JP7373100B2 - 細胞培養用基材及び培養方法 - Google Patents
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Description
或いは、hPSCを、細胞外マトリックス上、例えば、マトリゲル上もしくはゲルトレックス上において培養を行うという方法である。マトリゲルなどの細胞培養用の細胞外マトリックスは、主成分として、ラミニン、コラーゲンIV、へパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチン/ニドゲンを含み、さらに、様々な増殖因子などを含むEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫から分離された基質により構成されている。これらは、多くのhESC株の多分化能を支持することが報告されているが(非特許文献5:K G. Chen, et al., Cell Stem Cell. 2014 Jan 2; 14(1): 13-26.)、厳密な組成が明らかでなく、異種生物由来成分を含むものであるため、このような培養条件を用いた場合にはhPSCの臨床応用が妨げられる恐れがある。
また、MEFやマトリゲルを用いた場合は、ヒトに由来しないN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)などの免疫原性エピトープや、異種感染ウイルスのヒトへの伝播に関する懸念がある。
また、hPSCの多分化能の維持のためには、培地中に塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を添加することが必要であるが、bFGFは、高価で、また長期に安定に保存することが困難であり、そのことも、hPSCの工業的製造を妨げている。
FGFは、幹細胞の培養を安定して行なうために一般的に培地に添加されており、無血清培地においても重要性が高い成分の1つとなっている。しかしながら、培地中での安定性が低いことが知られており、細胞培養において高頻度の培地交換が要求される要因ともなっている。このことも、hPSCの工業的製造を妨げている。
その他、硫酸化ヒアルロン酸を用いて細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟を促進することができる培地及び培養方法が報告されている(特許文献5:特開2009-278873号公報)。そこでは、硫酸化度が、0.4又は1.0の硫酸化ヒアルロン酸が用いられており、硫酸化ヒアルロン酸とFGF-2とを組み合わせて添加することにより、細胞を活性化させ、神経細胞への分化・成熟を促進することができると記載されている。
本発明の一つの観点において、比較的高い硫化度の硫酸化ヒアルロン酸を用いることにより、フィーダー細胞を用いなくてもhPSCを未分化状態に維持した或いは多分化能を維持した状態で培養増殖させることができる。
本発明の別の一つの観点において、比較的高い硫化度の硫酸化ヒアルロン酸を用いることにより、抗体産生ハイブリドーマの培養において、抗体産生量を増加させることができる。
より具体的には本発明は以下の細胞培養方法及び細胞培養用基材を含むものである。
本発明は一つの観点において、比較的高い硫酸化度の硫酸化ヒアルロン酸(硫酸化度が、ヒアルロン酸2糖単位当たりの硫酸基数(以下、「硫酸化度(硫酸基数/2糖単位)」という表現を用いる場合がある)で、約1.3以上、好ましくは約1.5以上、より好ましくは、約2.0以上である硫酸化ヒアルロン酸)を用いることにより、支持細胞を用いなくてもhPSCを未分化状態に維持した或いは多分化能を維持した状態で培養増殖するための細胞培養方法を提供する。
本発明は別の観点において、比較的高い硫酸化度(硫酸化度(硫酸基数/2糖単位)が、約1.3以上、好ましくは約1.5以上、より好ましくは約2.0以上、さらに好ましくは約3.0以上)の硫酸化ヒアルロン酸を用いることにより、支持細胞及びbFGFを用いなくても、hPSCを未分化状態に維持した或いは多分化能を維持した状態で培養増殖するための細胞培養用方法を提供する。
本発明はまた別の観点において、支持細胞を用いない、場合により支持細胞に加えてさらにbFGFを用いないhPSCの培養において、hPSCを未分化状態に維持した或いは多分化能を維持した状態で培養増殖するための、比較的高い硫酸化度(硫酸化度(硫酸基数/2糖単位)が、約1.3以上、好ましくは約1.3~約3.0)の硫酸化ヒアルロン酸が、場合により細胞外マトリックスとともに、コートされた細胞培養用基材を提供する。
本発明はまた別の一つの観点において、上記の細胞培養用基材を用いた、hPSCの培養方法を提供する。
[1]硫酸化ヒアルロン酸が表面にコートされた細胞培養用基材。
[2]前記硫酸化ヒアルロン酸は、S含量にて約7%以上(好ましくは10%以上)の硫酸化度である硫酸化ヒアルロン酸である上記[1]に記載の細胞培養用基材。
[3]前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも約1.3以上の割合で導入されている上記[1]に記載の細胞培養用基材。
[4]前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して約1.3~約3.0の割合で導入されている、上記[3]に記載の細胞培養用基材。
[5]前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して3.0以上の割合で導入されている、上記[3]に記載の細胞培養用基材。
[6]多能性幹細胞の培養用基材であって、多能性幹細胞を未分化状態に維持するための培養に用いることを特徴とする上記[1]~[5]のいずれか一つに記載の細胞培養用基材。
[7]前記多能性幹細胞が、iPS細胞である上記[6]に記載の細胞培養用基材。
[8]前記硫酸化ヒアルロン酸が、細胞外マトリックス、たんぱく質又はポリマーとともに表面にコートされた上記[1]~[7]のいずれか一つに記載の細胞培養用基材。
[9]前記硫酸化ヒアルロン酸が、細胞外マトリックス、たんぱく質又はポリマー中に均一に分散された状態で存在することを特徴とする上記[8]に記載の細胞培養用基材。
[10]上記[1]~[9]のいずれか一つに記載の細胞培養用基材を含む細胞培養器具。
[11]上記[1]~[9]のいずれか一つに記載の細胞培養用基材を用いて、多能性幹細胞(好ましくは、ES細胞又はiPS細胞)を培養し、その分化能を維持することを特徴とする多能性幹細胞の培養方法。
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地を用いて、支持細胞を含まない培養条件にて細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、S含量にて約7%以上(好ましくは約10%以上、より好ましくは約13%以上、さらに好ましくは約14%以上)の硫酸化度である、
を含むことを特徴とする培養方法。
[13]多能性幹細胞(好ましくは、ES細胞又はiPS細胞)を培養する方法であって、以下の工程:
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地を用いて、支持細胞を含まない培養条件にて細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも約1.3以上(好ましくは約2.0以上、より好ましくは約2.5以上、さらに好ましくは約3.0以上、よりさらに好ましくは約3.5以上)の割合で導入されている、
を含むことを特徴とする培養方法。
[14]前記培養条件が、さらにbFGFを含まない培養条件である、上記[12]又は[13]に記載の培養方法。
[15]前記培養する工程が、細胞外マトリックス、たんぱく質又はポリマーが存在する状態で行われる、上記[12]~[14]のいずれか一つに記載の培養方法。
[16]前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である上記[12]~[15]のいずれか一つに記載の培養方法。
[17]抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを培養して抗体を産生する方法であって、以下の工程:
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、S含量にて7%以上(好ましくは10%以上、さらに好ましくは13%以上、より好ましくは14%以上)の硫酸化度である、
を含むことを特徴とする方法。
[18]抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを培養して抗体を産生する方法であって、以下の工程:
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも1.3以上(好ましくは2.0以上、より好ましくは2.5以上、さらに好ましくは3.0以上、よりさらに好ましくは3.5以上)の割合で導入されている硫酸化度である、
を含むことを特徴とする方法。
硫酸化の程度は「硫酸化度」として表される。本明細書中では、硫酸化度は、硫酸化ヒアルロン酸分子中の硫酸含量(S含量)(%)、或いは、構成単位である2糖単位における硫酸基の導入数(0~4)で表される。
硫酸含量(比濁法)は、Dogson-Priceの比濁法(Dogson, K. S. and Price, R.G., A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides, Biochem J. vol 84(1),106-110, 1962)により、硫酸カリウムを標準として測定できる。また、硫酸含量(重量法)は、JIS JB. 2.17.3 硫酸塩-重量法に準じた方法を用いて測定できる。硫酸化度はまた、導入される硫酸基の平均個数で表すこともできる。硫酸基は、2糖単位で、0~4個導入され得る。平均個数で表す場合は、硫酸化ヒアルロン酸の分子量をもとに、2糖単位における硫酸基の平均個数をS含量より算出できる。
本発明で用いる硫酸化ヒアルロン酸(以下、単に「硫酸化ヒアルロン酸」という場合がある)は、比較的高い硫酸化度を有するヒアルロン酸である。硫酸化ヒアルロン酸は、具体的な化合物としては、硫酸基数/2単糖として、1.0又はそれ以下の硫酸化度のヒアルロン酸が報告されている(例えば、特開2009-278873号公報参照)。本発明において用いる硫酸化ヒアルロン酸は、そのS含量は比濁法にて約7%以上であり、また、硫酸基数/2単糖は約1.3以上である。
本発明の培養方法に従い、支持細胞及びbFGFを用いずに多能性幹細胞の培養を行う場合に用いる硫酸化ヒアルロン酸とは、導入された硫酸基の平均個数は、約1.3以上、好ましくは約1.5以上、より好ましくは約2.0以上、さらに好ましくは約3.0以上である。
本発明の培養方法に従えば、支持細胞及びbFGFを用いずに、多能性幹細胞の培養を行うことができ、多能性幹細胞を、未分化状態を維持した或いは多分化能を維持した状態で培養できる。ただし、硫酸化ヒアルロン酸を含有しかつbFGFを含んだ培地での培養も本発明に含まれ、本発明の一部である。
また、上記の培養において、用いられる本発明の細胞培養用基材は、好ましくは細胞外マトリックスとともに上記硫酸化ヒアルロン酸がコートされた細胞培養用基材である。
硫酸化ヒアルロン酸がコートされた本発明の細胞培養用基材を用いて、支持細胞及びbFGFを用いないで、多能性幹細胞の培養を行うことができ、多能性幹細胞を、未分化状態を維持した或いは多分化能を維持した状態で培養できる。ただし、bFGFを含んだ培地での本発明の細胞培養用基材の使用も排除するものではなく、bFGFを添加した培地での培養に用いられる本発明の細胞培養用基材も本発明に含まれ、本発明の一部である。
本発明の培養方法に従い、抗体産生能をもつハイブリドーマの培養を行う場合に用いる硫酸化ヒアルロン酸とは、導入された硫酸基の平均個数は、約1.3以上、好ましくは約1.5以上、より好ましくは約2.5以上、さらに好ましくは約3.0以上、よりさらに好ましくは約3.5以上である。
このような基材となり得る材料は、これに制限されるものではないが、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、高密度ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート共重合体、ポリカーボネート、ポリエーテルサルフィン、MPCポリマーをあげることができる。
その他、細胞外マトリックス等の高分子物質ともに表面にコートされる場合は、細胞外マトリックス等の高分子物質の中に硫酸化ヒアルロン酸が保持された状態で基材表面に硫酸化ヒアルロン酸が保持されている状態も含まれる。
細胞の培養条件は、培養を目的とする細胞の種類、培養目的に応じ、適宜選択でき、そのような培養条件は、種々報告されているので、それを参考に行えばよい。
本発明の細胞培養方法又は細胞培養用基材を用いると、支持細胞(フィーダー細胞)を用いることなく多能性幹細胞の培養ができる。また、本発明の細胞培養用基材を用いて多能性幹細胞を培養する場合は、未分化状態を維持するために通常必要とされるbFGFの添加量を低減又は添加不要とすることができる。
つまり、本発明は、その一態様として、多能性幹細胞を、未分化な状態又は分化能を有する状態で、細胞の増殖を支持するための支持細胞層を用いずに、場合により支持細胞に加えてさらにbFGFを用いずに、安定かつ一貫して増殖させるための培養方法を提供するものである。
本発明に従って、抗体産生のための培養において用いることができる硫酸化ヒアルロン酸は、上記した比較的高い硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸、具体的には、S含量にて7%以上(好ましくは10%以上、さらに好ましくは13%以上、より好ましくは14%以上)の硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸、或いは、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも1.3以上(好ましくは2.0以上、より好ましくは2.5以上、さらに好ましくは3.0以上、よりさらに好ましくは3.5以上)の割合で導入されている硫酸化ヒアルロン酸であり、低分子量硫酸化ヒアルロン酸及び高分子量硫酸化ヒアルロン酸の何れも用いることができる。本発明の抗体の製造のための培養方法において、培地中に添加される硫酸化ヒアルロン酸の量は、用いる細胞、培養条件等により適宜選択することができるが、これに限定されないが、例えば、0.1~100μg/mL、好ましくは1~100μg/mLの濃度にて培地に添加される。培地は、特に制限されず、ハイブリドーマを用いた抗体産生において使用することができる何れの培地も用いることができるが、例えば、RPMI-1640培地、ダルベッコ改変イーグル培地、 Nutrient Mixture F-12 Ham、Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham、Iscove's Modified Dulbecco's Medium、GIT培地をあげることができる。また、抗体を産生するハイブリドーマの培養条件等は、自体公知の方法を適宜参考として行うことができる。
本発明はまた、本発明の細胞培養用基材を用いて、抗体の産生能力を有する細胞を培養する方法も含む。本発明の細胞培養用基材を用いて、抗体産生能力のある細胞を培養すると、抗体の産生量を顕著に増加させることができる。
よって、本発明は、他の一態様として、抗体産生細胞を培養して抗体を製造するための細胞培養方法と細胞培養用基材を提供するものである。
硫酸化ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸を硫酸化することにより調製した。ヒアルロン酸の硫酸化は、既知の硫酸化反応を用い、条件を適宜調整することにより、種々の硫酸化度のものを製造した。硫酸化に用いたヒアルロン酸は、分子量が10万のもの(以下、低分子量ヒアルロン酸という)及び60万のもの(以下、高分子量ヒアルロン酸という)を用いた。
硫酸化ヒアルロン酸の調製は、まず少量レベル(用いたヒアルロン酸量、1g)で、次いで、スケールアップしたレベル(用いたヒアルロン酸量、20g)で行った。
調製した硫酸化ヒアルロン酸について硫酸化度を確認した。結果を以下に示す。表1は、低分子量ヒアルロン酸を用いて調製した硫酸化ヒアルロン酸の硫化度を測定した結果であり、表2は、高分子量ヒアルロン酸を用いて調製した硫酸化ヒアルロン酸の硫化度を測定した結果である。「S含量(比濁法)」は、Dogson-Priceの比濁法により測定した結果であり、「S含量(重量法)」は、JIS JB. 2.17.3 硫酸塩-重量法に準じた方法を用いて測定した結果である。また、「硫酸化度」は、導入される硫酸基の数を、2糖単位当たりの平均個数で表したものである。
ヒトiPS細胞を、その未分化性を維持した状態で培養、増殖させるには、マウス由来の支持細胞上での培養、及び、培地へのbFGFの添加が必要である。この両者が無い状態での培養では、ヒトiPS細胞は速やかに分化する。よって、この両者の添加の必要性は、未分化性を維持したiPS細胞を大量に培養するための妨げとなっている。
そこで、実施例1で調製した高硫酸化ヒアルロン酸を培地に加えることにより、支持細胞やbFGFがない状態でもヒトiPS細胞が未分化性を維持して培養、増殖できるか検討した。
ヒトiPS細胞(hiPSC)として、MRC-hiPS_Fetch(細胞番号:NIHS0604)及びMRC-hiPS_Tic(細胞番号:JCRB1331)(いずれもExp.Cell Res.315(2009)2727-2740に記載、国立生育医療センターから入手)を使用した。各々の細胞を、10ng/mLの濃度でbFGF(和光純薬社製)を加えたiPSellon(Cell-Sight社製)中において、10μg/mLのマイトマイシン C(シグマ社製)で不活化したMEFs上で維持した。
上記hiPS細胞(hiPS#16及びhiPS#25)を、支持細胞とbFGFが無い状態で、10μg/mlの濃度になるように高硫酸化ヒアルロン酸(分子量10万)を添加したhiPS細胞用培地(DMEM/F-12 (Gibco)、20 % KnockOut Serum Replacement XenoFree (Thermo Fisher Scientific)、0.1 mM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fisher Scientific)、1 % Penicillin-Streptomycin(Thermo Fisher Scientific)、0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco)、2 mM L-Glutamine (Gibco))に加え、これを用いてマトリゲル(BD Bioscience)を処理した培養皿上で3日間培養した。3日後に、形成された未分化なhiPS細胞のコロニー数をカウントし定量的に解析した。結果を、図1に示す。他の条件と比べ、高硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地では、未分化なhiPS細胞のコロニー数が顕著に増加した。硫酸化ヒアルロン酸の有無のそれぞれの条件における形成されたコロニーの写真を図2に示す。Aは、支持細胞及びbFGFを加えず培養した場合の結果であり、Bは、支持細胞及びbFGFを加えないが、高硫酸化ヒアルロン酸を加えた場合の結果である。高硫酸化ヒアルロン酸を加えることにより、支持細胞及びbFGFが無くとも、hiPS細胞の未分化性が維持されていることが確認された。
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で培養したhiPS細胞について、未分化性維持に必須の転写因子(OCT4、KLF4、NANOG)の発現量を免疫ブロットにより測定することで、未分化性を確認した。結果を図3に示す。
培地中の高硫酸化ヒアルロン酸は、支持細胞やbFGFが無い状態でも未分化性維持転写因子の発現量を促進し、未分化性維持に寄与していることが示唆された。
硫酸化ヒアルロン酸を、細胞培養用の基材に接着させ、その接着量を評価した。
表面処理の異なる種々の細胞培養用の基材に、硫酸化ヒアルロン酸を接着させ、接着量を確認した。細胞培養用基材としては、BD(Becton Dickinson)社製 細胞培養処理シャーレ(35mm、ポリスチレン、真空ガスプラズマ処理による親水性処理)、BD社製 未処理シャーレ(35mm、ポリスチレン、疎水性表面)、BD NH2処理(6 well、ポリスチレン、アミノ基付加表面)、BD COOH(6 well、ポリスチレン、カルボキシル基付加表面)、IWAKI社製 細胞培養処理(6 well、ポリスチレン、親水性処理)、住友ベークライト社製 細胞培養処理(6 well、ポリスチレン、親水性処理)、住友ベークライト社製 未処理(6 well、ポリスチレン、疎水性表面)を用いた。硫酸化ヒアルロン酸は、低分子量の高硫酸化ヒアルロン酸を用いた。具体的には、硫酸化ヒアルロン酸をPBSバッファーに溶解し、37℃で1時間保温し、接着しなかった硫酸化ヒアルロン酸はPBSで洗浄した。硫酸化ヒアルロン酸の接着量は、DMMB法(Connect Tissue Res. 1982;9(4):247-8. A direct spectrophotometric microassay for sulfated glycosaminoglycans in cartilage cultures.Farndale RW, Sayers CA, Barrett AJ.)により評価した。結果を以下の表に示す。接着量は、面積当たり(9.6cm2)の硫酸化糖鎖接着量(μg)を示した。100μg/mL,10μg/mLはコート時の処理濃度である。u.d.は測定限界以下
SDA(NHS-Diazirine)を50mMの濃度で溶解し、アミノ基を有する培養シャーレに添加し、30分間室温で反応させ、シャーレ表面にDiazirineを結合させた。これに硫酸化糖鎖(コンドロイチン硫酸D)を添加しUV照射により基材表面に結合させた。その結果、硫酸化糖鎖の培養用基材(シャーレ)への共有結合による接着が確認できた。これにより、光反応性ジアリジン化合物を用いた方法で、BD NH2 6wellプレート等に対して硫酸化ヒアルロン酸を含む硫酸化糖鎖の結合が可能であることが判った。
硫酸化ヒアルロン酸に加えて細胞基質マトリックスをさらにコーティングした培養基材を作製し、それを用いた培養を検討した。
iPS細胞の培養に使用される基底膜マトリックス(マトリゲル(登録商標)、Corning社)と硫酸化ヒアルロン酸の混合コートを行った。硫酸化ヒアルロン酸は、低分子量(分子量10万)の硫酸化ヒアルロン酸を用いた。具体的には、以下のようにして、培養用基材へのコーティングを行った。マトリゲルを2.5%になるように細胞培養用培地DMEMで溶解し、そこに硫酸化ヒアルロン酸を2μg/ml、10μg/ml又は100μg/mlとなるように添加して混合し、次いで混合液を培養シャーレに加え、37℃、5% CO2条件下で1時間保温した、シャーレは使用まで凍結して保存し、使用前にマトリゲルを含む細胞培養用培地を抜き取り使用した。
作製した培養基材の表面の硫酸化ヒアルロン酸濃度を確認するために、DMMB法で硫酸化糖を定量した。結果、培養基材表面面積9cm2あたりの硫酸化ヒアルロン酸濃度は、コート添加量が2μg/ml、10μg/ml又は100μ/mlで、それぞれ、0.96μg、5.11μg、8.08μgであった。また、顕微鏡にて表面の状態を確認した結果、コート添加量が10μg/mlでは、硫酸化ヒアルロン酸がマトリゲル中に均一に分散していることが確認できた。
硫酸化ヒアルロン酸による抗体産生能の増強効果を確認した。
硫酸化ヒアルロン酸は、実施例1で調製した、低分子量の低硫酸化ヒアルロン酸(分子量10万)(HA-LS)、低分子量の高硫酸化ヒアルロン酸(分子量10万)(HA-HS)を用いた。比較例として、硫酸化されていないヒアルロン酸(HA)、デルマタン硫酸を用いた。
培地は、UltraDoma-PF培地(LONZA社から購入)を用い、ヒアルロン酸、低及び高硫酸化ヒアルロン酸、及びデルマタン硫酸を、それぞれ10μg/mlの濃度となるように添加した。
細胞は、IgGを産生するハイブリドーマであるGGR12株を用いた。
抗体産生を常法に従い行った。具体的には、ハイブリドーマを4x104cells/mlの濃度にて播種し、硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で3日間培養し、細胞数及び培養液中の抗体量を測定した。抗体量(抗体濃度)は、抗IgGポリクローナル抗体を用いて、サンドイッチELISAにより測定した。結果を図5に示す。
細胞数(細胞増殖)は、いずれの化合物を添加した培地で培養しても差がなかった。しかし、抗体産生量は、硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で有意に増加しており、高硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地では3倍以上に増加していた。
Claims (18)
- 多能性幹細胞の未分化状態を維持して培養するための細胞培養用基材であって、ヒアルロン酸の構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも1.3以上の割合で導入されている硫酸化ヒアルロン酸が表面にコートされた細胞培養用基材。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して3.0以上の割合で導入されている、請求項1に記載の細胞培養用基材。
- 前記多能性幹細胞が、iPS細胞である請求項1又は2に記載の細胞培養用基材。
- 前記多能性幹細胞が、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞である請求項1又は2に記載の細胞培養用基材。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸が、細胞外マトリックスとともに表面にコートされた請求項1~4のいずれか一つに記載の細胞培養用基材。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸が、細胞外マトリックス中に均一に分散された状態で存在することを特徴とする請求項5に記載の細胞培養用基材。
- 請求項1~6のいずれか一つに記載の細胞培養用基材を含む細胞培養器具。
- 請求項1~6のいずれか一つに記載の細胞培養用基材を用いて、多能性幹細胞を培養し、未分化状態を維持することを特徴とする多能性幹細胞の培養方法。
- 多能性幹細胞の未分化状態を維持して培養する方法であって、ヒアルロン酸の構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して1.3以上の割合で導入されている硫酸化ヒアルロン酸及び細胞外マトリックスを添加した培地にて、支持細胞を用いず、かつ、未分化状態維持因子を培地に添加しない培養条件にて細胞を培養することを特徴とする培養方法。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して3.0以上の割合で導入されている、請求項9に記載の培養方法。
- 前記未分化状態維持因子がbFGFである請求項9又は10に記載の培養方法。
- 前記多能性幹細胞が、iPS細胞である請求項9~11のいずれか一つに記載の培養方法。
- 前記多能性幹細胞が、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞である請求項9~11のいずれか一つに記載の培養方法。
- 前記硫酸化ヒアルロン酸が、10μg/mLの濃度にて培地に添加される請求項9~13のいずれか一つに記載の培養方法。
- 抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを培養して抗体を産生する方法であって、以下の工程:
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、S含量にて7%以上の硫酸化度である、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記硫酸化度が13%以上である請求項15に記載の方法。
- 抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを培養して抗体を産生する方法であって、以下の工程:
硫酸化ヒアルロン酸を添加した培地で細胞を培養する工程、ここで、前記硫酸化ヒアルロン酸は、構成単位である2糖単位に対して硫酸基が平均して少なくとも1.3以上の割合で導入されている硫酸化度である、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記硫酸化度が、硫酸基が平均して3.0以上の割合で導入されている請求項17に記載の方法。
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012147793A (ja) | 2008-03-17 | 2012-08-09 | Agency For Science Technology & Research | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア |
JP2012502664A (ja) | 2008-09-19 | 2012-02-02 | ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション | 多能性細胞の長期培養のためのペプチド提示表面 |
WO2013147264A1 (ja) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | 味の素株式会社 | 硫酸化化合物を含む幹細胞増殖用培地 |
JP2015534825A (ja) | 2012-11-08 | 2015-12-07 | インジェネロン インコーポレイテッド | 再生細胞の培養、保存、及び投与のための培地 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAGAHATA, Misao et al.,A novel function of N-cadherin and Connexin43: marked enhancement of alkaline phosphatase activity in rat calvarial osteoblast exposed to sulfated hyaluronan,Biochemical and Biophysical Research Communications,2004年,Vol.315, No.3,P.603-611 |
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