CN110195073B - 一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰rna和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰RNA和应用，属于昆虫基因工程技术领域；所述胰蛋白酶前体基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；降低所述胰蛋白酶前体基因在盲蝽科中黑盲蝽中的表达量，能够显著减少中黑盲蝽卵巢内卵的数量和终生产卵量，并且能够缩短雌成虫寿命。本发明提供的应用能够最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了理论基础。

Description

一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰RNA和应用
技术领域
本发明属于昆虫基因工程技术领域，尤其涉及一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰RNA和应用。
背景技术
中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis)属半翅目盲蝽科，在朝鲜、日本、西伯利亚东部和沿海地区，以及高加索等地皆有分布，在国内主要集中于长江流域和黄河流域(姜玉英等，盲蝽分区监测与治理.2015，北京：北京中国农业出版社)。自1997年Bt棉花种植以来，棉田盲蝽由次要害虫转变为主要害虫，中黑盲蝽是我国长江流域棉花种植区的主要害虫之一(陆宴辉等，棉盲蝽综合治理研究进展.植物保护，2007.06,10-15；Wu K,Lu YH,Feng HQ,Jiang YY,Zhao JZ, 2008.Suppression of Cotton Bollworm in Multiple Crops inChina in Areas with Bt Toxin-containing Cotton.Science.321:1676-1678)。中黑盲蝽寄主范围广泛，已记载的寄主植物有50科270种，其寄主植物主要有禾本科植物、棉花、蔬菜、大豆、果树等(张祝华，棉盲蝽的发生规律与防治技术.农民科技培训，2013.30-32)。目前中黑盲蝽的防治措施主要是化学防治(王建玉等，南阳棉田中黑盲蝽发生情况及防治措施.农业科技通讯，2017.298-300；潘洪生等，新疆棉花害虫发生演替与综合防治研究进展.植物保护，2018.44,47-55)。中黑盲蝽活动敏捷，易转移，导致其防治较难，且不合理的化学防治会带来环境污染，杀伤天敌，产生抗药性等问题。因此，探索新型高效的中黑盲蝽防治措施势在必行。
胰蛋白酶是脊椎动物消化道中一种主要的蛋白水解酶，是以胰蛋白酶原前体的形式从胰腺腺泡细胞中产生，去掉信号肤后变成胰蛋白酶原释放到肠道中，被肠激酶激活去掉激活肤变成有活性的胰蛋白酶 (花育旗，萍乡红鲫胰蛋白酶提取纯化及酶原前体cDNA克隆、序列分析.2010)。在昆虫体内，胰蛋白酶主要是由中肠肠壁细胞分泌，属于丝氨酸蛋白酶家族(serine proteinases，SPs)(SrinivasanA,GiriAP, Gupta VS,2006.Structuraland functional diversities in lepidopteran serine proteases.Cell Mol BiolLett.11:132-154)。胰蛋白酶主要功能为两个方面：一、消化蛋白质食物；二、活化作用：激活所有胰腺分泌的酶原，迅速地激活其他蛋白酶原而行使消化功能，在食物吸收和营养物同化过程中起关键的信号媒介作用(祝妮，小菜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因的克隆、转录及其酶活的研究.2013)。胰蛋白酶在昆虫体内除消化作用与激活酶原外，在昆虫生长发育，增强免疫力等方面也发挥着重要作用(刘骉，东方粘虫中肠胰蛋白酶基因上游启动子核心序列的克隆及功能验证.2017)。
目前，对于昆虫中胰蛋白酶前体的研究主要是其活化产物胰蛋白酶活性及抑制剂的研究，对胰蛋白酶前体在昆虫生殖过程中的作用未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰RNA和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种分离自中黑盲蝽的胰蛋白酶前体基因，所述胰蛋白酶前体基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了所述的胰蛋白酶前体基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了所述的胰蛋白酶前体基因的干扰RNA，所述干扰 RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，扩增所述干扰RNA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
本发明提供了所述的胰蛋白酶前体基因、所述蛋白质或所述干扰 RNA在防治盲蝽科昆虫中的应用，降低所述胰蛋白酶前体基因在盲蝽科昆虫中的表达量。
优选的，向所述盲蝽科昆虫体内导入所述的干扰RNA。
优选的，所述盲蝽科昆虫包括中黑盲蝽。
本发明提供了所述的干扰RNA在制备抗盲蝽科昆虫的植物中的应用。
优选的，将所述干扰RNA转入植物体中进行表达。
本发明的有益效果：本发明提供了一种分离自中黑盲蝽的胰蛋白酶前体基因、所述的胰蛋白酶前体基因编码的蛋白质、所述的胰蛋白酶前体基因的干扰RNA以及所述的胰蛋白酶前体基因、所述蛋白质或所述干扰RNA在防治盲蝽科昆虫中的应用。根据实施例的记载降低所述胰蛋白酶前体基因在盲蝽科昆虫中的表达量，能够显著减少中黑盲蝽卵巢内卵的数量和终生产卵量，并且能够缩短雌成虫寿命。本发明提供的应用能够最终导致种群发展的衰退，为控制中黑盲蝽种群的发展提供新思路，也为实现绿色防治中黑盲蝽及其他半翅目昆虫提供了理论基础。
附图说明
图1为本发明中所述胰蛋白酶前体基因功能验证流程图；
图2为pEASY-T1克隆载体结构示意图；
图3为本发明提供的胰蛋白酶前体基因编码的蛋白质序列与其它昆虫的3条胰蛋白酶前体氨基酸序列比对的部分结果图；
图4为胰蛋白酶的保守序列、裂解位点、活化位点和底物结合位点展示图；
图5为注射胰蛋白酶前体基因干扰dsRNA后，胰蛋白酶前体基因的沉默效率；
图6为注射胰蛋白酶前体基因干扰dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响，其中A为注射胰蛋白酶前体基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽卵巢内卵数量的影响；B为注射胰蛋白酶前体基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽雌成虫寿命的影响；C图为注射胰蛋白酶前体基因干扰dsRNA对中黑盲蝽终生产卵量的影响；D图为注射胰蛋白酶前体基因干扰序列的dsRNA对中黑盲蝽产卵前期的影响；其中“*”表示差异显著性：“*”P<0.05，“**”P<0.01。
具体实施方式
本发明提供了一种分离自中黑盲蝽的胰蛋白酶前体基因，所述胰蛋白酶前体基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；所述所述胰蛋白酶前体基因的cDNA序列全长为873bp。本发明提供的所述胰蛋白酶前体基因在中黑盲蝽生殖过程中具有重要的作用，抑制所述胰蛋白酶前体基因的表达会显著减弱中黑盲蝽的生殖能力，缩短成虫寿命，最终导致种群发展的衰退。
本发明还提供了所述的胰蛋白酶前体基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，包括290个氨基酸残基。
本发明提供了所述的胰蛋白酶前体基因的干扰RNA，所述干扰 RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。在本发明中，所述干扰RNA 优选的以中黑盲蝽的cDNA为模板，进行PCR扩增获的；扩增所述干扰RNA的引物对的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。在本发明中，所述干扰RNA能够显著降低所述胰蛋白酶前体基因的表达量，介导所述胰蛋白酶前体基因的沉默。
本发明还提供了所述的胰蛋白酶前体基因、所述蛋白质或所述干扰RNA在防治盲蝽科昆虫中的应用，降低所述胰蛋白酶前体基因在盲蝽科昆虫中的表达量。本发明中对于降低所述胰蛋白酶前体基因在盲蝽科昆虫中的表达量的方法没有特殊限定，只要能够实现所述胰蛋白酶前体基因表达量降低即可。在本发明具体实施过程中，优选的通过向所述盲蝽科昆虫体内导入所述的干扰RNA来实现所述胰蛋白酶前体基因的表达量的降低。在本发明中，优选的通过显微注射法将所述干扰RNA注入盲蝽科昆虫体内；所述干扰RNA的注入量优选为 1.0μg/只；在本发明中，所述方法适用于所有盲蝽科昆虫，本发明以中黑盲蝽为例。
本发明还提供了所述的干扰RNA在制备抗盲蝽科昆虫的植物中的应用。在本发明中，优选的将所述干扰RNA转入植物体中进行表达。本发明对所述干扰RNA转入植物体内的方法和步骤没有特殊限定，采用本领域常规的外源基因转入植物体内的方法即可。在本发明中，所述抗盲蝽科昆虫的植物表达所述干扰RNA，当所述盲蝽科昆虫寄生于所述植物上时，所述干扰RNA进入盲蝽科昆虫体内，介导所述盲蝽科昆虫体内胰蛋白酶前体基因的沉默，从而减少盲蝽科昆虫卵巢内卵的数量和终生产卵量，缩短雌成虫寿命，达到防治盲蝽科昆虫的效果。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
中黑盲蝽胰蛋白酶前体基因的克隆与功能分析
TRIzol法提取RNA
1)组织裂解：取30mg中黑盲蝽样品置于1.5ml无酶管中，液氮预冷，使用研磨棒研磨雌虫，直至研磨成粉状，向管内加入1000μl RNAisoplus裂解液，室温静置5min。
2)12000×g 4℃离心5min。
3)将上清液移至取新的1.5ml RNA无酶管内，加入200μl氯仿。剧烈振荡混匀。
4)室温静置5min。
5)12000×g 4℃离心15min。
6)将上清液移至取新的1.5ml RNA无酶管内，加入与上清液等体积异丙醇。上下颠倒混匀。
7)室温静置10min。
8)12000×g 4℃离心10min。
9)弃上清，留沉淀。
10)750μl无水乙醇与250μl无RNA酶的H2O现配75％酒精。加入管内。上下颠倒。
11)7900×g 4℃离心5min。
12)弃上清，留沉淀。
13)打开离心管盖，超净工作台内室温干燥4min。
14)加入适量无RNA酶的H2O水溶解，待其充分溶解后于-80℃保存。
cDNA克隆
使用日本Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(perfect real time)试剂盒将上述步骤(1)中提取的总RNA合成cDNA模板 (具体步骤按照试剂盒说明书)。
引物设计
根据转录组测序得到胰蛋白酶前体基因核酸序列(见SEQ ID NO:1)，利用在线软件设计引物(http://primer3.ut.ee/)验证预测的开放阅读框。设计后合成的引物如下：
上游引物序列TryP-F：5'-aggatcatcaagatgaaagcagcggtagc-3'(SEQ ID NO：6)，
下游引物序列TryP-R：5'-tctctcacttgttttgacaggtggctg-3'(SEQ ID NO:7)。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PCR扩增
以中黑盲蝽cDNA为模板，利用上述引物TryP-F和TryP-R，进行PCR扩增，PCR体系根据日本Takara公司的Ex Taq酶说明书配制。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s， 72℃复性延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。 1％琼脂糖电泳检测PCR产物，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察电泳结果，检测正确的片段切胶并利用AxyGen公司的的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。
PCR产物的克隆
回收的PCR产物根据北京全式金生物技术有限公司pEASY-T1 载体说明书，将其与pEASY-T1载体进行连接(pEASY-T1载体结构图如图2所示)，重组载体转化入购自北京全式金生物技术有限公司的感受态细胞T1，氨苄抗性LB培养基过夜培养。培养过夜后，挑取 8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上)，将菌落PCR扩增为阳性的克隆取新鲜菌液送武汉擎科生物公司测序。
序列分析
将测序公司返回的胰蛋白酶前体基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，验证其正确性，比对结果显示测序核苷酸序列与转录组核苷酸序列一致。利用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见SEQ ID NO:2)，胰蛋白酶前体基因开放阅读框架全长873bp，编码290个氨基酸残基，预测分子质量为73.04kDa，理论等电点为5.04。
本发明进一步将其与其它昆虫的3条胰蛋白酶前体氨基酸序列 trypsinprecursor[lygus lineolaris].dna AHY81288.1、trypsin precursor LhP1[Lygushesperus]AAK71135.1和trypsin-like protease[Ranatra unicolor]GenBank:ABZ89688.1(氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8～10 所示)进行比对，蛋白比对比对率71.21％，结果如图3和4所示，图4中细下划线为胰蛋白酶保守序列，粗下划线为裂解位点，圆圈为活化位点，方框为底物结合位点；由此确认本发明分离的蛋白具有典型的胰蛋白酶前体蛋白特征。
实施例2
合成dsRNA
1.制备dsRNA模板
根据实施例1中得到的胰蛋白酶前体基因序列，通过siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)预测dsRNA区域，并利用在线软件 (http://primer3.ut.ee/)设计特异性扩增引物(5'-端加上T7启动子序列：gcgtaatacgactcactatagg(SEQ ID NO:14))，用于胰蛋白酶前体基因的dsRNA片段的扩增，设计的特异性引物如下：
上游引物序列dsTryP-F：gcgtaatacgactcactatagggcagacccgacaacaacgaag(SEQID NO:4)，
下游引物序列dsTryP-R：gcgtaatacgactcactataggccagaatctccttggcaagc(SEQID NO:5)。
以中黑盲蝽cDNA为模板，利用上述引物dsTryP-F和dsTryP-F 进行PCR扩增，PCR反应体系根据日本Takara公司的Ex Taq酶使用说明书配制。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，产物4℃保存。1％琼脂糖电泳检测PCR产物，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察电泳结果，切胶并利用AxyGen的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段，将PCR产物连接到pEASY-T1载体上。挑取菌落PCR 检测为阳性的单菌落，送北京擎科生物公司测序，检测基因序列的正确性，对测序正确的单菌落，6ml LB+AMP培养基过夜摇菌培养。
1)用AxyPrep质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，使用上述特异性引物dsTryP-F和dsTryP-F进行第二次PCR 扩增，PCR体系和反应程序同上述(1)。
2.dsRNA模板的纯化
将第二次PCR的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作方法如下：
1)将PCR产物移至新的1.5ml RNA无酶管中，用无RNA酶的H2O定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)，加入1/10 体积(30μl)的3M乙酸钠(pH5.2)。
2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分震荡后，室温，12000r/min，离心10min。
3)移液枪吸取上层相(约300μl)，放于新的1.5ml RNA无酶管中，再加入2倍体积(约600μl)的无水乙醇(提前放入-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。
4)4℃，12000r/min，离心15min，弃上清液。
5)加入无RNA酶的H2O配制，-20℃预冷后的75％乙醇，上下颠倒数次，洗涤沉淀。
6)4℃，7500r/min，离心5min。
7)移液枪吸尽上清液，超净工作台内风干沉淀，加入20μl无 RNA酶的H2O溶解沉淀。
8)取1μl产物原液10倍稀释。
9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释10倍后的产物，并用 NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值；OD值在1.8～2.0可以进行后续试验。
3.合成dsRNA
1)dsRNA合成反应体系
按以下比例配置dsRNA合成反应体系
Figure RE-GDA0002118172020000091
移液枪吸打混匀，瞬时离心。37℃，4小时。
2)DNAse I消化DNA模板
DNAse I消化DNA模板，按照比例加入如下所示试剂：
Figure RE-GDA0002118172020000092
充分混匀，瞬时离心，37℃，60min。
4.酚氯仿抽提dsRNA
1)将反应产物转移至新的无RNA酶1.5ml离心管中，无RNA酶的H2O定容至300μl。加入1/10体积(30μl)的3M乙酸钠 (pH5.2)。
2)加入150μl的水饱和酚与150μl氯仿，充分震荡，4℃， 12000r/min，离心15min。
3)移液枪吸取上层相(约300μl)，放入新的无RNA酶1.5ml离心管中，加入2.5倍体积(约750μl)无水乙醇(提前放入-20℃预冷)温和混匀后放于-20℃静置过夜。
4)4℃，12000r/min，离心30min，弃上清液。
5)加入无RNA酶的H2O配制的75％乙醇(提前放入-20℃预冷) 上下颠倒数次，洗涤沉淀。
6)4℃，7500r/min，离心5min。
7)弃上清液，风干沉淀，加入20μl无RNA酶的H2O溶解沉淀。
8)取0.5μl产物原液20倍稀释。
9)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测稀释产物质量，并用NanoDrop 2000检测产物浓度和OD值，OD值在1.8～2.0可以进行后续试验。
10)将dsRNA浓度稀释为10μg/μl备用。
实施例3
注射胰蛋白酶前体基因dsRNA后基因的沉默效率及其对雌虫卵巢内卵的数量和生殖力变化情况
以绿色荧光蛋白基因(GFP)双链dsRNA作为对照，将胰蛋白酶前体基因dsRNA通过显微注射法从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射进入新羽化雌虫体内，注射量为1.0μg/只。
绿色荧光蛋白(GFP)的双链dsRNA的序列如SEQ ID NO:11所示：tggtcccaattctcg tggaactggatggcgatgtgaatgggcacaaattttctgtcagcggagagggtga aggtgatgccacatacggaaagctcaccctgaaattcatctgcaccactggaaagctccctgtgccatgg ccaacactggtcactaccttcacctatggcgtgcagtgcttttccagatacccagaccatatgaagcagca tgactttttcaagagcgccatgcccgagggctatgtgcaggagagaaccatctttttcaaagatgacggg aactacaagacccgcgctgaagtcaagttcgaaggtgacaccctggtgaatagaatcgagctgaaggg cattgactttaaggaggatggaaacattctcggccacaagctggaatacaactataactcccacaatgtgt acatcatggccgacaagcaaaagaatggcatcaaggtcaacttca ag。
其中下划线部分为引物序列。
扩增所述绿色荧光蛋白(GFP)的双链dsRNA的引物对序列如 SEQ ID NO:12和SEQID NO:13所示。
dsGFP-F1gcgtaatacgactcactataggtggtcccaattctcgtggaac
dsGFP-R1gcgtaatacgactcactataggcttgaagttgaccttgatgcc
沉默效率检测：分别收集注射处理后5天、10天、14天和18天的中黑盲蝽全虫，提取RNA并反转录为cDNA后，使用日本Takara 公司的
Figure RE-GDA0002118172020000101
Premix ExTaqTMII和Bio-RadDetection iQ2System检测胰蛋白酶前体基因的沉默效应。
卵巢内卵数量统计：注射dsRNA 10天后，利用体式显微镜(型号SMZ—t4，重庆奥特光学仪器有限责任公司)解剖雌虫卵巢，每个处理解剖20头未交配雌虫，3个生物学重复，观察卵巢形态，统计并分析中黑盲蝽卵巢内卵的数量。
生殖力：雌虫注射dsRNA后，与新羽化的雄虫一一配对，放入一次性塑料杯内(5cm×7cm)交配，若发现雄虫死亡，马上补充新的性成熟的雄虫，以40对虫子为一个处理组，3个生物学重复，统计产卵前期、终生产卵量和雌成虫寿命，以此评价注射胰蛋白酶前体基因dsRNA对中黑盲蝽产卵前期、产卵量和雌成虫寿命的影响。
试验结果及分析：
(1)胰蛋白酶前体沉默效率
结果如图5所示，其中“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01；。图中英文缩写含义：“dsTryP”表示注射trypsinprecursor基因dsRNA 的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组。与对照组相比，注射胰蛋白酶前体基因的dsRNA后，胰蛋白酶前体基因表达量在整个生育期显著下降，说明该中黑盲蝽胰蛋白酶前体基因的干扰序列可显著抑制胰蛋白酶前体基因的表达。
(2)注射胰蛋白酶前体基因dsRNA对中黑盲蝽雌虫卵巢内卵数量的影响
注射处理10天后，解剖雌虫卵巢，统计卵巢内卵的数量并观察卵巢形态，与对照组相比，注射胰蛋白酶前体基因dsRNA处理组的中黑盲蝽卵巢内卵的数量减少了26.5％(见图6中的A)。说明注射胰蛋白酶前体基因的dsRNA可显著减少了中黑盲蝽雌虫卵巢内卵的数量。
(3)注射胰蛋白酶前体基因dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响
新羽化雌虫注射dsRNA处理后与雄虫交配，统计其产卵前期(图 6D)、终生产卵量(图6C)和雌成虫寿命(图6B)，与对照组相比，处理组的中黑盲蝽产卵量下降了21.14％，雌成虫寿命减短了2.51d，但产卵前期没有显著差异(见表1)。可见将胰蛋白酶前体基因干扰后，显著抑制了中黑盲蝽卵巢内卵的数量与雌虫生殖力，并且减短了雌成虫寿命，对中黑盲蝽的生殖能力和种群的发展产生了不利影响。因此本发明提供的RNA干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发；进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。
表1注射胰蛋白酶前体基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响
Figure RE-GDA0002118172020000121
表1说明：注射胰蛋白酶前体基因的dsRNA对中黑盲蝽生殖能力的影响。其中“ns”表示无显著差异；“*”表示p<0.05。图中英文缩写含义：“dsTryP”表示注射胰蛋白酶前体基因dsRNA的处理组；“dsGFP”表示注射GFP基因dsRNA的对照组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种胰蛋白酶前体基因及其编码的蛋白质、干扰RNA和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> Adelphocoris suturalis
<400> 1
atgaaagcag cggtagcagt tctccttttg ggcgcagtcc taattcacgc tcaagactcc 60
tctgagtggg gtcagggcaa tggccaagtc caaaccaact gcacttgtgg atacaccaac 120
aaaaatgggg gaaggatcgt tggaggccgt gatgcccagg tcaacgaata ccccttgatt 180
gctggtatca tctacagggg aatgcccagc ttcatcttct gcggaggtac catcatcact 240
gagcgtcatg ttctcactgc agctcactgc agacccgaca acaacgaagc cttgtccgtt 300
gttcttgccg aacacaaagc cagctccaaa actgagagca agaccaccat cattgatgtc 360
acccgcatga tcagccacga gcagtacgat ctgaagaaaa acactgaaaa cgatattgct 420
ctgttggtcc tcgccagcca aattcccttc ggcaaaacca ttggacccgc ctgtttcccc 480
aaggctaacc tcaacattgt tggacagaag gtccgcgtta ttggatgggg agccctcgct 540
tccggtggac gtcaaccaga catcctccag aaggtcgatc tcgatgttca gcccacttcc 600
gcctgctcca gggtctacaa aggaatcacc gaaggccaac tctgcacata caccctcagg 660
aaagacgctt gccaaggaga ttctggtggc ccagtcatct ggcgtgaccc tggcaccagc 720
cgttacacca ttgttggagt cgtctcctac ggatacggat gcgccgagcc tggtgcacct 780
ggtgtcaaca ctaaagtctc tgcttaccgc gactgggtcc tccagaagat ccaacaaact 840
gtcccatcag cagccacctg tcaaaacaag tga 873
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Adelphocoris suturalis
<400> 2
Met Lys Ala Ala Val Ala Val Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Ile His
1 5 10 15
Ala Gln Asp Ser Ser Glu Trp Gly Gln Gly Asn Gly Gln Val Gln Thr
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Gly Tyr Thr Asn Lys Asn Gly Gly Arg Ile Val Gly
35 40 45
Gly Arg Asp Ala Gln Val Asn Glu Tyr Pro Leu Ile Ala Gly Ile Ile
50 55 60
Tyr Arg Gly Met Pro Ser Phe Ile Phe Cys Gly Gly Thr Ile Ile Thr
65 70 75 80
Glu Arg His Val Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Pro Asp Asn Asn Glu
85 90 95
Ala Leu Ser Val Val Leu Ala Glu His Lys Ala Ser Ser Lys Thr Glu
100 105 110
Ser Lys Thr Thr Ile Ile Asp Val Thr Arg Met Ile Ser His Glu Gln
115 120 125
Tyr Asp Leu Lys Lys Asn Thr Glu Asn Asp Ile Ala Leu Leu Val Leu
130 135 140
Ala Ser Gln Ile Pro Phe Gly Lys Thr Ile Gly Pro Ala Cys Phe Pro
145 150 155 160
Lys Ala Asn Leu Asn Ile Val Gly Gln Lys Val Arg Val Ile Gly Trp
165 170 175
Gly Ala Leu Ala Ser Gly Gly Arg Gln Pro Asp Ile Leu Gln Lys Val
180 185 190
Asp Leu Asp Val Gln Pro Thr Ser Ala Cys Ser Arg Val Tyr Lys Gly
195 200 205
Ile Thr Glu Gly Gln Leu Cys Thr Tyr Thr Leu Arg Lys Asp Ala Cys
210 215 220
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Ile Trp Arg Asp Pro Gly Thr Ser
225 230 235 240
Arg Tyr Thr Ile Val Gly Val Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Cys Ala Glu
245 250 255
Pro Gly Ala Pro Gly Val Asn Thr Lys Val Ser Ala Tyr Arg Asp Trp
260 265 270
Val Leu Gln Lys Ile Gln Gln Thr Val Pro Ser Ala Ala Thr Cys Gln
275 280 285
Asn Lys
290
<210> 3
<211> 418
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagacccga caacaacgaa gccttgtctg ttgttcttgc cgaacacaaa gtcagctcca 60
aaactgagag caagaccacc atcattgatg tcacccgcat gatcagccac gagcagtacg 120
atctgaagaa aaacactgaa aacgatattg ccctgttggt cctcgccagc caaattccct 180
tcggcaaaac cattggaccc gcctgtttcc ccaaggctaa cctcaacatt gttggacaga 240
aagtccgcgt tattggatgg ggagccctcg cttccggtgg acgtcaacca gacatcctcc 300
agaaggtcga tctcgatgtt cagcccactt ccgcctgctc cagggtctac aaaggaatca 360
ccgaaggcca actctgcaca tacaccctca ggaaagacgc ttgccaagga gattctgg 418
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtaatacg actcactata gggcagaccc gacaacaacg aag 43
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgtaatacg actcactata ggccagaatc tccttggcaa gc 42
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggatcatca agatgaaagc agcggtagc 29
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctctcactt gttttgacag gtggctg 27
<210> 8
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Lys Ala Val Val Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Gln Asp Ser Ser Glu Trp Gly Gln Gly Gly Gly Lys Val Gln Thr
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Gly Tyr Thr Asn Lys Asn Gly Gly Arg Ile Val Gly
35 40 45
Gly Arg Gln Thr Leu Val Asn Glu Tyr Pro Leu Ile Ala Gly Ile Thr
50 55 60
Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Phe Ile Phe Cys Gly Gly Thr Ile Ile Thr
65 70 75 80
Glu Arg His Val Leu Thr Ala Ser His Cys Lys Pro Glu Arg Asn Glu
85 90 95
Ala Leu Ser Val Val Leu Ala Glu His Lys Val Ser Ser Lys Thr Glu
100 105 110
Ser Lys Thr Thr Ile Ile Asp Val Thr Gln Phe Ile Thr His Glu Glu
115 120 125
Tyr Asn Arg Arg Gly Asn Thr Glu His Asp Val Ala Leu Leu Val Leu
130 135 140
Ala Ser Lys Ile Pro Phe Gly Lys Thr Ile Gly Pro Ala Cys Phe Pro
145 150 155 160
Lys Ala Asn Leu Asn Ile Val Gly Gln Gln Val Arg Val Val Gly Trp
165 170 175
Gly Ala Leu Tyr Ser Asn Gly Pro Gln Pro Asp Ile Leu Gln Lys Val
180 185 190
Asp Leu Asp Val Gln Pro Thr Ser Ala Cys Thr Lys Val Tyr Arg Gly
195 200 205
Ile Thr Glu Gly Gln Leu Cys Thr Tyr Thr Pro Lys Lys Asp Ala Cys
210 215 220
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Ile Trp Arg Asp Pro Ser Thr Asn
225 230 235 240
Arg Tyr Thr Val Val Gly Ile Val Ser Tyr Gly Asp Glu Cys Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Pro Gly Val Asn Thr Lys Val Ser Ala Tyr Arg Asp Trp
260 265 270
Ile Leu Gln Lys Ile Gln Gln Thr Val Pro Gly Ser Ala Thr Cys Gln
275 280 285
Asn Lys
290
<210> 9
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Gln Leu Thr Thr Val Val Leu Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Gln Asp Ser Ser Glu Trp Gly Leu Gly Gly Gly Lys Val Gln Thr
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Gly Tyr Thr Asn Lys Asn Gly Gly Arg Ile Val Gly
35 40 45
Gly Arg Gln Thr Lys Val Asn Glu Tyr Pro Leu Ile Ala Ala Ile Val
50 55 60
Asn Arg Gly Arg Pro Asn Phe Ile Phe Cys Gly Gly Thr Ile Ile Thr
65 70 75 80
Glu Arg His Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Pro Lys Asn Pro Phe
85 90 95
Gln Pro Leu Ser Val Val Leu Ala Glu His Gln Val Ser Ser Lys Thr
100 105 110
Glu Ser Gln Thr Thr Ile Ile Asp Val Glu Glu Phe Ile Thr His Glu
115 120 125
Gln Tyr Ile Leu Trp Arg Asn Leu Glu Asn Asp Val Ala Leu Leu Val
130 135 140
Leu Lys Ser Lys Ile Pro Phe Gly Lys Thr Ile Gly Pro Ala Cys Phe
145 150 155 160
Pro Lys Ala Asn Leu Asn Ile Val Gly Gln Lys Val Arg Val Ile Gly
165 170 175
Trp Gly Arg Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gln Pro Asp Ile Leu Gln Lys
180 185 190
Val Asp Leu Asp Val Gln Pro Ile Ser Ala Cys Gln Lys Val Tyr Lys
195 200 205
Gly Ile Thr Glu Gly Gln Val Cys Thr Tyr Thr Glu Lys Lys Asp Ala
210 215 220
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Ile Trp Leu Asp Pro Ser Thr
225 230 235 240
Asn Arg Tyr Thr Val Val Gly Ile Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Cys Ala
245 250 255
Gln Pro Gly Ser Pro Gly Val Asn Thr Ala Val Ser Thr Tyr Arg Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Gln Lys Ile Gln Ala Thr Ala Pro Gly Ser Ala Thr Cys
275 280 285
Gln Asn Lys
290
<210> 10
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Tyr Trp Arg Gly Val Trp Val Leu Ala Ala Val Val Cys Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Ala Asp Asp Ser Tyr Val Thr Trp Thr Asp Ser Ala Glu Ser
20 25 30
Gly Ser Glu Glu Tyr Gly Gln Phe Arg Gly Pro Lys Asp Thr Asn Cys
35 40 45
Ser Cys Gly Trp Thr Asn Lys Asp Ser Gly Arg Ile Val Gly Gly Arg
50 55 60
Glu Ala Phe Val Asn Glu Phe Pro Tyr Met Val Gly Leu Gly Tyr Met
65 70 75 80
Ser Pro Arg Gly Ser Ala Val Ser Ala Phe Cys Gly Ala Ser Ile Ile
85 90 95
Thr Pro Arg His Val Leu Thr Ala Ala His Cys Thr Phe Gln Asp His
100 105 110
Gly Glu Lys Leu Gly Val Val Val Gly Glu His Asp Thr Ser Arg Arg
115 120 125
Asp Glu Thr Lys His Thr Lys Val Tyr Ala Ile Ser Lys Ile Ile Glu
130 135 140
His Glu Gly Trp Ser Leu Gln Thr Phe Gln Asn Asp Val Ala Ile Val
145 150 155 160
Ile Thr Glu Lys Glu Ile Glu Phe Asn Gln Tyr Val Gly Pro Val Cys
165 170 175
Leu Pro Ser Pro Asn Met Pro Ser Leu Val Gly Lys His Ile Arg Val
180 185 190
Thr Gly Trp Gly Asn Thr Lys Gly Asn Gly Glu Glu Ser Glu Arg Leu
195 200 205
Leu Lys Val Arg Pro Lys Val Ile Asp Leu Lys Phe Cys Lys Glu Lys
210 215 220
Tyr Pro His Lys Pro Ile Arg Met Asn Pro Asn Thr Gln Leu Cys Thr
225 230 235 240
Tyr Ser Tyr Arg Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val
245 250 255
Val Trp Leu Asp Pro Glu Thr Asn Arg Tyr Thr Gln Val Gly Val Val
260 265 270
Ser Phe Gly Ala Gly Cys Ala Thr Arg Ile Pro Gly Val Asn Thr Asp
275 280 285
Val Ser His Phe Leu Gly Trp Ile Gln Lys Thr Val Arg Glu Ser Ile
290 295 300
Pro Ser Ser Tyr Arg Thr Cys Ser Lys Arg Gly
305 310 315
<210> 11
<211> 467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggtcccaat tctcgtggaa ctggatggcg atgtgaatgg gcacaaattt tctgtcagcg 60
gagagggtga aggtgatgcc acatacggaa agctcaccct gaaattcatc tgcaccactg 120
gaaagctccc tgtgccatgg ccaacactgg tcactacctt cacctatggc gtgcagtgct 180
tttccagata cccagaccat atgaagcagc atgacttttt caagagcgcc atgcccgagg 240
gctatgtgca ggagagaacc atctttttca aagatgacgg gaactacaag acccgcgctg 300
aagtcaagtt cgaaggtgac accctggtga atagaatcga gctgaagggc attgacttta 360
aggaggatgg aaacattctc ggccacaagc tggaatacaa ctataactcc cacaatgtgt 420
acatcatggc cgacaagcaa aagaatggca tcaaggtcaa cttcaag 467
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgtaatacg actcactata ggtggtccca attctcgtgg aac 43
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcgtaatacg actcactata ggcttgaagt tgaccttgat gcc 43
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgtaatacg actcactata gg 22

Claims (5)

1.一种分离自中黑盲蝽的胰蛋白酶前体基因、所述的胰蛋白酶前体基因编码的蛋白质或所述胰蛋白酶前体基因的干扰RNA在防治中黑盲蝽中的应用，其特征在于，降低所述胰蛋白酶前体基因在中黑盲蝽中的表达量；
所述胰蛋白酶前体基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，扩增所述干扰RNA的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，向所述中黑盲蝽体内导入所述的干扰RNA。
4.一种干扰RNA在制备抗中黑盲蝽的植物中的应用，其特征在于，所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述干扰RNA转入植物体中进行表达。
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"中黑盲蝽TryP和PGL基因的克隆及生殖调控功能研究";朱邦勤;《中国优秀硕士论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》;20200215(第2（2020）期);D046-124 *

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