JP2012502664A - 多能性細胞の長期培養のためのペプチド提示表面 - Google Patents

Abstract

本発明はヘパリンのようなグリコサミノグリカンに結合するペプチドを提示する不溶性の支持体上で多能性細胞を増殖させ、維持する方法に関する。特に、１または２の疎水性アミノ酸残基により隔てられた塩基性アミノ酸残基を有する少なくとも１種のペプチドを提示する化学的に定義された表面を有する支持体上で多能性細胞を増殖させ、維持する方法に関する。

Description

発明の背景

関連する出願の参照
本出願は、２００８年９月１９日に出願された米国仮出願第６１／０９８，７０３号の優先権を主張するものであり、引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、助成金番号ＡＩ０５５２５８および１４４ＰＲＪ２１ＣＺの下に、国立衛生学研究所により授与された米国政府補助金により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
本発明は、一般には多能性細胞（pluripotent cell）の培養に関し、より具体的には、多能性細胞の長期の増殖および維持（すなわち、自己複製）のための化学的に定義された（すなわち、合成の）表面に関する。

胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性細胞は、他の種類の細胞と区別する目安となる少なくとも二つの特徴を有する。一つ目の特徴は、これらは自己複製を行い、従って分化することなく無限に増殖する能力を有することである。二つ目の特徴は、これらは三胚葉のすべて（すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞に分化できることである。引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、Evans M & Kaufman M, "Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos," Nature 292:154-156 (1981)を参照。

多能性細胞を用いた仕事における一つの困難は、動物性の製品またはバッチ毎に変化する傾向のある血清などの製品の使用を要求すること無く、これらの細胞が上記の特徴を保つための標準化された培養条件を開発することである。それゆえに、これらの細胞の培養の重要な側面は、それらを増殖させる培地だけでなく、その上でそれらを培養する表面でもある。

これらの細胞は前記の特徴を保つために表面に接着／付着することを要求するので、多能性細胞の培養のための表面がここで特に重要である。これらの細胞用培地のための構成成分を化学的に定義することについては多くの情報が入手可能であるにも関わらず、これらの生存および増殖のための表面の構成成分を化学的に定義することや細胞−支持体の付着に関しては情報がほとんどない。

当初、多能性細胞はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または他のフィーダー細胞を含むゼラチン被覆表面上で培養した。例えば、Amit M, et al., "Human feeder layers for human embryonic stem cells," Biol. Reprod. 68:2150-2156 (2003)；Lee J, et al., "Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition," Biol. Reprod. 72:42-49 (2005)；およびThomson J, et al., "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts," Science 282:1145-1147 (1998)を参照。しかし、多能性細胞はフィーダー細胞上では成長せず、代わりに、露出したゼラチン被覆表面を占める傾向があった。これらの細胞は増殖するにしたがって、成長するコロニーがＭＥＦを押し出す。例えば、Imreh M, et al., "Culture and expansion of the human embryonic stem cell line HS181, evaluated in a double-color system," Stem Cells Dev. 13:337-343 (2004)を参照。

多能性細胞がフィーダー細胞からの分泌因子の存在下でゼラチン被覆表面上で培養できると認識されると、フィーダー細胞層非存在下（つまり、フィーダーフリー）で細胞を培養することが可能になった。例えば、フィーダー細胞を培養した培地である「馴化培地」（ＣＭ）の使用により、フィーダー細胞層を避けることができる。しかし、ＣＭ中でゼラチン被覆表面上で多能性細胞を培養すると、細胞は細胞の迅速な分化を引き起こす。例えば、Xu C, et al., "Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells," Nat. Biotechnol. 19:971-974 (2001)を参照。

より最近では、培地のそれぞれの構成成分が完全に明らかにされ、かつ、特徴づけられた、化学的に定義された培地（つまり、完全培地）を用いることにより、フィーダー細胞層を避けることができることも認識された。それぞれ引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、Ludwig T, et al., "Feeder-independent culture of human embryonic stem cells," Nat. Methods 3:637-646 (2006)；およびLudwig T, et al., "Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions," Nat. Biotechnol. 24: 185-187 (2006)を参照。

しかし、好結果の多能性細胞の維持および増殖に対する表面付着の役割を見逃すべきではない。この点に関して、マトリゲル（Matrigel）（商標）などの商業的に製造される細胞外基質（ＥＣＭ）物質の使用によって、フィーダー細胞層を避けることができる。しかし、マトリゲル（商標）は、未決定の（つまり、不確定の）量のラミニン、コラーゲンおよびエンタクチンなどのマウス細胞外基質タンパク質を含んでいる。加えて、マトリゲル（商標）にはバッチ毎の変動が存在し、成長因子などの他の不明な成分が存在する。多能性細胞の培養に用いられる他のＥＣＭ物質としてはビトロネクチン、フィブロネクチンおよびラミニンが挙げられる。

多能性細胞のための化学的に定義された表面がこれまでに記載されている（例えば、Derda R, et al., "Defined substrates for human embryonic stem cell growth identified from surface arrays," ACS Chem. Biol. 2:347-355 (2007)；およびGerecht S, et al., "Hyaluronic acid hydrogel for controlled self-renewal and differentiation of human embryonic stem cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:11298-11303 (2007)を参照。）が、これらの表面は多能性細胞の長期の増殖および維持には効果的でないことが既に示されている。特に、数週間これらの表面上で増殖した細胞は未分化および分化細胞の不均質な細胞集団を形成し、互いに分離するのは挑戦的である。Bendall et al. "IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro." Nature (2007) 448:1015-1021 (2007)。加えて、これらの表面は典型的には動物またはヒト起源のＥＣＭタンパク質に頼っている。例えば、Amit M, et al., "Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells," Biol. Reprod. 70:837-845 (2004)；Braam S, et al., "Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self renewal via αVβ5 integrin," Stem Cells [Epub ahead of print, July 17, 2008]；および上記Xu et al.を参照。

したがって、化学的に定義された表面を有する不溶性支持体および多能性細胞の長期の増殖と維持を支持する多能性細胞のための培養条件が望まれている。

さらに、定義された支持体上で多能性細胞を分化させる方法や未分化多能性細胞から分化した細胞を分離する方法に対する強いニーズが存在する。

第一の側面では、本発明はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合するペプチドを提示する不溶性支持体として要約される。一つの態様では、支持体は、ペプチドがペプチド提示表面の約０．５％〜約１００％、約０．５％〜約５０％、約１％〜約５％、または約１％の面積を占め、一つ若しくは二つの疎水性アミノ酸残基により隔てられた正に荷電したアミノ酸残基または塩基性（つまり、親水性）のアミノ酸残基を含む、ＧＡＧ結合ペプチドを提示する化学的に定義された表面を有する。一つの態様では、ペプチドは表面の少なくとも３０％の面積を占める。このペプチドはＧＡＧ結合モチーフを含むことができ、合成ペプチドまたはより長いポリペプチドのＧＡＧ結合ペプチド部分とすることができる。好適なペプチドは、制限は無いが、長さにおいて少なくとも約３〜約３５アミノ酸の範囲とすることができる。好ましいペプチドは長さにおいて約７〜約１８アミノ酸の範囲とすることができる。４アミノ酸のＧＡＧ結合ペプチドが下記Frommによる論文に記載されている。化学的に定義された表面を有する支持体が多能性細胞の長期培養に適している。

第二の側面では、本発明は、一つ若しくは二つの疎水性アミノ酸残基により隔てられた正に荷電したアミノ酸残基または塩基性（つまり、親水性）アミノ酸残基を含むペプチドを提示する化学的に定義された表面を含む細胞培養容器として要約され、ここでペプチドは、ペプチド提示表面の約０．５％〜約２５％、約１％〜約５％、または約１％の面積を占める。培養容器は、有効量のキナーゼ阻害剤を含む化学的に定義された培地を含んでいても良い。

第三の側面では、本発明は多能性細胞を上記で定義した表面上で培養する工程を含む細胞培養法として要約される。

第四の側面では、本発明は多能性細胞を上記で定義した表面上で培養し、分化を誘導し、および未分化細胞から分化した細胞を分離する工程を含む、未分化細胞から分化した細胞を分離する方法として要約される。

第五の側面では、本発明は上記で定義したＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面、およびその表面に接着する多能性幹細胞を有する構成物として要約され、ここで細胞は正常な核型、多能性細胞特異的マーカー、およびその表面上での三ヶ月以上の培養後に三胚葉のすべてに分化する能力を示す。

いくつかの態様では、化学的に定義されたペプチド提示表面は、例えば、ｎが約３〜約５０であるＸ（ＣＨ_２）_ｎＳＨの構造を有する１以上の長鎖アルカンチオール（ＡＴ）を含む自己組織化単分子膜を含んでいてもよい。より好ましい態様では、ｎは約１１〜約１８である。

いくつかの態様では、ペプチドは、ビトロネクチン由来の（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）、フィブロネクチン由来の（GWQPPRARI；配列番号：２）、または骨シアロタンパク質由来の（FHRRIKA；配列番号：３）ヘパリン結合領域などのＧＡＧ結合ペプチド（ＧＢＰ）とすることができる。

いくつかの態様では、キナーゼ阻害剤は、Ｙ−２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジハイドロクロライド］、Ｈ−１１５２［（Ｓ）−（＋）−（２−メチル−５−イソキノリニル）スルホニルホモピペラジン］、およびＨＡ−１００［１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジンハイドロクロライド］などのＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤とすることができる。

化学的に定義された表面は多能性細胞の増殖および維持のために用いることができる。これらの表面上での長期（すなわち、＞３ヶ月）の培養後でも、多能性細胞は正常な核型、多能性細胞に特徴的な多能性細胞特異的マーカーおよび三胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてに分化する能力を維持する。加えて、これらの表面は、リガンド／エピトープの密度、位置および組成が管理された状態で、接着性リガンド／エピトープの組合せを提示することができる。これらの表面は、多能性細胞の潜在的に危険な汚染および／または動物性製品への暴露をも最小限にする。

本発明のこれらのおよび他の特色、目的並びに利点は下記の記載からより良く理解されるであろう。より好ましい態様の記載は、発明を制限し、または改変の方法、等価の方法および代替の方法のすべてをカバーすることを意図したものではない。それゆえに、発明の範囲を解釈するためには、特許請求の範囲を参照するべきである。

下記の詳細な記載が考慮されたとき、本発明はより良く理解できるであろうし、上記以外の特色、側面および利点が明らかになるであろう。そのような詳細な記載は下記の図を参照する。

図１は、混合自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）においてペプチド−ＡＴアレイ上にスポットされた様々なペプチドの、多能性細胞の増殖および維持に対する影響を示す。図１ａは、生理活性ペプチドを提示する代表的なアレイおよび混合ＳＡＭにおけるペプチド−ＡＴのパーセンテージとして報告される表面密度を示す。ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）はペプチド特異的かつペプチド密度依存的にその表面に結合した。６日間にわたり、細胞は増殖し、アレイ素子を埋めた（図１ｂ〜図１ｇ；Ｏｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４に対して染色され、ＤＡＰＩで対比染色されたアレイ上の細胞の高倍率像）。図１ｂはビトロネクチン由来のＧＢＰ（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。図１ｃは、フィブロネクチン由来のＧＢＰ（GWQPPRARI；配列番号：２）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。図１ｄは、骨シアロタンパク質由来のＧＢＰ（FHRRIKA；配列番号：３）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。図１ｅは、ＦＧＦ受容体結合ペプチド（GGGEVYVVAENQQGKSKA；配列番号：４）およびインテグリン結合ペプチド（KGRGDS；配列番号：５）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。図１ｆは、インテグリン結合ペプチド（KGRGDS；配列番号：５）およびフィブロネクチン由来の他の生理活性ペプチド（KPHSRN；配列番号：６）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。図１ｇは、ラミニン由来の生理活性ペプチド（GSDPGYIGSR；配列番号：７）を提示する表面上で増殖したｈＥＳＣを示す。 図２は、ＧＢＰが少なくとも数回の継代にわたり多能性細胞の自己複製を支持することを示す。図２ａは、溶解性ヘパリンは、マトリゲルまたはビトロネクチンで覆われた表面ではなく、ヘパリン結合ペプチドGKKQRFHRNRKGで覆われた表面へのｈＥＳＣの結合を取り消すことができることを示す。細胞の結合のパーセンテージは、ヘパリン非存在下に対する、ヘパリン存在下で播種された細胞から調製された細胞溶解産物の発光平均値の割合を表す。エラーバーは標準偏差を示す。図２ｂは、ＧＢＰまたはビトロネクチンＧＢＰ（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）およびインテグリン結合ペプチド（KGRGDS；配列番号：５）の組合せを提示するＳＡＭ上で、３回の継代培養の間、培養したｈＥＳＣが多能性細胞特異的なマーカー発現を維持した（分化マーカーとして役立つＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４；ＳＳＥＡ−１）ことを示す。しかし、インテグリン結合ＲＧＤペプチド（KGRGDS；配列番号：５）を単独で提示するＳＡＭ上で培養した細胞は、３回の継代培養の後に有意に低レベルの多能性細胞特異的マーカーを有した。細胞は、ＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面上よりもＲＧＤを提示する表面上で、はるかに遅く増殖した。 図３は、ビトロネクチンＧＢＰ（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）を提示する合成表面が３ヶ月の培養にわたりｈＥＳＣの多能性および核型安定性を支持することを示す。図３ａは、化学的に定義された表面上で３ヶ月間培養したｈＥＳＣが高レベルの多能性（pluripotency）のマーカーを維持したことを示す。エラーバーは１７回目の継代培養後の連続した３回の継代培養からの平均を表す。図３ｃは、ビトロネクチンＧＢＰ（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）上で約３ヶ月間培養したｈＥＳＣ（Ｈ９ｈＥＳＣ）が標準Ｇ分染法により決定された通り核型的に正常であったことを示す。 図４はヘパリン結合ペプチド配列の一覧表を示す。 図５は天然および合成支持体上で培養したｈＥＳＣの増殖特性を示す。

発明の具体的説明

本発明が様々な改変の方法や代替の方法の形態を許容する一方で、その典型的な態様が図において例示的に示され、本実施例中で詳細に記載される。しかし、典型的な態様の記載は、開示した特定の形態に発明を制限することを意図するものではなく、逆にその意図は特許請求の範囲により定義された発明の精神および範囲に入るすべての改変の方法、等価の方法および代替の方法をカバーすることであると理解されるべきである。

本発明は、多能性細胞が、ビトロネクチン由来のヘパリン結合ペプチド（GKKQRFRHRNRKG；配列番号：１）などのＧＢＰを認識し、これに接着する細胞表面受容体を有するという本発明者らの知見に関する。それゆえに、本発明者らは、ＧＢＰが、マトリゲル（商標）に存在するような多くの細胞外基質タンパク質の合成代替品として表面に提示されうると仮定した。

下記に記載された通り、ＧＢＰを提示する化学的に定義された表面を有する不溶性支持体は、６日の培養後にＯｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４の存在により評価されたように、多能性細胞の接着と自己複製の両方を支持した。特定のＧＢＰは細胞接着および拡散を促進することが知られているが、これまで多能性細胞の自己複製を支持することが示されたことはない。それぞれ引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、McCarthy J, et al., "RGD-independent cell adhesion to the carboxy-terminal heparin-binding fragment of fibronectin involves heparin-dependent and -independent activities," J. Cell Biol. 110:777-787 (1990)；およびVogel B, et al., "A novel integrin specificity exemplified by binding of the alpha v beta 5 integrin to the basic domain of the HIV Tat protein and vitronectin," J. Cell Biol. 121:461-468 (1993)を参照。

本明細書に記載された化学的に定義されたペプチド提示表面は、様々な状況および利用において有用である。例えば、この表面は、多能性細胞を未分化状態で維持するために用いることができる。加えて、この表面は未分化のまま多能性細胞の集団を増やすために用いることができる。化学的に定義されたペプチド提示表面は、例えば１以上の分化誘導剤を培地に加えることにより引き続き分化を誘導する、多能性細胞の培養にも有用である。多能性細胞に由来する分化した細胞は化学的に定義された表面上で維持することができる。

細胞型は、分化の途上で、全能性（totipotency）、多能性（pluripotency）および多分化能性（multipotency）などの様々なレベルの分化能を通り抜ける。本明細書では多能性細胞が特に興味深い。本明細書で用いられる「多能性細胞」とは三胚葉（例えば、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてに分化することができる細胞または細胞の集団を意味する。多能性細胞は様々な多能性細胞特異的マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１ではなく、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、またはＴｒａ−１−８１）を発現し、未分化細胞に特有な細胞形態（例えば、凝縮したコロニー、高い核／細胞質比率および目立った核小体）を有し、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入されると奇形種を形成する。上記のEvans & Kaufmanを参照。奇形種は典型的には三胚葉のすべてに特徴的な細胞または組織を含む。これらの特徴は本技術分野で通常用いられる分析法を用いて評価することができる。引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、Thomson J, et al., "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts," Science 282: 1145- 1147 (1998)を参照。

多能性細胞は細胞培養において増殖し、多分化能性を示し分化系列が制限された様々な細胞集団に向かって分化する能力を有する。多能性細胞は、多能性細胞に比べより分化しているが未だ終末分化はしていない体細胞である多分化能性細胞よりも高い分化能力を有す。

本明細書の使用に好適な多能性細胞としては、ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞が挙げられ、好ましくは霊長類、特にヒト霊長類由来である。本明細書で用いられる「胚性幹細胞」若しくは「ＥＳＣ」とは胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。上記のThomson et al.を参照。これらの細胞は、少なくともＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、またはＴＲＡ−１−８１を発現し、高い核／細胞質比率および目立った核小体を有する凝縮したコロニーとして現れる。ＥＳＣはＷｉＣｅｌｌ研究所（マジソン、ＷＩ）などの供給元から商業的に入手することができる。

本明細書で用いられる「誘導性多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」とは、その起源である分化した体細胞に関して異なっていることがあり、特定の一組の分化能力決定因子に関して異なっていることがあり、およびこれらを分離するために用いられる培養条件に関して異なっていることがあるにも関わらず、その起源である分化した体細胞と実質的に遺伝学的に同一であり、本明細書に記載されたＥＳＣなどの高い分化能を有する細胞と同様の特徴を示す多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、Yu J, et al., "Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells," Science 318:1917-1920 (2007)を参照。

ｉＰＳ細胞はＥＳＣと類似した形態学的特性（例えば、円形形状、大きな核小体および乏しい細胞質）および増殖特性（例えば、約１７〜１８時間の倍加時間）を示す。加えて、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１ではなく、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、またはＴｒａ−１−８１）を発現する。しかし、ｉＰＳ細胞は直接胚に由来するものではない。本明細書で用いられる「直接胚に由来するものではない」とは、ｉＰＳ細胞を製造するための出発細胞型が産後の個体から得られる体細胞などの多分化能性細胞または終末分化した細胞などの非多能性細胞（non-pluripotent cell）であることを意味する。

本明細書における使用に好適な他の型の多能性細胞としては、下記に限られないが、体細胞核移植からの細胞（例えば、Wilmut I, et al., "Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells," Nature 385:810-813(1997)を参照）または体細胞とＥＳＣとの融合からの細胞（例えば、Cowan C, et al., "Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells," Science 309:1369-1373 (2005)；およびYu et al., "Human embryonic stem cells reprogram myeloid precursors following cell-cell fusion," Stem Cells 24:168-176 (2006)を参照）が挙げられる。

用いられる多能性細胞に関わらず、本明細書に記載された化学的に定義された表面は、周知の方法に従って構築されうる。例えば、グリオキシリル官能基を付与したスライドグラス上へのペプチドのコンタクトスポッティング（例えば、Falsey J, et al., "Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays," Bioconjug. Chem. 12, 346-353 (2001)を参照）；アクリルアミド被覆スライドグラス上へのペプチドのコンタクトプリンティング；およびイン・サイチュー重合が続くスライドグラス上へのペプチドの組合せのスポッティング（例えば、Anderson et al., Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells, Nat. Biotechnol. 22:863 (2004)を参照）を用いることができる。加えて、ビオチン化した所望のペプチドで処理したストレプトアビジン被覆プレートまたは所望のペプチドに架橋したアクリルアミドゲルでさえも用いることができる。Klein et al., Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control, Meth. Enzymol. 426:155 (2007)を参照。同様に、水不溶性の合成または天然ハイドロゲルも、好適なペプチド提示表面を提供するものとして企図されている。

本明細書で用いられる「グリコサミノグリカン」（ＧＡＧ）は二糖類ユニットとアミノ糖の繰り返しから構成される多糖である。グリコサミノグリカンは負に荷電し、タンパク質と連結してプロテオグリカンを形成することができる。グリコサミノグリカンの例としては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸およびケラタン硫酸が挙げられる。

好ましくは、不活性な下地の上にＡＴをスポットして、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成する。それぞれ引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、例えば、Derda et al., supra; Derda R, et al., "Solid-phase synthesis of alkanethiols for the preparation of self-assembled monolayers," Langmuir 23:11164-11167 (2007)；およびHouseman B & Mrksich M, "Efficient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanethiols for the preparation of substrates that support the adhesion of cells," J. Org. Chem. 63:7552-7555 (1998)を参照。例えば、下地は細胞非親和性（すなわち、細胞をはじく）かつ溶媒非親和性（すなわち、溶媒をはじく）でありうるペルフルオロＡＴで形成することができる。まず、金被覆表面は、単分子膜内にアレイ素子のための領域（すなわち、孔）を残すか、または続く工程において単分子膜内にアレイ素子のための領域を作って、ペルフルオロＡＴで被覆することができる。その後、本明細書に記載されたＧＢＰなどのペプチドに連結したＡＴは、孔内の支持体に付着して単分子膜を完成することができ、多能性細胞の表面への付着のためのリガンドを提示することができる。ＧＢＰの表面密度はペプチド−ＡＴおよび非接着グルカミン−ＡＴとの混合ＳＡＭを用いて制御することができる。化学的に定義された表面アレイ上の両方の領域に対してＡＴ種を合成する方法は下記実施例中で提供される。金被覆カバーグラス上（アレイ素子と反対の）での長期培養のために、ペプチド−ＡＴおよびグルカミン−ＡＴ（５％ペプチド−ＡＴ）との混合単分子膜を形成した。２４時間後、その表面をエタノールで洗浄し、細胞を表面上に播種した。

各ＡＴ種は３つの重要な領域または部分を有すると考えることができる。一つの領域は基底端であり、その表面に単分子膜種を付着するための付着部である。この付着部は典型的にはチオール基であり、金の支持体に付着している。他の付着基は他の基質に付着できる。もう一つの領域は、中間領域であり、本願の他の箇所で記載された約３〜約５０の炭素長の、好ましくは約１１〜約１８の炭素長のアルカンなどのスペーサー部である。他の単純な有機基は、結果として生じる種が単分子膜中で自己組織化できる限りは、スペーサーのために用いることができる。最後に、単分子膜種の端の活性基はリガンドであり、細胞非親和性または細胞親和性であるように意図された基とすることができる。本明細書での使用に好適な細胞親和性リガンドとしては、下記に限られないが、ペプチド、特に、ビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）、フィブロネクチンＧＢＰ（配列番号：２）および骨シアロタンパク質ＧＢＰ（配列番号：３）のような、１または２の疎水性アミノ酸残基により隔てられた塩基性アミノ酸残基を有するペプチドが挙げられる。図５に示されるように、すべてのＧＢＰ配列が、１または２の疎水性アミノ酸残基により隔てられた塩基性アミノ酸残基を有するわけではない。実際に、本発明者らは、もしペプチドがグリコサミノグリカンに結合するならば、それは多能性幹細胞を自己複製させることができると予測する。

塩基性（すなわち、親水性）アミノ酸は極性であり、そのｐＫａ以下のｐＨ値では正に荷電する。塩基性アミノ酸の例としては、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンが挙げられる。

アミノ酸の疎水性親水性指数は側鎖の疎水性または親水性の特性を表す数値である。Kyte J & Doolittle R, "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein," J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)を参照。数値が大きくなるにつれ、アミノ酸はより疎水性になる。最も疎水性のアミノ酸はイソロイシン（４．５）およびバリン（４．２）である；一方で、最も親水性のアミノ酸はアルギニン（−４．５）およびリジン（−３．９）である。疎水性アミノ酸は（タンパク質の三次元形状に関して）内部にありがちであるが、一方で親水性アミノ酸はタンパク質の表面でより頻繁に見いだされるため、疎水性親水性（hydropathy）はタンパク質構造において重要である。

表１：２０種の天然アミノ酸の疎水性親水性指数（Kyte & Doolittle）

表２：疎水性親水性指数で昇順に並べられたアミノ酸

ＡＴを用いることの利点は、それらが再現性のあるＳＡＭおよび化学的に定義された表面を形成することである。この性質は、作られた表面がトポロジーなどの表面の他のバルクの性質ではなく、表面上に提示されたペプチドまたは追加のリガンドのために変化する化学的に定義された表面であることを意味する。ＡＴを用いることのもう一つの利点は、ペプチドまたは追加のリガンドを表面の定められた領域において多能性細胞に提示されるように設計することができること、および表面のその他の領域（すなわち、下地の領域）を溶媒および細胞の存在に耐えるように設計できることである。培養細胞のために以前構築された表面に対して、本明細書に記載された化学的に定義された表面の成分は、既知の分量ですべての構成要素を有することにより完全に特徴づけられている。

本明細書に記載された化学的に定義された表面上での多能性細胞の長期培養は典型的にはマトリゲル（商標）若しくはＭＥＦなどの表面からコンフルエントの多能性細胞を化学的に、酵素的にまたは機械的に塊／集合体または単一細胞へと乖離させることにより開始する。いくつかの事例では、例えばコンフルエントの細胞を新しい化学的に定義された表面上に播種するときに、表面は本明細書に記載した化学的に定義された表面の一つである。

その後、塊または集合体または単一細胞は、培地からのタンパク質のいかなる非特異的吸着をも最小限にするためにダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２またはｍＴｅＳＲまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）などの無タンパク質の基本培地において、本明細書に記載された化学的に定義された表面上に播種することができる。約１時間後、培地を、例えば、キナーゼ阻害剤を補ったｍＴｅＳＲ^ＴＭ１などの定義された培地で交換することができる。

本明細書で用いられる「化学的に定義された培地」または「定義された培地」とは、培地が既知の分量ですべての構成成分を有することを意味する。典型的には、細胞培養のために培地に通常加えられる血清は、例えば、既知の分量のアルブミン、インシュリン、トランスフェリン、およびおそらくは特異的成長因子（すなわち、塩基性線維芽細胞増殖因子、形質転換成長因子または血小板由来成長因子）などの血清成分により置き換えられる。定義された培地（ＤＭ）はそれゆえに無血清である。本明細書で用いられる「無血清」とは、培地が血清若しくは血清代用品を含まないこと、または本質的に血清若しくは血清代用品を含まないことを意味する。本明細書で用いられる「本質的」とは、最小のまたは低減した量の（すなわち、５％未満）の血清などの構成成分が存在してもよいことを意味する。

本明細書の使用に好適なＤＭの例はＴｅＳＲ^ＴＭである。ＴｅＳＲ^ＴＭの完全な構成成分および使用法は、Ludwig et al.に記載されている。それぞれ引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、Ludwig T, et al., "Feeder-independent culture of human embryonic stem cells," Nat. Methods 3:637-646 (2006)；およびLudwig T, et al., "Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions," Nat. Biotechnol. 24:185-187 (2006) を参照。本明細書の使用に好適なその他のＤＭの調合としては、例えば、ｍＴｅＳＲ^ＴＭ（ステムセルテクノロジーズ社；バンクーバ、ブリティッシュコロンビア、カナダ）、Ｘ−Ｖｉｖｏ（バイオウィッタカー社；ウォーカーズビル、ＭＤ）およびＳｔｅｍＰｒｏ（商標）（インビトロジェン社；カールスバッド、ＣＡ）などが挙げられる。

ＲＯＣＫ阻害剤などのキナーゼ阻害剤は単一細胞および細胞の小集合体を保護することが知られている。引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、米国特許出願公開番号第２００８／０１７１３８５；およびWatanabe K, et al., "A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells," Nat. Biotechnol. 25:681-686 (2007)を参照。ＲＯＣＫ阻害剤が化学的に定義された表面上での多能性細胞の生存率を有意に増加させることが下記に示されている。本明細書での使用に好適なＲＯＣＫ阻害剤は、下記に限定されないが、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジンジハイドロクロライド（通称：Ｈ−１１５２）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジンハイドロクロライド（通称：ＨＡ−１００）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（通称：Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（通称：イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリン−スルホンアミドジハイドロクロライド（通称：Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミドジハイドロクロライド（通称：Ｈ−９）、Ｎ−［２−ｐ−ブロモ−シンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミドジハイドロクロライド（通称：Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミドハイドロクロライド（通称：ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンジハイドロクロライド（通称：ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジンジハイドロクロライド（通称：グリシルＨ−１１５２）および（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジハイドロクロライド（通称：Ｙ−２７６３２）が挙げられる。キナーゼ阻害剤は細胞が生存し、表面に付着し続ける十分に高い濃度で提供することができる。約３μＭ〜約１０μＭの間の阻害剤濃度が適しうる。低い濃度では、またはＲＯＣＫ阻害剤が提供されないと、典型的には未分化細胞は剥がれ、一方で分化した細胞は定義された表面に付着し続ける。

本発明者らは、分化した細胞ではなく未分化細胞が化学的に定義された表面に付着するためにＲＯＣＫ阻害剤を必要とするという知見を利用して、未分化細胞から分化した細胞を分離した。例えば、多能性や多分化能性細胞はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で化学的に定義された表面上で維持することができる。所望のときに、例えば、１以上の分化誘導剤を細胞培地に加えることにより化学的に定義された表面上で細胞を分化誘導させることができる。代わりに、多能性細胞および非多能性細胞を化学的に定義された表面に直接播種することもできる。未分化細胞から分化した細胞を分離するために、ＲＯＣＫ阻害剤を培地から取り除くと、分化した細胞ではなく未分化細胞が付着した分化した細胞の集団を残して表面から剥がれる。

化学的に定義された表面上での培養中は、通常の細胞培養条件を用いることができる。例えば、温度は約３６℃〜約３７．５℃の間で様々であってよい。同様に、ＣＯ_２濃度も、培地および炭酸水素イオンの濃度に依存して約２％〜約１０％の間で様々であってよいし、様々であろう。例えば、恒湿器内では細胞培養条件を３７℃および５％ＣＯ_２とすることができる。多能性細胞をコンフルエントまで（典型的には約５日〜約６日）培養し、そのときに当該技術分野で周知の技術により（すなわち、化学的、酵素的または機械的手法により）継代することができる。

他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、発明の属する技術分野の通常の技能を有する者により一般に理解されるのと同様の意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と同様のまたは同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。

態様の記載および特許請求の範囲において、下記の専門用語が、下記に記載される定義と一致して用いられている。

本明細書で用いられる「約」とは記載された濃度範囲、密度、温度または時間枠の５％以内であることを意味する。

本明細書で用いられる「相同」とはこれらのポリペプチドが与えられたＧＢＰ（例えば、配列番号：１〜３）と少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有し、その結果、細胞表面を介して多能性細胞と結合することを言う。例えば、本明細書で取り上げられたＧＢＰと少なくとも９０％または少なくとも９５％同一なポリペプチドは、このペプチドと多能性細胞の外側表面上の分子との間の複合体の構成成分であると予想される。当業者であれば、ペプチドの改変には、置換、挿入（例えば、１０以下のアミノ酸の付加）および欠失（例えば、１０以下のアミノ酸の削除）が挙げられることが理解できる。これらの改変は構造や究極的には機能を損なうことなく、本明細書で取り上げられたポリペプチドに導入することができる。そのような改変を含むポリペプチドは、本明細書に記載された方法に用いることができる。

加えて、同じ保守的グループのアミノ酸は典型的にはタンパク質の機能に実質的に影響することなく他のアミノ酸と置換できることが本技術分野でよく知られている。本発明の目的のため、そのような保守的グループを表３に示すが、保守的グループは共有する特性に基づいている。

表３：アミノ酸の保守的置換

ビトロネクチン、フィブロネクチンおよび骨シアロタンパク質に対する遺伝子およびタンパク質配列が知られており、かつ、特徴づけられている。例えば、それぞれ、遺伝子識別（GeneID）番号７４４８、２３３５および３３８１を参照。上記遺伝子識別番号により定義されたすべての配列は、引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる。同様に、多能性幹細胞の自己複製を支持するために使うことのできる他のＧＡＧ結合分子についての情報が、例えば、引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、Fromm, J.R., et al., Pattern and Spacing of Basic Amino Acids in the Heparin Binding Sites, Arch. Biochem. Biophys. 343:92 (1997)に見いだされる。

記載されたそれぞれの文献は引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる。

本発明は、制限されることのない下記の実施例を考慮することで、より完全に理解されるであろう。

実施例１：ＧＢＰを提示する化学的に定義された表面上でのｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の培養と自己複製
方法：
細胞培養：Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４ ｈＥＳＣ（ＷｉＣｅｌｌ研究所）およびｉＰＳ細胞（ＤＦ１９−９およびＩＭＲ９０由来のｉＰＳ細胞）をマトリゲル（商標）被覆プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；フランクリンレイク、ＮＪから得たマトリゲル（商標））上で、ｍＴｅＳＲ^ＴＭ１培地を用いて維持した。細胞を３７℃かつ５％ＣＯ_２にて維持し、５〜６日毎に、５〜６分間の２ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（Dispase）（商標）（ギブコ社；ロックビル、ＭＤ）で処理した後に手動で継代した。

ｈＥＳＣを１０ｎｇ／ｍｌヘレグリン−β１（ペプロテック社；ロッキーヒル、ＮＪ）および５μＭ Ｙ−２７６３２（カルバイオケム社；サンディエゴ、ＣＡ）を補うこともあるｍＴｅＳＲ^ＴＭ培地において、金上のペプチド−ＡＴコンジュゲート（conjugates）のＳＡＭに継代した。ヘレグリンは初期の細胞生存率を適度に改善することが示されている。いくつかの表面にはビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）、フィブロネクチンＧＢＰ（配列番号：２）または骨シアロタンパク質（配列番号：３）のみのペプチド−ＡＴコンジュゲートを提示させた。代わりに、いくつかの表面にはインテグリン結合ペプチド（配列番号：５）、フィブロネクチンから由来する他の生理活性ペプチド（配列番号：６）、ＦＧＦ受容体結合ペプチド（配列番号：４）、ラミニン由来生理活性ペプチド（配列番号：７）、ＡＤＳＱＬＩＨＧＧＬＲＳまたはＭＨＲＭＰＳＦＬＰＴＴＬのみのペプチド−ＡＴコンジュゲートを提示させた。さらに、いくつかの表面には、インテグリン結合ペプチド（配列番号：５）およびＦＧＦ受容体結合ペプチド（配列番号：４）；インテグリン結合ペプチド（配列番号：５）およびビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）；インテグリン結合ペプチド（配列番号：５）およびフィブロネクチン由来の生理活性ペプチド（配列番号：６）；ならびにビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）およびＭＲＨＭＰＳＦＬＰＴＴＬの個々のペプチド−ＡＴコンジュゲートを提示させた。表面上のペプチドの密度は０．５％〜２５％で様々であった（図１参照）。

さらに、いくつかのｈＥＳＣはビオチン化ビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）で処理したストレプトアビジン被覆プレートまたはビトロネクチンＧＢＰ（配列番号：１）に架橋させたポリアクリルアミドゲルに継代した。

化学的に定義された表面またはそれに付着したペプチドの性質に関係なく、約５×１０^４細胞／ｍｌを、５〜７日毎に（すなわち、コンフルエントで）、酵素を含まない細胞剥離緩衝液（シグマ社；セントルイス、ＭＯ；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．０２％重量／体積のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））で１０〜１５分間処理した後に、新しい化学的に定義された表面に手動で継代した。３回の継代（約２１日）後に、細胞をフローサイトメトリー法により多能性細胞特異的マーカーで評価した。

細胞接着：ＧＢＰに結合したｈＥＳＣに対する可溶性ＧＡＧの効果を決定するために、ｈＥＳＣを可溶性ヘパリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）の存在下若しくは非存在下で、マトリゲル被覆表面、ビトロネクチン被覆表面またはヘパリン結合ペプチドＧＫＫＱＲＦＨＲＮＲＫＧ提示表面上に、ｈＥＳＣを播種した。１時間後、表面を洗浄し、細胞を溶解させた。細胞溶解産物を用いて、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（プロメガ社）を用いておおよその細胞数を決定した。ヘパリン非存在下に対する、ヘパリン存在下で播種された細胞の細胞溶解産物の平均発光の比率を、それぞれの表面に対して結合する細胞のパーセントとして表した。

ＧＢＰ結合にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が必要であるか否かを決定するために、マトリゲル上で培養したヒトＥＳＣ（Ｈ９）を、１０〜１５分間、酵素を含まないハンクス平衡塩細胞剥離緩衝液（シグマ社）を用いて剥離させた。細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ社）、または２ユニット／ｍＬコンドロイチナーゼＡＢＣ（シグマ社）若しくは５００μｇ／ｍＬヘパリンを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁した。ＧＡＧ分解酵素で処理した細胞を懸濁液の状態で３７℃で１時間インキュベートした。細胞懸濁液をマトリゲル被覆表面、組み換えビトロネクチン被覆表面（１０μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）、または５％表面密度のペプチドＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧ提示ＳＡＭ上に播種した。１時間後、表面をＰＢＳで３回洗浄し、細胞をＭ−ＰＥＲ緩衝液（サーモフィッシャーサイエンティフック社、ロックフォード、ＩＬ）で溶解した。細胞溶解物をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（プロメガ社）と混合し、ＡＴＰの存在に基づいて培養物中の生存細胞の数を決定した。発光を２０／２０^ｎルミノメーター（ターナーバイオシステムズ社、サニーベイルＣＡ）で計測した。

細胞増殖：ｈＥＳＣ（Ｈ９）を５μＭ ＲＯＣＫ阻害剤を補ったｍＴｅＳＲ培地において、マトリゲル、ビトロネクチン、ポリリジン、ＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧ、またはＫＲＧＤＳ上で２回の継代にわたり培養した。細胞数をそれぞれの時点で細胞計数キット−８（ドージンドーモレキュラーテクノロジーズ社、ロックビル、ＭＤ）を用いて算出した。

ｈＥＳＣの分化：３ヶ月以上の培養の後に、懸濁培養で、ポリ（２−ハイドロキシエチルメタクリレート）被覆フラスコ（グライナーバイオ−ワン社、モンロー、ＮＣ）内で、ｈＥＳＣに胚様体（ＥＢ）を形成させ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ギブコ社）、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ギブコ社）、１％可欠アミノ酸（ギブコ社）および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（ギブコ社）の培地において培養した。

顕微鏡検査および免疫染色：画像は、オリンパスＩＸ８１顕微鏡上に取り付けられたハママツ（ブリッジウォーター、ＮＪ）デジタルカメラで収集した。用いられた一次抗体は以下の通りであった：Ｏｃｔ−４（１：４００；Ｒ＆Ｄシステムズ社；ミネアポリス、ＭＮ）、ＳＳＥＡ−４（１：４００；サンタクルーズバイオテクノロジー社；サンタクルーズ、ＣＡ）、β−ＩＩＩチューブリン（１：３０００；Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ネスチン（１：３０００）、α−フェトプロテイン（１：２５０；シグマ社）、ＦｏｘＡ２（１：１００；Ｒ＆Ｄシステムズ社）、α−平滑筋アクチン（１：１０００；シグマ社）、および脂肪酸結合タンパク質４（１：２５０；Ｒ＆Ｄシステムズ社）。細胞は４％ホルムアルデヒドおよび０．１５％ピクリン酸を含むＰＢＳで２０分間３７℃にて固定し、その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで透過処理を行い、ブロッキングした。すべての抗体は、室温で１時間インキュベートしたβ−ＩＩＩチューブリン、ネスチンおよびα−平滑筋アクチンに対する抗体を除き、ブロッキング緩衝液において４℃で一晩インキュベートした。二次染色はブロッキング緩衝液に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８−および／または５９４−コンジュゲート抗体（１：１０００；インビトロジェン社）で行い、室温で１時間インキュベートした。細胞は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート（ＤＡＰＩ：インビトロジェン社）で対比染色した。画像の重ね合せはＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪはワールド・ワイド・ウェブ上で入手できるパブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラムである）を用いて生成した。ペプチドアレイモザイクはＡｎａｌｙＳＩＳ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（オリンパス社）を用いて生成した。

フローサイトメトリー法：ｈＥＳＣを、２％ニワトリ血清（ギブコ社）を含む０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにより剥離した。細胞表面マーカー染色は、アルカリフォスファターゼ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、Ｔｒａ１−６０（ＢＤバイオサイエンシズ社）、Ｔｒａ１−８１（ＢＤバイオサイエンシズ社）、ＳＳＥＡ−４（ＢＤバイオサイエンシズ社）、ＳＳＥＡ−３（ＢＤバイオサイエンシズ社）、ＳＳＥＡ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ社）に対する直接的にコンジュゲートした抗体で、２％ＢＳＡ（重量／体積）を含むＰＢＳ中で、４℃で３０分間行い、その後、室温にて２％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで３０分間の固定を行った。

細胞内マーカー染色のために、ｈＥＳＣを２％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温で３０分間固定した。Ｏｃｔ−４の染色のために、細胞をサポニン透過処理用緩衝液（ＳＰＢ；ＰＢＳ中０．１％サポニン、０．１％ＢＳＡ 重量／体積）で室温で３０分間透過処理を行い、その後、Ｏｃｔ−４ ＰＥ−コンジュゲート抗体で一晩インキュベートした。

Ｓｏｘ−２の染色のために、細胞を氷冷した９０％メタノールで透過処理を行い、ＳＰＢで洗浄し、Ｓｏｘ−２ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）コンジュゲート抗体で４℃で１時間インキュベートし、その後、ＳＰＢで２回洗浄した。

フローサイトメトリーデータをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭ（ＢＤバイオサイエンシズ社）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ツリースター社；アッシュランド、ＯＲ）を用いて分析した。陽性細胞のパーセンテージは実験の細胞を部分的に分化させたｈＥＳＣと比較することにより設定した。陽性および陰性集団のためのゲートは部分的に分化させたｈＥＳＣの二つのピークを分析することにより設定した。

Ｇ分染法核型決定：ヒトＥＳ細胞を下記のように回収した。エチジウムブロマイド（０．００１％最終濃度；サーモフィッシャーサイエンティフィック社、http://www.thermofisher.com、ウォルサム、ＭＡ）を活発に分裂する培養物（継代後３または４日目）に直接的に加え、その後、５％ＣＯ_２を伴う３７℃インキュベータ内で４０分間インキュベートした。コルセミド（２００ｎｇ／ｍｌ最終濃度；インビトロジェン社）を培養物に加え、追加で３０分間インキュベータに戻した。細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン社）で剥離し、遠心分離し、５ｍｌの０．０７５Ｍ ＫＣｌ低張液（インビトロジェン社）で再懸濁し、３７℃水浴にて１８〜２５分間インキュベートした。細胞懸濁液を２０滴の３：１メタノール−酢酸固定液（低水分メタノール、ＡＣＳプラス認証の酢酸；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で、室温で５分間前固定した。続く遠心分離（２００×ｇ、５分間）により、前固定溶液を除去し、固定液で置換し、室温で３０分間インキュベートした。固定液は少なくとも２回以上置換した。固定された細胞懸濁液を、ＣＤＳ−５サイトジェネティックスドライイングチャンバー（サーモトロン社、オーランド、ＭＩ、http://www.thermotron.com）内で、規定の温度および湿度条件下（２５℃／３３％湿度）でスライドグラス上に滴下した。これらの試料を、サーモブライトスタットスピン（アボット社）上で９０℃で１時間加熱し、Ｇ分染法のために中期伸展標本を「寝かせ」、室温まで冷却した。スライドを１×トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％、ＨＢＳＳ（インビトロジェン社）に希釈した）内に２５〜３０秒間浸し、その後、ＦＢＳ溶液（２％（ｖ／ｖ）、インビトロジェン社、ＨＢＳＳに希釈した）およびミリＱ水（ミリポア社）で短時間の洗浄を行った。染色体を、ガー（Ｇｕｒｒ）緩衝液（インビトロジェン社）に１：４で希釈したリーシュマン染色（０．２％（ｗ／ｖ）、シグマ社、メタノール（フィッシャー社）に溶解した）で９０秒間染色し、ミリＱ水（ミリポア社）で短時間の洗浄を２回行った。スライドを５０℃のホットプレート上で１５分間乾燥させ、サイトシール−６０封入液（リチャード−アランサイエンティフィック社、カラマズー、ＭＩ、http://www.rallansci.com）で封入した。Ｇ分染法分析は、少なくとも２０個の中期をランダムに選択して行った。選ばれた中期の各細胞内の染色体を計数し、染色体数の最頻値を求め、少なくとも８個を顕微鏡で分析し、そのうちの少なくとも４個を染色体図にした。中期の像を、オリンパスＢＸ４１顕微鏡（オリンパス、センターバレー、ＰＡ、http://www.olympusamerica.com）を用いてアプライドスペクトラルイメージング（ＡＳＩ社）アクイジションおよびバンドビューソフトウェア（ビスタ、ＣＡ、http://www.spectral-imaging.com）で取り込み、分析した。

定義された表面の製作：クロム（１ｎｍ）およびそれから金（２５ｎｍ）を、熱蒸着装置（デントンバキューム社；ムーアズタウン、ＮＪ）を用いて、ピラニア溶液で洗浄したカバーグラス（コーニングＮｏ１ １／２、２３ｍｍ四方）上に、蒸着させた。支持体を即座に無水エタノール中の１ｍＭフルオロ−ＡＴ溶液中に浸漬した。２４時間後、支持体をエタノールで完全にすすぎ、窒素流下で乾燥させた。フルオロ−ＡＴ ＳＡＭを有するカバーガラスに、石英フォトマスク（５００μｍまたは７００μｍ四方のアレイ、０．０６７石英−クロムマスク（フォトサイエンス社、トランス、ＣＡ））を通して、ＵＶ光（１ｋｗ−−Ｈｇ−Ｘｅリサーチアークランプ；スペクトラ−フィジックス社；スタンフォード、ＣＴ）を１時間照射した。照射された試料を無水エタノールおよび蒸留水を用いて数回繰り返し完全にすすぎ、窒素流下で乾燥させた。

むき出しの金の領域上へのＡＴ溶液のスポッティングは、２時間以内のフォトリソグラフィーで行った。スポッティングは、恒湿器内でＰ２−ピペットマン（ギルソン社；ミドルトン、ＷＩ）を用いて手動で行った。スポットされたアレイを恒湿器内で１２時間保存し、エタノール及び水で繰り返し洗浄し、完全に洗浄した。アレイのスポットの相互汚染を防ぐために、洗浄中は高い流速を用いた。

代わりに、２５０Åの金および１０Åのクロムで被覆されたスライドグラス（２２ｍｍ四方、０．１６ｍｍ厚）をＥＭＦコーポレーション社から購入した。アレイを上記の通り調製した。引用することによってその全体が本明細書の開示範囲とされる、Derda, R. et al., "Defined substrates for human embryonic stem cell growth identified from surface arrays," ACS Chem. Biol. 2, 347-355 (2007)。より大きい面積のペプチド−ＡＴ ＳＡＭが必要とされるときは、同じＳＡＭを提示するチップ全体を、２枚の金被覆スライド間にペプチド−ＡＴ／グルカミン−ＡＴを挟み込むことにより製作した。ＳＡＭは使用前に恒湿器内で２４時間で形成させた。

ペプチド−ＡＴ：ペプチドは、Ｐｉｏｎｅｅｒ^ＴＭペプチド合成システム（アプライドバイオシステムズ社；フォスターシティー、ＣＡ）上で、リンクアミドＡＭ樹脂上で、標準Ｆｍｏｃ化学を用いて合成した。ペプチド−ＡＴコンジュゲートは上記のHouseman & Mrksichと同様に調製した。要約すると、遊離Ｎ末端を有する保護ペプチドを含む樹脂を乾燥ＴＨＦ中で膨潤させ、化合物１，ＨＯＢｔおよび１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の各々の５倍過剰量をＴＨＦ中の樹脂懸濁液に加えた。樹脂を１２時間保温し、さらに３倍過剰量のＤＩＣおよびＨＯＢｔを加えた。３時間後、樹脂をカイザーテストで試験し（Kaiser E, et al., "Color test for detection of free terminal amino groups in solid-phase synthesis of peptides," Anal. Biochem. 34:595-598 (1970)）、ＤＭＦとジクロロメタンで洗浄し、真空減圧下で乾燥させた。ＴＦＡ／ＤＩＣ／ＥＤＴ／Ｈ_２Ｏ／フェノール（３６：１：１：１：１）で２時間開裂させ、エーテル沈殿を行った後に、コンジュゲートを分取ＨＰＬＣにより精製した。勾配を用いた（移動相Ａのパーセンテージ）：１００→０％ ２０分、０％ ３分、０→１００％ ３分。およそ１７分の保持時間のピークを収集した。精製した各資料をＬＣＭＳおよびＨ ＮＭＲにより分析した。Ｈ ＮＭＲにおけるＣＤ_３ＯＤ中のＡＴ−ペプチドの１，１，１−三重線δ２．４９ (t[111t], 2H, J=7.1 Hz, J_HD=1.0 Hz)の三重線の存在は、遊離チオール官能基を示す。遊離チオール官能基の隣が、メチレン水素のシグナルである（隣接したメチレンとカップリングした７ＮＺ、遊離チオール上の重水素とカップリングした１Ｈｚ）。

結果：
本発明者らは、配列番号１などのＧＢＰが単独でまたは他の接着ペプチドとの組合せで、提示の方法の代替方法を用いて多能性細胞の付着、増殖および維持を支持できるか否かを調べた。本明細書に記載された化学的に定義された表面は、優れた付着、自己複製およびコロニーの広がりを見せたが、ある程度の専門技術を必要とした。

Ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤であるＹ−２７６３２を補ったｍＴｅＳＲ培地において、ＧＢＰを提示する表面上で６日間増殖したｈＥＳＣ（Ｈ１およびＨ９）は高レベルのＯｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４の発現を維持した（図１）。グリコサミノグリカン分解コンドロイチンＡＢＣ酵素で処理した細胞はマトリゲルおよびビトロネクチンに接着する能力を維持したが、GKKQRFRHRNKGを提示する合成表面への接着の減少が見られた。同様に、可溶性ヘパリンも表面への結合に対してＧＡＧと競合して、接着を阻害した（図２ａ）。

様々なペプチド表面がｈＥＳＣの付着、増殖および維持を支持した。興味深いことに、ＧＢＰを提示するペプチド表面は、ビトロネクチンＧＢＰのように、細胞の付着および自己複製の双方を最も強く支持したが、このことは６日後のＯｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４の存在により判断された。特に、ＲＧＤペプチドおよびビトロネクチンＧＢＰの組合せが細胞の自己複製を支持したのに対して、ＲＧＤペプチドを介して結合するインテグリンは自己複製には必須ではなかった（図２参照）。

ＲＧＤ提示表面は、多能性幹細胞の増殖に対しては、より劣る支持体である。ＧＢＰ上で培養した細胞は、高い核細胞質比率を示し、高いレベルの多能性マーカーを維持し（図２ｂ）、未分化ｈＥＳ細胞に特徴的な堅く凝縮したコロニーの形態で増殖した。対照的に、ＲＧＤ提示表面上で増殖した細胞集団は、コロニーおよび個々の細胞の不均質な混合物の形態で増殖し、この集団においてはより少ない細胞が多能性マーカーを示した（図２ｂ）。一貫して、ＲＧＤ提示表面上で培養した細胞は様々な形態を示し、三胚葉のすべてに分化した。従って、ＲＧＤペプチド単独への付着は、自己複製を支持するには不十分であった。

配列番号１のペプチドを提示する定義された表面上で継続的に３ヶ月継代した後に、細胞をＯｃｔ−４およびＳＳＥＡ−４（図３ｂ参照）、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２などの多能性細胞特異的マーカーで評価したところ、これらは高いレベルで維持されていた。重要なことに、ＧＢＰ提示表面上で培養した細胞は未分化多能性細胞の均質な集団を形成し（図３ａ）、密集して凝縮したコロニー内で増殖した。対照的に、マトリゲル（商標）上で培養した細胞は不均質の細胞集団を形成した。多能性細胞に関連したマーカーの遺伝子発現レベルは、マトリゲル上で増殖した細胞とＧＢＰ提示表面上で増殖した細胞とで同等であったが、マトリゲル上で増殖した細胞は特定の多能性マーカーの細胞表面の発現を消失させた（図３ａ）。対照的にＧＢＰ提示表面上で増殖した細胞は、これらのマーカーの細胞表面での発現を維持した。さらに、ＧＢＰ提示表面上で増殖した細胞は、実験の過程にわたり核型的に正常なままであった（図３ｂ参照）。

ＧＢＰ提示表面は細胞分裂の促進においてはポリリジン被覆表面よりも優れている。標準的な支持体上で培養した多能性幹細胞の増殖特性を、合成ペプチドを提示する表面上で培養した細胞の増殖特性と比較した。２回の継代にわたり様々な表面上で培養したｈＥＳ細胞（Ｈ９およびＨ１３）およびベクターを含まないｉＰＳ細胞（ＤＦ１９−９）に対して、増殖曲線を作成した。マトリゲル被覆表面は、ビトロネクチン−およびＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧ−被覆表面と比較して、２４時間後に若干高いコロニー形成率を示し、ビトロネクチン−とＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧ−被覆表面は同等であった。合成ペプチドＫＲＧＤＳを提示する表面は最も低いコロニー形成率を示した（図５）。マトリゲル−被覆、ビトロネクチン−被覆およびＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧ−提示表面上で培養した細胞では、各継代後、細胞数の増加が観察された（図５）。

ヘパリン結合ペプチドＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧまたはＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧおよびＲＫＧＤＳの組合せを提示する合成表面上で培養した細胞は、マトリゲル上で培養した細胞と同等の数の細胞分裂を行ったが、このことは蛍光細胞染色により示された。対照的に、ビトロネクチン被覆表面およびＫＲＧＤＳ提示合成表面上で培養した細胞はより少ない回数の細胞分裂を行った。重要なことに、ＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＫＧ提示表面は細胞分裂の促進においてポリリジン被覆表面よりも優れている。

ＳＡＭに加えて、他の化学的に定義された表面も同様に多能性細胞の培養に適していた。例えば、ビオチン化された配列番号１のペプチドで処理されたストレプトアビジン被覆プレートは、配列番号１のペプチドがＳＡＭ上に提示されたときほどでは無かったが、細胞接着と増殖を支持した（データ省略）。興味深いことに、コロニーの広がりはＳＡＭ上での広がりよりも低かったが、目に見える細胞死の増加を伴わずにＲＯＣＫ阻害剤を除外することができ、このことから他のペプチド提示足場は培地にＲＯＣＫ阻害剤を必要としないことが示唆された。同様に、ポリアクリルアミドまたはカバーグラスにコンジュゲートしたＣＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧもＳＡＭと同等の細胞接着および増殖を支持した。これらの結果から、ＧＡＧ結合ペプチドを提示する様々な支持体が多能性細胞の細胞接着および増殖を維持できることが示された。

化学的に定義されたペプチド提示表面上で培養した多能性細胞は、自己複製能だけではなく、三胚葉由来の細胞へと分化する能力も保持していた。配列番号１のペプチドを提示する化学的に定義された表面上での３ヶ月間の培養の後に、細胞は続いて浮遊培養中でＥＢを形成した。浮遊培養での２週間の後に、不均質な細胞の集団が三胚葉のすべてのマーカーで染まり、外胚葉の派生物であることを示すβ−ＩＩＩチューブリンおよびネスチンで陽性に染まった。加えて、いくつかの細胞は、中胚葉の派生物であることを示す脂肪酸結合タンパク質４およびα−平滑筋アクチンで陽性に染まった。最後に、いくつかの細胞は、内胚葉の派生物であることを示すα−フェトプロテインおよびＦｏｘＡ２で陽性に染まった。同様の結果が、合成支持体上で１ヶ月間（６回の継代）培養した様々なｈＥＳＣ株（例えばＨ１、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１３）を用いて観察された。

実施例２：ＧＢＰを提示する化学的に定義された表面上で培養した非多能性細胞からの多能性細胞の分離
方法：
ＧＢＰ提示表面は本質的に実施例１に記載される通りに作成した。多能性細胞は本質的に実施例１に記載される通りに培養した。

細胞接着に対するＲＯＣＫ阻害剤の効果：未分化ｈＥＳＣ（Ｏｃｔ−４陽性）および胚様体から由来する分化した細胞（Ｏｃｔ−４陰性）の混合物をＧＢＰ ＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧおよびインテグリン結合ペプチドＫＲＧＤＳを提示する自己組織化単分子膜上に植え付けた。いくつかの実験では、細胞をＣＧＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧペプチドを提示するポリアクリルアミドまたはカバーグラス上に植え付けた。細胞を５μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ培地中で２４時間増殖させ、その後、更なる２４時間培養のためにＲＯＣＫ阻害剤無しのｍＴｅＳＲ培地に交換した。細胞を固定し、Ｏｃｔ−４で染色し、ファロイジンおよびＤＡＰＩで対比染色した。いくつかの事例では、細胞をＲＯＣＫ阻害剤無しで表面に加えた。

結果：
実施例１に記載されるように、ＲＯＣＫ阻害剤存在下でＧＢＰを提示する表面上で培養した多能性細胞は、高いレベルの多能性細胞特異的マーカーを維持した（図２ｂ）。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の除去後、かなりの数の未分化細胞の剥離が観察された。対照的に、分化した細胞はＲＯＣＫ阻害剤の除去後も接着および生存したままであった。従って、培地からのＲＯＣＫ阻害剤の除去により、未分化の潜在的に奇形種を形成する細胞は、分化した細胞集団を残して、選択的に剥離した。細胞をＲＯＣＫ阻害剤無しの表面に加えると、いくつかの細胞は表面に接着したが、これらの細胞はほとんどＯｃｔ−４陽性の未分化細胞ではなかった。

要約すれば、本明細書に記載された実施例により単一型のペプチドしか有さない化学的に定義されたペプチド提示表面でも、多能性細胞の日常の培養および自己複製に用いることができることが示された。特に、本明細書に記載されたペプチドを提示するＳＡＭは、接着、自己複製およびコロニー拡大を提供した。

本発明は、現在、最も実用的で好ましい態様であると考えられることに関連して記載されている。しかし、本発明は例示のために示されているのであって、開示した態様に限定することを意図したものではない。従って、当業者は本発明が全ての改変および代替の手法が、特許請求の範囲に記載された発明の精神および範囲に含まれるように意図されていると理解するであろう。

Claims (19)

1. 多能性細胞の培養方法であって、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含んでなる化学的に定義された培地において、ＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面を有する不溶性の支持体上で多能性細胞を培養する工程を含んでなる、方法。
2. 表面が化学的に定義されたものである、請求項１に記載の方法。
3. ペプチドが１または２の疎水性アミノ酸残基により隔てられた塩基性アミノ酸残基を有する、請求項１に記載の方法。
4. 多能性細胞が胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から選ばれる、請求項１に記載の方法。
5. 多能性細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
6. ペプチド提示表面がＸ（ＣＨ_２）_ｎＳＨの構造を有するアルカンチオールを含んでなる、請求項１に記載の方法。
7. ｎが約３〜約５０である、請求項６に記載の方法。
8. ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３および図４において定義されたいずれかのペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. ペプチドが表面の約０．５％〜約１００％、表面の約０．５％〜約５０％、または、好ましくは表面の少なくとも３０％の面積を占める、請求項１に記載の方法。
10. ＲＯＣＫ阻害剤が（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジハイドロクロライド（Ｙ２７６３２）である、請求項１に記載の方法。
11. 非多能性細胞から多能性細胞を分離する方法であって、
    ＲＯＣＫ阻害剤を含んでなる化学的に定義された培地において、ＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面を有する不溶性の支持体上で多能性細胞および非多能性幹細胞を培養する工程と、
    多能性細胞が支持体から分離するまで培地からＲＯＣＫ阻害剤を除去する工程と
    を含んでなる、方法。
12. ＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面を有する不溶性の支持体と、表面に接着している多能性細胞であって、多能性細胞特異的マーカーを示し、かつ、表面への接着の３ヶ月以上後に三胚葉のすべてに分化する能力を示す細胞とを含んでなる組成物。
13. ＧＡＧ結合ペプチドを提示する表面を有する不溶性の支持体と、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を含んでなる化学的に定義された培地とを含んでなる、培養容器。
14. 表面が化学的に定義されたものである、請求項１３に記載の培養容器。
15. ペプチドが１または２の疎水性アミノ酸残基により隔てられた塩基性アミノ酸残基を有する、請求項１３に記載の培養容器。
16. ペプチドが表面の約０．５％〜約２５％の面積を占める、請求項１３に記載の培養容器。
17. 表面がＸ（ＣＨ_２）_ｎＳＨの構造を有するアルカンチオールを含んでなる、請求項１３に記載の培養容器。
18. ｎが約３〜約５０である、請求項１７に記載の培養容器。
19. ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３および図４において定義されたいずれかのペプチドからなる群から選択される、請求項１３に記載の培養容器。