CN111662369B - 一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用 - Google Patents

一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用，属于昆虫基因工程技术领域。本发明所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还设计了所述基因的RNA干扰序列，所述干扰序列dsRNA对中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因具有良好的沉默效果。注射该干扰序列，显著降低了中黑盲蝽卵巢的挂卵量，抑制了中黑盲蝽的产卵量，最终导致了中黑盲蝽的生殖能力下降，可以有效的控制其种群的发展，可用于转基因抗虫植物的开发以及中黑盲蝽的生物防治。

Description

一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用
技术领域
本发明属于昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种中黑盲蝽insulin receptorsubstrate 1基因及其应用。
背景技术
中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis)原是棉花的一种次生害虫，但随着转基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)棉花的广泛应用，广谱杀虫剂的减少，使其成为我国棉花种植区的一个重大问题。中黑盲蝽和绿盲蝽是我国棉田两种主要的棉花害虫，中黑盲蝽不仅会危害棉花，对谷物、蔬菜、水果等也有重大危害，而且中黑盲蝽具有多食性和高度流动性的特点，对其防治方面增加了困难，并呈进一步蔓延和大面积灾变的发展趋势。当前我国棉区广泛使用防治中黑盲蝽的杀虫剂包括机磷类、菊酯类、烟碱类等。频繁、过度长期使用化学杀虫剂会降低害虫对药剂的敏感性，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施成为了当前的防治热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因，所述基因可对中黑盲蝽生殖过程产生作用，当抑制其表达会显著减弱中黑盲蝽的生殖能力，终身产卵量显著减少，最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述基因的编码蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一组扩增所述基因的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物IRS-F和下游引物IRS-R；所述上游引物IRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游引物IRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种制备所述基因的干扰序列dsRNA的方法，以中黑盲蝽全基因组cDNA为模板，以干扰引物组为引物进行PCR；所述干扰引物组包括上游引物dsIRS-F和下游引物dsIRS-R；所述上游引物dsIRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物dsIRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了所述基因在防治盲蝽科昆虫中的应用。
本发明还提供了所述基因在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在防治盲蝽科昆虫中的应用。
本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
本发明提供了一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因，按照如图1所示流程设计了所述基因的RNA干扰序列dsRNA，而后利用显微注射法将dsRNA注射到中黑盲蝽体内，以绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组，发现中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因表达量在整个生育期极显著降低，同时发现干扰该基因后，中黑盲蝽卵巢内卵的数量和终生产卵量显著减少。本发明首次发现insulin receptor substrate 1基因在中黑盲蝽生殖过程中的作用，抑制其表达会显著减弱中黑盲蝽的生殖能力，终身产卵量显著减少，最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了基础；同时所述insulin receptor substrate 1基因还可作为抗中黑盲蝽转基因植物培育的备选基因。
附图说明
图1为insulin receptor substrate 1基因功能验证流程图；
图2为pEASY-T1克隆载体结构示意图；
图3为注射insulin receptor substrate 1基因干扰序列的dsRNA后，insulinreceptor substrate 1基因的沉默效率；其中“**”表示p<0.01，“dsIRS”表示注射insulinreceptor substrate 1基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组；
图4为注射insulin receptor substrate 1基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响，其中A表示注射insulin receptor substrate 1基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢内卵数量的影响；B表示注射insulin receptor substrate 1基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽终生产卵量的影响；其中“**”表示差异极显著性：“**”P<0.01，“dsIRS”表示注射insulin receptor substrate 1基因干扰序列dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组。
具体实施方式
本发明提供了一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因的开放阅读框架全长3786bp，编码1261个氨基酸残基，预测分子质量为139.0kDa，理论等电点为6.91。本发明所述基因的编码蛋白质序列优选如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述基因的制备方法，优选包括：提取中黑盲蝽基因组RNA，以所述RNA为模板反转录为cDNA，而后以所述cDNA为模板，设计特异性引物进行PCR，从而克隆得到所述基因。
本发明还提供了一组扩增所述基因的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物IRS-F和下游引物IRS-R；所述上游引物IRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5'-TTTCTAAGAGTGCGGTGCGG-3'；所述下游引物IRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5'-GGAGGTGTTTTCGGAGAGGG-3'。
本发明利用所述特异性引物扩增所述基因，所述扩增优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。本发明将所述扩增得到的产物优选与pEASY-T1载体进行连接(图2)，重组载体转化入北京全式金感受态细胞T1，氨苄抗性LB培养基过夜培养。培养过夜后，挑取阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将菌落PCR扩增为阳性的克隆测序，测序正确即为本发明所述基因。
本发明还提供了一种制备所述基因的干扰序列dsRNA的方法，以中黑盲蝽全基因组cDNA为模板，以干扰引物组为引物进行PCR；所述干扰引物组包括上游引物dsIRS-F和下游引物dsIRS-R；所述上游引物dsIRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物dsIRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明所述干扰引物组优选利用siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)预测所述基因的dsRNA区域，并利用在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计特异性扩增引物(5'-端加上T7启动子序列)，用于insulin receptorsubstrate 1基因的dsRNA片段的扩增。本发明设计得到的所述上游引物dsIRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：GGGCCGAAAGAACTCAACAG；设计得到的所述下游引物dsIRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：GGGGCCATTTGAGCATAGTC。
本发明在制备所述干扰序列dsRNA时，优选首先制备dsRNA模板，然后将所述dsRNA模板纯化后，最后再合成所述干扰序列dsRNA。本发明制备所述dsRNA模板时，优选以中黑盲蝽cDNA为模板，利用所述引物dsIRS-F和dsIRS-R进行第一PCR扩增。本发明所述第一PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。本发明将所述第一PCR扩增的产物优选连接到pEASY-T1载体上，挑取菌落PCR检测为阳性的单菌落测序，对测序正确的单菌落，6mL LB+AMP培养基过夜摇菌培养；然后再提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，使用所述引物dsIRS-F和dsIRS-R进行第二PCR扩增，所述第二PCR扩增的反应程序与第一PCR扩增优选相同，在此不再赘述。
本发明对所述dsRNA模板纯化的方法并没有特殊限定，优选包括酚氯仿抽提法。
本发明利用纯化后的dsRNA模板合成所述干扰序列dsRNA，所述合成的体系优选为50μL体系，包括：
Figure BDA0002578372450000041
Figure BDA0002578372450000051
本发明所述合成的程序优选为37℃，4h。
本发明在得到所述合成的产物后，优选还包括DNAse I消化和酚氯仿抽提。本发明对所述DNAse I消化和酚氯仿抽提的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了所述基因在防治盲蝽科昆虫中的应用。
本发明在抑制所述基因的表达后，可显著减少中黑盲蝽雌虫卵巢内卵的数量，并且抑制中黑盲蝽卵巢内卵的数量与雌虫生殖力，对中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展产生了不利影响，可用于盲蝽科昆虫的防治。
本发明还提供了所述基因在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在防治盲蝽科昆虫中的应用。
本发明所述干扰序列dsRNA可降低insulin receptor substrate 1的全生育期表大量，显著抑制所述基因的表达。
本发明还提供了所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因的克隆与分析
1.TRIzol法提取RNA
1)组织裂解：取30mg中黑盲蝽样品置于1.5mL无酶管中，液氮预冷，使用研磨棒研磨雌虫，直至研磨成粉状，向管内加入1000μL RNAiso plus裂解液，室温静置5min。
2)12000×g 4℃离心5min。
3)将上清液移至取新的1.5mL RNA无酶管内，加入200μL氯仿。剧烈振荡混匀。
4)室温静置5min。
5)12000×g 4℃离心15min。
6)将上清液移至取新的1.5mL RNA无酶管内，加入与上清液等体积异丙醇。上下颠倒混匀。
7)室温静置10min。
8)12000×g 4℃离心10min。
9)弃上清，留沉淀。
10)750μL无水乙醇与250μL无RNA酶的H2O现配75％酒精。加入管内。上下颠倒。
11)7900×g 4℃离心5min。
12)弃上清，留沉淀。
13)打开离心管盖，超净工作台内室温干燥4min。
14)加入适量无RNA酶的H2O水溶解，待其充分溶解后于-80℃保存。
2.cDNA克隆
使用日本Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(perfect real time)试剂盒将上述步骤(1)中提取的总RNA合成cDNA模板(具体步骤按照试剂盒说明书)。
3.引物设计
根据转录组测序得到insulin receptor substrate 1基因核酸序列(见SEQ IDNO：1)，利用在线软件设计引物(http://primer3.ut.ee/)验证预测的开放阅读框。设计后合成的引物如下：
上游引物序列IRS-F(SEQ ID NO.3)：TTTCTAAGAGTGCGGTGCGG，
下游引物序列IRS-R(SEQ ID NO.4)：GGAGGTGTTTTCGGAGAGGG。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
4.PCR扩增
以中黑盲蝽cDNA为模板，利用上述引物IRS-F和IRS-R，进行PCR扩增，PCR体系根据日本Takara公司的ExTaq酶说明书配制。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。1％琼脂糖电泳检测PCR产物，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察电泳结果，检测正确的片段切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。
5.PCR产物的克隆
回收的PCR产物根据北京全式金pEASY-T1载体说明书，将其与pEASY-T1载体进行连接(见图2)，重组载体转化入北京全式金感受态细胞T1，氨苄抗性LB培养基过夜培养。培养过夜后，挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将菌落PCR扩增为阳性的克隆取新鲜菌液送武汉擎科生物公司测序。
6.序列分析
将测序公司返回的insulin receptor substrate 1基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，验证其正确性，比对结果显示测序核苷酸序列与转录组核苷酸序列一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(SEQ ID NO.2)，insulinreceptor substrate 1基因开放阅读框架全长3786bp，编码1261个氨基酸残基，预测分子质量为139.0kDa，理论等电点为6.91，分离的蛋白具有典型的insulin receptorsubstrate 1蛋白特征。
实施例2
合成dsRNA
1.制备dsRNA模板
1)根据实施例1中得到的insulin receptor substrate 1基因序列，通过siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)预测dsRNA区域，并利用在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计特异性扩增引物(5'-端加上T7启动子序列)，用于insulinreceptor substrate 1基因的dsRNA片段的扩增，设计的特异性引物如下：
上游引物序列dsIRS-F(SEQ ID NO.5)：GGGCCGAAAGAACTCAACAG，
下游引物序列dsIRS-R(SEQ ID NO.6)：GGGGCCATTTGAGCATAGTC。
2)以中黑盲蝽cDNA为模板，利用上述引物dsIRS-F和dsIRS-R进行PCR扩增，PCR反应体系根据日本Takara公司的ExTaq酶使用说明书配制。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。1％琼脂糖电泳检测PCR产物，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察电泳结果，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段,将PCR产物连接到pEASY-T1载体(见图2)上。挑取菌落PCR检测为阳性的单菌落，送北京擎科生物公司测序，检测基因序列的正确性，对测序正确的单菌落，6mL LB+AMP培养基过夜摇菌培养。
用AxyPrep质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，使用上述特异性引物dsIRS-F和dsIRS-R进行第二次PCR扩增，PCR体系和反应程序同上述(1)。
2.dsRNA模板的纯化
将第二次PCR的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作方法如下：
1)将PCR产物移至新的1.5mL RNA无酶管中，用无RNA酶的H2O定容至300μL(可根据实际需要等比例扩大体系)，加入1/10体积(30μL)的3M乙酸钠(pH5.2)。
2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分震荡后，室温，12000r/min，离心10min。
3)移液枪吸取上层相(约300μL)，放于新的1.5mL RNA无酶管中，再加入2倍体积(约600μL)的无水乙醇(提前放入-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。
4)4℃，12000r/min，离心15min，弃上清液。
5)加入无RNA酶的H2O配制，-20℃预冷后的75％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀。
6)4℃，7500r/min，离心5min。
7)移液枪吸尽上清液，超净工作台内风干沉淀，加入20μL无RNA酶的H2O溶解沉淀。
8)取1μL产物原液10倍稀释。
9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释10倍后的产物，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。
3.合成dsRNA
1)dsRNA合成反应体系
按以下比例配置dsRNA合成反应体系
Figure BDA0002578372450000091
移液枪吸打混匀，瞬时离心。37℃，4小时。
2)DNAse I消化DNA模板
DNAse I消化DNA模板，按照比例加入如下所示试剂
Figure BDA0002578372450000092
充分混匀，瞬时离心，37℃，60min。
4.酚氯仿抽提dsRNA
1)将反应产物转移至新的无RNA酶1.5mL离心管中，无RNA酶的H2O定容至300μL。加入1/10体积(30μL)的3M乙酸钠(pH5.2)。
2)加入150μL的水饱和酚与150μL氯仿，充分震荡，4℃，12000r/min，离心15min。
3)移液枪吸取上层相(约300μL)，放入新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入2.5倍体积(约750μL)无水乙醇(提前放入-20℃预冷)温和混匀后放于-20℃静置过夜。
4)4℃，12000r/min，离心30min，弃上清液。
5)加入无RNA酶的H2O配制的75％乙醇(提前放入-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。
6)4℃，7500r/min，离心5min。
7)弃上清液，风干沉淀，加入20μL无RNA酶的H2O溶解沉淀。
8)取0.5μL产物原液20倍稀释。
9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释产物质量，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值。
10)将dsRNA浓度稀释为10μg/μL备用。
实施例3
注射insulin receptor substrate 1基因dsRNA后基因的沉默效率及其对雌虫卵巢内卵的数量和生殖力变化情况
以绿色荧光蛋白基因(GFP)双链dsRNA作为对照，将insulin receptor substrate1基因dsRNA通过显微注射法从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射进入新羽化雌虫体内。
沉默效率检测：分别收集注射处理后4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天和18天的中黑盲蝽全虫，提取RNA并反转录为cDNA后，使用日本Takara公司的
Figure BDA0002578372450000101
PremixExTaqTMII和Bio-Rad Detection iQ2 System检测insulin receptor substrate 1基因的沉默效应。
结果如图3所示，与对照组相比，注射insulin receptor substrate 1基因的dsRNA后，insulin receptor substrate 1基因表达量在整个生育期显著下降，说明该中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因的干扰序列可显著抑制insulin receptorsubstrate 1基因的表达
卵巢内卵数量统计：注射dsRNA 11天后，利用体式显微镜(型号SMZ—t4，重庆奥特光学仪器有限责任公司)解剖雌虫卵巢，每个处理解剖20头未交配雌虫，3个生物学重复，观察卵巢形态，统计并分析中黑盲蝽卵巢内卵的数量。
结果如图4所示，注射处理11天后，解剖雌虫卵巢，统计卵巢内卵的数量并观察卵巢形态，与对照组相比，注射insulin receptor substrate 1基因dsRNA处理组的中黑盲蝽卵巢内卵的数量减少了65.14％(图4中A)。说明注射insulin receptor substrate 1基因的dsRNA可显著减少了中黑盲蝽雌虫卵巢内卵的数量。
生殖力：雌虫注射dsRNA后，与新羽化的雄虫一一配对，放入一次性塑料杯内(5cm×7cm)交配，若发现雄虫死亡，马上补充新的性成熟的雄虫，以40对虫子为一个处理组，3个生物学重复，统计终生产卵量，以此评价注射insulin receptor substrate 1基因dsRNA对中黑盲蝽产卵量的影响。
结果如图4所示，新羽化雌虫注射dsRNA处理后与雄虫交配，统计终生产卵量，与对照组相比，处理组的中黑盲蝽产卵量下降了70.56％(图4中B)。可见将insulin receptorsubstrate 1基因干扰后，显著抑制了中黑盲蝽卵巢内卵的数量与雌虫生殖力，对中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展产生了不利影响。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种中黑盲蝽insulin receptor substrate 1基因及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3786
<212> DNA
<213> Adelphocoris suturalis
<400> 1
atgtttagga tgtcatcaag ccgtgagctg gttcccagag tggacaccgg tgaaattatc 60
aagcaaggct acctaaaaaa gctcaagacg atgcgcaaaa agtactttgt tcttcggggg 120
gattcagctg aggcatccgc ccgtttggag tactatgagt cggaaaagaa atggaaaacg 180
acaacttgca acccaaaaag aactattact ctgaagaact gttttaacat caacaaaaaa 240
ctggacactc gacataaatg ggtaattgct ctttacactc gcaacgacaa gttttgcatc 300
gtttttgata atgaagaaga aatggaagac tggctccaag cactcttagc acttcaacaa 360
ggcgaaaaaa ttgaagaagg cggagttgta cgtcctaatt tcgagcacgt ctgggaggtt 420
tatcttcatt ctaagcagct gggctccaaa acgaacatga cagggccttg tcgtctgtgt 480
ctcactgacc aagcggtcac tcttgtgagg caggaacaag acgagtcagc tcctgaaacg 540
tccctcgaat attcgcttca gaaaattcga tgttgcgggc acgtagatac atttttctac 600
atggaggttg gtcagtggac agctactggg gctgggaatc tttggcttca agccgaggac 660
aacaacattg ccgaaaacat ccacctcacg atcctgaaat acctccatgg taacggaatt 720
cagccattgt ggcccatctc ccagccatgg ctcaaccatg ccagacgtcc agagcgatct 780
tggagcttca tgtttctttg gaagagagcc tgtgggaaaa accccaatag agaaatccag 840
cagccaaggc cacgtgcagt atctgtgact gatgctgacc ggcggcctct catgacaagg 900
tggtcaactc acacagcatc tagcgggagt ggtggtggag ggacgaacca tcagcgaact 960
tattcattcc cactttctcc cctaccaccc gctcgaagag ctagtacggg tacaagacct 1020
ctgtccaaac tcatcatctc aacctcacct cagtccagtt tgaccacgcg tgatcgatca 1080
gacacgatgc ccactcaggc ggtctctcga cccaggacct ccagcgagtg tgcaactcac 1140
ctcgcttatc ccccacgcca cccgaacaac ctccatggtc gcccgttatc atcttataat 1200
cgtggaataa gctactcacc tccagctgcc ccaagtccag tcagcccagg gagtgctaca 1260
tgttcggact cagctggctc ctcactctca atggatgggg atgttccgga tagtcactgg 1320
gaggaccggt atagccactc cctcactcct gatgaacctg ttattgttga agagaacacg 1380
gacgattacg ctccttggat aggggaagac gagcggctga ataactatgt acgtaattca 1440
gacaccccca tgtacgcacc gattctgaac accgttagtt ctcacaatag cactaataat 1500
ctccaaacct ctaacaatga ttacaagtgc aactatgctc ctagtcaggt ctcgcgtttg 1560
gagagctcta acagtggaaa ggacacgagt tacatgataa tgactccagg gtcaaacgtc 1620
cccaaaaccc aagccaaaag cagcatcaat cacagtcggg ggagtagtct gactgaagaa 1680
ggttacgttc ctatggcccc cggcaattca gatgatggtt acgtggatat ggaccatgga 1740
tctactcggc atagagatca ctaccaaagt ggagatcttt ctgctggttc tagctgctct 1800
atgacttctg ggacaccatc cactgatcag aggttcagtg attatcctct cgacaaagtt 1860
atatcgtatt ttcccgatga agaattggct gctgaacgtc accctcgatc ttattccgtt 1920
ggatcccggc caaaccttaa caagaataga actgaagttc cagtaactac ctttagtgaa 1980
cgagcaaggg cttcttcctt gggctccaag aacgggaagg gctttcattc attaagaatg 2040
cacaatcacc atcatgttgc ttccagccat tcctccatgg agccttctga cgacatgatg 2100
gaaatggact tcagtaaaaa agggaggatg aagaacagaa agaaaccatc cagctctgag 2160
cgtctcagtg taccctgtgg cagtgcttct accctgtctt ctgccgctag ctcctactcc 2220
actgctgagg gtagttatat ggagatgtca cctaggtgct ctccttctct gccttctcca 2280
cctaaaacca acagattact gtcaatcttg ggaaaatccc cgccaaagca cgacctattt 2340
cctttcacca aaaactctcc tccagtttca ggttatccat ccccatcatt gggtagagtt 2400
cctgaaattg aaccatttta taatgaatct tctcaccagc agtcaccgaa tgactcttac 2460
atggagatga agcctaaaca tttggaatca aaccaaaaga ttgttgctgc taagaatact 2520
aaggctcgaa ttgagtcatt cccaacaagt ggtagcttca gtcaaacaac ggctcgatcg 2580
aagtgtagca gagatgatca ttttgagtct tcattaaaga gaaaaatgtc acacaattgc 2640
acaataccag aagataataa taacagtaag ataattattg ggaactcacc tccctctagt 2700
caacttgacg aatatgttga gatggatcta ggagtttcta agagtgcggt gcggtctaag 2760
aataaaaata ttgaagaaga agactacatg gaaatggatg ggagaggaga caaggtggag 2820
tttggtcgtt cacaacccat tgcaatacag tcaaatgtga aagaaaccaa ctcattgtac 2880
tcattgggcc gaaagaactc aacaggcaca cctccaaaac ggtcttttct cttatttgga 2940
tcttctcctt caccggtttc aagtccttat ggaacccttg ggagatcgcg tcctaggaaa 3000
aatactctga gacgggatag caaggagaat ttagggactg cctcttctgg ctcgtcatca 3060
tcgttatttc ctatgagcct aaacagttca ataaattccc ctgacgactt tgaagccaag 3120
tgcccagtag atgctaccag tggcactgtg gtgctgtcta ccgaaaacag ccgctcagtt 3180
gatgacctat ctagtaaggt tgggtgctgt atcattgaag atggtcctga agattacgtc 3240
ccctatgagc ctggcgcgaa tcttagaacc tctaattctt cagaggctga ctatgctcaa 3300
atggcccccg tcaagccacc caccatcagg aagacatcag tacctctcct caacaagttt 3360
gacaggtttc taatgggttt gggggtgggg cagttgacaa gcagtacatc ttcaccgtcc 3420
atcaaactgg cgtgttcaga gccagcagtc gatcttgggg aatccccttc acttcctgaa 3480
gaagaagaag aagaggacga tactcctgct gtcacatcca cgaccagcaa gtctcaaggc 3540
gatgttccct ctccgaaaac acctccagtt atgaaggaca aggagcttca ttacgcttcc 3600
ctcgatctcg ctcgctcagg ttcggaaagt gaagagtcca acaagaccct gaaaactcaa 3660
agctcactta cagaatcttc ttctgcaagc tctccttctc ccaacccggc tgacgctgcc 3720
acctcctctt tcacgtacgc tgaaatagat tttgccaaaa ctggttcctc ctcacaaaat 3780
ccgtaa 3786
<210> 2
<211> 1261
<212> PRT
<213> Adelphocoris suturalis
<400> 2
Met Phe Arg Met Ser Ser Ser Arg Glu Leu Val Pro Arg Val Asp Thr
1 5 10 15
Gly Glu Ile Ile Lys Gln Gly Tyr Leu Lys Lys Leu Lys Thr Met Arg
20 25 30
Lys Lys Tyr Phe Val Leu Arg Gly Asp Ser Ala Glu Ala Ser Ala Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Tyr Glu Ser Glu Lys Lys Trp Lys Thr Thr Thr Cys Asn
50 55 60
Pro Lys Arg Thr Ile Thr Leu Lys Asn Cys Phe Asn Ile Asn Lys Lys
65 70 75 80
Leu Asp Thr Arg His Lys Trp Val Ile Ala Leu Tyr Thr Arg Asn Asp
85 90 95
Lys Phe Cys Ile Val Phe Asp Asn Glu Glu Glu Met Glu Asp Trp Leu
100 105 110
Gln Ala Leu Leu Ala Leu Gln Gln Gly Glu Lys Ile Glu Glu Gly Gly
115 120 125
Val Val Arg Pro Asn Phe Glu His Val Trp Glu Val Tyr Leu His Ser
130 135 140
Lys Gln Leu Gly Ser Lys Thr Asn Met Thr Gly Pro Cys Arg Leu Cys
145 150 155 160
Leu Thr Asp Gln Ala Val Thr Leu Val Arg Gln Glu Gln Asp Glu Ser
165 170 175
Ala Pro Glu Thr Ser Leu Glu Tyr Ser Leu Gln Lys Ile Arg Cys Cys
180 185 190
Gly His Val Asp Thr Phe Phe Tyr Met Glu Val Gly Gln Trp Thr Ala
195 200 205
Thr Gly Ala Gly Asn Leu Trp Leu Gln Ala Glu Asp Asn Asn Ile Ala
210 215 220
Glu Asn Ile His Leu Thr Ile Leu Lys Tyr Leu His Gly Asn Gly Ile
225 230 235 240
Gln Pro Leu Trp Pro Ile Ser Gln Pro Trp Leu Asn His Ala Arg Arg
245 250 255
Pro Glu Arg Ser Trp Ser Phe Met Phe Leu Trp Lys Arg Ala Cys Gly
260 265 270
Lys Asn Pro Asn Arg Glu Ile Gln Gln Pro Arg Pro Arg Ala Val Ser
275 280 285
Val Thr Asp Ala Asp Arg Arg Pro Leu Met Thr Arg Trp Ser Thr His
290 295 300
Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Asn His Gln Arg Thr
305 310 315 320
Tyr Ser Phe Pro Leu Ser Pro Leu Pro Pro Ala Arg Arg Ala Ser Thr
325 330 335
Gly Thr Arg Pro Leu Ser Lys Leu Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln Ser
340 345 350
Ser Leu Thr Thr Arg Asp Arg Ser Asp Thr Met Pro Thr Gln Ala Val
355 360 365
Ser Arg Pro Arg Thr Ser Ser Glu Cys Ala Thr His Leu Ala Tyr Pro
370 375 380
Pro Arg His Pro Asn Asn Leu His Gly Arg Pro Leu Ser Ser Tyr Asn
385 390 395 400
Arg Gly Ile Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ser Pro Val Ser Pro
405 410 415
Gly Ser Ala Thr Cys Ser Asp Ser Ala Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp
420 425 430
Gly Asp Val Pro Asp Ser His Trp Glu Asp Arg Tyr Ser His Ser Leu
435 440 445
Thr Pro Asp Glu Pro Val Ile Val Glu Glu Asn Thr Asp Asp Tyr Ala
450 455 460
Pro Trp Ile Gly Glu Asp Glu Arg Leu Asn Asn Tyr Val Arg Asn Ser
465 470 475 480
Asp Thr Pro Met Tyr Ala Pro Ile Leu Asn Thr Val Ser Ser His Asn
485 490 495
Ser Thr Asn Asn Leu Gln Thr Ser Asn Asn Asp Tyr Lys Cys Asn Tyr
500 505 510
Ala Pro Ser Gln Val Ser Arg Leu Glu Ser Ser Asn Ser Gly Lys Asp
515 520 525
Thr Ser Tyr Met Ile Met Thr Pro Gly Ser Asn Val Pro Lys Thr Gln
530 535 540
Ala Lys Ser Ser Ile Asn His Ser Arg Gly Ser Ser Leu Thr Glu Glu
545 550 555 560
Gly Tyr Val Pro Met Ala Pro Gly Asn Ser Asp Asp Gly Tyr Val Asp
565 570 575
Met Asp His Gly Ser Thr Arg His Arg Asp His Tyr Gln Ser Gly Asp
580 585 590
Leu Ser Ala Gly Ser Ser Cys Ser Met Thr Ser Gly Thr Pro Ser Thr
595 600 605
Asp Gln Arg Phe Ser Asp Tyr Pro Leu Asp Lys Val Ile Ser Tyr Phe
610 615 620
Pro Asp Glu Glu Leu Ala Ala Glu Arg His Pro Arg Ser Tyr Ser Val
625 630 635 640
Gly Ser Arg Pro Asn Leu Asn Lys Asn Arg Thr Glu Val Pro Val Thr
645 650 655
Thr Phe Ser Glu Arg Ala Arg Ala Ser Ser Leu Gly Ser Lys Asn Gly
660 665 670
Lys Gly Phe His Ser Leu Arg Met His Asn His His His Val Ala Ser
675 680 685
Ser His Ser Ser Met Glu Pro Ser Asp Asp Met Met Glu Met Asp Phe
690 695 700
Ser Lys Lys Gly Arg Met Lys Asn Arg Lys Lys Pro Ser Ser Ser Glu
705 710 715 720
Arg Leu Ser Val Pro Cys Gly Ser Ala Ser Thr Leu Ser Ser Ala Ala
725 730 735
Ser Ser Tyr Ser Thr Ala Glu Gly Ser Tyr Met Glu Met Ser Pro Arg
740 745 750
Cys Ser Pro Ser Leu Pro Ser Pro Pro Lys Thr Asn Arg Leu Leu Ser
755 760 765
Ile Leu Gly Lys Ser Pro Pro Lys His Asp Leu Phe Pro Phe Thr Lys
770 775 780
Asn Ser Pro Pro Val Ser Gly Tyr Pro Ser Pro Ser Leu Gly Arg Val
785 790 795 800
Pro Glu Ile Glu Pro Phe Tyr Asn Glu Ser Ser His Gln Gln Ser Pro
805 810 815
Asn Asp Ser Tyr Met Glu Met Lys Pro Lys His Leu Glu Ser Asn Gln
820 825 830
Lys Ile Val Ala Ala Lys Asn Thr Lys Ala Arg Ile Glu Ser Phe Pro
835 840 845
Thr Ser Gly Ser Phe Ser Gln Thr Thr Ala Arg Ser Lys Cys Ser Arg
850 855 860
Asp Asp His Phe Glu Ser Ser Leu Lys Arg Lys Met Ser His Asn Cys
865 870 875 880
Thr Ile Pro Glu Asp Asn Asn Asn Ser Lys Ile Ile Ile Gly Asn Ser
885 890 895
Pro Pro Ser Ser Gln Leu Asp Glu Tyr Val Glu Met Asp Leu Gly Val
900 905 910
Ser Lys Ser Ala Val Arg Ser Lys Asn Lys Asn Ile Glu Glu Glu Asp
915 920 925
Tyr Met Glu Met Asp Gly Arg Gly Asp Lys Val Glu Phe Gly Arg Ser
930 935 940
Gln Pro Ile Ala Ile Gln Ser Asn Val Lys Glu Thr Asn Ser Leu Tyr
945 950 955 960
Ser Leu Gly Arg Lys Asn Ser Thr Gly Thr Pro Pro Lys Arg Ser Phe
965 970 975
Leu Leu Phe Gly Ser Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Pro Tyr Gly Thr
980 985 990
Leu Gly Arg Ser Arg Pro Arg Lys Asn Thr Leu Arg Arg Asp Ser Lys
995 1000 1005
Glu Asn Leu Gly Thr Ala Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Leu Phe Pro
1010 1015 1020
Met Ser Leu Asn Ser Ser Ile Asn Ser Pro Asp Asp Phe Glu Ala Lys
1025 1030 1035 1040
Cys Pro Val Asp Ala Thr Ser Gly Thr Val Val Leu Ser Thr Glu Asn
1045 1050 1055
Ser Arg Ser Val Asp Asp Leu Ser Ser Lys Val Gly Cys Cys Ile Ile
1060 1065 1070
Glu Asp Gly Pro Glu Asp Tyr Val Pro Tyr Glu Pro Gly Ala Asn Leu
1075 1080 1085
Arg Thr Ser Asn Ser Ser Glu Ala Asp Tyr Ala Gln Met Ala Pro Val
1090 1095 1100
Lys Pro Pro Thr Ile Arg Lys Thr Ser Val Pro Leu Leu Asn Lys Phe
1105 1110 1115 1120
Asp Arg Phe Leu Met Gly Leu Gly Val Gly Gln Leu Thr Ser Ser Thr
1125 1130 1135
Ser Ser Pro Ser Ile Lys Leu Ala Cys Ser Glu Pro Ala Val Asp Leu
1140 1145 1150
Gly Glu Ser Pro Ser Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Thr
1155 1160 1165
Pro Ala Val Thr Ser Thr Thr Ser Lys Ser Gln Gly Asp Val Pro Ser
1170 1175 1180
Pro Lys Thr Pro Pro Val Met Lys Asp Lys Glu Leu His Tyr Ala Ser
1185 1190 1195 1200
Leu Asp Leu Ala Arg Ser Gly Ser Glu Ser Glu Glu Ser Asn Lys Thr
1205 1210 1215
Leu Lys Thr Gln Ser Ser Leu Thr Glu Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro
1220 1225 1230
Ser Pro Asn Pro Ala Asp Ala Ala Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Ala Glu
1235 1240 1245
Ile Asp Phe Ala Lys Thr Gly Ser Ser Ser Gln Asn Pro
1250 1255 1260
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttctaagag tgcggtgcgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaggtgttt tcggagaggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggccgaaag aactcaacag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggccattt gagcatagtc 20

Claims (6)

1.一种中黑盲蝽insulin receptorsubstrate 1基因，其特征在于，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种制备权利要求1所述基因的干扰序列dsRNA的方法，其特征在于，以中黑盲蝽全基因组cDNA为模板，以干扰引物组为引物进行PCR；所述干扰引物组包括上游引物dsIRS-F和下游引物dsIRS-R；所述上游引物dsIRS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物dsIRS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求1所述基因在防治中黑盲蝽中的应用。
4.权利要求1所述基因在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
5.利用权利要求2所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在防治中黑盲蝽中的应用。
6.利用权利要求2所述方法制备得到的干扰序列dsRNA在中黑盲蝽转基因植物育种中的应用。
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