CN104774159B - 一种酰肼类化合物及其在制备抗手足口病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了一种酰肼类化合物。采用有机弱碱催化的苯甲酰氯和苯肼盐酸盐的缩合反应制备了这种酰肼类衍生物。细胞毒性和抗EV71活性结果表明：合成的化合物大多数都具有很好抗EV71活性，显示此类化合物在制备抗手足口病药物中的应用前景。

Description

一种酰肼类化合物及其在制备抗手足口病药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种酰肼类化合物及其在制备抗手足口病药物中的应用。
背景技术
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。
人类肠道病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，是引起婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease，HFMD)主要病原体之一，它是人类发现的一种新的肠道病毒。它是微小核糖核酸病毒科肠道病毒属的一种，能引起以发热和手、足、口腔等部位的皮疹、疱疹和疱疹性咽峡炎为主要特征的急性传染病，多发于4-5岁的孩子，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗手足口病药物，尤其是EV71抑制剂的缺乏使得设计、合成一系列新型有效的EV71抑制剂具有很大的前景，同时也具有很大的挑战性。临床上主要采用对症和支持疗法用于治疗手足口病，而现阶段关于新型EV71抑制剂的设计合成研究报道也很少，使得其具有很大的空间。
目前用于治疗EV71的药物主要分为以下三类：1、位点结合阻断剂，2009年在《Nature medicine》杂志上，有学者报道了EV71的受体包括清道夫受体B2和P选择素糖蛋白配体1；2、酶抑制剂以蛋白酶抑制剂3C为主，蛋白酶是微小核糖核酸病毒属病毒复制所必需的特异性蛋白酶之一，同时对其基因组研究表明，编码3C蛋白酶的基因序列高度保守，所以，3C蛋白酶就成为了抗小RNA病毒药物开发的重要的靶标。如依据3C蛋白酶设计的潜力抗病毒物质芦平曲韦在临床上具有很好的效果；3、RNA干扰技术小干扰RNA在感染的早期阶段能够有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断。临床数据分析，通过在人横纹肌肉瘤细胞上接种EV71，抗病毒结果显示siRNA具有较强的抑制EV71复制的能力。
虽然已有文献报道了不同结构的抗手足口病活性化合物及药物，但是真正能够临床用于手足口病治疗的药物目前还没有，所有设计合成一系列新型的能够较好抑制肠道病毒的活性化合物对于临床研制手足口病药物是十分有必要的。基于此，通过高内涵筛选技术我们发现并合成了这种基于酰肼骨架的化合物作为EV71抑制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酰肼类化合物及其在制备抗手足口病药物中的应用。
本发明所提供的酰肼类化合物，具有以下通式所示的结构：
其中，
R1为H、4-Me、4-OMe、4-Et、4-OEt、4-Pr、4-tBu或4-NMe2；
R2为2,6-Me2、2,6-Cl2、2,6-OMe2、2,6-Br2、2,6-F2或2-Me-6-Cl；
本发明通过体外抗EV71活性实验，发现上述酰肼类化合物可以用作EV71抑制剂，用于制备抗手足口病药物。优选的，尤其是下列化合物:
N'-(2,6-二甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼(HX-1)、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼(HX-2)、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-甲氧基苯甲酰肼(HX-3)、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-乙基苯甲酰肼(HX-4)、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼(HX-5)、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-6)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-甲基苯甲酰肼(HX-7)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼(HX-8)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-乙基苯甲酰肼(HX-9)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-乙氧基苯甲酰肼(HX-10)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-丙基苯甲酰肼(HX-11)、
N'-(2,6-二氯苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-12)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼(HX-13)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼(HX-14)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲氧基苯甲酰肼(HX-15)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-乙氧基苯甲酰肼(HX-16)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼(HX-17)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-18)、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲硫基苯甲酰肼(HX-19)、
N'-(2,6-二甲氧基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-20)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-甲基苯甲酰肼(HX-21)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼(HX-22)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-甲氧基苯甲酰肼(HX-23)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-乙基苯甲酰肼(HX-24)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-乙氧基苯甲酰肼(HX-25)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-丙基苯甲酰肼(HX-26)、
N'-(2,6-二溴苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-27)、
N'-(2,6-二氟苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼(HX-28)、
N'-(2,6-二氟苯)-4-甲氧基苯甲酰肼(HX-29)、
N'-(2,6-二氟苯)-4-乙氧基苯甲酰肼(HX-30)、
N'-(2,6-二氟苯)-4-丙基苯甲酰肼(HX-31)、
N'-(2,6-二氟苯)-4-叔丁基苯甲酰肼(HX-32)。
本发明还提供前面结构式所表示的酰肼类化合物的制备方法。
当R2＝2,6-OMe2，2-Br2或2-Cl-6-Me时,通过下面反应式i、ii所示反应合成得到带R2的苯肼盐酸盐。
具体操作步骤可以为：
i)取一三颈瓶，加入2,6-二甲氧基苯胺(1.53g,10mmol)，搅拌下加入浓盐酸(2.5mL,30mmol)和H2O(5mL)，继续搅拌至完全溶解，然后冷却到-5℃，滴加新鲜配制的NaNO2(0.76g,11mmol)水(3mL)溶液进行重氮化。滴加完毕，搅拌15min，所得的重氮盐备用。
ii)取另一三颈瓶配制SnCl2溶液(3.78g,20mmol；6mL浓HCl；2mL H2O)，冰浴下将i制备的重氮盐滴加于SnCl2溶液中，产生沉淀，滴完后搅拌过夜，抽虑，滤饼用大量饱和NaCl饱和溶液洗涤，真空干燥得目标化合物苯肼盐酸盐，为淡黄色固体，产率82％。
除上述反应i、ii得到的以外的带R2的苯肼盐酸盐衍生物以及带R1的苯甲酰氯衍生物，均可以在市场上购买。
通过合成或购买商品，获得带R1的苯甲酰氯衍生物和带R2的苯肼盐酸盐衍生物，然后取适量的带R1的苯甲酰氯衍生物和带R2的苯肼盐酸盐衍生物于二氯甲烷中加入三乙胺反应，TLC监测反应进行，原料基本反应完全后，柱层析分离即为目标化合物。
反应式如下面(iii)式所示。
R1为H、4-Me、4-OMe、4-Et、4-OEt、4-Pr、4-tBu或4-NMe2；
R2为2,6-Me2、2,6-Cl2、2,6-OMe2、2,6-Br2、2,6-F2或2-Me-6-Cl；
具体操作过程可以如下：
取0.2mmol的反应i、ii或者商品化的带R2的苯肼盐酸盐衍生物溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的带R1的苯甲酰氯衍生物0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物。
药理实验发现，本发明所述的化合物可以作为EV71抑制剂，用于制备抗手足口病药物。所以，本发明也提供了一种抗手足口病药物组合物，包含本发明所述的化合物和一种或多种药学上可接受的助剂，其可以按照现有的常规医药技术来制备。
具体实施方式
实施例1：N'-(2,6-二甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物,产物为白色固体，mp 139-142℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.54(s,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,2H),7.27(d,J＝8.0Hz,2H),6.94(d,J＝7.4Hz,2H),6.78(t,J＝7.6Hz,1H),6.49(d,J＝3.2Hz,1H),2.48(s,6H),2.36(s,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.64,146.11,142.73,131.31,129.88,129.62,129.03,128.23,123.08,21.39,19.01.HRMS(ESI)calcd for C16H18N2NaO[M+Na]+277.1317,found 277.1308.
实施例2：N'-(2,6-二甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-二甲氨基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp140-141℃；产率为81％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.29(s,1H),7.79(d,J＝8.9Hz,2H),6.92(d,J＝7.4Hz,2H),6.74(dd,J＝16.2,8.2Hz,3H),6.46(s,1H),2.99(s,6H),2.48(s,6H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.89,153.64,146.54,132.14,129.60,128.82,122.85,120.58,117.85,111.80,111.60,40.15,19.08.HRMS(ESI)calcd for C17H21N3NaO[M+Na]+306.1582,found 306.1572.
实施例3：N'-(2,6-二甲基苯)-4-甲氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物,产物为白色固体，mp 180-181℃；产率为90％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.48(s,1H),7.90–7.86(m,2H),7.00–6.97(m,2H),6.93(d,J＝7.4Hz,2H),6.77(t,J＝7.6Hz,1H),6.48(d,J＝3.2Hz,1H),3.85(s,3H),2.48(s,6H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.31,163.32,146.22,130.03,129.60,128.97,126.23,123.02,114.47,55.78,19.01.HRMS(ESI)calcd for C16H18N2NaO2[M+Na]+293.1266,found 293.1262.
实施例4：N'-(2,6-二甲基苯)-4-乙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物,产物为白色固体，产物为白色固体，产物为白色固体，mp 127-128℃；产率为91％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.54(s,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,2H),7.30(d,J＝8.2Hz,2H),6.94(d,J＝7.6Hz,2H),6.78(t,J＝7.6Hz,1H),6.50(d,J＝3.2Hz,1H),2.70–2.65(m,2H),2.48(s,6H),1.21(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.66,149.00,146.11,131.57,129.62,129.03,128.73,128.35,123.09,19.02,15.79.HRMS(ESI)calcdfor C17H20N2NaO[M+Na]+291.1473,found 291.1469.
实施例5：N'-(2,6-二甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-丙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物,产物为白色固体，mp 117-118℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone)δ9.54(s,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,2H),7.28(d,J＝8.2Hz,2H),6.94(d,J＝7.4Hz,2H),6.78(t,J＝7.6Hz,1H),6.50(d,J＝3.2Hz,1H),2.64–2.59(m,2H),2.48(s,6H),1.63(dd,J＝15.0,7.6Hz,2H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,Acetone)δ167.70,147.40,146.11,131.59,129.63,129.33,129.04,128.27,123.10,38.38,25.11,19.04,14.03.HRMS(ESI)calcd for C18H22N2NaO[M+Na]+305.1630,found 305.1619.
实施例6：N'-(2,6-二甲基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 155-156℃；产率为92％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.54(d,J＝2.6Hz,1H),7.85–7.81(m,2H),7.51–7.46(m,2H),6.93(d,J＝7.4Hz,2H),6.79(d,J＝7.4Hz,1H),6.50(d,J＝3.4Hz,1H),2.48(s,6H),1.31(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.64,155.65,146.10,131.32,129.64,129.03,128.11,126.17,123.10,35.46,31.44,19.06.HRMS(ESI)calcd for C19H24N2NaO[M+Na]+319.1786,found 319.1776.
实施例7：N'-(2,6-二氯苯)-4-甲基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 140-141℃；产率为91％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.86(s,1H),7.84(d,J＝8.2Hz,2H),7.30(dd,J＝16.4,8.0Hz,4H),7.16(d,J＝2.8Hz,1H),6.95(t,J＝8.2Hz,1H),2.37(s,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.10,143.00,142.97,130.87,129.94,129.93,128.42,125.61,123.91,123.87,21.45.HRMS calcd forC14H12Cl2N2NaO[M+Na]+317.0224,found 317.0215.
实施例8：N'-(2,6-二氯苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-二甲氨基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 156-157℃；产率为83％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.56(s,1H),7.84–7.80(m,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(d,J＝3.2Hz,1H),6.95(t,J＝8.0Hz,1H),6.76–6.72(m,2H),3.02(s,6H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.14,153.78,143.39,129.89,129.75,125.57,123.66,120.09,111.79,40.14.HRMS(ESI)calcd forC15H15Cl2N3NaO[M+Na]+346.0490,found 346.0482.
实施例9：N'-(2,6-二氯苯)-4-乙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 113-114℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.86(d,J＝1.8Hz,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(dd,J＝8.2,3.1Hz,4H),7.17(d,J＝3.0Hz,1H),6.96(t,J＝8.1Hz,1H),2.71–2.65(m,2H),1.22(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.08,149.25,142.98,131.12,129.94,128.78,128.53,125.61,123.87,29.33,15.80.HRMS(ESI)calcd for C15H14Cl2N2NaO[M+Na]+331.0381,found 331.0368.
实施例10：N'-(2,6-二氯苯)-4-乙氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 154-155℃；产率为94％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.77(s,1H),7.93–7.89(m,2H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),7.15(d,J＝3.2Hz,1H),7.01–6.95(m,3H),4.10(t,J＝7.0Hz,2H),1.38(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.71,162.83,143.09,130.22,129.93,125.59,123.81,114.95,64.33,14.98.HRMS(ESI)calcd for C15H15Cl2N2O2[M+H]+325.0511,found 325.0504.
实施例11：N'-(2,6-二氯苯)-4-丙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-丙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 125-126℃；产率为95％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.86(s,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,2H),7.31(t,J＝8.6Hz,4H),7.16(d,J＝3.0Hz,1H),6.96(t,J＝8.2Hz,1H),2.69–2.59(m,2H),1.69–1.59(m,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.10,147.66,142.98,131.15,129.94,129.37,128.44,125.62,123.87,38.40,25.10,14.03.HRMS(ESI)calcd for C16H16Cl2N2NaO[M+Na]+345.0537,found325.0526.
实施例12：N'-(2,6-二氯苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氯苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 112-113℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.69(s,1H),7.88–7.84(m,2H),7.52–7.49(m,2H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝7.4Hz,1H),6.86(dd,J＝13.2,5.4Hz,2H),2.50(s,3H),1.32(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.31,155.82,144.24,130.99,130.88,130.77,128.43,128.35,128.17,126.23,124.87,123.55,123.52,35.49,31.48,31.44,19.47.HRMS(ESI)calcdforC17H18Cl2N2NaO[M+Na]+359.0694,found 359.0687.
实施例13：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 125-126℃；产率为90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝7.9Hz,2H),7.62(s,1H),7.30(d,J＝7.8Hz,3H),7.18(dd,J＝13.8,7.0Hz,2H),2.44(s,3H),2.33(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.71,142.66,138.17,132.79,131.17,129.46,129.39,127.78,127.46,127.01,21.57,19.15.HRMS(ESI)calcd for C15H15ClN2NaO[M+Na]+297.0771,found 297.0766.
实施例14：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-二甲氨基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp133-134℃，产率为78％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝4.4Hz,1H),7.69–7.65(m,2H),7.20(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝7.0Hz,1H),6.88(t,J＝7.8Hz,1H),6.69–6.64(m,3H),3.02(s,6H),2.55(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.86,152.82,142.83,130.37,129.79,128.58,127.93,125.60,123.84,118.64,111.12,40.07,18.60.HRMS(ESI)calcd for C16H18ClN3NaO[M+Na]+326.1036,found 326.1031.
实施例15：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 145-147℃；产率为92％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(d,J＝4.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.8Hz,2H),7.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝7.4Hz,1H),6.96–6.89(m,3H),6.66(d,J＝4.8Hz,1H),3.85(s,3H),2.55(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ162.68,142.49,130.44,129.82,128.92,128.01,125.70,124.41,124.13,114.03,55.46,18.53.HRMS(ESI)calcd for C15H15ClN2NaO2[M+Na]+313.0720,found 313.0713.
实施例16：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-乙氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 133-134℃；产率为94％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.61(s,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝7.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H),6.85(t,J＝7.8Hz,2H),4.13–4.07(m,2H),2.50(s,3H),1.38(d,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.06,162.77,144.43,130.87,130.74,130.11,128.33,125.77,124.84,123.46,114.95,64.32,19.48,15.00.HRMS(ESI)calcdfor C16H17ClN2NaO2[M+Na]+325.0876,found 327.0871.
实施例17：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-丙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 126-128℃；产率为92％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.67(s,1H),7.84(d,J＝8.2Hz,2H),7.30(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(t,J＝6.4Hz,1H),7.06(d,J＝7.4Hz,1H),6.86(dd,J＝9.8,5.6Hz,2H),2.65(d,J＝7.4Hz,2H),2.51(s,3H),1.67–1.61(m,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.42,147.58,144.26,131.31,130.88,130.79,130.56,129.38,128.34,128.32,124.89,123.56,123.53,38.39,25.10,19.47,14.02.HRMS(ESI)calcd for C17H19ClN2NaO[M+Na]+325.1084,found325.1073.
实施例18：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 112-113℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.69(s,1H),7.88–7.84(m,2H),7.52–7.49(m,2H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝7.4Hz,1H),6.86(dd,J＝13.2,5.4Hz,2H),2.50(s,3H),1.32(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.31,155.82,144.24,130.99,130.88,130.77,128.43,128.35,128.17,126.23,124.87,123.55,123.52,35.49,31.48,31.44,19.47.HRMS(ESI)calcdforC18H21ClN2NaO[M+Na]+339.1240,found 339.1233.
实施例19：N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲硫基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2-氯-6-甲基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲硫基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 125-127℃；产率为88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,J＝8.2Hz,2H),7.60(s,1H),7.31(dd,J＝10.8,5.0Hz,3H),7.18(dd,J＝12.8,7.0Hz,2H),2.54(s,3H),2.33(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ144.38,138.14,132.70,131.15,129.98,129.41,127.84,127.04,125.49,19.15,15.03.HRMS(ESI)calcd forC15H15ClN2NaOS[M+Na]+329.0491,found 329.0485.
实施例20：N'-(2,6-二甲氧基苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二甲氧基苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 147-148℃；产率为87％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.50(d,J＝7.0Hz,1H),7.82(d,J＝8.6Hz,2H),7.52–7.47(m,2H),7.31(d,J＝8.6Hz,1H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),6.66(d,J＝8.4Hz,2H),3.90(s,6H),1.33(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ155.38,151.63,131.51,127.86,127.12,126.15,125.93,123.04,105.97,56.69,35.44,31.54,31.45.HRMS(ESI)calcd for C19H24N2NaO3[M+Na]+351.1685,found351.1689.
实施例21：N'-(2,6-二溴苯)-4-甲基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 123-124℃；产率为91％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.82(s,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,2H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),7.04(d,J＝2.8Hz,1H),6.83(t,J＝8.0Hz,1H),2.38(s,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.95,144.70,143.01,133.96,130.84,129.91,128.47,125.06,114.83,21.43.HRMS(ESI)calcdfor C14H12Br2N2NaO[M+Na]+404.9214,found 404.9218.
实施例22：N'-(2,6-二溴苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-二甲氨基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp156-158℃；产率为81％。1H NMR(400MHz,Acetone)δ9.53(s,1H),7.84(d,J＝9.0Hz,2H),7.54(d,J＝8.0Hz,2H),7.00(d,J＝3.0Hz,1H),6.81(t,J＝8.0Hz,1H),6.74(d,J＝9.0Hz,2H),3.02(s,6H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.04,153.78,145.10,133.92,129.82,124.86,120.04,114.79,111.79,40.14.HRMS(ESI)calcd for C15H15Br2N3NaO[M+Na]+433.9480,found 433.9486.
实施例23：N'-(2,6-二溴苯)-4-甲氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 150-151℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ10.18(s,1H),8.05(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(d,J＝5.2Hz,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.10–7.05(m,1H),6.88(t,J＝8.0Hz,1H),4.10(s,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ164.84,158.77,144.88,134.36,133.89,132.59,125.94,121.87,120.56,115.74,112.88,56.78.HRMS(ESI)calcd for C14H12Br2N2NaO2[M+Na]+420.9163,found 420.9159.
实施例24：N'-(2,6-二溴苯)-4-乙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 146-148℃；产率为94％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.82(s,1H),7.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝8.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.04(d,J＝2.8Hz,1H),6.83(t,J＝8.0Hz,1H),2.72–2.66(m,2H),1.22(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.99,149.26,144.69,133.97,131.08,128.78,128.59,125.07,114.84,29.31,15.79.HRMS(ESI)calcd for C15H14Br2N2NaO[M+Na]+418.9371,found418.9365.
实施例25：N'-(2,6-二溴苯)-4-乙氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 161-163℃；产率为95％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.74(s,1H),7.95–7.91(m,2H),7.55(d,J＝8.0Hz,2H),7.02(d,J＝2.8Hz,1H),7.00–6.97(m,2H),6.82(t,J＝8.0Hz,1H),4.11(q,J＝7.0Hz,2H),1.38(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.63,162.84,144.80,133.95,130.30,125.57,125.01,114.95,114.82,64.33,15.00.HRMS(ESI)calcd for C15H14Br2N2NaO2[M+Na]+434.9320,found434.9325.
实施例26：N'-(2,6-二溴苯)-4-丙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-丙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 117-118℃；产率为92％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.83(s,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.0Hz,2H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),7.04(d,J＝3.0Hz,1H),6.83(t,J＝8.0Hz,1H),2.66–2.61(m,2H),1.65(dd,J＝15.0,7.5Hz,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.01,147.67,144.70,133.96,131.11,129.38,128.51,125.08,114.86,38.41,25.10,14.04.HRMS(ESI)calcd for C16H16Br2N2NaO[M+Na]+432.9527,found 432.9524.
实施例27：N'-(2,6-二溴苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二溴苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 168-169℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.83(s,1H),7.91(d,J＝8.6Hz,2H),7.54(dd,J＝11.8,8.4Hz,4H),7.05(d,J＝2.8Hz,1H),6.83(t,J＝8.0Hz,1H),1.34(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ166.90,155.91,144.70,133.96,130.83,128.32,126.22,125.05,114.82,110.90,35.50,31.41.HRMS(ESI)calcd for C17H18Br2N2NaO[M+Na]+446.9684,found 446.9689.
实施例28：N'-(2,6-二氟苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氟苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-二甲氨基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp150-151℃；产率为80％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.61(s,1H),7.82(d,J＝8.9Hz,2H),6.97–6.86(m,4H),6.72(d,J＝9.0Hz,2H),3.00(s,6H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.64,154.77(d,1JC-F＝242.00Hz),154.71(d,2JC-F＝242.00Hz),153.77,129.64,127.88(t,3JC-F＝12.00Hz；4JC-F＝12.00Hz),121.58(t,5JC-F＝10.00Hz；6JC-F＝9.00Hz),120.29,112.42(d,7JC-F＝16.00Hz),112.35(d,8JC-F＝16.00Hz),111.79,40.15.HRMS(ESI)calcd for C15H15F2N3NaO[M+Na]+314.1081,found 314.1089.
实施例29：N'-(2,6-二氟苯)-4-甲氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氟苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-甲氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 117-118℃；产率为93％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.86(d,J＝4.2Hz,1H),8.02(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.51(ddd,J＝8.5,7.3,1.9Hz,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,2H),7.06(td,J＝7.8,0.9Hz,1H),6.94(tt,J＝5.3,3.5Hz,3H),4.04(s,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ165.75,158.76,154.78(d,1JC-F＝242.00Hz),154.72(d,2JC-F＝242.00Hz),134.20,132.43,127.32(t,3JC-F＝13.00Hz；4JC-F＝13.00Hz),122.22(t,5JC-F＝10.00Hz；6JC-F＝9.00Hz),121.79,121.03,112.84,112.51(d,7JC-F＝16.00Hz),112.44(d,8JC-F＝16.00Hz),56.62.HRMS(ESI)calcd for C14H12F2N2NaO2[M+Na]+301.0765,found 301.0760.
实施例30：N'-(2,6-二氟苯)-4-乙氧基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氟苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-乙氧基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 125-126℃；产率为95％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.80(s,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,3H),6.96–6.86(m,3H),4.11(q,J＝6.9Hz,2H),1.38(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.20,162.82,154.74(d,1JC-F＝241.00Hz),154.68(d,2JC-F＝241.00Hz),130.09,127.56(t,3JC-F＝12.00Hz；4JC-F＝13.00Hz),125.79,121.71(t,5JC-F＝10.00Hz；6JC-F＝9.00Hz),114.96,112.46(d,7JC-F＝16.00Hz),112.39(d,8JC-F＝16.00Hz),64.33,14.99.HRMS(ESI)calcd for C15H14F2N2NaO2[M+Na]+315.0921,found 315.0925.
实施例31：N'-(2,6-二氟苯)-4-丙基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氟苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-丙基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 92-93℃；产率为92％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.87(s,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,2H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),7.04(d,J＝3.0Hz,1H),6.98–6.89(m,3H),2.67–2.61(m,2H),1.65(dd,J＝15.0,7.5Hz,2H),0.92(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.52,154.72(d,1JC-F＝242.00Hz),154.66(d,2JC-F＝241.00Hz),147.62,131.33,129.37,128.28,127.45(t,3JC-F＝12.00Hz；4JC-F＝12.00Hz),121.73(t,5JC-F＝9.00Hz；6JC-F＝10.00Hz),112.47(d,7JC-F＝17.00Hz),112.40(d,8JC-F＝16.00Hz),38.39,25.10,13.99.HRMS(ESI)calcd for C16H16F2N2NaO[M+Na]+313.1128,found313.1122.
实施例32：N'-(2,6-二氟苯)-4-叔丁基苯甲酰肼的制备
取0.2mmol的2,6-二氟苯肼盐酸盐溶于5mL二氯甲烷中，加入0.52mmol的三乙胺使苯肼游离出来，然后冰浴下再加入2mL二氯甲烷溶解的商品化的4-叔丁基苯甲酰氯0.26mmol，室温下搅拌反应，TLC监测反应进行。原料基本反应完全后，柱层析分离得到纯净的目标化合物，产物为白色固体，mp 112-113℃；产率为94％。1H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ9.90(d,J＝3.0Hz,1H),7.88(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(d,J＝8.5Hz,2H),7.05(d,J＝3.1Hz,1H),6.95–6.89(m,3H),1.33(s,9H).13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ167.51,154.72(d,1JC-F＝241.00Hz),154.67(d,2JC-F＝245.00Hz),131.02,128.15,127.44(t,3JC-F＝13.00Hz；4JC-F＝12.00Hz),126.23,121.73(t,5JC-F＝9.00Hz；6JC-F＝10.00Hz),112.48(d,7JC-F＝16.00Hz),112.41(d,8JC-F＝16.00Hz),35.49,31.44.HRMS(ESI)calcd for C17H18F2N2NaO[M+Na]+327.1285,found 327.1289.
表1本发明方法合成的目标化合物1-32的化学结构
Entry Compounds R1 R2
1 HX-1 4-Me 2,6-Me2
2 HX-2 4-N(Me)2 2,6-Me2
3 HX-3 4-OMe 2,6-Me2
4 HX-4 4-Et 2,6-Me2
5 HX-5 4-Pr 2,6-Me2
6 HX-6 4-tBu 2,6-Me2
7 HX-7 4-Me 2,6-Cl2
8 HX-8 4-N(Me)2 2,6-Cl2
9 HX-9 4-Et 2,6-Cl2
10 HX-10 4-OEt 2,6-Cl2
11 HX-11 4-Pr 2,6-Cl2
12 HX-12 4-tBu 2,6-Cl2
13 HX-13 4-Me 2-Cl-6-Me
14 HX-14 4-N(Me)2 2-Cl-6-Me
15 HX-15 4-OMe 2-Cl-6-Me
16 HX-16 4-OEt 2-Cl-6-Me
17 HX-17 4-Pr 2-Cl-6-Me
18 HX-18 4-tBu 2-Cl-6-Me
19 HX-19 4-SMe 2-Cl-6-Me
20 HX-20 4-tBu 2,6-OMe2
21 HX-21 4-Me 2,6-Br2
22 HX-22 4-N(Me)2 2,6-Br2
23 HX-23 4-OMe 2,6-Br2
24 HX-24 4-Et 2,6-Br2
25 HX-25 4-OEt 2,6-Br2
26 HX-26 4-Pr 2,6-Br2
27 HX-27 4-tBu 2,6-Br2
28 HX-28 4-N(Me)2 2,6-F2
29 HX-29 4-OMe 2,6-F2
30 HX-30 4-OEt 2,6-F2
31 HX-31 4-Pr 2,6-F2
32 HX-32 4-tBu 2,6-F2
实验例25：酰肼类化合物药理实验
(1)化合物细胞毒性测定:
四唑化合物
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetr azolium,inner salt)，简称MTS，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTS还原为有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
MTS/PMS试剂盒从美国Promega公司购买。
实验时，将Vero(美国健康研究院提供)细胞传至96孔板中，24小时后将化合物按一定的稀释度加入细胞在37℃培养72小时后，加入20μL MTS/PMS混合液，37℃继续培养4小时后，用酶标仪测定490nm波长下的OD值。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表给药组的OD值，“P”代表未给药组的OD值，“N”代表空白组OD值。化合物的半数抑制浓度(CC50)作为该化合物细胞毒性的指标。
(2)化合物体外抗EV71活性:
EV71病毒感染Vero，RD等细胞后，在一定的时间后会引起细胞病变，可以根据细胞病变的程度来反映药物对病毒的抑制水平。
实验时，将100TCID50EV71病毒与不同稀释度的药物混合加入到Vero细胞中(80％(面积比)铺满)，每个稀释度做8个重复孔。37℃培养24-48小时后，待病毒对照组细胞完全出现细胞病变后，加入20μL MTS/PMS混合液，37℃继续培养4小时后，用酶标仪测定490nm波长下的OD值。化合物的抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100，其中“E”代表实验组的OD值，“P”代表阳性组的OD值，“N”代表阴性组的OD值。化合物的半数抑制浓度(EC50)作为其抗病毒活性的指标。
本发明以Enviroxime对照，对合成的32个化合物进行细胞毒性和抗EV71活性检查，并计算了化合物的选择性指数SI，结果见表2。
表2本发明合成的目标化合物HX1-32的细胞毒性和抗EV71活性结果
Entry Compounds IC50(μM) CC50(μM) SI(CC50/IC50)
1 HX-1 5.308±1.345 >314.556 >59.3
2 HX-2 0.294±0.076 >282.318 >960.3
3 HX-3 12.318±4.143 >295.939 >24
4 HX-4 1.570±0.431 135.269±36.631 86.2
5 HX-5 0.946±0.439 >283.306 >299.5
6 HX-6 0.167±0.037 166.326±31.814 996
7 HX-7 1.282±0.480 >271.036 >211.4
8 HX-8 0.016±0.004 >246.757 >15422.3
9 HX-9 0.941±0.267 >258.74 >275
10 HX-10 0.326±0.070 >246.010 >754.6
11 HX-11 0.415±0.080 >247.512 >596.4
12 HX-12 0.471±0.096 30.838±7.591 65.5
13 HX-13 12.957±4.622 >291.179 >22.5
14 HX-14 0.284±0.077 92.828±25.050 326.9
15 HX-15 5.744±1.820 >275.155 >47.9
16 HX-16 0.394±0.073 >262.492 >666.2
17 HX-17 0.918±0.186 80.251±22.853 87.4
18 HX-18 0.789±0.202 49.239±13.162 62.4
19 HX-19 6.128±2.174 106.58±27.444 17.4
20 HX-20 10.414±3.776 >243.601 >23.4
21 HX-21 10.805±6.171 146.329±27.079 13.5
22 HX-22 0.032±0.010 >193.654 >6051.7
23 HX-23 3.324±0.710 >199.967 60.2
24 HX-24 0.927±0.609 >200.958 >216.7
25 HX-25 0.367±0.104 >193.194 >526.4
26 HX-26 3.543±0.915 >194.119 >54.8
27 HX-27 0.078±0.034 >187.729 2406.8
28 HX-28 17.954±12.976 >274.635 15.3
29 HX-29 74.033±24.222 >287.507 3.8
30 HX-30 66.717±25.387 >273.709 4.1
31 HX-31 67.381±29.796 >275.570 4.1
32 HX-32 2.192±0.812 149.835±28.686 68.4
33 恩韦肟 0.148±0.058 >223.205 >1508.1
上述实验结果表明：合成的化合物大多数都具有很好抗EV71活性，例如化合物HX-6(EC50＝0.167μM，SI＝996)、HX-8(EC50＝0.016μM，SI>15422.3)、HX-22(EC50＝0.032μM，SI>6051.7)、HX-27(EC50＝0.078μM，SI＝2406.8)等。

Claims (5)

1.一种酰肼类化合物，具有如下通式所示的结构：
其中，
R1为4-Me、4-OEt、4-Pr或4-NMe2；
R2为2,6-Me2、2,6-Cl2、2,6-OMe2、2,6-Br2、2,6-F2或2-Cl-6-Me。
2.权利要求1所述酰肼类化合物在制备抗手足口病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酰肼类化合物为：
N'-(2,6-二甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氯苯)-4-甲基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氯苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氯苯)-4-乙氧基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氯苯)-4-丙基苯甲酰肼、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-甲基苯甲酰肼、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-乙氧基苯甲酰肼、
N'-(2-氯-6-甲基苯)-4-丙基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二溴苯)-4-甲基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二溴苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二溴苯)-4-乙氧基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二溴苯)-4-丙基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氟苯)-4-二甲氨基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氟苯)-4-乙氧基苯甲酰肼、
N'-(2,6-二氟苯)-4-丙基苯甲酰肼。
4.权利要求1所述酰肼类化合物在制备肠道病毒EV71抑制剂上的应用。
5.一种抗手足口病药物组合物，包含权利要求1所述的化合物和一种或多种药学上可接受的助剂。
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