CN105372356B - 一种n‑糖链固相富集并质谱分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及一种用氨基磷酸盐衍生N‑糖链并用Ti4+修饰磁性纳米材料富集衍生后的N‑糖链的方法，其包括：首先通过对N‑糖链的还原端进行氨基磷酸盐的衍生在N‑糖链上引入磷酸根，再将Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+置于衍生后的糖链溶液中，通过Ti4+和糖链中的磷酸根之间的螯合反应，将糖链固定在磁性纳米材料上，随后将未和纳米材料结合的非糖链分子(如蛋白质、多肽、无机盐等)清洗除去，最后再在碱性条件下将捕获的糖链从材料上解离下来，送入质谱分析糖链。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，能实现N‑糖链的高灵敏、高选择性质谱分析。
Description
技术领域
本发明属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及一种N-糖链衍生、固相富集并质谱分析的方法。本发明方法能显著地提高N-糖链质谱分析的选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。
背景技术
蛋白质N-糖基化是生物体内普遍存在的一种翻译后修饰，据研究报道，生物体内约有1/2以上的蛋白质会发生N-糖基化。糖蛋白的N-糖链具有重要的生物学功能，在细胞识别和分子识别，蛋白质折叠，维持蛋白质正确构象中起到重要作用。研究同时表明，许多重大疾病的发生发展往往伴随着N-糖链组成、结构等的改变。高灵敏地鉴定生物体内的N-糖链是进一步研究其组成和结构的首要前提。然而，N-糖链研究面临着如下困难：首先，糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度通常较低，因此，N-糖链的含量相对较低；第二，N-糖链由于缺乏疏水性基团以及缺少可带电的基团，因此在质谱中的离子化效率往往比蛋白质或肽段低，不易被质谱鉴定；第三，N-糖链本身的微观不均一性导致糖链在质谱中的信号分散和减弱，更加难以被质谱高灵敏鉴定；第四，目前尽管已有亲水富集柱，石墨化碳柱等固相富集方法，但这些方法由于固相载体和N-糖链之间的相互作用较弱，存在选择性较差的问题。
鉴于此现状，本申请的发明人拟提供一种更加特异和更加便于固液分离的N-糖链的固相富集方法，该方法有利于实现N-糖链的高选择性富集和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质组学和糖组学的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效的实现N-糖链选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的方法。
本发明提供了一种利用氨基磷酸盐对N-糖链进行衍生，并采用Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+富集N-糖链并质谱分析的方法。本发明利用氨基磷酸盐的氨基和N-糖链还原端的醛基间的还原胺化反应将磷酸根引入到N-糖链中，再利用Fe3O4@Ti4+上的Ti4+和衍生后N-糖链中磷酸根之间的螯合作用，将N-糖链固定在磁性纳米材料上,而非糖链则被清洗除去,最后再利用氨水将N-糖链从材料上解离下来，从而实现N-糖链的选择性富集并质谱分析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.对蛋白质样品进行去糖链酶PNGase F处理，将N-糖链从蛋白质上解离下来；
2.用氨基磷酸盐对其中的N-糖链进行衍生并用Ti4+修饰的磁性纳米材料进行富集；
3.将N-糖链从磁性纳米材料上洗脱下来送入质谱分析。
具体的，本发明的一种固相富集N-糖链并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基磷酸盐对N-糖链进行衍生后，、以磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+为吸附剂，实现N-糖链的选择性富集，其包括步骤：
(1)对蛋白质样品进行去糖链酶PNGase F处理，将N-糖链从蛋白质上解离下来；
(2)对蛋白质样品进行碱性磷酸酶CIP处理，去除蛋白质样品中的磷酸根；
(3)用氨基磷酸盐对其中的N-糖链进行衍生；
(4)加入Fe3O4@Ti4+材料与样品溶液充分混合；
(5)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；
(6)用缓冲液清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；
(7)用氨水重新混匀材料；
(8)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。
更具体的，本发明的方法中，采用Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+为吸附剂，利用材料上的Ti4+和经氨基磷酸盐衍生后的N-糖链上的磷酸根之间的反应，将N-糖链固定在磁性纳米材料上，经外加磁场作用使得磁性材料与溶液分离，最终实现N-糖链的富集和质谱分析；
本发明中，蛋白质样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL；
所述步骤(1)中，将蛋白质样品溶于10-50mM碳酸氢铵水溶液中，按照每mg蛋白质加入1μL的PNGase F，在37摄氏度下混合12-16小时，使样品中的N-糖链从蛋白质上解离下；
所述步骤(2)中，在上述蛋白质样品中按照每mg样品加入1μL碱性磷酸酶CIP，在37摄氏度下混合12-16小时，使样品中磷酸化蛋白质上的磷酸根从蛋白质上解离下来；
所述步骤(3)中，将上述蛋白质样品冻干，并用甲醇使蛋白质浓度保持在10ng/μL-1000ng/μL；再加入氨基磷酸盐，使氨基磷酸盐浓度保持为0.5-2.5mg/mL；二者在60℃-90℃反应1-3小时；
所述步骤(4)中，将上述蛋白质样品冻干，再加入50％乙腈水溶液(含1-5％的三氟乙酸TFA)，使蛋白质浓度保持在10ng/μL-1000ng/μL；再加入Fe3O4@Ti4+磁性纳米粒子，使纳米粒子浓度保持为1mg/mL-10mg/mL；二者在25-37摄氏度混合0.5-2小时；
所述步骤(5)中，外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；
所述步骤(6)中，对步骤(3)中得到的下层固体相，用50μL－1mL 50％乙腈(ACN)水溶液(含1-5％的三氟乙酸TFA)清洗材料1-3次；每次清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；
所述步骤(7)中，将(6)中收集的材料中用用5-10μL的5％NH3·H2O溶液重新混匀材料，将N-糖链从材料上解离下来；
所述步骤(8)中，外加磁场再次将材料从上清液中分离后，取上清液与有机基质含有2,5-二羟基苯甲酸(DHB)混合，进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱MALDI-TOF-MS分析；
本发明的N-糖链固相富集并质谱分析的方法具有如下优点：
由于磷酸根和Ti4+之间的螯合作用强，螯合反应速度快,能显著地提高N-糖链的质谱分析选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。
附图说明
图1为本发明富集方法的流程图。
图2为100ng/μL标准糖链麦芽七糖DP7的MALDI-TOF-MS谱图，MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(％Intensity)，横坐标为质荷比(m/z)；(a)是衍生前，(b)是经AMS衍生后，上样量和衍生前相同；对比图(a)和图(b)显示出，DP7被完全衍生，未衍生峰没有被检测到。
图3为质量比为1:100的AMS衍生后的DP7和牛血清白蛋白BSA酶解肽段的MALDI-TOF-MS谱图，MALDI-TOF-MS谱图纵坐标为质谱峰的相对强度(100％Intensity)，横坐标为质荷比(m/z)；(a)是富集前；(b)是富集后；“﹒”为来自BSA的酶解肽段，“*”为AMS衍生后的DP7；对比图(a)和图(b)显示出，经过富集后，N-糖链能被选择性的富集下来，实现高灵敏质谱鉴定。
图4为从复杂人血清样品中衍生和固相富集得到的N-糖链，图中显示出，经过衍生和富集后，有32条N-糖链被成功富集和质谱鉴定。
具体实施方式
通过下面的实例对本发明的N-糖链衍生、固相富集并质谱分析方法进一步说明。
实施例1
N-糖链衍生的实验
用甲醇配制100μL 100ng/μL的标准糖链麦芽七糖(DP7)，加入0.5-2.5mg/mL的氨基磷酸盐4-氨基苯磷酸钠盐(AMS)，在60-90摄氏度孵育1-3小时；冻干上述样品，并在其中加入50μL－1mL 50％ACN水溶液(含1-5％TFA)混合0.5-2小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL 50％ACN水溶液(含1-5％TFA)清洗材料1-3次，每次收集固相材料；再用5-10μL的NH3·H2O溶液重新混匀材料；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有N-糖链的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图2所示。
实施例2
Fe3O4@Ti4+对N-糖链选择性富集能力的实验
用甲醇配制100μL 10ng/μL级别的标准糖链麦芽七糖(DP7)和1μg/μL的牛血清白蛋白(BSA)酶解肽段，得到糖链和多肽的混合物，加入0.5-2.5mg/mL的氨基磷酸盐4-氨基苯磷酸钠盐(AMS)，在60-90摄氏度孵育1-3小时；冻干上述样品，并在其中加入50μL－1mL50％ACN水溶液(含1-5％TFA)混合0.5-2小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL 50％ACN水溶液(含1-5％TFA)清洗材料1-3次，每次收集固相材料；再用5-10μL氨水溶液重新混匀材料；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有N-糖链的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图3所示。
实施例3
Fe3O4@Ti4+对复杂样品人血清中N-糖链衍生和固相富集选择性能力的实验
用10-50mM碳酸氢铵水溶液配制100ng/μL级别的人血清酶解肽段混合物10μL，加入1μL的PNGase F酶，在37摄氏度下孵育12-16小时，再加入1μL的碱性磷酸酶CIP在37摄氏度下孵育12-16小时；冻干上述样品，用甲醇重溶样品至终浓度为100ng/μL，加入0.5-2.5mg/mL的氨基磷酸盐4-氨基苯磷酸钠盐(AMS)，在60-90摄氏度孵育1-3小时；冻干上述样品，并在其中加入50μL－1mL50％ACN水溶液(含1-5％TFA)混合0.5-2小时；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来；弃除上清液，然后取50μL－1mL 50％ACN水溶液(含1-5％TFA)清洗材料1-3次，每次收集固相材料；再用5-10μL氨水溶液重新混匀材料；在外加磁场作用下将磁性纳米材料从溶液中分离出来，取上清液(最终的含有N-糖链的溶液)1μL点样于MALDI靶板上，待干燥后再点样等体积的DHB基质溶液，干燥结晶后进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图4所示。
Claims (1)
1.一种N-糖链固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基磷酸盐对N-糖链的还原端进行衍生，再采用Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+为吸附剂对衍生后的N-糖链进行吸附，实现N-糖链的选择性富集；其包括步骤：
(1)对蛋白质样品进行PNGase F去糖基化处理，使糖蛋白质上的糖链释放；
所述的蛋白质样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL，溶于10-50mM碳酸氢铵缓冲液中，其中，蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的PNGase F酶；
(2)加入碱性磷酸酶，去除蛋白质样品中磷酸化蛋白质上的磷酸根；
所述的蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的碱性磷酸酶；
(3)冻干去除溶液后，再加入氨基磷酸盐溶液对糖链的还原末端进行衍生，
所加入的氨基磷酸盐终浓度为0.5-2.5mg/mL；反应溶液为甲醇，反应时间为1-3小时，反应温度为60-90摄氏度；
(4)冻干去除溶液后，再加入Fe3O4@Ti4+纳米材料及富集溶液，混匀，其中，
加入的Fe3O4@Ti4+材料浓度为1mg/mL-10mg/mL；Fe3O4@Ti4+磁性纳米材料进行样品富集的温度是25-37摄氏度，样品富集的时间是0.5-2小时，溶液为50％乙腈水溶液，其中含1-5％的三氟乙酸TFA；
(5)外加磁场，使磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；
(6)用50μL－1mL 50％乙腈水溶液，其中含1-5％的三氟乙酸，清洗材料1-3次，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；
(7)加入氨水溶液，用5-10μL的5％NH3·H2O溶液混匀材料，将糖链从材料上解离；
(8)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。
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| Enrichment of glycopeptides for glycan structure and attachment site identification;Jonas Nilsson et al.;《nature methods》;20091130;第6卷(第11期);全文 * |
| Glycomic analysis using glycoprotein immobilization for glycan extraction;Shuang Yang et al.;《Anal Chem.》;20130604;第85卷;全文 * |
| Graphene based soft nanoreactors for facile "one-step" glycan enrichment and derivatization for MALDI-TOF-MS analysis;Haihong Bai et al.;《Talanta》;20031231;第117卷;摘要，第2页"2 Experiments"至第3页左栏 * |
| Purification and Identification of O-GlcNAc-Modified Peptides Using Phosphate-Based Alkyne CLICK Chemistry in Combination with Titanium Dioxide Chromatography and Mass Spectrometry;Benjamin L.Parker;《Journal of Proteome Research》;20111231;第10卷;全文 * |
| 基于化学衍生化的蛋白质N-糖链质谱鉴定新方法研究;佟巍;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20121015;第10-12页 * |
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