CN108889285A - 限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用 - Google Patents
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-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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Abstract
本发明提供了一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)使带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到表面吸附有聚合物微球的多孔材料；(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；(3)在不破坏多孔材料孔道内功能基团的前提下，除去多孔材料表面吸附的聚合物微球；(4)对步骤(3)得到的多孔材料外表面进行化学修饰，使外表面具有亲水性，得到所述限进型色谱填料。本发明提供的限进型色谱填料对蛋白具有很高的排阻率，而且对于小分子物质显示出较强的保留能力和分离能力。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离材料的技术领域，涉及一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用。
背景技术
生物和环境样品基体复杂以及被测物浓度低，决定了在测定前必须对其进行合适的前处理。固相萃取由于具有较短的萃取时间、较高的回收率、较高的富集因子、较少的试剂消耗、易于实现自动化及无相分离操作等优点，目前已经成为最为常用的生物体液及环境水样的样品前处理方法。当用固相萃取分离富集生物组织样品中的小分子分析物时，经常碰到的一个问题就是样品中的生物大分子如蛋白质及核酸等，遇到疏水性反相固相萃取填料时发生生物大分子的变性，变性后的大分子物质会吸附在填料的表面，造成填料孔径堵塞、分析物在固定相上的传质效率下降等不利现象，从而使柱效降低、吸附容量下降、萃取柱寿命缩短，最终造成对小分子分析物测定的严重干扰。
限进介质固相萃取吸附剂在一定程度上克服了上述不足，这类吸附剂同时兼具针对大分子的体积排阻功能和针对小分子分析物的萃取功能，通过控制吸附剂合适的孔径和对吸附剂外表面进行适当的亲水性修饰，使得生物或环境样品溶液中的大分子不能进入吸附剂的内孔中去，且亲水性的外表面保证了生物大分子在吸附剂的外表面不会发生不可逆的变性和吸附，这些措施保证了在上样过柱时，该类吸附剂不会对大分子产生保留，大分子物质在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去，而该类吸附剂的内孔表面则仍为反相萃取剂或离子交换萃取剂性质，这种结构上的特点就可保证在生物大分子或腐植酸的存在下，实现对小分子分析物的萃取。
近年来，限进填料已有文献报道(Anal.Bioanal.Chem.，2006，384：1462-1469；J.Chromatogr.B，2004，801：141-156)，但文献中提供的方法在合成中要通过酶解的方式在硅胶外表面引入亲水基团，导致成本较高。CN102335597A提供了一种限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料及制备方法，其在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)，然后在包覆层表面接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，在经过水解得到亲水性表面，得到的色谱填料应用范围较窄，可对生物复杂样品中的疏水性化合物进行有效分离。CN103626934A公开了一种限进型聚(甲基丙烯酸-3-磺酸丙酯)修饰硅胶色谱填料，其在硅胶表面接枝双层聚合物，内层为聚(甲基丙烯酸-3-磺酸丙酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯)，外层为聚(甲基丙烯酸甘油单酯)，其色谱填料可用作生物样品及环境样品分子的色谱固定相，进行阳离子型化合物的直接进样提取，应用范围较窄。制备限进介质型色谱填料时，也常采用物理屏蔽的方式，利用介质中的孔道结构尺寸对生物大分子进行排阻，这种类型的限进型色谱填料一般要求孔径小于8nm，使用这种物理屏蔽的方式大大限制了其应用范围。
目前需要开发一种新型的限进型色谱填料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种限进型色谱填料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)使带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到表面吸附有聚合物微球的多孔材料；
(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；
(3)在不破坏多孔材料孔道内功能基团的前提下，除去多孔材料表面吸附的聚合物微球；
(4)对步骤(3)得到的多孔材料外表面进行化学修饰，使外表面具有亲水性，得到所述限进型色谱填料。
本发明利用带正电荷的聚合物微球吸附到带负电荷的多孔材料表面作为多孔材料的保护层，然后在多孔材料孔道内引入功能基团，后除去多孔材料表面的聚合物微球，最后使多孔材料的外表面具有亲水性，得到限进型色谱填料。本发明提供的制备方法，不用特别限定多孔材料的材质、结构以及内部孔道结构大小，同时也不需要复杂大分子对表面进行限进，以聚合物微球作为初始的屏蔽层(保护层)，避免了在孔道内引入功能基团时也会在硅胶微球表面引入；且聚合物微球合成简单、成本低、可重复性高，适合工业化制备限进型硅胶色谱填料。
通过本发明制备得到的色谱填料外表层具有亲水性基团，使得生物或环境样品溶液中的大分子不能进入吸附剂的内孔中去，进而实现对小分子的萃取。
在本发明步骤(1)中，聚合物微球应处于过量的状态以确保在多孔填料表面最大程度吸附有聚合物微球。
优选地，所述聚合物微球的粒径为50-500nm(例如100nm、200nm、300nm、400nm等)，所述多孔材料的孔径为6-100nm(例如10nm、20nm、50nm、80nm、90nm等)，且所述聚合物微球的粒径与所述多孔材料的孔径比≥1.2(例如1.5、5、10、20、50、100等)。
当聚合物微球的粒径与多孔材料的孔径比≥1.2时，可以保证聚合物微球只能吸附在多孔材料外表面，而不会进入到多孔材料的内部孔道内。
在本发明中，多孔材料的孔径在6-100nm范围内，聚合物微球粒径在50-500nm内，本发明提供的仅是优选范围，在实际应用过程中，应根据实际情况使聚合物微球的粒径与多孔材料孔径相匹配。
优选地，所述多孔材料的粒径为0.5-100μm，例如1μm、10μm、20μm、50μm、80μm等，进一步优选2-50μm。
本发明所述的粒径、孔径均为平均粒径、平均孔径。
优选地，所述多孔材料的粒径与所述聚合物微球的粒径比≥10，例如20、50、100、200等。
在本发明中，多孔材料的粒径在0.5-100μm范围内，聚合物微球粒径在50-500nm内，本发明提供的仅是优选范围，在实际应用过程中，应根据实际情况具体选择使二者相匹配。
优选地，所述聚合物微球包括聚环氧丙基丙烯酸酯微球、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球和聚苯乙烯类树脂微球中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚苯乙烯类树脂微球包括苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球、二乙烯基苯-乙烯基苄基氯共聚物微球、甲基丙烯酸酯-乙烯基苄基氯共聚物微球和二乙烯基苯-乙烯基苄基缩水甘油醚共聚物微球中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述多孔材料包括硅胶、氧化铝、氧化钛和有机无机杂化材料中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选硅胶材料，更进一步优选硅胶微球。
优选地，步骤(1)所述带有负电荷的多孔材料的制备方法为：将多孔材料在pH为6-12的条件下进行处理，使多孔材料带负电。所述pH为6-12可以是7、8、9、10、11等。
优选地，所述pH为8-10。
优选地，步骤(2)所述功能基团的引入方式为通过化学键合的方式引入功能基团。
优选地，所述功能性基团为反相功能性基团和/或离子交换基团中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述反相功能基团为比较疏水的功能基团，例如长链烷基、芳香基等，所述离子交换基团为含有阴阳离子交换功能的基团。
优选地，所述功能基团为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳香基、酰胺、磺酰胺、氨基甲酸酯、尿素、乙醚、羧基、磺酸、氨基、氰基、环氧乙烷、带有磺酸基的阳离子交换基团和带有二乙胺乙基的阴离子交换基团中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述烷基为C1-C30的直链烷基或支链烷基。
优选地，所述芳香基为苯基、苯基己基和联苯基中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，步骤(3)所述除去多孔材料表面吸附的聚合物微球的方法为：通过程序升温对步骤(2)得到的多孔材料进行煅烧，所述煅烧温度高于聚合物微球的分解温度且低于孔道内功能基团的分解温度。
本发明除去多孔材料表面吸附的聚合物微球时，要确保在除去聚合物微球的同时保证多孔材料内部孔道中引入的功能基团的完整、不被破坏。
优选地，所述煅烧温度为150-250℃。
在本发明中，并不是限定煅烧温度在150-250℃内，而是一般满足要求的煅烧温度均在150-250℃范围内，需要根据实际选取的聚合物微球以孔道内官能团的类型进行选择煅烧温度。
在本发明中，步骤(4)所述化学修饰的方法为：使用硅烷化试剂通过化学键合的方法在多孔材料表面引入亲水层。
优选地，所述硅烷化试剂包括γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基二甲基一甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二乙氧基硅烷和γ-(2,3-环氧丙氧)丙基二甲基一乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的组合。
本发明除了上述方法之外，也可采用其他方法进行化学修饰，任何可以实现使外表面具有亲水性的方法均可采用。
本发明步骤(4)选用的修饰试剂分子量均较大，由于多孔材料内部孔道内的功能基团趋于饱和且由于修饰试剂的空间位阻效应，在进行外表面修饰时，修饰试剂很难进入内部孔道。
作为优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将多孔材料在pH为6-12的条件下进行处理，使多孔材料带负电，将带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到外表面吸附有聚合物微球的多孔材料；
(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；
(3)通过程序升温对步骤(2)得到的多孔材料进行煅烧，所述煅烧温度高于聚合物微球的分解温度且低于孔道内功能基团的分解温度；
(4)通过硅烷化试剂或接枝反应在步骤(3)得到的硅胶填料外表面进行化学修饰，使外表面为中性或者带有亲水性功能基团，得到所述限进型色谱填料。
在本发明中，多孔材料优选硅胶填料，最优选硅胶微球，硅胶微球可以购买，也可以合成，合成可以参考文献(W,Fink A,Ernst Bohn.Controlled growth ofmonodisperse silica spheres in the micron size range[J].Journal of Colloid&Interface Science,1968,26(1):62-69)制备，也可以参考其它方法。
在本发明中，吸附在多孔材料外面的聚合物微球可以购买，也可以自行合成，其制备方法比较成熟，可以参考文献(U.S.Pat.Nos.5,936,003、5,925,253；5532279and5324752)制备，也可以参考其他方法。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述的制备方法制备得到的限进型色谱填料。
第三方面，本发明提供了一种固定相，所述固定相包括第二方面所述的限进型色谱填料。
优选地，所述固定相为第二方面所述的限进型色谱填料。
第四方面，本发明提供了如第三方面所述的固定相在固相萃取或液相分离中的应用，所述固定相用于分离预分离物中含有的生物大分子干扰项和小分子化合物。
优选地，所述生物大分子为蛋白质和/或腐殖酸。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，不用特别限定多孔材料的材质、结构以及内部孔道结构大小，同时也不需要复杂大分子对表面进行限进，以聚合物微球作为初始的屏蔽层(保护层)，避免了在孔道内引入功能基团时也会在硅胶微球表面引入；且聚合物微球合成简单、成本低、可重复性高，适合工业化制备限进型硅胶色谱填料；
(2)通过本发明制备得到的色谱填料外表层具有亲水性基团，使得生物或环境样品溶液中的大分子不能进入吸附剂的内孔中去，进而实现对小分子的萃取；
(3)本发明提供的限进型色谱填料对蛋白具有很高的排阻率，而且对于小分子物质显示出较强的保留能力和分离能力。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种限进型色谱填料的制备方法如下：
(1)将10g硅胶微球分散在100mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝10)中，并搅拌1小时，制备成硅胶微粒悬浊液备用，其中，硅胶微球粒径为5μm，孔径为10nm；
(2)将32g 4-乙烯基苄基缩水甘油醚和2.5g 80％的二乙烯基苯混合，加入到200g溶有2g 70％的曲拉通X-100(一种非离子型表面活性剂)、2.1g过硫酸钾和15g 50％焦亚硫酸钾的水溶液中，将上述混合溶液用氮气下脱气5min，密闭后至于40℃水浴下搅拌10小时完成聚合反应得到白色的不透明产物，经过滤得到纳米级聚合物乳胶颗粒，然后将上述得到的纳米聚合物乳胶颗粒与107g 1M硝酸溶液和246g 5M的三甲胺溶液混合搅拌12小时，得到带正电荷的聚合物微球，粒径为70nm；
(3)取50mL带有正电荷的聚苯乙烯微球(微球粒径为80nm，固液比重为1％)，向其加入步骤(1)得到的硅胶微粒悬浊液并搅拌一个小时，离心、洗涤除去多余的聚苯乙烯微球，重复以上清洗过程三次，得到表面吸附有聚苯乙烯微球的硅胶微球；
(4)将上述得到的表面吸附有聚苯乙烯微球的硅胶微球分散到50mL无水甲苯中，然后加入10g十八烷基三甲氧基硅烷和1g咪唑作为催化剂，在氮气保护下回流反应20h，将修饰完成的微球材料过滤，分别用200mL甲苯、200mL丙酮、20mL 1％甲酸水溶液、200mL丙酮洗涤后干燥，得到带有十八烷基的硅胶微球；
(5)将步骤(4)得到的硅胶微球材料置于马弗炉中200℃煅烧2小时，除去外表面的聚苯乙烯微球；
(6)将100mLγ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、5mL 2,6-二甲基吡啶和2000mL无水甲苯混合均匀，然后与步骤(5)得到的硅胶微球于110℃的恒温条件下反应20h；反应结束后，过滤、然后用无水1,4-二恶烷清洗滤饼并干燥。
(7)取10g步骤(6)所得滤饼依次用水和甲醇冲洗，然后用0.1mol/L的盐酸溶液在60℃处理2h，依次用水和甲醇冲洗，得到限进型色谱填料。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，步骤(4)将十八烷基三甲氧基硅烷替换为八烷基三甲氧基硅烷，得到带有八烷基的硅胶微球。
实施例3
与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，步骤(4)中的功能基团由十八烷基变为氨基，步骤如下：
将3g步骤(3)得到的表面吸附有聚苯乙烯微球的硅胶微球分散到50mL无水甲苯中，然后加入5.2g 3-氨丙基三乙氧基硅烷，于110℃下反应24h，依次用甲苯、乙腈各洗3次后干燥，得到带有氨基的硅胶微球。
实施例4
与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，步骤(4)中得到的功能基团由十八烷基变为阴离子交换功能基团，步骤如下：
将100mLγ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、5mL 2,6-二甲基吡啶和2000mL无水甲苯混合均匀，然后与100g步骤(3)得到的表面吸附有聚苯乙烯微球的硅胶微球于110℃的恒温条件下反应20h后，过滤、清洗、干燥；
上述得到的硅胶微球10g分散到50mL去离子水中，再加入1g 1M硝酸溶液和50g10％的三甲胺水溶液混合搅拌12h，过滤、洗涤、干燥得到带有阴离子交换功能基团的硅胶微球。
实施例5
与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，将步骤(7)替换为如下步骤：
将10g步骤(6)所得滤饼分散到50mL无水1,4-二恶烷中，然后加入5g乙二醇机械搅拌混合，在氮气保护下，向该混合溶液中加入0.5mL Et2OBF3，在50℃条件下搅拌12h；过滤、分别用200mL二恶烷、200mL去离子水、200mL甲醇和200mL丙酮洗涤，得到限进型色谱填料。
实施例6
与实施例1的区别仅在于，在本实施例中，将步骤(7)替换为如下步骤：
将10g步骤(6)所得滤饼分散到50mL无水1,4-二恶烷中，然后加入5g PEG(分子量1000)机械搅拌混合，在氮气保护下，向该混合溶液中加入0.5mL Et2OBF3，在50℃条件下搅拌12h；过滤、分别用200mL二恶烷、200mL去离子水、200mL甲醇和200mL丙酮洗涤，得到限进型色谱填料。
实施例7
一种限进型色谱填料的制备方法如下：
(1)将氧化铝微球在pH＝8条件下处理，使其带有负电荷，并搅拌1小时，制备成微粒悬浊液备用，其中，氧化铝微球的粒径为50μm，孔径为20nm；
(2)将带有正电荷的聚甲基丙烯酸酯微球(粒径为50nm)分散在水相中，再加入步骤(1)得到的微粒悬浊液并搅拌一个小时，离心、洗涤除去多余的聚甲基丙烯酸甲酯微球，重复以上清洗过程三次，得到表面吸附有聚甲基丙烯酸甲酯微球的氧化铝微球；
(3)利用十八烷基三甲氧基硅烷在表面吸附有聚甲基丙烯酸甲酯微球的氧化铝微球的内部孔道内引入十八烷基，得到带有十八烷基的氧化铝微球；
(4)将步骤(3)得到的氧化铝微球置于马弗炉中200℃煅烧2小时，除去聚甲基丙烯酸甲酯微球；
(5)通过γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷在氧化铝微球外表面引入环氧基团，然后再进行开环处理得到二醇基，得到限进型色谱填料。
对比例1
一种非限进型硅胶微球，制备方法如下：
(1)将100g硅胶微球分散在100mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝10)中，并搅拌1h，制备成硅胶微粒悬浊液备用，其中，硅胶微球粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积为300m2/g；
(2)将上述活化的硅胶微球分散到500mL无水甲苯中，然后加入100g十八烷基三甲氧基硅烷和10g咪唑作为催化剂，在氮气保护下回流反应20h，将修饰完成的微球材料过滤，分别用2000mL甲苯、2000mL丙酮、200mL 1％甲酸水溶液、2000mL丙酮洗涤后干燥，得到带有十八烷基的色谱填料。
性能测试
需要分离的物质不同，选择的色谱填料也不同，因此，在本发明中，选择可以分离双酚A的实施例1、5-6和对比例1提供的色谱填料进行性能测试，方法如下：
通过高压匀浆填充技术分别将实施例1、5-6和对比例1提供的色谱填料装填到50mm×4.6mm(i.d.)HPLC不锈钢柱中；
待测试样品：含有10mg/mL BSA和10g/mL的双酚A的20％甲醇溶液；
进样量：10L；
流动相：A:CH3CN；B:50mM磷酸缓冲液，pH＝7.0；C:去离子水；
梯度：
| 时间(min) | A％ | B％ | C％ |
| 0 | 0 | 100 | 0 |
| 10 | 0 | 100 | 0 |
| 15 | 0 | 20 | 80 |
| 25 | 80 | 0 | 20 |
| 30 | 80 | 0 | 20 |
| 35 | 0 | 0 | 100 |
| 40 | 0 | 100 | 0 |
| 50 | 0 | 100 | 0 |
流速：1.0mL/min；
温度：25℃
检测器：UV@225nm和UV@280nm；
测试结果见表1：
表1
由实施例和测试结果可知，本发明提供的限进型色谱填料可以有效的分离BSA和双酚A，且对双酚A有很高的捕获效率，回收率高，可达71％以上，其中实施例5提供的限进型色谱填料效果最好，为92％；由实施例和对比例的对比可知，对比例1中BSA并没有明显的洗脱峰，即表明BSA吸附在色谱填料表面，可能因此导致堵塞色谱填料孔径，进而对双酚A的捕捉效果极差，回收率较低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种限进型色谱填料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)使带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到表面吸附有聚合物微球的多孔材料；
(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；
(3)在不破坏多孔材料孔道内功能基团的前提下，除去多孔材料表面吸附的聚合物微球；
(4)对步骤(3)得到的多孔材料外表面进行化学修饰，使外表面具有亲水性，得到所述限进型色谱填料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物微球的粒径为50-500nm，所述多孔材料的孔径为6-100nm，且所述聚合物微球的粒径与所述多孔材料的孔径比≥1.2；
优选地，所述多孔材料的粒径为0.5-100μm，进一步优选2-50μm；
优选地，所述多孔材料的粒径与所述聚合物微球的粒径比≥10；
优选地，所述聚合物微球包括聚环氧丙基丙烯酸酯微球、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球和聚苯乙烯类树脂微球中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述聚苯乙烯类树脂微球包括苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球、二乙烯基苯-乙烯基苄基氯共聚物微球、甲基丙烯酸酯-乙烯基苄基氯共聚物微球和二乙烯基苯-乙烯基苄基缩水甘油醚共聚物微球中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述多孔材料包括硅胶、氧化铝、氧化钛和有机无机杂化材料中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选硅胶材料，更进一步优选硅胶微球。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述带有负电荷的多孔材料的制备方法为：将多孔材料在pH为6-12的条件下进行处理，使多孔材料带负电；
优选地，所述pH为8-10。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述功能基团的引入方式为通过化学键合的方式引入功能基团；
优选地，所述功能基团为反相功能性基团和/或离子交换基团中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述功能基团为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳香基、酰胺、磺酰胺、氨基甲酸酯、尿素、乙醚、羧基、磺酸、氨基、氰基、环氧乙烷、带有磺酸基的阳离子交换基团和带有二乙胺乙基的阴离子交换基团中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述烷基为C1-C30的直链烷基或支链烷基；
优选地，所述芳香基为苯基、苯基己基和联苯基中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述除去多孔材料表面吸附的聚合物微球的方法为：通过程序升温对步骤(2)得到的多孔材料进行煅烧，所述煅烧温度高于聚合物微球的分解温度且低于孔道内功能基团的分解温度；
优选地，所述煅烧温度为150-250℃。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述化学修饰的方法为：使用硅烷化试剂通过化学键合的方法在多孔材料表面引入亲水层；
优选地，所述硅烷化试剂包括γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基二甲基一甲氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二乙氧基硅烷和γ-(2,3-环氧丙氧)丙基二甲基一乙氧基硅烷中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将多孔材料在pH为6-12的条件下进行处理，使多孔材料带负电，将带负电荷的多孔材料和带有正电荷的聚合物微球发生反应，得到外表面吸附有聚合物微球的多孔材料；
(2)在步骤(1)得到的多孔材料内部孔道内引入功能基团，得到带有功能基团的多孔材料；
(3)通过程序升温对步骤(2)得到的多孔材料进行煅烧，所述煅烧温度高于聚合物微球的分解温度且低于孔道内功能基团的分解温度；
(4)对步骤(3)得到的多孔材料外表面进行化学修饰，使外表面具有亲水性，得到所述限进型色谱填料。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的制备方法制备得到的限进型色谱填料。
9.一种固定相，其特征在于，所述固定相包括权利要求8所述的限进型色谱填料；
优选地，所述固定相为权利要求8所述的限进型色谱填料。
10.根据权利要求9所述的固定相在固相萃取或液相分离中的应用，其特征在于，所述固定相用于分离预分离物中含有的生物大分子干扰项和小分子化合物；
优选地，所述生物大分子为蛋白质和/或腐殖酸。
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