JPH0779697B2 - 細胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系、及びその製造方法 - Google Patents
細胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系、及びその製造方法Info
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- JPH0779697B2 JPH0779697B2 JP62106171A JP10617187A JPH0779697B2 JP H0779697 B2 JPH0779697 B2 JP H0779697B2 JP 62106171 A JP62106171 A JP 62106171A JP 10617187 A JP10617187 A JP 10617187A JP H0779697 B2 JPH0779697 B2 JP H0779697B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は細胞の培養及びそれからの生産物の製造に関す
るものであつて、特に微細担体（micro−carriers）を
用いる非固定依存性細胞（nonanchorage−dependent ce
lls）の固定化に関するものである。
るものであつて、特に微細担体（micro−carriers）を
用いる非固定依存性細胞（nonanchorage−dependent ce
lls）の固定化に関するものである。
（従来の技術） ミラー〔Miller〕等の米国特許第4,266,032号明細書、
レビーン〔Levine〕等の米国特許第4,189,534号及4,29
3,654号明細書、1982年３月４日付PCT特許明細書WO/82/
00660号、及び1982年12月15日付ヨーロツパ特許明細書
第66726号には細胞の成長を行なうための微細担体の使
用による培養方法の総説及び開示を記載している。
レビーン〔Levine〕等の米国特許第4,189,534号及4,29
3,654号明細書、1982年３月４日付PCT特許明細書WO/82/
00660号、及び1982年12月15日付ヨーロツパ特許明細書
第66726号には細胞の成長を行なうための微細担体の使
用による培養方法の総説及び開示を記載している。
ミラー〔Miller〕等の特許明細書の微細担体はアミノ
酸、ペプチツド又はヒドロオキシカルボン酸の誘導体化
した架橋ポリスチレン樹脂より成るものである。その樹
脂球の直径範囲は20ないし64ミクロンであつて固定依存
性細胞（anchorage−dependent cells）を成長させるの
に使用されることが記載されている。レビーン〔Levin
e〕等の特許は乾燥状態における粒子径が約75ミクロ
ン、又は水和した樹脂球の場合には約120ないし200ミク
ロンの平均粒径を有する正に荷電したイオン交換樹脂を
開示している。これらの特許は共にこの樹脂が固定依存
性細胞成長用の微細担体として使用されることを示して
いる。これらの特許は微細担体が他の型の細胞の成長用
にも使用し得ることを述べているが他の細胞型について
の例示又は説明は行なわれていない。
酸、ペプチツド又はヒドロオキシカルボン酸の誘導体化
した架橋ポリスチレン樹脂より成るものである。その樹
脂球の直径範囲は20ないし64ミクロンであつて固定依存
性細胞（anchorage−dependent cells）を成長させるの
に使用されることが記載されている。レビーン〔Levin
e〕等の特許は乾燥状態における粒子径が約75ミクロ
ン、又は水和した樹脂球の場合には約120ないし200ミク
ロンの平均粒径を有する正に荷電したイオン交換樹脂を
開示している。これらの特許は共にこの樹脂が固定依存
性細胞成長用の微細担体として使用されることを示して
いる。これらの特許は微細担体が他の型の細胞の成長用
にも使用し得ることを述べているが他の細胞型について
の例示又は説明は行なわれていない。
PCT特許明細書に記載されている微細担体はゼラチン又
はキトサン等の天然蛋白質又は多糖体であつて、これら
は架橋されていても良い。ヨーロツパ特許明細書の微細
担体はアニオン交換樹脂であつてその官能基が変質しに
くい第四級アンモニウム基である。上記両特許明細書に
記載されている樹脂は固定依存性細胞単独の培養に使用
される。
はキトサン等の天然蛋白質又は多糖体であつて、これら
は架橋されていても良い。ヨーロツパ特許明細書の微細
担体はアニオン交換樹脂であつてその官能基が変質しに
くい第四級アンモニウム基である。上記両特許明細書に
記載されている樹脂は固定依存性細胞単独の培養に使用
される。
固定依存性細胞と非固定依存性細胞はその培養要件が著
しく異つている。固定依存性細胞は生育を保持するため
に固体基質に付着することが必要である。蛋白質、炭水
化物、脂質又はこれらの物質、その他の複合体等の市販
の価値がある製品は、細胞と微細担体との付着が重合体
粒子上の官能基によつて形成され、微細担体の密度が周
囲の培地の密度よりも僅かに大きいような微細担体に付
着している間に成長が行なわれる。微細担体の存在によ
つて単層培養で達成される細胞濃度よりも遥かに大きい
濃度とすることが出来、また細胞生産物を容易に回収精
製することが可能になる。従つて所望の生成物の収率は
著しく大きくなる。
しく異つている。固定依存性細胞は生育を保持するため
に固体基質に付着することが必要である。蛋白質、炭水
化物、脂質又はこれらの物質、その他の複合体等の市販
の価値がある製品は、細胞と微細担体との付着が重合体
粒子上の官能基によつて形成され、微細担体の密度が周
囲の培地の密度よりも僅かに大きいような微細担体に付
着している間に成長が行なわれる。微細担体の存在によ
つて単層培養で達成される細胞濃度よりも遥かに大きい
濃度とすることが出来、また細胞生産物を容易に回収精
製することが可能になる。従つて所望の生成物の収率は
著しく大きくなる。
（発明により解決しようとする問題点） ハイブリドーマ細胞から得られる単クローン性抗体のよ
うな、多くの生物学的に重要な物質は非固定依存性細胞
又は表面に付着する細胞、すなわち培養液表面に存在す
る細胞中には効率良く生成しない。本明細書中において
は“nonanchorage−dependent"（非固定依存性）という
用語を上記二種の細胞（非固定依存性細胞及び表面に付
着する細胞）の両者を意味するものとする。非固定依存
性細胞は懸濁液中で成長するが、培地の単位体積当りの
細胞数を大きい値に保持し、即ち生成物の生成率を大き
い値に保つためには適当な栄養源を供給するために培養
条件として、培地の交換率を高くすることが必要であ
る。培地の交換率を所望の大きさにすると、特に公知の
灌流培養法を行なう場合には、懸濁している細胞の流失
を起し生成物の著しい損失を招くであろう。
うな、多くの生物学的に重要な物質は非固定依存性細胞
又は表面に付着する細胞、すなわち培養液表面に存在す
る細胞中には効率良く生成しない。本明細書中において
は“nonanchorage−dependent"（非固定依存性）という
用語を上記二種の細胞（非固定依存性細胞及び表面に付
着する細胞）の両者を意味するものとする。非固定依存
性細胞は懸濁液中で成長するが、培地の単位体積当りの
細胞数を大きい値に保持し、即ち生成物の生成率を大き
い値に保つためには適当な栄養源を供給するために培養
条件として、培地の交換率を高くすることが必要であ
る。培地の交換率を所望の大きさにすると、特に公知の
灌流培養法を行なう場合には、懸濁している細胞の流失
を起し生成物の著しい損失を招くであろう。
此の難点は細胞と流出する培地の間に膜又はセラミツク
フイルター又は遠心過器のようなある種の物理的障壁
を設けることによつてある程度まで緩和することが出来
る。然しこのような特殊の装置を造ること、又は既存装
置を改造することは非固定依存性細胞の培養及びそれか
らの有用生成物の製造を著しく複雑化しまたそのコスト
を増大する。
フイルター又は遠心過器のようなある種の物理的障壁
を設けることによつてある程度まで緩和することが出来
る。然しこのような特殊の装置を造ること、又は既存装
置を改造することは非固定依存性細胞の培養及びそれか
らの有用生成物の製造を著しく複雑化しまたそのコスト
を増大する。
（発明の構成） 非固定依存性細胞をその細胞損失を著しく減少し追加的
な特殊フイルター等の装置を必要としないで懸濁液中で
培養し、灌流培養液中に保持し得ることが発見された。
この利点は非固定依存性細胞を水に懸濁したものを正に
荷電したイオン交換樹脂粒子と負に荷電したイオン交換
樹脂粒子を組合わせて形成される凝集物と接触させるこ
とによつて得られる。樹脂凝集物は細胞と結合してこれ
を担体し複合体を形成し、これが過その他の方法で懸
濁液から容易に除去される。
な特殊フイルター等の装置を必要としないで懸濁液中で
培養し、灌流培養液中に保持し得ることが発見された。
この利点は非固定依存性細胞を水に懸濁したものを正に
荷電したイオン交換樹脂粒子と負に荷電したイオン交換
樹脂粒子を組合わせて形成される凝集物と接触させるこ
とによつて得られる。樹脂凝集物は細胞と結合してこれ
を担体し複合体を形成し、これが過その他の方法で懸
濁液から容易に除去される。
樹脂凝集物と細胞との接触を良好にするには、細胞と凝
集物とを含有している懸濁物をかく拌することが好まし
い。一般的にはかく拌をとめると細胞を担持している凝
集物は容器の底に急速に沈降する。そのために細胞を損
失することなく、培地の変更を行なうことが出来る。細
胞塊（cellmass）の有効径は著しく増大しているので細
胞凝集物複合体の除去を過器等の物理的障壁を用いて
容易に行なうことが出来る。
集物とを含有している懸濁物をかく拌することが好まし
い。一般的にはかく拌をとめると細胞を担持している凝
集物は容器の底に急速に沈降する。そのために細胞を損
失することなく、培地の変更を行なうことが出来る。細
胞塊（cellmass）の有効径は著しく増大しているので細
胞凝集物複合体の除去を過器等の物理的障壁を用いて
容易に行なうことが出来る。
すなわち本発明の一つの態様として、細胞の培養を一層
効果的に行ない、又はそれからの生産物の製造を効果的
に行なうために非固定依存性の細胞を含有している培地
を正荷電および負荷電の粒状イオン交換樹脂と接触させ
る非固定依存性細胞の固定化方法が提供されている。細
胞は樹脂に結合しその上に保持され、細胞の成長が容易
になる。
効果的に行ない、又はそれからの生産物の製造を効果的
に行なうために非固定依存性の細胞を含有している培地
を正荷電および負荷電の粒状イオン交換樹脂と接触させ
る非固定依存性細胞の固定化方法が提供されている。細
胞は樹脂に結合しその上に保持され、細胞の成長が容易
になる。
本発明のその他の態様は、非固定依存性細胞を担持して
いる凝集物より成る細胞培養用又はそれからの生産物を
製造するための微細担体系と細胞培養方法とより成るも
ので、前記凝集物は細胞を含有している培地を正及び負
荷電の粒状イオン交換樹脂とを合一して形成される樹脂
凝集物と接触させることによつて形成され、また該細胞
培養方法においては非固定依存性細胞が樹脂凝集物上に
担持されていて細胞の成長と細胞からの有用な生産物の
製造を一層効果的に行なおうとするものである。
いる凝集物より成る細胞培養用又はそれからの生産物を
製造するための微細担体系と細胞培養方法とより成るも
ので、前記凝集物は細胞を含有している培地を正及び負
荷電の粒状イオン交換樹脂とを合一して形成される樹脂
凝集物と接触させることによつて形成され、また該細胞
培養方法においては非固定依存性細胞が樹脂凝集物上に
担持されていて細胞の成長と細胞からの有用な生産物の
製造を一層効果的に行なおうとするものである。
本発明の前記およびその他の態様として記載した態様、
特徴、および利点については後記の記載によつて更に明
らかに理解されるであろう。
特徴、および利点については後記の記載によつて更に明
らかに理解されるであろう。
本発明の一つの実施態様においては、正又は負に荷電し
たイオン交換樹脂を、非固定依存性細胞を含有している
培地に添加し、混合物をかく拌してイオン交換樹脂を培
地の全体中に分散させ、次に得られた混合物を最初に添
加したイオン交換樹脂と反対電荷を有するイオン交換樹
脂と接触させることによつて細胞を固定化する。最初に
添加するイオン交換樹脂が正荷電であつて、後から添加
されるイオン交換樹脂が負荷電であることが好ましい。
相反する電荷を有する樹脂間の凝集の結果、凝集物の形
成が直ちに始まる。凝集物は細胞を結合し、細胞を担持
している凝集物は静止状態になると沈澱する。所望の場
合には第二回目に添加される樹脂との接触及びそれによ
る凝集は第１工程における混合物のかく拌と同様にかく
拌によつて促進調節することが出来る。
たイオン交換樹脂を、非固定依存性細胞を含有している
培地に添加し、混合物をかく拌してイオン交換樹脂を培
地の全体中に分散させ、次に得られた混合物を最初に添
加したイオン交換樹脂と反対電荷を有するイオン交換樹
脂と接触させることによつて細胞を固定化する。最初に
添加するイオン交換樹脂が正荷電であつて、後から添加
されるイオン交換樹脂が負荷電であることが好ましい。
相反する電荷を有する樹脂間の凝集の結果、凝集物の形
成が直ちに始まる。凝集物は細胞を結合し、細胞を担持
している凝集物は静止状態になると沈澱する。所望の場
合には第二回目に添加される樹脂との接触及びそれによ
る凝集は第１工程における混合物のかく拌と同様にかく
拌によつて促進調節することが出来る。
細胞の懸濁物に添加されるべき樹脂の量は細胞の濃度、
細胞及び樹脂の電荷密度、樹脂の粒径及び有孔率によつ
て左右され、又当業者がよく知つているように懸濁物の
pH、培地中の細胞以外の物質が細胞の生産物の等電点、
細胞や原料又は生成物の樹脂に対する親和性によつて左
右される。一般的には細胞と同一重量の樹脂が使用され
るが、前記の因子によつてかなり大きい変動があり得
る。
細胞及び樹脂の電荷密度、樹脂の粒径及び有孔率によつ
て左右され、又当業者がよく知つているように懸濁物の
pH、培地中の細胞以外の物質が細胞の生産物の等電点、
細胞や原料又は生成物の樹脂に対する親和性によつて左
右される。一般的には細胞と同一重量の樹脂が使用され
るが、前記の因子によつてかなり大きい変動があり得
る。
固定化した細胞を移送又は貯蔵しようと思うならば、細
胞を担持している凝集物を過等の適宜の方法で培地か
ら分離する。その後に固定化した細胞を培養及び／又は
細胞系の独自の酵素、抗生物質その他の物質の生産を行
なうために再分散する。
胞を担持している凝集物を過等の適宜の方法で培地か
ら分離する。その後に固定化した細胞を培養及び／又は
細胞系の独自の酵素、抗生物質その他の物質の生産を行
なうために再分散する。
あるいは凝集物を培地から分離しないで、必要ならば灌
流を行なつてその凝集状態を保持して細胞の培養を行な
つても良い。
流を行なつてその凝集状態を保持して細胞の培養を行な
つても良い。
樹脂凝集物上に固定化した細胞は容器の底に急速に沈降
し、細胞を損失することなく培地の変更を行なうことが
出来るのでこの方法は便利に実施することが出来る。非
固定依存性細胞の培養に従来使用されている物理的支持
体は、固定化による細胞塊の有効径を増大し得るので従
来よりも有利性が大きい場合もある。
し、細胞を損失することなく培地の変更を行なうことが
出来るのでこの方法は便利に実施することが出来る。非
固定依存性細胞の培養に従来使用されている物理的支持
体は、固定化による細胞塊の有効径を増大し得るので従
来よりも有利性が大きい場合もある。
完全には解明されてはいないが、固定化は最初に正荷電
の樹脂と負荷電の樹脂の表面との相互作用によつて起
り、続いて添加された負荷電の樹脂は次に架橋剤として
作用し、反対荷電の樹脂が凝集すると共に細胞／樹脂複
合体のかたまりを形成するものと考えられている。
の樹脂と負荷電の樹脂の表面との相互作用によつて起
り、続いて添加された負荷電の樹脂は次に架橋剤として
作用し、反対荷電の樹脂が凝集すると共に細胞／樹脂複
合体のかたまりを形成するものと考えられている。
本発明の他の一つの実施態様においては、樹脂凝集物は
細胞培地と接触させる前に形成される。これは通常反対
荷電の樹脂を水中懸濁物に添加混合し、次に水中懸濁物
を、要すればかく拌しながら、細胞培地に添加して行な
われる。これによつて細胞の固定化が行なわれ、凝集物
に担持されている生成した細胞塊は前記のように分離さ
れるか、灌流される。
細胞培地と接触させる前に形成される。これは通常反対
荷電の樹脂を水中懸濁物に添加混合し、次に水中懸濁物
を、要すればかく拌しながら、細胞培地に添加して行な
われる。これによつて細胞の固定化が行なわれ、凝集物
に担持されている生成した細胞塊は前記のように分離さ
れるか、灌流される。
細胞に対して有効な静電気的けん引作用を及ぼし相互作
用によつて樹脂凝集物を形成するために十分な電荷密度
（イオン交換容量）と電荷の比率とを持つ粒状イオン交
換樹脂ならば任意に使用することが出来るが、樹脂の粒
径は、平均粒子直径で約0.01ないし約５ミクロン、好ま
しくは約0.01ないし約1.5ミクロン、更に好ましくは約
0.1ないし約１ミクロンのものである。粒径が小さいと
樹脂の表面積／体積の比が大きく、従つて吸着性及び静
電的けん引効果が大きい。使用し得る正荷電樹脂は、前
記の米国特許、PCT、およびヨーロツパ特許明細書及び
特許等に記載されているもので、これらは水に不溶であ
つて、必要な粒径に製造されているか、あるいはその粒
径をあとから研磨して小さくしたものである。
用によつて樹脂凝集物を形成するために十分な電荷密度
（イオン交換容量）と電荷の比率とを持つ粒状イオン交
換樹脂ならば任意に使用することが出来るが、樹脂の粒
径は、平均粒子直径で約0.01ないし約５ミクロン、好ま
しくは約0.01ないし約1.5ミクロン、更に好ましくは約
0.1ないし約１ミクロンのものである。粒径が小さいと
樹脂の表面積／体積の比が大きく、従つて吸着性及び静
電的けん引効果が大きい。使用し得る正荷電樹脂は、前
記の米国特許、PCT、およびヨーロツパ特許明細書及び
特許等に記載されているもので、これらは水に不溶であ
つて、必要な粒径に製造されているか、あるいはその粒
径をあとから研磨して小さくしたものである。
一般的には正荷電樹脂も負荷電樹脂も、通常最初に懸濁
重合又は乳化重合法によつて架橋した共重合体のマトリ
ツクスを形成し、然る後に共重合体粒子が必要な電荷と
電荷密度を持つように官能化して製造される。架橋共重
合体の主鎖及び架橋結合の両方を形成するために多種類
の単量体を使用することが出来る。これらの単量体は
“イオン交換”〔Ion Exchahge〕（J.Marinsky,Ed.,Vo
l.II,第６章（ニユーヨーク,1969）のような本問題の標
準的参考書に記載されているような種々の公知のビニル
芳香族およびアクリル系単量体である。
重合又は乳化重合法によつて架橋した共重合体のマトリ
ツクスを形成し、然る後に共重合体粒子が必要な電荷と
電荷密度を持つように官能化して製造される。架橋共重
合体の主鎖及び架橋結合の両方を形成するために多種類
の単量体を使用することが出来る。これらの単量体は
“イオン交換”〔Ion Exchahge〕（J.Marinsky,Ed.,Vo
l.II,第６章（ニユーヨーク,1969）のような本問題の標
準的参考書に記載されているような種々の公知のビニル
芳香族およびアクリル系単量体である。
好ましいイオン交換樹脂はチヨン〔chong〕、イサコフ
〔Isacoff〕、及びニーリー〔Neely〕の米国特許第4,20
0,695号明細書、チヨン〔chong〕の第4,359,537号及び
第4,380,590号明細書、及びイサコフ〔Isaclff〕、及び
ニーリー〔Neely〕の4,537,683号明細書に記載されてい
る。これらの特許に記載されている樹脂は、一般的にほ
ぼ球状の小球の形の架橋した重合体で形成されているイ
オン交換樹脂で乳化重合によつて製造される。使用し得
る樹脂は単量体１単位当り0.1ないし1.5個の電荷密度を
生成する官能基を持つものであるが、官能基比の値は異
つていても良い。正荷電樹脂は強酸性（例えば、−SO3H
基）又は弱塩基性基（例えば−COOH基）を有するもの、
負荷電樹脂は強塩基性基（例えば第四級アンモニウム
基）か弱塩基性基（例えば第三級アミン基）のどちらを
有するものである。
〔Isacoff〕、及びニーリー〔Neely〕の米国特許第4,20
0,695号明細書、チヨン〔chong〕の第4,359,537号及び
第4,380,590号明細書、及びイサコフ〔Isaclff〕、及び
ニーリー〔Neely〕の4,537,683号明細書に記載されてい
る。これらの特許に記載されている樹脂は、一般的にほ
ぼ球状の小球の形の架橋した重合体で形成されているイ
オン交換樹脂で乳化重合によつて製造される。使用し得
る樹脂は単量体１単位当り0.1ないし1.5個の電荷密度を
生成する官能基を持つものであるが、官能基比の値は異
つていても良い。正荷電樹脂は強酸性（例えば、−SO3H
基）又は弱塩基性基（例えば−COOH基）を有するもの、
負荷電樹脂は強塩基性基（例えば第四級アンモニウム
基）か弱塩基性基（例えば第三級アミン基）のどちらを
有するものである。
前記の特許、特許明細書、及び特許公告のすべてに開示
されている樹脂は本発明に参考として包含されている。
されている樹脂は本発明に参考として包含されている。
樹脂は無毒性でなければならないことは言うまでもな
く、また本発明に基いて使用する通常の方法で無毒性に
されるものでなくてはならない。
く、また本発明に基いて使用する通常の方法で無毒性に
されるものでなくてはならない。
培地は非固定依存性細胞の培養に使用される公知の液体
系のものが任意に使用されるが、勿論その具体的組成は
本発明に基いて固定化および／又は培養される細胞の型
式によつて異る。液状の培地は通常炭素源及び窒素源な
らびに種々の塩類の供給源となる栄養物、緩衝剤、およ
びpHの調節や成長及び生産を最大にするために必要な成
分を含んでいる。
系のものが任意に使用されるが、勿論その具体的組成は
本発明に基いて固定化および／又は培養される細胞の型
式によつて異る。液状の培地は通常炭素源及び窒素源な
らびに種々の塩類の供給源となる栄養物、緩衝剤、およ
びpHの調節や成長及び生産を最大にするために必要な成
分を含んでいる。
本発明はすべての非固定依存性細胞（動物、植物、微生
物又は遺伝工学的に作られた細胞）に適用することが出
来、懸濁培養法で通常取得可能な細胞数よりも大きい集
塊（cluster）を得ることが出来る。本発明によつて集
合することが出来る細胞の代表的なものはリンパ球、そ
の他の血液細胞、腫瘍に由来する細胞、融合によつて形
成された細胞、CHO及びHeLaのような形質転換細胞系
統、およびこれらの細胞を実験室的に変換した菌株であ
る。一般的に言うと、これらの細胞は動物源でも植物源
でも良く、又これらに対して懸濁培養又は付着培養技術
が確立しているものである。本発明はまた、単細胞生物
例えば酵母、藻、細菌等に対しても適用することができ
る。
物又は遺伝工学的に作られた細胞）に適用することが出
来、懸濁培養法で通常取得可能な細胞数よりも大きい集
塊（cluster）を得ることが出来る。本発明によつて集
合することが出来る細胞の代表的なものはリンパ球、そ
の他の血液細胞、腫瘍に由来する細胞、融合によつて形
成された細胞、CHO及びHeLaのような形質転換細胞系
統、およびこれらの細胞を実験室的に変換した菌株であ
る。一般的に言うと、これらの細胞は動物源でも植物源
でも良く、又これらに対して懸濁培養又は付着培養技術
が確立しているものである。本発明はまた、単細胞生物
例えば酵母、藻、細菌等に対しても適用することができ
る。
この細胞は生物活性物質又は化学的活性物質の生産源と
して分離した固定化細胞と同様にバイオリアクター中に
使用することが出来る。このようなバイオリアクターは
かく拌型、液中浸漬型、深層タンク型、および空気揚液
型、又は不溶性マトリツクス型の反応器のどれであつて
も良く、バイオリアクターはバツチ型式又は灌流型の型
式のどれかで使用することも出来る。
して分離した固定化細胞と同様にバイオリアクター中に
使用することが出来る。このようなバイオリアクターは
かく拌型、液中浸漬型、深層タンク型、および空気揚液
型、又は不溶性マトリツクス型の反応器のどれであつて
も良く、バイオリアクターはバツチ型式又は灌流型の型
式のどれかで使用することも出来る。
本発明の実施を最適にするその他の条件は当業者には良
く知られており、イオン交換樹脂の濃度、pHおよび温度
の調節、栄養物その他の細胞成長用成分の選択、培地の
かく拌手段およびその条件、細胞の生産物の回収方法、
であつて、これらの問題に関するぼう大な文献が参照さ
れている。
く知られており、イオン交換樹脂の濃度、pHおよび温度
の調節、栄養物その他の細胞成長用成分の選択、培地の
かく拌手段およびその条件、細胞の生産物の回収方法、
であつて、これらの問題に関するぼう大な文献が参照さ
れている。
後記の実施例は本発明について更に説明を行なうために
記載したものであつて、発明の範囲を限定するものでは
ない。実施例中“部”および“パーセント”はすべて別
のことわりがない限り重量部及び重量パーセントであ
る。
記載したものであつて、発明の範囲を限定するものでは
ない。実施例中“部”および“パーセント”はすべて別
のことわりがない限り重量部及び重量パーセントであ
る。
実施例1. 全量で25ミリリツトルのハム〔Ham〕のF12培地中の5000
万個のCHO細胞に、無菌の第四級アミンで官能性を与え
た、乳化重合したスチレン／ジビニルベンゼンのゲル状
共重合体樹脂の１重量％懸濁液50ミクロリツトルと、平
均粒径0.22±0.02ミクロンでアニン交換容量が乾燥物と
して3.8meg/gの架橋剤（樹脂Ａ）1.8％を添加した。混
合物を十分かく拌し、この分散物に無菌のスルホン酸で
官能化した乳化重合したスチレン／ジビニルベンゼンゲ
ル状共重合体樹脂の１重量％懸濁液100ミクロリツトル
及び平均粒径0.26±0.02ミクロン、カチオン交換容量が
乾燥物として5.1meg/g（樹脂Ｂ）の架橋剤を添加した。
万個のCHO細胞に、無菌の第四級アミンで官能性を与え
た、乳化重合したスチレン／ジビニルベンゼンのゲル状
共重合体樹脂の１重量％懸濁液50ミクロリツトルと、平
均粒径0.22±0.02ミクロンでアニン交換容量が乾燥物と
して3.8meg/gの架橋剤（樹脂Ａ）1.8％を添加した。混
合物を十分かく拌し、この分散物に無菌のスルホン酸で
官能化した乳化重合したスチレン／ジビニルベンゼンゲ
ル状共重合体樹脂の１重量％懸濁液100ミクロリツトル
及び平均粒径0.26±0.02ミクロン、カチオン交換容量が
乾燥物として5.1meg/g（樹脂Ｂ）の架橋剤を添加した。
容器の底に沈降した生成凝集物を分離した後、これをハ
ムのF12培地25ml中に再分散した。凝集物をこの培地中
で５％CO2−95％空気の雰囲気中に37℃において７日間
保持し、必要に応じて培地を取りかえた。最初の凝集物
は顕微鏡での観察の結果視認し得る明瞭な細胞を有する
開放構造を有し細胞が固定化されていることを示した。
７日後には細胞／樹脂のかたまりの外部に単独細胞が認
められた。各樹脂100ミクロリツトルを用いて実験を反
復した結果、反復に対応して数の増加する細胞を含んで
いるかたまりが認められた。
ムのF12培地25ml中に再分散した。凝集物をこの培地中
で５％CO2−95％空気の雰囲気中に37℃において７日間
保持し、必要に応じて培地を取りかえた。最初の凝集物
は顕微鏡での観察の結果視認し得る明瞭な細胞を有する
開放構造を有し細胞が固定化されていることを示した。
７日後には細胞／樹脂のかたまりの外部に単独細胞が認
められた。各樹脂100ミクロリツトルを用いて実験を反
復した結果、反復に対応して数の増加する細胞を含んで
いるかたまりが認められた。
実施例2. ハムのF12 50ml中のマウス骨髄腫細胞500万個に樹脂Ａ
の無菌１重量％懸濁液1.0mlと樹脂Ｂ（実施例１）の無
菌１重量％懸濁液0.5mlを相ついで添加した。培養条件
は実施例１に記載した条件と同じであつた。顕微鏡によ
る観察を９日間継続したが細胞は生存状態を保つことを
認めた。しかし細胞数の増加は認めなかつた。
の無菌１重量％懸濁液1.0mlと樹脂Ｂ（実施例１）の無
菌１重量％懸濁液0.5mlを相ついで添加した。培養条件
は実施例１に記載した条件と同じであつた。顕微鏡によ
る観察を９日間継続したが細胞は生存状態を保つことを
認めた。しかし細胞数の増加は認めなかつた。
実施例3. ハムの培地20ml中の500万個のマウスハイブリドーマ（H
ybridoma）細胞に同質量の樹脂Ａと樹脂Ｂ（実施例１）
を混合して、予め作成した樹脂凝集物1mlを添加した。
オートクレーブ処理後の予め形成した樹脂凝集物懸濁液
中の固形分は0.5重量％であつた。24hr後に観察した結
果細胞の大部分は凝集物に付着していた。固定化した細
胞による抗原の生成は酵素免疫法（ELISAassay）で確認
せられた。
ybridoma）細胞に同質量の樹脂Ａと樹脂Ｂ（実施例１）
を混合して、予め作成した樹脂凝集物1mlを添加した。
オートクレーブ処理後の予め形成した樹脂凝集物懸濁液
中の固形分は0.5重量％であつた。24hr後に観察した結
果細胞の大部分は凝集物に付着していた。固定化した細
胞による抗原の生成は酵素免疫法（ELISAassay）で確認
せられた。
実施例4. 実施例１の正荷電樹脂（樹脂Ａ）の１重量％懸濁液1ml
をサツカロミセス セレビシエー（saccharomyces cere
visiae）の一昼夜培養液10mlに添加し、次いで実施例１
の負荷電樹脂（樹脂Ｂ）の１重量％懸濁液0.5mlを添加
した。細胞の95％以上が急速に管の底に沈降した。培地
をサブロー（sabarouds）培地10mlに10％のぶどう糖を
添加したものと24hr毎に置換した。CO2の発生とエタノ
ールの生成が５日以上にわたつて継続した。
をサツカロミセス セレビシエー（saccharomyces cere
visiae）の一昼夜培養液10mlに添加し、次いで実施例１
の負荷電樹脂（樹脂Ｂ）の１重量％懸濁液0.5mlを添加
した。細胞の95％以上が急速に管の底に沈降した。培地
をサブロー（sabarouds）培地10mlに10％のぶどう糖を
添加したものと24hr毎に置換した。CO2の発生とエタノ
ールの生成が５日以上にわたつて継続した。
実施例5. 実施例１の記載とほとんど同一の方法で５億個のCHO細
胞を樹脂Ａ及びＢで固定化した。ただし、各樹脂の１重
量％懸濁液500ミクロリツトルを使用した点だけが異
る。生成した凝集物を25ミリリツトルの培地中に再懸濁
した。７日間にわたる観察による細胞の生存数に対して
は樹脂密度を増加しても悪影響を認めなかつた。
胞を樹脂Ａ及びＢで固定化した。ただし、各樹脂の１重
量％懸濁液500ミクロリツトルを使用した点だけが異
る。生成した凝集物を25ミリリツトルの培地中に再懸濁
した。７日間にわたる観察による細胞の生存数に対して
は樹脂密度を増加しても悪影響を認めなかつた。
本発明は、その実施態様として以下のものを含む。
1.非固定依存性細胞を含有している培地を、正及び負に
荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成した凝集物と
接触させて、細胞を凝集物に結合させ、これに担持させ
る細胞の培養方法であって、該樹脂が0.01ないし1.5ミ
クロンの平均粒径を有する架橋共重合体粒子である細胞
の培養方法。
荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成した凝集物と
接触させて、細胞を凝集物に結合させ、これに担持させ
る細胞の培養方法であって、該樹脂が0.01ないし1.5ミ
クロンの平均粒径を有する架橋共重合体粒子である細胞
の培養方法。
2.凝集物をその上に担持する細胞と共に培養器内で沈澱
させ、沈澱物上の培地を交換する前記第１項に記載する
方法。
させ、沈澱物上の培地を交換する前記第１項に記載する
方法。
3.樹脂の凝集物が培地との接触を行なうに先立って形成
される前記第１項に記載する方法。
される前記第１項に記載する方法。
4.樹脂の凝集物が反対電荷の樹脂を培地に別々に添加す
ることによってその場に形成される前記第１項に記載す
る方法。
ることによってその場に形成される前記第１項に記載す
る方法。
5.正に荷電した樹脂を培地中に分散した後、負に荷電し
た樹脂を添加する前記第４項に記載する方法。
た樹脂を添加する前記第４項に記載する方法。
6.樹脂が単量体１単位当り0.1ないし1.5個のイオン交換
官能基を有する近似的な球形粒である前記第１項に記載
する方法。
官能基を有する近似的な球形粒である前記第１項に記載
する方法。
7.細胞がCHO細胞系統、マウス骨髄腫細胞、マウスハイ
ブリドーマ細胞、又はサッカロミセスセレビシエー（sa
ccaromyces cerevisiae）細胞である前記第１項に記載
する方法。
ブリドーマ細胞、又はサッカロミセスセレビシエー（sa
ccaromyces cerevisiae）細胞である前記第１項に記載
する方法。
8.非固定依存性細胞の水に懸濁したものを、正及び負に
荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成した凝集物と
接触させ、細胞を凝集物に結合、担持させ、該樹脂凝集
物上に固定した細胞を分離する細胞の固定化方法であっ
て、該樹脂が0.01ないし５ミクロンの範囲の平均粒径を
有する架橋共重合体である、細胞の培養又は細胞生産物
の製造のための細胞の固定化方法。
荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成した凝集物と
接触させ、細胞を凝集物に結合、担持させ、該樹脂凝集
物上に固定した細胞を分離する細胞の固定化方法であっ
て、該樹脂が0.01ないし５ミクロンの範囲の平均粒径を
有する架橋共重合体である、細胞の培養又は細胞生産物
の製造のための細胞の固定化方法。
9.樹脂が単量体１単位につき0.1ないし1.5個のイオン交
換官能基を有する近似的に球形粒である前記第８項に記
載する方法。
換官能基を有する近似的に球形粒である前記第８項に記
載する方法。
10.樹脂凝集物が細胞懸濁物と接触するに先立って形成
される前記第８項に記載する方法。
される前記第８項に記載する方法。
11.樹脂凝集物が細胞懸濁物に反対電荷を有する樹脂を
別々に添加することによってその場で形成される前記第
８項に記載する方法。
別々に添加することによってその場で形成される前記第
８項に記載する方法。
12.正に荷電した樹脂を細胞懸濁物に分散させた後、負
に荷電した樹脂を添加する前記第11項に記載する方法。
に荷電した樹脂を添加する前記第11項に記載する方法。
13.細胞がCHO細胞系統、マウス骨髄腫細胞、マウスハイ
ブリドーマ細胞、又はサッカロミセスセレビシエー細胞
である前記第８項に記載する方法。
ブリドーマ細胞、又はサッカロミセスセレビシエー細胞
である前記第８項に記載する方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン・オットー・ネイプルズ アメリカ合衆国ペンシルバニヤ州19025, ドレシャー，ドレシャータウン・ロード 1570
Claims (7)
- 【請求項１】非固定依存性細胞の水に懸濁したものを、
正及び負に荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成し
た凝集物と接触させ、細胞を凝集物に結合、担持させ、
該樹脂凝集物上に固定した細胞を分離する細胞培養用又
は細胞生産物製造用の微細担体系の製造方法であって、
該樹脂が0.01ないし５ミクロンの範囲の平均粒径を有す
る架橋共重合体である方法により製造した樹脂凝集物と
該樹脂凝集物上に固定した非固定依存性細胞とを含む細
胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系。 - 【請求項２】非固定依存性細胞の水に懸濁したものを、
正及び負に荷電したイオン交換樹脂を組合わせて形成し
た凝集物と接触させ、細胞を凝集物に結合、担持させ、
該樹脂凝集物上に固定した細胞を分離する細胞培養用又
は細胞生産物製造用の微細担体系の製造方法であって、
該樹脂が0.01ないし５ミクロンの範囲の平均粒径を有す
る架橋共重合体である、細胞の培養又は細胞生産物の製
造用の微細担体系の製造方法。 - 【請求項３】樹脂が単量体１単位につき0.1ないし1.5個
のイオン交換官能基を有する近似的に球形粒である前記
特許請求の範囲第２項に記載する方法。 - 【請求項４】樹脂凝集物が細胞懸濁物と接触するに先立
って形成される前記特許請求の範囲第２項に記載する方
法。 - 【請求項５】樹脂凝集物が細胞懸濁物に反対電荷を有す
る樹脂を別々に添加することによってその場で形成され
る前記特許請求の範囲第２項に記載する方法。 - 【請求項６】正に荷電した樹脂を細胞懸濁物に分散させ
た後、負に荷電した樹脂を添加する前記特許請求の範囲
第５項に記載する方法。 - 【請求項７】細胞がCHO細胞系統、マウス骨髄腫細胞、
マウスハイブリドーマ細胞、又はサッカロミセスセレビ
シエー細胞である前記特許請求の範囲第２項に記載する
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US854982 | 1986-04-28 | ||
| US06/854,982 US4952506A (en) | 1986-04-28 | 1986-04-28 | Immobilization of nonanchorage-dependent cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62269691A JPS62269691A (ja) | 1987-11-24 |
| JPH0779697B2 true JPH0779697B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=25320050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62106171A Expired - Lifetime JPH0779697B2 (ja) | 1986-04-28 | 1987-04-28 | 細胞培養用又は細胞生産物製造用の微細担体系、及びその製造方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4952506A (ja) |
| EP (1) | EP0245986B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0779697B2 (ja) |
| KR (1) | KR910006601B1 (ja) |
| AT (1) | ATE92097T1 (ja) |
| CA (1) | CA1290269C (ja) |
| DE (1) | DE3786698T2 (ja) |
| DK (1) | DK214187A (ja) |
| FI (1) | FI871830A (ja) |
| NO (1) | NO871734L (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP1882738A4 (en) * | 2005-05-20 | 2009-02-25 | Arkray Inc | METHOD FOR OBTAINING MICROORGANISMS AND NUCLEIC ACIDS USING FINE PARTICLES AND FOR THE METHOD OF USING THE KIT |
| EP1963526A4 (en) | 2005-12-09 | 2009-11-18 | Promega Corp | PURIFICATION OF NUCLEIC ACID WITH A BINDING MATRIX |
| US8420379B2 (en) * | 2008-01-10 | 2013-04-16 | Universal Bio Research Co., Ltd. | Material for capturing microbes, device for capturing microbes, method of capturing microbes, and method of producing material for capturing microbes |
| CN107523534B (zh) * | 2017-09-20 | 2020-10-02 | 北京亚东生物制药有限公司 | 重组cho细胞的贴壁微载体悬浮培养方法 |
Family Cites Families (11)
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|---|---|---|---|---|
| US29130A (en) * | 1860-07-10 | cookb | ||
| US3887430A (en) * | 1972-02-24 | 1975-06-03 | Dow Chemical Co | Culture medium for tissue culture techniques |
| US4036693A (en) * | 1976-02-02 | 1977-07-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Treatment of cell culture microcarries |
| US4189534A (en) * | 1976-11-11 | 1980-02-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell culture microcarriers |
| US4380590A (en) * | 1978-09-19 | 1983-04-19 | Rohm And Haas Company | Emulsion copolymer cation exchange resins |
| US4200695A (en) * | 1978-09-19 | 1980-04-29 | Rohm And Haas Company | Flocs for filtration and deionization prepared from cationic and anionic emulsion ion exchange resins |
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| US4347320A (en) * | 1980-11-24 | 1982-08-31 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of microorganisms in gelled carrageenan |
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| EP0101724A1 (en) * | 1982-02-23 | 1984-03-07 | Ventrex Laboratories Inc. | Multipurpose supports for immunological and biological use |
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1986
- 1986-04-28 US US06/854,982 patent/US4952506A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-04-14 CA CA000534646A patent/CA1290269C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-27 FI FI871830A patent/FI871830A/fi not_active Application Discontinuation
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- 1987-04-27 AT AT87303692T patent/ATE92097T1/de active
- 1987-04-27 KR KR1019870004059A patent/KR910006601B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-04-27 NO NO871734A patent/NO871734L/no unknown
- 1987-04-27 DK DK214187A patent/DK214187A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-04-27 DE DE87303692T patent/DE3786698T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-28 JP JP62106171A patent/JPH0779697B2/ja not_active Expired - Lifetime
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