CN101605885B - 能够使多能干细胞增殖的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及开发用于在体外培养处于未分化状态的干细胞的组合物(例如细胞外基质)以及使用该组合物的方法。在这方面,已经发现,当在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)、或层粘连蛋白-5(层粘连蛋白-322)、或者它们的功能结构域的板上培养多能的鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞时,所述胚胎干细胞增殖并保持它们的多能性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年1月4日提交的序列号为No.60/883,406的美国临时申请的优先权,在此将其全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
在诸多示例性实施方案中,本公开总体上涉及能够在体外使多能或未分化的干细胞粘附、增殖以及保持自我更新的组合物和方法。这些干细胞包括胚胎干细胞(例如鼠胚胎干细胞或人胚胎干细胞)和骨髓干细胞。
干细胞是一种未分化的细胞,由该细胞随后衍生出特化细胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力并具有分化为所有三种胚层细胞的多能性潜能。它们可用于治疗目的,并且可为组织移植治疗、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源(Skottman,H.,Dilber,M.S.和Hovatta,O.(2006);The derivation ofclinical-grade human embryonic stem cell lines;FEBS Lett 580,2875-2878)。
在白血病抑制因子(LIF)的存在下,鼠多能胚胎细胞能够在体外细胞培养条件下保持多能状态(Williams RL,Hilton DJ,Pease S,Willson TA,Stewart CL,Gearing DP,Wagner EF,Metcalf D,NicolaNA,Gough NM(1988);Myeloid leukemia inhibitory factor maintainsthe developmental potential of embryonic stem cells,Nature 1988 Dec15;336(6200):684-7)。
此外,当在作为饲养细胞的鼠胚胎成纤维细胞中培养时,鼠多能胚胎细胞能够在体外保持多能状态。当在MatrigelTM中培养时,人胚胎细胞也需要饲养细胞以在体外保持多能状态或者需要分化抑制剂(例如Noggin)和/或高剂量的碱性成纤维细胞生长因子(FGF)(参见综述:Skottman,H.,Dilber,M.S.和Hovatta,O.(2006);Thederivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines;FEB SLett 580,2875-2878)。然而,使用饲养细胞存在许多缺点。例如:饲养细胞可能含有病原体(例如能够感染干细胞的病毒)(Hovatta,O.和Skottman,H.(2005);Feeder-free derivation of human embryonicstem-cell lines;Lancet 365,1601-1603;Skottman,H.,Dilber,M.S.和Hovatta,O.(2006);The derivation of clinical-grade human embryonicstem cell lines;FEBS Lett 580,2875-2878)。
支持人胚胎干细胞自我更新的不含饲养细胞的体系需要下列物质作为粘附底质:i)MatrigelTM(Richards,M.,Fong,C.Y.,Chan,W.K.,Wong,P.C和Bongso,A.(2002);Human feeders support prolongedundifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stemcells;Nat Biotechnol 20,933-936);(Xu,C.,Inokuma,M.S.,Denham,J.,Golds,K.,Kundu,P.,Gold,J.D.和Carpenter,M.K.(2001);Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells;Nat Biotechnol 19,971-974);(Xu,R.H.,Peck,R.M.,Li,D.S.,Feng,X.,Ludwig,T.和Thomson,J.A.(2005);Basic FGF and suppression ofBMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells;Nat Methods 2,185-190);或者ii)鼠饲养细胞衍生的细胞外基质(Klimanskaya,I.,Chung,Y.,Meisner,L.,Johnson,J.,West,M.D.和Lanza,R.(2005);Human embryonic stem cells derived without feedercells;Lancet 365,1636-1641)。然而,这些包被为异体来源,因而根据FDA的规定不能用于临床(Hovatta,O.和Skottman,H.(2005);Feeder-free derivation of human embryonic stem-cell lines;Lancet 365,1601-1603)。这些包被也不满足体系明确和无免疫原性的标准,其重要性在(Hovatta,O.和Skottman,H.(2005);Feeder-free derivation ofhuman embryonic stem-cell lines;Lancet 365,1601-1603;Skottman,H.,Dilber,M.S.和Hovatta,O.(2006);The derivation of clinical-gradehuman embryonic stem cell lines;FEBS Lett 580,2875-2878)中有所讨论。
在哺乳动物胚胎发育期间,受精卵首先分裂成二个细胞,随后进行另一次细胞复制以产生四细胞胚胎。在四细胞阶段,在细胞膜蛋白以及新的连接组织(细胞外基质)分子的作用下,胚胎细胞连接在一起。首先出现的细胞外基质分子是基底膜蛋白,例如层粘连蛋白和蛋白聚糖(Cooper,A.R.和MacQueen,H.A.(1983);Subunits oflaminin are differentially synthesized in mouse eggs and early embryos;Dev Bioi 96,467-471)(Dziadek,M.和Timpl,R.(1985);Expression ofnidogen and laminin in basement membranes during mouseembryogenesis and in teratocarcinoma cells;Dev Biol 111,372-382)。随后,胚胎细胞开始分化为三种生殖细胞层(外胚层、内胚层和中胚层)并开始形态发生。细胞外基质分子(例如层粘连蛋白)负责与细胞表面受体的相互作用,因此对诸如粘附、增殖、迁移、以及分化等细胞行为进行调节(Colognato,H.和Yurchenco,P.D.(2000);Form and function:the laminin family of heterotrimers;Dev Dyn 218,213-234),而其它细胞外基质组分(例如I、II、III或IV型胶原蛋白)主要起机械支持的作用(Aumailley,M.和Gayraud,B.(1998);Structure and biological activity of the extracellular matrix;J MoI Med76,253-265)。
源自鼠成纤维细胞的细胞外基质与可溶性分化抑制剂结合可能足以替代饲养细胞(Klimanskaya,I.,Chung,Y.,Meisner,L.,Johnson,J.,West,M.D.和Lanza,R.(2005);Human embryonic stem cellsderived without feeder cells;Lancet 365,1636-1641),这显示了细胞外基质分子的重要功能。层粘连蛋白是大的三聚体细胞外基质蛋白,其由α、β和γ链构成。已经发现,在鼠和人的组织中存在5种不同的α链、3种β链和3种γ链的至少15种不同的组合(Colognato,H.,and Yurchenco,P.D.(2000);Form and function:the laminin family ofheterotrimers;Dev Dyn 218,213-234);(Aumailley,M.,Bruckner-Tuderman,L.,Carter,W.G.,Deutzmann,R.,Edgar,D.,Ekblom,P.,Engel,J.,Engvall,E.,Hohenester,E.,Jones,J.C.,et al.(2005);A simplified laminin nomenclature;Matrix Biol 24,326-332)。基于它们的历史性发现,这些分子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15,但是一种可选择的命名法根据它们的链的组成来描述这些同等型(isoform),例如,层粘连蛋白-111(层粘连蛋白-1)含有α-1、β-1和γ-1链(层粘连蛋白命名法:(Aumailley,M.,Bruckner-Tuderman,L.,Carter,W.G.,Deutzmann,R.,Edgar,D.,Ekblom,P.,Engel,J.,Engvall,E.,Hohenester,E.,Jones,J.C.,et al.(2005);A simplifiedlaminin nomenclature;Matrix Biol 24,326-332))。
尽管如此,仍需要提供用于胚胎干细胞的培养和生长的组合物和方法。在这方面,在不使用分化抑制剂(例如LIF)或饲养细胞的情况下,提供能够在体外使多能干细胞增殖和存活的组合物和方法将是有益的。
发明概述
本公开涉及开发用于在体外培养处于未分化状态的干细胞的组合物(例如细胞外基质)以及使用该组合物的方法。优选地,所述干细胞为胚胎干细胞,例如鼠或人胚胎干细胞。但是,本公开还包括使用骨髓干细胞。
已经发现,某些层粘连蛋白提供了用于使未分化的鼠和人胚胎干细胞在体外生长和增殖的确定和合适的细胞外基质。这不存在任何饲养细胞和/或分化抑制剂。例如,已经发现,当在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)或层粘连蛋白-5(层粘连蛋白-322)的板上培养多能鼠胚胎干细胞时,即使在不存在分化抑制剂的情况下,该胚胎干细胞也会增殖并保持它们的多能性。
还发现:当在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)的板上、在化学成分确定的培养基(例如mTeSR1的类似物)中培养多能人胚胎干细胞时,即使在不存在分化抑制剂的情况下,该细胞也能够增殖并保持它们的多能性。
下面将更详细地讨论本公开的这些以及其它的非限定性特征。
附图简要说明
下面是附图的简要说明,其目的是用于解释在此公开的示例性实施方案,而不是用于限制。
图1a是示出了鼠胚胎干细胞在层粘连蛋白(LN)、MatrigelTM(MG)、明胶(GEL)和多聚-D-赖氨酸(PL)中增殖的图。细胞在LN-332和LN-511上扩展了至少达169天,期间细胞数目发生了约150次加倍。相反的是,细胞在LN-111、LN-411、明胶或多聚-D-赖氨酸上没有自我更新。图1b是示出了图1a中1-20天的扩增情况的图,其示出了细胞在LN-111、LN-411、MatrigelTM和明胶上增殖至一定的极限,但是增殖在1-2周内停止。细胞与多聚-D-赖氨酸的粘附较差。
图2是显示鼠胚胎干细胞中的多能标志物(Sox2、Oct4)、增殖标志物(Tert)和分化标志物(α-胎蛋白、brachyury、巢蛋白和波形蛋白)的表达情况的RT-PCR照片,其中,在不存在任何分化因子或分化抑制剂的情况下,所述鼠胚胎干细胞在层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-312、层粘连蛋白-411、层粘连蛋白-511、MatrigelTM、明胶和多聚-D-赖氨酸上培养长达145天。
图3a-3d涉及一系列的彩色显微照片(免疫荧光(×40)),其证明了鼠胚胎干细胞在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上的自我更新的效果。图3a涉及对多能标志物Oct4和Sox2进行免疫荧光染色的显微照片。在LIF(对照+LIF)存在的条件下培养的胚胎干细胞表达多能标志物Oct4和Sox2(对照)。在不存在LIF或任何其它的分化抑制剂的情况下,经过在层粘连蛋白-332或层粘连蛋白-511上培养169天之后,胚胎干细胞继续表达Oct4和Sox2。值得注意的是,在层粘连蛋白-111或MatrigelTM上仅培养11天之后,胚胎干细胞停止表达Oct4和Sox2。图3b涉及显微照片,其显示出对多能标志物Nanog进行免疫荧光染色的类似的数据。图3c显示了对多能标志物UTF1进行免疫荧光染色的类似的数据。图3d涉及对多能标志物Oct4和分化标志物胶原蛋白IV进行免疫荧光染色的显微照片。
图4是一系列的彩色显微照片(免疫荧光(×40)),其证明了在不存在LIF或任何其它的分化抑制剂的情况下,在层粘连蛋白-511上培养的鼠胚胎干细胞保持多能的机理。在不存在分化抑制剂的情况下,胚胎干细胞在层粘连蛋白-511上培养80天,并以180个细胞/mm2的细胞密度铺板。按照如下的时间间隔拍摄显微照片:1小时、3小时、1天、2天和3天。多能标志物Sox2在前2天中以相同的水平表达。胚胎干细胞并不相互接触,而仅仅与层粘连蛋白-511接触。
图5a是示出了多能鼠胚胎干细胞与不同的包被表面(层粘连蛋白-111(LN-111)、层粘连蛋白-332(LN-332)、层粘连蛋白-411(LN-411)、层粘连蛋白-511(LN-511)、Matrigel(MG)、明胶(GEL)和多聚-D-赖氨酸(PL))粘附的图。数值以被粘附的细胞的百分比±标准偏差(STD)的形式示出。图5b是示出了粘附到不同的包被表面上的多能ESC的扩展情况的图。粘附到某一包被上的细胞的面积以扩展效率的测量值的形式计算。该面积以平均相对面积±标准偏差(STD)的形式表示。图5c是一系列的4张显微照片,其显示了孵育1小时后粘附至不同的层粘连蛋白上的胚胎干细胞。结晶紫染色,放大倍数(×5/×40)。如图所示,不同于层粘连蛋白-111或层粘连蛋白-411,层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511与胚胎干细胞具有高度的粘附性。
图6是源自鼠胚胎干细胞的嵌合鼠的照片,所述鼠胚胎干细胞在不存在饲养细胞以及任何的分化抑制剂的情况下在层粘连蛋白-511上培养3个月。
图7是人胚胎干细胞的显微照片(相差显微照片),所述人胚胎干细胞在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)的板上在化学成分确定的培养基中经过105天的无饲养细胞的培养。
图8是RT-PCR照片,其显示了多能标志物(Oct4、Nanog)、内部对照物(GAPDH)和分化标志物(α-胎蛋白、brachyury、Sox1和Pax6)在人胚胎干细胞中的表达情况,所述人胚胎干细胞分别在层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)上在化学成分确定的培养基中培养105天(LN-511,20次传代)以及在人包皮成纤维细胞(对照)上在传统的培养基中培养。在此,hGADPH、hOct4、hNanog、hBrach、hAFP、hSox1、以及hPax6分别代表GAPDH、Oct4、Nanog、brachyury、α-胎蛋白、Sox1、以及Pax6。
图9包含一系列的彩色显微照片(免疫荧光),其证实了人胚胎干细胞在层粘连蛋白-511上的自我更新效果。在层粘连蛋白-511上在化学成分确定的培养基中培养105天(20次传代)后,人胚胎干细胞继续表达多能标志物Oct4(绿色)和Sox2(红色)(LN-511,20次传代)。在人包皮成纤维细胞上在传统的培养基中培养的人胚胎干细胞也表达多能标志物Oct4和Sox2(对照)。
发明详述
已经发现,在存在有促有丝分裂因子bFGF(10ng/ml)并且不存在任何的分化抑制剂的情况下,当将多能鼠胚胎干细胞在包被有重组人层粘连蛋白-5(层粘连蛋白-332)或层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)的板上培养时,该细胞至少在140天(23次传代)内增殖并保持它们的多能性(图1a、图6)。Oct4、TERT、Sox2、Nanog和UTF1等多能标志物的表达(图2、图3a-3d、图4)以及增殖速率(图1a)也保持稳定。此外,注意到胚胎细胞与层粘连蛋白-5或层粘连蛋白-10分子的粘附与后者对胚胎细胞自我更新的支持能力相关联(图5a-5c)。
相反的是,当将鼠胚胎干细胞在相同的条件下在包被有鼠(EHS)层粘连蛋白-1(层粘连蛋白-111)、层粘连蛋白-8(层粘连蛋白-411)、MatrigelTM、或明胶的板上培养时,该多能细胞在1-2周后停止增殖(图1b)。它们分化、或分离、或死亡。此外,在这些条件下在层粘连蛋白-111或MatrigelTM上培养的细胞开始表达分化标志物(例如胶原蛋白IV和brachyury),并停止表达多能标志物Oct4、Sox2、Nanog或UTF1(图2、图3a-3d)。
此外,已经发现,当多能人胚胎干细胞在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)的板上在化学成分确定的培养基中培养时,该细胞至少在105天(20次传代)内增殖并保持它们的多能性(图7-9)。Oct4、Sox2、Nanog等多能标志物的表达、以及增殖速率也保持稳定。
在下面的非限定性实施例中将进一步解释本公开,应该理解的是,这些例子的意图仅仅是解释性,并非意图将本公开限制于在此列举的材料、条件、工艺参数等等。除非另有说明,否则所有比例都是按重量计。
方法
细胞培养
将鼠胚胎干细胞(使用2个细胞系:源自129SvJ鼠的GSI-1细胞系,由Uppsala University Transgenic Facility提供;以及RW4细胞系)在细胞外基质包被上在培养基中在37℃、5%CO2的条件下培养,其中所述培养基含有80%Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM),并含有GlutaMax-1和4.5g/L的葡萄糖、20%的符合胚胎细胞的胎儿血清、1%的青霉素、1%的链霉素、10mM的Hepes缓冲液、1mM的丙酮酸钠、非必需氨基酸(全部由Invitrogen提供)、0.1mM的β-巯基乙醇(Sigma)以及10ng/ml的β-成纤维细胞生长因子(bFGF)(Chemicon)。将胚胎细胞以300个细胞/mm2的初始密度在细胞外基质包被上铺板。在4-6天中用0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞分裂一次,并以180个细胞/mm2的细胞密度铺板。将胚胎细胞以2个独立的细胞系在各自的包被上进行培养。每一次传代期间用血细胞计数器进行细胞计数。
在包被有重组层粘连蛋白-10(层粘连蛋白-511)的板上在化学成分确定的培养基(mTeSR1的类似物)中培养人胚胎干细胞(使用两种细胞系:HS420和HS207,皆由瑞典Karolinska学院的KarolinskaUniversity Hospital(Huddinge)的Hovatta教授善意馈赠)。除了下面几处不同之外,按照文章(Ludwig,T.E.,Bergendahl,V.,Levenstein,M.E.,Yu,J.,Probasco M.D.and Thomsom,J.A.(2006);Feeder-independent culture of human embryonic stem cells;NatMethods 8,637-646)中所述制备培养基。首先,使用重组碱性人FGF(RDSystems)代替zbFGF,并且使用来自牛血清的白蛋白(SIGMA-Aldrich,B4287)代替BSA第V组部分。其次,使用被添加至已制得的培养基中的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂(Invitrogen)作为元素的来源以代替文章中描述的方法。通过暴露于TrypLETMExpress(GIBCO),每隔4-6天将人胚胎干细胞以团块的形式进行传代。将细胞在室温下用酶处理2分钟,然后用培养液冲洗2次,之后轻刮以进行收集。大的细胞团块通过轻轻移液而破开并进行1∶3传代。
如文章(Inzunzaa,J.,Gertow,K.,M.,A.,Matilainen,E.,Blennow,E.,Skottman,H.,Wolbank,S.,Ahrlund-Richter,L.andHovatta,O.(2005);Derivation of Human Embryonic Stem Cell Lines inSerum Replacement Medium Using Postnatal Human Fibroblasts asFeeder Cells.Stem Cells 2005;23:544-549)中所述,在传统的培养基中,将对照用的人胚胎干细胞保持在人包皮成纤维细胞上。通过在体视显微镜下用解剖刀将细胞集落切成8片从而手工将细胞传代。每隔6天进行手工分裂。通过形态学判断来选择未分化的细胞以用于各自的进一步传代。
板的包被
在4℃下,用下列细胞外基质蛋白的无菌溶液对96孔的组织细胞培养板(Sarstedt)进行包被过夜:鼠层粘连蛋白-111(Invitrogen)、人重组层粘连蛋白-332、人重组层粘连蛋白-411(Kortesmaa,J.,Yurchenco,P.,and Tryggvason,K.(2000);Recombinant laminin-8(alpha(4)beta(1)gamma(1)).Production,purification,and interactionswith integrins.J Biol Chem 275,14853-14859,美国专利6,638,907)、人重组层粘连蛋白-511(Doi,M.,Thyboll,J.,Kortesmaa,J.,Jansson,K.,livanainen,A.,Parvardeh,M.,Timpl,R.,Hedin,U.,Swedenborg,J.,and Tryggvason,K.(2002);Recombinant human laminin-10(alpha5betalgammal);Production,purification,andmigration-promoting activity on vascular endothelial cells.J Biol Chem277,12741-12748;美国专利6,933,273)(浓度均为30μg/ml(5μg/mm2))、生长因子耗尽的MatrigelTM(1∶30)(BD Biosciences)、牛明胶1mg/ml(Sigma)、0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸(Sigma)。
细胞粘附分析
按照(Extracellular Matrix Protocols,2000)中所述进行粘附分析。简言之,根据上面描述的方法将MaxiSorp 96孔板(Nunc)用细胞外基质蛋白包被,并用1%的热变性BSA溶液封闭。将未分化的胚胎细胞以800个细胞/mm2的细胞密度在细胞外基质包被的板上铺板,并使其在37℃下粘附1小时。将没有粘附的细胞冲洗掉,并将粘附的细胞用5%的戊二醛固定20分钟,并用0.1%的结晶紫染色。
RT-PCR
按照制造商的说明书,用Absolutely RNA Microprep Kit(Stratagene)从鼠和人的样品中分离总RNA。按照制造商的说明书,使用0.2μg的总RNA在20μl反应混合物中合成cDNA,所述反应混合物中含有寡脱氧胸苷(dT)12-18的引物和Superscript II反转录酶(Invitrogen)。为了补偿变化的cDNA产率,通过使用持家基因GADPH的表达水平作为标准来校准每一个PCR反应的cDNA的量。将产量等同于GADPH的PCR产物(20个循环,数据未给出)的量的cDNA用于随后的PCR反应。使用表1(用于鼠样品)中的引物和表2(用于人样品)中的引物来扩增cDNA。所有的PCR反应进行30个循环(包括显示在图片中的那些GADPH的PCR反应),并且使用1U的Taq DNA Polimerase Recombinant(Invitrogen)、在标准条件下、在20μl中进行。在含有溴化乙啶的1.5%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
对于每一种RNA样品,在没有反转录酶的条件下进行RT-PCR以证实没有基因组DNA被分离。
表1 用于RT-PCR的引物(鼠样品)
基因 | 正向引物 | 反向引物 | 产物大小(bp) | 退火温度(℃) |
Oct-4 | AGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTA | TGGGGGCAGAGGAAAGGATACAGC | 266 | 64 |
Sox-2 | GTGGAAACTTTTGTCCGAGACC | TGGAGTGGGAGGAAGAGGTAAC | 551 | 60 |
TERT | CTGCGTGTGCGTGCTCTGGAC | CACCTCAGCAAACAGCTTGTTCTC | 498 | 64 |
GADPH | GTGGAGATTGTTGCCATCAACGACC | GGCTAAG CAGTTGGTGGTGCAGGA | 393 | 64 |
波形蛋白 | CAAGGGTGAGTAGAGAGTTCGGG | TATAACACTGTTAGGAAAGAGGGTC | 226 | 60 |
巢蛋白 | CGGCCCACGCATCCCCCATCC | CAGCGGCCTTCCAATCTCTGTTCC | 259 | 64 |
Brachyury | GCTCATCGGAACAGCTCTCCAACC | GGAGAACCAGAAGACGAGGACGTG | 320 | 64 |
AFP | GTTTTCTGAGGGATGAAACCTATGCC | CGCCCAAAGCATCACGAGTTTTGG | 285 | 64 |
GATA4 | GGCCCCTCATTAAGCCTCAGCGC | GCAGGACCTGCTGGCGTCTTAGAT | 250 | 64 |
表2 用于RT-PCR的引物(人样品)
基因 | 正向引物 | 反向引物 | 产物大小(bp) | 退火温度(℃) |
Oct-4 | CGACCATCTGCCGCTTTGAG | CCCCCTGTCCCCCATTCCTA | 573 | 61 |
Nanog | AGCATCCGACTGTAAAGAATCTTCAC | CGGCCAGTTGTTTTTCTGCCACCT | 433 | 61 |
GADPH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA | TTCACACCCATGACGAACAT | 402 | 59 |
Pax6 | AACAGACACAGCCCTCACAAAC | CGGGAACTTGAACTGGAACTGAC | 275 | 61 |
AFP | CTTTGGGCTGCTCGCTATGA | TGGCTTGGAAAGTTCGGGTC | 175 | 59 |
Brachyury | GAAGGTGGATCTCAGGTAGC | CATCTCATTGGTGAGCTCCTT | 251 | 59 |
Sox1 | CTCACTTTCCTCCGCGTTGCTTCC | TGCCCTGGTCTTTGTCCTTCATCC | 849 | 61 |
免疫荧光
为了进行免疫荧光,用4%的多聚甲醛将胚胎细胞固定于96孔板的孔中,用0.1%的Triton-X渗透,并在0.1%的Tween-20(Sigma)PBS中用10%的胎牛血清(Invitrogen)封闭1小时。在室温下用一抗孵育1.5小时。使用针对下列鼠抗原的一抗:Oct4(来自BDBiosciences)、Sox2、UTF、Nanog、胶原蛋白IV(全部来自Millipore)。使用针对下列人抗原的一抗:Oct4和Sox2(都来自RDSystems)。用二抗(Alexa-488-和Alexa 546-标记的分子探针)和DAPI(分子探针)孵育40分钟。在两次孵育之间,将样品在PBS中用0.1%的Tween-20洗3-5次,每次洗10分钟。将样品保存在荧光封固剂(Dako)中并用荧光显微镜(Leica)观察。
嵌合鼠
将鼠胚胎干细胞在层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-332上培养95天(17次传代)之后,在LIF的存在下,使其在鼠胚胎成纤维细胞上扩展,并注射到C57BI鼠胚泡中(该操作在位于斯德哥尔摩的Karolinska学院Karolinska Center for Transgene Technologies进行)。当地的伦理委员会于2005年9月29日颁发给Karl Tryggvason用于实验动物研究的伦理许可#246/05。
结果
A.在不存在饲养细胞、或LIF、或任何其它的分化抑制剂的情况下,在层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-332上培养的鼠胚胎干细胞增殖并保持多能性。
发现在不存在LIF或任何其它的分化抑制剂的情况下,层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-332上的鼠胚胎干细胞至少在140天内保持多能性。参见图1。
增殖:在整个实验期间,在不存在LIF/MEF的情况下,在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上培养的鼠胚胎干细胞的增殖速率保持稳定和一致(高)。参见图1a、1b。从第40天至第80天,加倍时间为1.2天。
RT-PCR标志物:多能标志物Sox2、Oct4和增殖标志物Tert被在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上培养(在不存在LIF的情况下)145天的鼠胚胎干细胞相同程度地表达,如在LIF上培养的多能胚胎干细胞那样。参见图2。
免疫荧光:该胚胎干细胞相同程度地表达多能标志物(如Oct4、Sox2、UTF1和Nanog),如在LIF存在的情况下生长的胚胎干细胞那样。参见图3a、3b、3c、3d。
形态学:在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上培养的胚胎干细胞的形态与在LIF存在的情况下在MEF或明胶上培养的胚胎干细胞的形态显著不同。在LIF存在的情况下在MEF或明胶上培养的胚胎干细胞形成了具有明显和确定的边界的致密的群集。然而,在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上培养的胚胎干细胞首先在细胞外基质包被上扩展形成单层,并且仅在此之后开始形成多层。但是,多能标志物Oct4和Sox2的表达并不降低。参见图4。
体内情况(嵌合鼠):在不存在饲养细胞、或LIF、或任何其它的分化抑制剂的情况下,在层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511上培养95天(17次传代)后的鼠胚胎干细胞(GSI-1细胞系)能够形成嵌合鼠。为了验证在不存在饲养细胞或分化抑制剂的情况下,在层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-332上培养的鼠胚胎干细胞是多能的,将保持95天(17次传代)后的细胞注射到鼠的胚泡中,所述胚泡随后移植到假孕的鼠中。这导致嵌合鼠的产生(图6),证实了该细胞确实是多能的。在不存在饲养细胞或分化抑制剂的情况下,在层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-332上经过11次传代后的鼠胚胎干细胞(RW4细胞系)也产生嵌合鼠。
B.与鼠胚胎干细胞自我更新相关联的粘附
已经发现,某些细胞外基质组分支持鼠胚胎干细胞自我更新的能力与粘附相关联。未分化的胚胎干细胞与层粘连蛋白-332和层粘连蛋白-511强烈地粘附(图5a和5c)。在这些层粘连蛋白上粘附的胚胎干细胞的平均表面积比微弱粘附的胚胎干细胞的平均表面积高2.7倍(图5b)。胚胎干细胞与层粘连蛋白-111、MatrigelTM、明胶的粘附并不强。观察到胚胎干细胞与层粘连蛋白-411、多聚-D-赖氨酸的粘附微弱或者没有粘附。Student’s双侧检验显示,层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-332的粘附以及表面积的差异在统计上不同于所有其它包被(p值小于5%)。
C.在不存在饲养细胞的情况下,在层粘连蛋白-511上培养的人胚胎干细胞在化学成分确定的培养基中增殖并保持多能性
发现在层粘连蛋白-511上,人胚胎干细胞在化学成分确定的培养基中保持多能性至少105天(20次传代)。
形态学:在层粘连蛋白-511上培养的人胚胎干细胞的形态与所发现的在MatrigelTM上培养的人胚胎干细胞的形态十分类似(Bendall,S.,C.,Stewart,M.,H.,Menendez,P.,George,D.,Vijayaragavan,K.,Werbowetski-Ogilvie,T.,Ramos-Mejia,V.,Rouleau,A.,Yang,J.,Bossé,M.,Lajoie,G.and Bhatia,M.(2007);IGF and FGFcooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotenthuman cells in vitro.Nature,2007Aug 30;448(7157):1015-21.)或与在细胞外基质包被的板上培养的人胚胎干细胞的形态十分类似(Klimanskaya,I.,Chung,Y.,Meisner,L.,Johnson,J.,West,M.,D.andLanza,R.(2005);Human embryonic stem cells derived without feedercells.Lancet.2005 May 7-13;365(9471):1601-1603)。参见图7。但是,不同于上述的两种包被,根据FDA的规定,重组人层粘连蛋白-511能够制成无异源体的、确定的、无免疫原性的化合物,并随后用于临床。
RT-PCR标志物:多能标志物Oct4和Nanog被在化学成分确定的培养基中在层粘连蛋白-511上培养105天的人胚胎干细胞相同程度地表达,如在传统的培养基中在人包皮成纤维细胞上培养的多能胚胎干细胞那样。参见图8。
免疫荧光:人胚胎干细胞相同程度地表达多能标志物(如Oct4和Sox2),如在传统环境中生长的胚胎干细胞那样。参见图9。
尽管已经对具体的实施方案进行了描述,但是对申请人或其它的本领域技术人员而言,可能发生未预见到的或可能目前未预见到的替换、修改、变化、改进以及实质等同形式。因此,提交的所附权利要求以及可能对它们做出的改变均意图包括所有这些替换、修改、变化、改进以及实质等同形式。
Claims (8)
1.一种组合物,该组合物能够被应用在体外作细胞培养并能使多能干细胞增殖,所述组合物包含:
细胞培养基,所述细胞培养基包含10ng/ml β-成纤维细胞生长因子;及
被多能干细胞在其上铺板的包被,所述包被包含:30μg/ml层粘连蛋白511(层粘连蛋白-10)。
2.权利要求1所述的组合物,其中所述组合物还包含生长因子。
3.权利要求1所述的组合物,其中所述组合物不含任何分化抑制剂。
4.权利要求1所述的组合物,其中所述多能干细胞为胚胎干细胞。
5.权利要求4所述的组合物,其中所述胚胎干细胞为鼠胚胎干细胞。
6.权利要求4所述的组合物,其中所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
7.权利要求1所述的组合物,其中所述多能干细胞为骨髓干细胞。
8.一种组合物,该组合物能够被应用在体外作细胞培养并能使多能干细胞增殖大于14天,所述组合物包含:
细胞培养基,所述细胞培养基包含10ng/ml β-成纤维细胞生长因子,及
层粘连蛋白层,所述层粘连蛋白由30μg/ml层粘连蛋白511(层粘连蛋白-10)构成。
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