CN101220128B

CN101220128B - 一种聚甲基丙烯酸甲酯复合微球及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101220128B
Application number: CN2008100333199A
Authority: CN
Inventors: 熊焕明; 陆豪杰
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: CN101220128A

Abstract

本发明属纳米材料技术领域，具体为一种聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)核壳型微球及其制备方法和应用，该微球内核为无机纳米粒子，外壳为PMMA，微球的直径为100～500纳米，无机纳米粒子与PMMA通过化学键、氢键或路易斯酸碱相互作用等方式紧密的结合在一起。该材料在合成过程中不使用任何表面活性剂、乳化剂、相转移试剂或交联剂，最大程度上减少了对蛋白质或多肽质谱信号的干扰。PMMA微球本身就有良好的富集功能，引入无机纳米核之后，能够大大削弱PMMA的信号，并且同时增强了目标分子的质谱信号强度及信噪比，这样采用“富集分离+质谱”的方法可以分析实际生物样品中极低浓度的蛋白质及多肽。

Description

一种聚甲基丙烯酸甲酯复合微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属纳米材料技术领域，具体涉及一种聚合物纳米杂化微球及其制备方法和应用。

背景技术

随着人类基因组全序列测定的完成，蛋白质组研究已成为21世纪生命科学的焦点之一。然而，蛋白质组比基因组复杂的多，蛋白质组学的发展不仅需要新技术的发展和新实验战略的建立，而且还需要学科转移和跨学科合作的精神。虽然，上世纪八十年代末，新的软电离方式电喷雾(ESI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)的发明及成功应用，使生物质谱成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段和蛋白质组研究产业化进程中必不可少的核心设备。然而，ESI离子化机理主要为小分子离子蒸发机制和大分子带电残基机制，因此溶液的pH值、溶剂组成、杂质、盐、喷雾温度、色谱流出梯度变化等条件都会影响分析鉴定结果的准确性。虽然MALDI和飞行时间质谱组合后扩大了被分析物质的质量上限(可达100万Da)，但是盐和其它杂质的存在都会影响MALDI有效鉴定低丰度蛋白质。此外，由于蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系及其复杂，蛋白动态分布范围非常广，例如疾病和信号传导相关蛋白质一般在浓度10^-6-10-¹⁸M之间，在样品预处理过程中还必须加入一些表面活性剂、去垢剂、尿素等试剂来增加蛋白质的溶解度，随之带来的问题是这些杂质或盐分会大大降低蛋白质或肽段的质谱信号，利用目前现有手段尚无法实现一些重要低丰度蛋白质的有效、准确和快速鉴定。所以建立对低丰度蛋白质的高效分离富集和除盐及高灵敏离子化新方法是蛋白质组进一步研究所必须解决的关键技术瓶颈，也是低丰度蛋白质成功鉴定的必要前提。

解决这个难题最简单的方法就是向复杂水溶液中加入某种富集剂，该富集剂对目标分子有专一的吸附性能，能够高效富集溶液中绝大多数的目标分子，而且经过简单的分离操作就能把吸附了目标分子的富集材料分离出来。然后，这种材料还能再次分散到微量的水中，加到MALDI样品板上晾干后即可做质谱分析。聚合物微球恰好能够满足这个要求，它们能够长年在水中稳定悬浮，尺寸、表面基团都能够在合成制备中控制，经过高速离心能从水中分离出来，在超声波下还能再次分散到水中。但是，聚合物的分子量与多肽及蛋白质接近，在MALDI测试过程中也能够电离出碎片，从而严重干扰了目标分子的信号。如果向微球中添加无机纳米粒子，并且让这些纳米粒子与聚合物有强烈的相互作用，那么在电离过程中，纳米粒子就能抓住聚合物抑制其分解，将会降低干扰，增强目标分子的质谱信号、信噪比以及肽段的覆盖度。问题是通常合成这类聚合物纳米粒子核壳型杂化材料时，都需要大量的表面活性剂、乳化剂或交联剂等，保证无机的纳米粒子能够均匀分散到聚合物材料中。但是，这些表面活性剂能够和蛋白质形成加合物使其表观分子量提高，而且表面活性剂自身也能够聚集成高分子量的集团，从而严重干扰了样品的分析。为了获得高效富集分离蛋白质及多肽的聚合物纳米粒子杂化微球，就必须在合成中摒弃任何能够干扰后续质谱分析的物质。

发明内容

本发明的目的在于提出一种性能良好的聚合物纳米杂化微球及其方法。该微球可以高效富集分离蛋白质及多肽。

本发明提出的聚合物纳米杂化微球，是以无机纳米粒子为核，以聚合物PMMA为外壳的核壳型微球，直径在100～500纳米范围，无机纳米粒子的的含量按质量百分比计为1～30％，PMMA的分子量在500～2000Da范围。该微球能够分散在水中形成稳定的牛奶状乳液，经过高速离心能够沉降为胶状物，用超声波还能够再次分散到水中形成乳浊液。该核壳型微球合成过程中不使用任何表面活性剂、乳化剂或交联剂，从而一方面能够高效富集蛋白质和多肽，另一方面不会对后继的质谱分析造成干扰。

本发明中，无机纳米粒子可以是SnO₂、TiO₂、ZnO等无机氧化物，聚合物可以是PMMA或者PS(聚苯乙烯)，但是PMMA对蛋白质和多肽的富集效果更好，所以一般采用PMMA。无机纳米粒子的直径对杂化微球有明显的影响，纳米粒子直径越大，相对表面积就越小，与PMMA的作用力就越弱，在质谱分析中对PMMA电离的抑制就越弱。因此无机纳米粒子的粒径为1-10nm为好。无机纳米粒子的种类对整个材料的影响不大，但是种类不同时，由于比重的不同也会导致在相同质量百分比条件下的纳米核的数量不同。无机纳米粒子的质量百分比超过30％时，整个微球的比重大于水，所以这种微球就很容易从水中沉降下来。PMMA的分子量对杂化微球的性质有显著影响，分子量较低时，一方面微球比较小，另一方面粘度很大，彼此聚集程度高；PMMA分子量太大时，微球直径过大，比表面积下降，对蛋白质、多肽的吸附性能减弱。

本发明提出的PMMA核壳型微球可采用下三种方法之一种进行制备：

(1)在无机纳米粒子表面首先修饰上PMMA的低聚物或共聚物，然后溶解到MMA单体中，直接加入合成PMMA的水相体系，MMA在聚合反应生成微球的同时，形成核壳型纳米粒子，具体步骤是：

首先在合成纳米粒子的同时就把带有双键的有机羧酸基团甲基丙烯酸根或丙烯酸根修饰到无机纳米粒子表面上，把这种无机纳米粒子按照“相似相溶”的原则分散到MMA单体中，在加热、紫外光照或超声下引发单体聚合，并且控制聚合物在每个无机纳米粒子的表面形成薄薄的一层，厚度为1～10纳米，立即中止反应，把所需的样品从体系中分离出来；由于反应介质中的MMA单体与纳米粒子表面的单体共聚，该反应生成的聚合物壳是通过共价键连接在纳米晶表面上的。这样一种纳米粒子很容易溶解到MMA单体中，然后把这种溶液与合成纯PMMA微球的做法一样加入到水相反应体系中，即可获得含有该无机纳米粒子的PMMA悬浮的微球。

(2)分别制备好有机亲水基团修饰的无机纳米粒子在甲基丙烯酸甲酯(MMA)中的溶胶，将这些溶胶注入合成PMMA的水相体系，无机纳米粒子在被包入PMMA的同时脱去表面亲水基团，最终产物是含有该无机纳米粒子的PMMA悬浮的微球；具体步骤是：

首先合成带有羟基的无机纳米粒子，然后用羟基交换法把具有单个活性羟基的有机分子基团修饰到无机纳米粒子表面，这种无机纳米粒子能够分散到MMA单体中形成稳定的溶胶，并且这种无机纳米粒子在水中能够很快的和水分子发生羟基交换反应脱除表面的亲水基团。这样当把这种溶胶注入到合成PMMA的水相体系中，MMA聚合的同时纳米粒子被包入PMMA并脱去表面基团，最终产物是含有该无机纳米粒子的悬浮的PMMA微球。而通过高速离心和用水洗涤循环反复的操作，可以清除材料中残留的亲水的有机分子，获得纯净的产品。

(3)对于普通的表面没有做过特殊修饰的无机纳米粒子粉体，也可以合成出类似的核壳型PMMA微球。具体步骤是：

把这种无机纳米粒子用超声波分散到MMA单体中形成悬浊液，其中较大的沉淀物通过低速离心除去。然后加入痕量的引发剂(如AIBN)，在较低温度下作快速的预聚，形成粘稠的浆料。然后把它倒入事先加有引发剂(如K₂S₂O₈)的沸水中，高速搅拌，就可以获得核壳型微球的悬浊液，最后用分级离心的方法获得所需要的尺寸均匀的产品。

本发明中，内核与外壳之间通过强相互作用连接在一起。其中，PMMA和无机纳米粒子之间的作用力可以是化学键(共价键或配位键)、氢键、路易斯酸碱作用或者是物理吸附。作用力越强，杂化微球的性质越好。前面提到的3种合成方法，方法1得到的产物中，无机纳米粒子与PMMA之间是共价键作用，方法2的产物中是氢键或者路易斯酸碱相互作用，方法3得到的是简单的物理混合物。

本发明中，为了检测这些杂化微球对蛋白质及多肽的富集效果，把它们分别加入到400nM(10^-9mol/L)的MYO(马的心肌血红蛋白)和1nM的MYO水解产物中，随后检测富集产物的MALDI-TOF质谱。通过与未富集前的样品质谱进行比较，来判断这些微球富集分离的实际效果。结果表明，该微球具有非常好的富集分离蛋白质及多肽的效果。

能够高效富集分离复杂水溶液中的痕量蛋白质和多肽(浓度最低可达到10^-9mol/L)以下，并且在随后的质谱分析中使目标分子表现出增强的信号、信噪比和氨基酸覆盖度，从而大大提高了质谱方法对极低浓度下目标分子的灵敏度和蛋白质的鉴定成功率。

附图说明

图1：分别为用PEGME修饰的SnO₂(a)、TiO₂(b)、ZnO(c)的高分辨透射电镜照片。

图2：用方法2合成的SnO₂@PMMA的透射电镜照片，SnO₂含量是22.3wt.％。

图3：未经富集的MYO蛋白质(a)及其水解产物(b)的质谱，以及纯PMMA微球(c)在相同条件下的质谱。

图4：用实施例1材料富集后的样品质谱。(a)为MYO，(b)为MYO的水解产物。

图5：用实施例2材料富集后的样品质谱。(a)为MYO，(b)为MYO的水解产物。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明。

实施例1

将0.5M的SnCl₄水溶液装入聚四氟乙烯衬底的不锈钢反应釜，在160℃烘箱内水热反应2小时，取出来自然冷却到室温。把上层清液和下层的白色沉淀摇匀后离心后倒出强酸性母液(主要是水解产生的HCl溶液)，再加入少量的PEGME(聚乙二醇单甲基醚，分子量350Da)，用超声波分散溶解。再离心除去不溶的物质，倒出清液。向清液内加入过量的无水乙醇，生成沉淀。离心分离出白色沉淀物，再向其中加入PEGME，溶解生成无色透明溶胶。将此溶胶在100℃烘箱中加热30min挥发除去乙醇，然后在不锈钢反应釜中180℃加热1小时。经冷却后，再次用过量无水乙醇沉淀出无机纳米粒子，离心，并用无水乙醇洗涤，烘干，这样就得到了室温下无色透明非常粘稠的液体PEGME-SnO₂。这种液体做热重分析，结果是SnO₂的含量在25％左右。把这种粘稠的液体溶于MMA单体中，能形成稳定的溶胶。透射电镜下看到SnO₂是单分散的纳米晶，直径在2纳米左右。

制备含有无机纳米核的PMMA微球的一般方法是：把一定量的纳米粒子分散到5gMMA单体中备用，另外5g MMA与80g水加热至75℃后加入0.5g的K₂S₂O₈，并不断搅拌，当溶液略显浑浊时，迅速注入上述备用的单体溶胶，快速升温，让反应体系回流1个小时，得到牛奶色的乳浊液。冷却后，用低速离心6000rpm，6min除去其中大颗粒固体，把上层乳浊液倒出来再次离心，12000rpm，30min得到胶状的杂化微球，这种胶状物能够用超声波再次分散到水中形成乳浊液。经过几次“离心—分散”的操作后，就可以用水洗去全部的PEGME分子(因为它和水是互溶的)。把这种乳浊液蒸干称重就能得到它的质量浓度，把干燥过的固体拿来做热重分析，就能知道其中无机纳米粒子的含量。在本例中，起初PEGME-SnO₂的投料为10g，最终得到的SnO₂@PMMA微球中SnO₂的含量为22.3％，微球的直径在200纳米左右。

测试这类聚合物纳米杂化微球对复杂水溶液中目标分子(蛋白质或多肽)的富集分离效果的一般方法是：向1mL，400nM的MYO水溶液中加入0.5μL，1mg/μL的乳浊液，或者向1mL，1nM的MYO水解后的多肽混合物中加入0.5μL，250μg/μL的乳浊液，然后在37℃摇匀10min，离心分离(16000rpm，20min)得到胶状沉淀物，向胶状沉淀物中加入0.5μL的基质(体积比为1∶1的乙腈与水的混合溶液含0.1％的三氟乙酸，溶质是10μg/μL的α-氰基-4-羟基-肉桂酸)，超声分散后滴加在MALDI样品板上。晾干后即可做质谱分析。MYO的分子量是16942Da，其质谱表现为一系列相关联的峰，其中结合了2个质子的MYO的质荷比m/z在8471Da附近，在这一系列质谱峰中信号最强，所以它的绝对强度和信噪比被用作衡量富集效果的一个指标。对于MYO，水解后得到一系列多肽，每个肽段都有相应的质谱信号，其中m/z在748Da附近的肽段信号最强，所以它的绝对强度和信噪比被用作衡量富集效果的另一个指标。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是734和290，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是40761和2779。

实施例2

制备方法和测试方法实施例1相同，但是起初PEGME-SnO₂的投料为3g，其他条件不变，最终得到SnO₂@PMMA微球中SnO₂的含量为4.6％，微球的直径也是在200纳米左右。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是143和56，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是5109和484。

实施例3

将10mL钛酸四丁酯加入到40mL的PEGME350中，混合后再在细胞粉碎机中进行超声。浸于溶液中的细胞粉碎机中的钛探头会向溶液施加100W/cm²，90min的超声波，反应温度维持在100℃。之后，将得到的透明胶体放在聚四氟乙烯为衬底的不锈钢反应釜中，在氩气保护气氛中加热至200℃保持24hr。冷却至室温后，用无水乙醇沉淀、离心、洗涤PEGME-TiO₂纳米粒子，然后将其溶于乙腈中形成黄色透明溶胶，不溶的固体通过离心除去。该溶胶蒸干后形成黄色透明的非常粘稠的液体，经过热重分析发现，其中TiO₂的含量在15％左右。透射电镜下看到TiO₂是单分散的纳米晶，直径在8纳米左右。

制备TiO₂@PMMA微球的方法与实施例1的方法相同，本例中加入了15g PEGME-TiO₂原料，最终得到的TiO₂@PMMA微球中TiO₂的含量为20.6％，微球的直径也在200纳米左右。

测试方法与实施例1相同。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是309和143，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是29491和2437。

实施例4

制备方法和测试方法实施例3相同，但是起初PEGME-TiO₂的投料为4g，其他条件不变，得到SnO₂@PMMA微球中SnO₂的含量为5.1％，微球的直径也是在200纳米左右。

测试方法与实施例1完全相同。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是71和44，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是5819和444。

实施例5

向PEGME(分子量350Da)0.01M的水溶液里加入KOH和研细的KMnO₄，搅拌反应至绿色消失(让中间产物Mn₂O₄ ^-反应完)，滤掉棕色的MnO₂沉淀，向所得清液里滴加盐酸至中性，然后旋转蒸干，用甲苯溶解产物后，滤掉不溶的KCl，母液旋转蒸发，除去水和甲苯，剩下的就是端基被氧化为羧基的PEGME，记作MePEO-COOH。把新沉淀的Zn(OH)₂与MePEO-COOH的水溶液混合，加热搅拌数小时后滤掉过量的Zn(OH)₂，旋转蒸干所得清液，然后在100℃真空烘箱里干燥过夜。产品就是无水的Zn(MePEO-COO)₂。把Zn(MePEO-COO)₂溶于无水乙醇后，与LiOH的无水乙醇溶液按摩尔比[LiOH]/[Zn²⁺]＝3.5混合，反应过夜。让溶胶在40℃旋转蒸发浓缩，向其中加入过量无水乙醚，充分振荡后放在分液漏斗里静置，液体分为两层，让下层液体在100℃真空烘箱里干燥过夜除尽其中的乙醇和乙醚，就得到MePEO-COO^-修饰的ZnO纳米粒子，记作PEGME-ZnO，该纳米粒子在室温下为无色粘稠的液体，热重分析表明ZnO的质量百分比在20％左右。因此，这种纳米粒子很容易分散到MMA单体中形成溶胶。透射电镜下看到ZnO是单分散的纳米晶，直径在3纳米左右。

制备ZnO@PMMA微球的方法与与实施例1的方法相同，本例中加入了3g PEGME-ZnO原料，最终得到的ZnO@PMMA微球中ZnO的含量为5.8％，微球的直径也在200纳米左右。

测试方法与实施例1完全相同。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是142和51，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是5180和462。

实施例6

将4.66g甲基丙烯酸锌溶于200mL乙醇，80℃下回流3hr得到无色透明的溶液，其中锌盐浓度约为0.1mol/L；将5g氢氧化锂溶于500mL乙醇，用高速剧烈搅拌帮助溶解，滤去不溶物后得到无色透明的LiOH溶液，浓度约为0.2mol/L，利用EDTA和草酸标准溶液分别滴定甲基丙烯酸锌和氢氧化锂的准确浓度。然后将得到的甲基丙烯酸锌和氢氧化锂乙醇溶液按照摩尔比[Zn²⁺]/[LiOH]＝3.5混合。该混合液常温反应8hr后，在旋转蒸发仪中蒸去大部分溶剂，待出现白色浑浊时停止蒸发。4℃下冷却上述浑浊溶液1hr后离心，倾去上层清液后所得固体置于真空烘箱中除去残余溶剂。干燥后得到的固体迅速分散到甲苯和MMA混合液中于60℃下循环水浴10min，通过离心除去不溶物后蒸干所得澄清溶液即得产品。该方法是利用ZnO表面原有自由基引发聚合，得到包覆了聚合物壳层结构的ZnO纳米微粒记作ZnO-Polymer。透射电镜下ZnO内核的直径大小平均为2纳米，热重分析证明这种ZnO-Polymer主要成分就是ZnO，含量在90％以上。该纳米粒子能够溶解在MMA单体中形成非常稳定的溶胶。

制备ZnO-Polymer@PMMA微球的方法与实施例1的方法相同，本例中加入了0.5gZnO@Polymer原料，最终得到的ZnO-Polyme@PMMA微球中ZnO的含量为5.2％，微球的直径也在200纳米左右。

测试方法与实施例1相同。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是840和175，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是5949和1478。

实施例7

将4.4g醋酸锌(含2个结晶水)溶于200mL乙醇，80℃下回流3hr得到无色透明的溶液，其中锌盐浓度为0.1mol/L；将5g氢氧化锂溶于500mL乙醇，用高速剧烈搅拌帮助溶解，滤去不溶物后得到无色透明的LiOH溶液，浓度约为0.2mol/L，利用EDTA和草酸标准溶液分别滴定醋酸锌和氢氧化锂的准确浓度。然后将得到的醋酸锌和氢氧化锂乙醇溶液按照摩尔比[LiOH]/[Zn²⁺]＝1.4混合。该混合液常温反应24hr后，旋转蒸发浓缩，再加入3倍体积的环己烷沉淀出ZnO纳米粒子，离心分离。该纳米粒子表面修饰有醋酸根基团，记作ZnO-Ac，它不能溶解在MMA单体中，只能分散成悬浊液。热重分析表明，ZnO含量在80％左右。透射电镜下，ZnO纳米粒子的直径约为3纳米。

制备ZnO-Ac@PMMA微球的方法与实施例1的方法相同，本例中加入了0.7g ZnO-Ac原料，最终得到的ZnO-Ac@PMMA微球中ZnO的含量为5.0％，微球的直径也在200纳米左右。

测试方法与实施例1完全相同。在本例中，指标1(MYO)的绝对强度和信噪比分别是34和18，指标2(MYO的水解肽段)的绝对强度和信噪比分别是4002和237。

上述实施例可以总结为一个表格：

实施例	内核及其含量	内核直径	制备方法	指标1(蛋白质)绝对强度/信噪比	指标2(多肽)绝对强度/信噪比
						1	SnO₂，22.3％	2纳米	2	734/290	40761/2779
2	SnO₂，4.6％	2纳米	2	143/56	5109/484
						3	TiO₂，20.6％	8纳米	2	309/143	29491/2437
4	TiO₂，5.1％	8纳米	2	71/44	5819/444
						5	ZnO，5.8％	3纳米	2	142/51	5180/462
6	ZnO，5.2％	3纳米	1	840/175	5949/1478
						7	ZnO，5.0％	3纳米	3	34/18	4002/237

根据大量的实验结果，可以总结出这样的规律——PMMA与无机纳米内核之间的相互作用强弱决定了这种材料富集分离的效果以及在质谱分析中的表现，具体有以下几个方面：

1、内核含量越高，效果越好。参见实施例1～2，3和4。

2、内核的直径越小，比表面积越大，效果越好。比较例1和例4，例2、例5和例6。

3、内核与PMMA之间的作用力，化学键＞氢键＞物理吸附，导致最终效果是例6＞例5＞例7。

4、在氧化物纳米粒子之间比较，核的种类对结果影响不大。

Claims

1.一种PMMA核壳型微球的制备方法，其特征在于采用下述之一种：

(1)在无机纳米粒子表面首先修饰上PMMA的共聚物，然后溶解到MMA单体中，直接加入合成PMMA的水相体系，MMA在聚合反应生成微球的同时，形成核壳型纳米粒子，具体步骤是：

首先在合成纳米粒子的同时就把带有双键的有机羧酸基团甲基丙烯酸根修饰到无机纳米粒子表面上，把这种无机纳米粒子按照“相似相溶”的原则分散到MMA单体中，在加热、紫外光照或超声下引发单体聚合，并且控制聚合物在每个无机纳米粒子的表面形成薄薄的一层，厚度为1～10纳米，立即中止反应，把所需的样品从体系中分离出来；由于反应介质中的MMA单体与纳米粒子表面的单体共聚，该反应生成的聚合物壳是通过共价键连接在纳米晶表面上的；然后把这种溶液与合成纯PMMA微球的做法一样加入到水相反应体系中，即可获得含有该无机纳米粒子的PMMA悬浮的微球；这里MMA为甲基丙烯酸甲酯；

(2)分别制备好有机亲水基团修饰的无机纳米粒子在MMA中的溶胶，将这些溶胶注入合成PMMA的水相体系，无机纳米粒子在被包入PMMA的同时脱去表面亲水基团，最终产物是含有该无机纳米粒子的PMMA悬浮的微球；具体步骤是：

首先合成带有羟基的无机纳米粒子，然后用羟基交换法把具有单个活性羟基的有机分子基团修饰到无机纳米粒子表面，这种无机纳米粒子能够分散到MMA单体中形成稳定的溶胶，并且这种无机纳米粒子在水中能够很快的和水分子发生羟基交换反应脱除表面的亲水基团；把这种溶胶注入到合成PMMA的水相体系中，MMA聚合的同时纳米粒子被包入PMMA并脱去表面基团，最终产物是含有该无机纳米粒子的悬浮的PMMA微球；而通过高速离心和用水洗涤循环反复的操作，清除材料中残留的亲水的有机分子，获得纯净的产品；

(3)对于普通的表面没有做过特殊修饰的无机纳米粒子粉体，具体步骤是：

把这种无机纳米粒子用超声波分散到MMA单体中形成悬浊液，其中较大的沉淀物通过低速离心除去；然后加入痕量的引发剂，在较低温度下作快速的预聚，形成粘稠的浆料；然后把它倒入事先加有引发剂的沸水中，高速搅拌，获得核壳型微球的悬浊液，最后用分级离心的方法获得所需要的尺寸均匀的产品；

所制得的PMMA核壳型微球，直径为100～500纳米，外壳为PMMA，PMMA的分子量为500～2000g/mol，内核为无机纳米粒子，无机纳米粒子的含量按质量计为1～30％，无机纳米粒子的粒径为1～10纳米，内核与外壳通过化学键、氢键、路易斯酸碱作用或者为物理吸附作用连接在一起，这里PMMA为聚甲基丙烯酸甲酯。

2.根据权利要求1所述的PMMA核壳型微球的制备方法，其特征在于所述的无机纳米粒子材料为SnO₂、TiO₂或ZnO。

3.一种如权利要求1或2所述的制备方法获得的PMMA核壳型微球。

4.一种如权利要求3所述的PMMA核壳型微球在富集、分离水溶液中痕量蛋白质和多肽中的应用。