对南方小花蝽影响中的应用。
上述方案的有益效果是：
本发明提供的评价方法建立在RNAi类转基因棉花对非靶标生物影响的安全评价基础之上，可以根据需求使用dsRNA的量使南方小花蝽暴露在适合浓度的dsRNA，且方法简单，适用性强，可以为转基因棉花安全评价提供可靠的依据。
附图说明
图1为本发明ddH2O中dsRNA及饲料中dsRNA的凝胶电泳图；
图2为本发明中南方小花蝽对饲料的趋避性柱状图；
图3为本发明中取食不同处理饲料的南方小花蝽的生存率图；
图4为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的4龄龄期柱状图；
图5为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的5龄龄期柱状图；
图6为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的雌虫数柱状图；
图7为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的雄虫虫数柱状图；
图8为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的产卵量柱状图；
图9为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的卵孵化率柱状图；
图10为本发明中取食不同处理饲料后的南方小花蝽的FAR基因相对表达量柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法，包括如下步骤：
本发明的实施例中以表达中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis)fatty acyl-CoAreductase(FAR)基因dsRNA(dsAsFAR)的转基因棉花为研究对象，以南方小花蝽为非靶标评价生物，评估转dsAsFAR棉花对南方小花蝽的安全性(转dsAsFAR棉花中dsAsFAR的最高表达量为0.7μg/g。按照转基因作物安全性评价原则，使小花蝽暴露在10倍自然表达量下，因此，人工饲料中混入的dsRNA浓度为7μg/g)，具体方法如下：取食行为实验设置4个处理组，每个处理组以饲料直接饲喂南方小花蝽，4个处理组的饲料中分别混入dsGFP、dsAsFAR和dsOsFAR溶液和等量的ddH2O。
电泳实验表明：dsRNA在南方小花蝽人工饲料中虽然会有一定程度的降解，但基本可以稳定存在3d，为本评价方法提供理论基础(图1所示)；
饲喂实验表明：相同时间内南方小花蝽取食含有高浓度dsRNA饲料的次数和取食加入ddH2O饲料的次数之间无显著性差异，即南方小花蝽对含高浓度dsRNA食物无趋避行为(图2所示)；以上述处理饲喂南方小花蝽3龄若虫，结果表明各组生存率无显著性差异(图3所示)；各组4龄若虫龄期均在3.5d-4d之间，相互间无显著性差异(图4所示)；5龄若虫龄期dsOsFAR处理组与其它处理组间有显著性差异，相比其他组延长1d左右(图5所示)；羽化后的雌、雄虫数各处理间也无显著性差异，且各组雌雄虫比例接近1:1(图6、7所示)；dsOsFAR处理组试虫产卵量略低于其他各组，但无显著性差异(图8所示)；各组孵化率均在80％左右，无显著差异(图9所示)；各处理组OsFAR表达量经荧光定量PCR分析显示，dsOsFAR处理组与其它各组相比OsFAR表达量显著下降(图10所示)；
上述结果表明南方小花蝽可通过取食获得外源dsRNA，生命参数结果证明外源dsAsFAR对南方小花蝽无显著影响。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种评价外源dsRNA对南方小花蝽影响的方法，其特征在于，把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂南方小花蝽，观察饲喂过程中南方小花蝽的生物学变化，并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂3龄南方小花蝽10-15天，待南方小花蝽生长至成虫后喂食豆蚜，观察饲喂过程中南方小花蝽的生物学变化，并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，把外源dsRNA均匀混入饲料中后直接饲喂3龄南方小花蝽10-15天，待南方小花蝽生长至成虫后喂食豆蚜，此为处理组；同时分别以正常饲料、混有dsGFP的饲料、混有南方小花蝽自身dsRNA的饲料作为阳性组；通过比较南方小花蝽的生物学变化并辨别成虫雌雄，用以评价外源dsRNA对南方小花蝽影响。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述饲料为由蝇蛆粉、蛋黄、蜂蜜组成，且蝇蛆粉、蛋黄、蜂蜜的质量含量比为(23％-29％)：(33％-41％)：(16.5％-20.5％)。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述生物学变化为生长发育情况、产卵情况、卵孵化情况。
6.权利要求1-5任一项所述方法在评价外源dsRNA对南方小花蝽影响中的应用。
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