SU1161548A1 - Способ получени желатиновых микроносителей дл культивировани клеток - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в непол рном органическом растворителе , обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т личающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса и улучшени  технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул провод т 1,4-1,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

Description

а

00 . . Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к получению микроносителей дл  и мoбилизaции и вьфащиваниА клеток рост которых BiOSMoaKH на поверхности носител , : Использование микроносителей дл  культивировани  позвол ет выращиват значительные количества клеток в одном р еажторе, уйеньшает трудоем; кость процесса, позвол ет достичь боиырей стерильности и тем самым открывает возможности использовани  методов выращивани  клеток в пpo вJшпeнныx масштабах. Дл  культивировани  клеток используютс  различные микроносители в частности, на основе декстрана, модифицированного коллагеном fl. Недостаткам микроносител   вл ютс  двустадийность его синтеза, невозможность его использовани  дл  культивировани  некоторых типов клеток, а также ухудшение его характеристик при повторном использовании . Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту  вл етс  способ получени  желатиновых микроносителей дл  культивировани  клеток, включающей получение желатиновьпс гранул при диспергировании водного раствора желатина в непол р органическ растворителе (хлороформ-толуол ) , обработку гранул диальдегидами (глутаровым альдегид и их сепарирование. Способ предусматривает раздельно проведение всех стадий, двухкратное сепарирование, использование высоки концентраций глутарового альдегида Недостатками способа  вл ютс  ег многостадийность, сложность, большо расход глутарового альдегида и недостатки целевого продукта (окрашивание гел  при шкpocкoпиpoвaнии, неспеци4 1ческа  сорбци  по свободным альдегидным группам). Цель кзобретёни  - упрощение пр :цесса и улучшение технологических характеристик целевого продукта. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получё ни  желатиновьЕк микроносителей дл  .культивировани  клеток, включа1ощем получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в непол рном органкче;ском 82 растворителе, обработку гранул -, диальдегидами и их сепарирование, обработку гранул провод т 1,41 ,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раст-, вора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами. Б качестве диальдегидов можно использовать глутаровьй альдегид, диапьдегид азелаиновой кислоты, глиоксаль , терефталевый диальдегид. Обработка протекает в среде различных непол рных органических растворителей (машинного,трансформаторного масла, изооктана, толуола, ксилола, бензолаj хлороформа и др.) с последующим отмыванием реакционной среды и последующим фракционированием, выдел   частицы микроносител  с оптимальными размерами 100-250 мкм. В качестве восстанавливакнцих реагентов используютс  реагенты, воссТанавливашЦл св зи и альдегидные группы , например боргидриды щелочных металлов , перекись водорода, атомарный водород, дитионит (гидросульфит) натри  и др.. Использование предлагаемого cftoсоба обеспечивает упрощение процесса получени  носител : уменьшаетс  стадийность способа получени  микроносител  (отпадает необходимость в стади х выпаривани , повторного автоклавировани  и приготовлени  трёхкомпонентной смеси), упрощаетс  состав реакционной среды (вместо трехкомпонентной смеси по известному способу в предлагаемом используетс  однокомпонентна  система), уменьшаетс  обща  продолжительность проведени  процесса уменьшаетс  расход поперечно сшивающего агента (вместо использовани  20 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида на 1,5 г желатина по известному способу в гсредлагаемом способе на такое же количество желатина используетс  3 МП 25%-ного раствора глутарового альдегида)t Использование предлагаемого способа позвол ет заметно улучшить также качество микроносител : обработка восстанавливающим реагентом позвол ет обесцветить частицы носител  (тем самым улучшаютс  его технологические качества) и облегчает непрерывный анализ роста кле- .

ток на микроносител х} обработка восстанавливающим реагентом позвол ет удалить несв занные альдегидные группы ч тем самым увеличить специфичность взаимодействи  носител  с клеткой , использование услови  получени  микроносител  позвол ет получить носитель, который стабилен не только при комнатной температуре (20-25 ) , но и при более высоких температурах, что облегчает проведение различных операций (стерилизации, дальнейшего модифицировани ) с ним.

Согласно предлагаемому способу получен микроноситель с плотностью и прозрачностью, близкой таковым у воды, значительной химической и механической стабильностью, с размерами частиц, обеспечивающими оптимальный рост клеток и шарообразной формой микросферы, обеспечивающей быctpoe прикрепление клеток к поверхности микроносител  и эффективный рост и распластьгаание клеток самого различного типа. Полученные микроносители не разрушаютс  обьгчными культуральньпут средами и позтому они могут быть использованы многократно. Рост культур клеток на них можно осуществить как а статических услови х, так и суспензионным методом в динамических услови х, т.е. в услови х глубинного культивировани  клеток.

... .

При мер 1. 400 мл 15%-ного раствора желатина,полученного при 50С, суспендинуют в 2 л смеси, состо щей иэ машинного масла и изооктана (1:1 по объему), и интен сивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавлива  мешалку, к смеси приливают 150 мп 25%-ного раствора глутарового альдегида конечна  . концентраци  1,46% и перемешивают еще 20 мин. После этого носитель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изоокта ом,гор чей водой в присутствии поверхностно-активных веществ гор чей водой. Получевный микроноситель заливают 1 л 21-ного раствора боргидрида натри  и ввдерживают 0,5 ч, затем фильтруют, промвают водой .и фра1кхщон1фуют, отбира  фракцию с размерами частиц 100250 мкм. Получают 540 г влажйого микроносител , содержащего (в пересчете на сухое вещество) 10% желатина .

Прим е р 2. 200 мл 25%-ного раствора желати 1а, пол -ченного при , суспендируют в 1   смеси, состо щей из трансформаторного масла и и ооктана (1:1 по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавлива  мешалку, к смеси прибавл ют 75 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают еще 20 мин. Затем микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, гор чей водой в присутствии поверхностно-активных веществ.и еще гор чей водой. Полученный носитель запивают 500 мл 10%-ного раствора перекиси водорода и вьщерживают 0,5 ч; затем фильтруют, промьюают водой и фракционируют, отбира  фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 260 г влажного микроносител , содержащего (в пересчете на сухое вещество) 18% желатина .

П р и мер 3. 200 мл 20%-ного. раствора желатина, полученного при 50°С,суспендируют в 1 л ксилола и интенсивно перемешивают при комнатной температзфе в течение 3 мин. Затем , не останавлива  мешалку, прибавл ют 75 л 25%-ного глутарового альдегида и перемешивают еще 5 мин. Микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм, промывают петролейным эфиром, гор чей водой в присутствий поверхностно-активных веществ и чистой гор чей водой.Полученный микроноситель заливают 500 мл 0 5%-ного раствора гидросуль4 гта натри  и вьщер онвают 1 ч , затем фильтруют, промьюают водой и фракционируют , отбира  фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 200 г влажного никроносител , содержащего (в пересчете на сухое в ество) 18% желатина.

и м е р А. 200 мл гОХ-иого аствора желатина суспендируют в 1 л ксилола и интенсивно перемеши-г ают в течение 3 кии. Затем, не станавлива  нешалку к суспензии рибавл ют 50 мп 35%-ного раствоa глиоксал  (конечна  концентраци  1, и перемешивают еще 5 мин. алее обрабатывают согласно примеру . Получают 195 г микроносител ,со5 держап;его l7% желатина (в пересчете на сухое вещество). Пример 5. 200 мл 20%-ного раствора желатина суспендируют в 1 л смеси, состо щей из машинного масла и изооктана (1:1 по объему),и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин Затем, не останавлива  мешалку, к суспензии прибавл ют 50 ш |0%-н го раствора терефтальевого диальде гида (конечна  -концентраци  1,6%) в диоксане и перемешивают еще 60 мин. Полученные гранулы отфильт ровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, гор чей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз гор чей водой. Полученный материал запивают 500 м раствора перекиси водорода и вьщерживают 0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбира  фракцию с размерами частиц 100-250 мкм. Получают 180 г микроносител , содержащего 17% лселатина (в пересчете на сухое веи ество) П р и м е р 6. 200 мл 20%-ного желатина суспендируют в 1 л смеси, состо щей из маи  нного масла и изооктана (1:1 по объему), и интен сивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем не останавлива  мешалку, к суспензии прибавл ют 80 мл 28%-ного раст вора свежеприготовленного диальдегида азелаиновой кислоты (конечна  концентраци  1,75%) и перемешивают 20 мин. Полученные гранулы отфильт ровывают на сите 100 мкм и промывают Изооктаном, гор чей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз водой. Гранулы заливают 500 мп 8%-ного раствора перекиси водорода и вьщержившот 0,5 ч, фильтруютj прог-ашают водой и фракционируют, отбира  фракцию с размером частиц 100--250 мкм. Получают 190 г микроносител  с содержанием 17% желатина (в пересчет на сухое вещество), Микроносители, полученные согла но примерам содержат 10-18% желатина (в пересчете на cyicoe вещества) имеют сходные свойства и могут быть применены (д.п  размно жени  клеток) с од1 Е11аковым успехом . 8 Выращивание различных типов клеток на предлагаемых микроносител х протекает следующим .образом. 10 мл плотного осадка микроносителей (предварительно стерилизованных автоклавированием), что обеспечивает культуральную поверхность около 2500 см, и 40.20 свежеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста суспендируют в 100 мл питательной среды 199 с 0,15% гидроЛизата лактальбумина , 5% тел чьей сыворотки, 0,1% галактозы, 20 мм буфера HEPES (рН 7,4) и антибиотиками. Культивирование провод т в сосуде объемом 250 мл с подвешенной мешалкой при 37°С. В первые сутки культивировани  число оборотов мешалки составл ет 10 об/мин, на вторые и третьи сутки- 20-30 об/мин и далее 50-60 об/мин. Через 48 ч культивировани  .замен ют 50-70% среды на свежую. Спуст  4-5 сут после начала культивировани  на частицах микроносителей формируютс  плотные культуры клеток куриных эмбрионов. Концентраци  клеток к этому времени достигает (2,,3) млн. кл/мл, т.е. за 4-5 сут их число возрастает ,в среднем в 6,5 раза. Клетки почек зеленых мартьшек ГКПЗМ) первого субпассажа культивируют на микроносител х в услови х, аналогичных описанным в примере 1, с той разницей, что посевна  концентраци  клеток в данном примере составл ет 1,5-10 . кл/мл, концентраци  сыворотки 10%. Через 4-5 сут культивировани  концентраци  клеток .достигает (1,5±0,22) млн. кл/мл, возраста  в среднем в 10,8 раза.Клетки диплоидной лин.ии И-21 змбриона человека, вз тые на зфовне 24 и 28 пассажей., . выращивш.от на микроносител х, как описано выше, с той разницей, что вместо среды 199 используют основную среду Игла. Через 5 сут культивировани  число клеток увеличиваетс  в среднем в 7j6 раза, концентраци  клеток при этом достигает (1,,11) млн кл/мл, Таким образом, преимущества при использовании предлагаемого способа заключаютс  в том, что он проще известного в осу1цествлении: меньше стадий, однокомпонентна  система.

7 11615488

уменьшена продолжительность, процес-бедных альдегидных групп) которые

са;позвол ет экомить сьфье (умень-обуславливают неспецнфическую адшен расход глутарового альдегида);сорбдию компонентов среды), прозра

улучшить качество целевого продукта,цен (чтопозвол ет проводитьвизуальтак как полученный микроносительs ный контроль культур клеток на микроностабилен в широком диапазоне темпе-сител х),может быть использован дл  выратур (до ), не содержит сво-ращивани  клеток многократно.

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИ-

   НОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получе ние желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т пинающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

   Л161548

   1 1161548