CN102335597A - 限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料及制备方法。在多孔硅胶微球表面引入原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂、通过“grafting from”方法在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)；然后在包覆层表面接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；再经过水解得到亲水性表面，得限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆的硅胶色谱填料。该聚合物包覆硅胶色谱填料具有结合疏水性小分子、排阻生物大分子的功能，能够在免去蛋白沉淀的前处理过程的情况下对生物复杂样品中的疏水性化合物进行有效分离，可以作为色谱固定相或固相萃取剂，进行生物或环境样品中小分子化合物的直接进样分离提取及测定，实现对生物体系中小分子物质的高效分析测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料及制备方法，属于新型色谱分离材料的领域。这种限进型多功能分离材料可应用于生物或环境样品中疏水性小分子物质的萃取和直接进样色谱分离分析，免去蛋白沉淀等前处理过程，达到对于生物复杂体系中小分子物质进行高效分析测定的目的。
背景技术
生物和环境样品基体成分复杂、待测物浓度很低，需要在测定前进行适当的前处理。由于固相萃取具有回收率较高、试剂消耗少和易于实现自动化等优点，已经成为最为常用的样品前处理方法，而疏水性色谱固定相是常用的色谱固相萃取材料。但是，使用这类色谱材料分离、富集生物样品中的小分子待测物时，样品中的生物大分子会在材料表面发生变性并吸附在表面上，造成填料孔堵塞、柱效降低，严重干扰色谱方法的应用。
为了解决这个问题，研究工作者进行了多功能固定相材料的研究工作，制备了不同类型的限进材料(restricted access material)。限进材料通过一定的孔径或者以一定结构的聚合物链形成大分子扩散障碍，使得生物样品中的大分子不能进入吸附剂的小分子结合层，而且限进材料外表面亲水，因此生物大分子不会发生变性和不可逆吸附。将这种材料应用于生物样品的色谱分析时，大分子物质在死时间下被洗脱除去，而小分子可以进入填料的内层，与能够结合小分子的固定相内层相互作用，从而免去沉淀蛋白的前处理过程，实现对小分子分析物的快速萃取和色谱分离。
近年来，限进填料已有文献报道(Anal.Bioanal.Chem.，2006，384：1462-1469；J.Chromatogr.B，2004，801：141-156)，但文献的一些方法在合成中要通过酶解的方式在硅胶外表面引入亲水基团，导致成本较高，而我国尚无商品化的限进色谱材料。
为了发展应用于生物样品快速分析的材料，我们进行了以活性自由基法合成新型限进材料的研究，方法利用键合于硅球表面的引发剂进行ATRP(Atom Transfer RadicalPolymerization，原子转移自由基聚合)反应、接枝聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆层，在疏水性高分子包覆层上，再接枝线性聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、水解后得到亲水聚合物链，制备了能够排阻大分子、结合小分子的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料。
发明内容
本发明的目的是提供一种限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料及其制备方法。改性后的硅胶表面具有两种不同化学结构层，即内层为聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)或聚苯乙烯，能以疏水作用结合药物，对含苯环的化合物具有独特的选择性；外层为可以排阻蛋白的亲水性聚甲基丙烯酸甘油酯。这种多功能的限进分离材料可以作为生物样品及环境样品分析的色谱固定相或固相萃取材料，具有结合疏水性小分子、排阻生物大分子的功能，能够在免去蛋白沉淀的前处理过程的情况下对生物复杂样品中的疏水性 化合物进行有效分离，可以作为色谱固定相或固相萃取剂，进行生物或环境样品中小分子化合物的直接进样分离提取及测定，达到对生物体系中小分子物质的高效分析测定的目的。
本发明提供的限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料是以色谱用硅胶为核、一定交联度的聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)或线性聚苯乙烯为疏水内层、聚甲基丙烯酸甘油酯为亲水外层的双聚合层结构的分离萃取材料。合成中首先在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)，然后再接枝聚甲基丙烯酸甘油酯为限进层，其表达式如下：Silica-g-p(St-co-DVB)-g-pGMMA，其中，Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(St-co-DVB)表示苯乙烯-二乙烯苯共聚合物，其中，二乙烯苯比例可以是0-100％；pGMMA表示聚甲基丙烯酸甘油酯。
所述的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆后的硅胶碳含量为23-30％；
所述的聚甲基丙烯酸甘油酯接枝后的限进层厚度以限进层的碳含量予以表征，限进层的碳含量为4-5％。
所述的硅胶的粒径为10-80微米，孔径为 
所述的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)可以用用聚苯乙烯代替(即苯乙烯-co-二乙烯苯中，二乙烯苯比例为0)。
以聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)为内层的限进聚合物包覆硅胶结构如图5所示：
本发明提供的限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料的制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂中，多孔硅胶与γ-氨丙基三甲氧基硅烷反应，产物和4-氯甲基苯甲酰氯反应，得到表面接有ATRP引发剂的硅胶；
(2)以苯乙烯为单体(或加入二乙烯基苯为交联剂)的情况下，以2，2′-联吡啶为配体、氯化亚铜(CuCl)为催化剂进行可控的原子转移自由基聚合，在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)或聚苯乙烯；
(3)在聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)或聚苯乙烯包覆层的表层继续进行ATRP聚合，接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；
(4)经两次聚合包覆后的硅胶填料在酸性条件下进行水解，再经洗涤、干燥处理，得到限进型聚合物包覆硅胶色谱填料。若内层为聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)，则得到聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料，简称为：限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶；若内层为聚苯乙烯，则得到聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-苯乙烯]包覆硅胶色谱填料，简称为：限进型聚苯乙烯包覆硅胶。
所述步骤(2)中的有机溶剂可以是甲苯或苯。
所述步骤(2)中的单体和交联剂分别是单烯类化合物和多烯类化合物。单烯类化合物可以是苯乙烯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸十二醇酯中的任一种；多烯类化合物可以是二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯中的任一种。
所述步骤(2)中聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)合成中，交联剂二乙烯苯在单体总量(苯乙烯+二乙烯苯)中的比例(摩尔比)可以是25-100％。
所述步骤(2)和(3)中原子转移自由基聚合用到的配体可以是2，2′-联吡啶、四甲基乙二胺、六甲基三乙四胺中的一种；金属卤化物可以是氯化亚铜、溴化亚铜中的一种。
所述步骤(4)中的酸性催化剂可以是硫酸、盐酸、高氯酸中的任一种。
本发明限进型聚合物包覆硅胶色谱填料的应用方法包括的步骤：
以限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶为固定相，对血浆中β-阻断剂类药物(阿替洛尔atenolol、美托洛尔metoprolol、普萘洛尔propranolol)的进行色谱分离，加入β-阻断剂类药物后的血浆样品在离心后直接进样；检测波长：280nm，流动相A：(0.05mol/L磷酸缓冲溶液，pH 7.0)/异丙醇/四氢呋喃(84/10/6，v/v)，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-3分钟0％B，3-6分钟0-45％B。
本发明得到的改性后的硅胶表面具有两种不同化学结构层，即内层为聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)或聚苯乙烯，能以疏水作用结合药物，对含苯环的化合物具有独特的选择性；外层为可以排阻蛋白的亲水层。这种多功能的限进分离材料可以作为生物样品及环境样品分析的色谱固定相或固相萃取材料，样品可在离心后直接进样，不需要沉淀蛋白的前处理过程，减少由此带来的损失，有利于实现在线分析、提高分析效率及准确性。
本发明与已知技术(如第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集的报道)比较，在合成方法、材料结构及应用效果方面均具有很大差别。
(1)本发明采用硅烷化试剂接枝引发剂，得到的ATRP引发剂结构与已知技术不同，而且材料中引发剂密度有了很大提高(已知技术使用的氯乙醇法接枝引发剂，硅胶中接枝的引发剂密度是本发明的五分之一)。
(2)已知技术在ATRP中采用五甲基二亚乙基三胺，而本发明的ATRP催化体系中配体采用2，2′-联吡啶，降低了催化速率，提高了反应可控性及重现性；
(3)GMA聚合物接枝方法不同，新方法能够在较短时间内得到所需的聚合物链，工艺更成熟，对于蛋白的排阻效果更好。
(4)本发明得到的材料对于芳香化合物有更高的柱效(理论塔板数达到19500每米)，而已知技术的方法得到的材料的理论塔板数较低。也说明本发明材料分离层结构与已知技术不同，更适合于色谱分离。本发明得到的限进性材料对于蛋白的回收率高于已知技术，也是结构不同的表现。
(5)本发明中的色谱方法：对于酚类、血浆中β-阻断剂类药物、磺胺类药物的分离以前并没有发表。
总之，本发明的色谱填料内层疏水、外层亲水，具有可以结合疏水性小分子并且排阻生物大分子的功能，并能够对疏水性化合物进行分离。这种限进材料可以作为色谱固定相或固相萃取剂，进行生物或环境样品中小分子化合物的分离提取、或含蛋白的样品直接色谱进样测定，免去蛋白沉淀的前处理过程，使色谱分析更加简便、快速，达到对于生物复杂体系中小分子物质进行高效分析测定的目的。
附图说明
图1聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶对烷基苯的分离色谱图。
图2聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶对7种酚类化合物的分离色谱图。
图3限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶对血浆中β-阻断剂类药物的分离色谱图；图4限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶对血浆中磺胺类药物的分离色谱图。
图5以聚(苯乙烯-co-二乙烯基苯)为内层的限进聚合物包覆硅胶结构。
具体实施方式
本发明限进型聚合物包覆硅胶色谱填料的制备方法包括的步骤：
1)硅胶表面接枝ATRP引发剂
N2气保护下，以甲苯为溶剂，加入经过活化的硅胶与γ-氨丙基三甲氧基硅烷，110℃搅拌回流反应12小时。将反应产物洗涤，真空干燥，标记为Sil-NH2。
在室温下，以环己酮为溶剂，加入Sil-NH2和4-氯甲基苯甲酰氯，在N2气保护下搅拌反应18小时，得到表面接枝ATRP引发剂的硅胶，标记为Sil-Cl。
2)合成聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶
室温下以甲苯为溶剂，苯乙烯为单体、二乙烯基苯为交联剂，2，2′-联吡啶为配体，氯化亚铜(CuCl)为催化剂，N2保护下，在Sil-Cl表面进行ATRP接枝聚合，110℃加热回流反应2小时，得到聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶。产物依次用乙醇和Na2EDTA饱和溶液洗涤，再用丙酮索氏提取12小时，真空干燥。
3)聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶表面接枝聚(甲基丙烯酸甘油酯)
N2保护下，以N，N-二甲基甲酰胺/甲醇为溶剂，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体，2，2′-联吡啶、氯化亚铜和氯化铜(CuCl2)存在下，在聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶表面进行ATRP接枝聚合，50℃反应4小时。
产物经洗涤后，加入稀酸中，于60℃搅拌水解，使聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基水解开环。产物用蒸馏水洗涤至中性，再用甲醇洗涤，真空干燥，从而制得内层键合聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)、外层为聚(甲基丙烯酸甘油酯)的硅胶：[silica-g-p(St-co-DVB)-g-pGMMA]，称为限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶。
4)在第二步聚合物接枝反应中只以苯乙烯为单体，不使用交联剂二乙烯苯，则得到聚苯乙烯包覆硅胶，经第二次ATRP接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯并水解后，得到限进型聚苯乙烯包覆硅胶[silica-g-p(St)-g-pGMMA]。限进型聚苯乙烯包覆硅胶与限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶只是内层聚合物结构稍有不同，聚苯乙烯为直链，聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)为交联结构，但应用功能相同。
5)以色谱法对聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料的疏水性、分离能力进行测定评价。材料对于烷基苯有很好的选择性及亲和能力，柱效N为19500每米(N/m)(以苯测定)，对于酚类化合物能够很好分离。
6)以色谱法对于限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料的性能进行测定，包括对于蛋白的排阻能力及疏水性小分子化合物的保留能力。结果证明，其作为色谱固定相，对于牛血清蛋白的排阻能力达到99.2％，而对于烷基苯的结合能力(以保留因子测定)与聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶(未接枝聚甲基丙烯酸甘油酯的材料)相似。对于药物加标血浆样品的色谱测定说明，药物能够有很好的保留，并能够与血浆 基质成分很好分离。
下述实施例中所采用试剂均为分析纯；药物为标准品或对照品。
实施例1
1.制备ATRP引发剂固载硅胶
称取15.0克活化后硅胶微球，分散于150毫升干燥甲苯中，在N2保护下，加入18.0毫升γ-氨丙基三甲氧基硅烷试剂，110℃下搅拌回流12小时。将反应产物抽滤，依次用甲苯、丙酮、洗涤。60℃真空干燥，产物标记为Sil-NH2。
将Sil-NH2转移至圆底烧瓶中，加入120毫升干燥环己酮，搅拌分散，在N2保护下，于冰水浴条件下逐滴加入30毫升含有9.98克4-氯甲基苯甲酰氯的环己酮溶液，并加入1.2毫升吡啶，室温条件下搅拌反应18小时。反应后将产物抽滤，再以丙酮进行索氏提取，得到产物标记为Sil-Cl。置于真空干燥箱中60℃干燥后备用。
通过氧瓶燃烧/离子色谱法测定Sil-Cl中的氯含量，测得Sil-Cl中ATRP引发剂含量为1.3毫摩尔/克。
2.制备聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶
干燥后的三口瓶中加入2.5克Si-Cl(引发剂含量为1.3毫摩尔/克)，甲苯14毫升，机械搅拌使硅胶分散，依次加入苯乙烯1.81克(17.4毫摩尔)，二乙烯基苯2.26克(17.4毫摩尔)，2，2′-联吡啶1.07克(6.9毫摩尔)，氯化亚铜0.34克(3.4毫摩尔)，油浴110℃加热，回流反应2小时，得到聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶。产物依次用乙醇和Na2EDTA饱和溶液洗涤，再用丙酮索氏提取12小时，50℃真空干燥后备用，元素分析测得碳含量为25.5％。
3.制备聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶
通N2气条件下，在干燥三口瓶中加入2.5克交联聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶，14毫升反应溶剂(N，N-二甲基甲酰胺/甲醇，5/2，v/v)，机械搅拌使硅胶分散，依次加入甲基丙烯酸缩水甘油酯7.5克(52.8毫摩尔)，2，2′-联吡啶0.48克(3.07毫摩尔)，氯化亚铜0.12克(1.2毫摩尔)，氯化铜0.043克(0.32毫摩尔)，50℃加热反应4小时，制得硅胶-g-聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)-g-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应过程中一直保持通N2。产物依次用乙醇和Na2EDTA饱和溶液洗涤，再用丙酮索氏提取12小时，50℃真空干燥。干燥后产物置于100毫升圆底烧瓶中，加入60毫升浓度为0.1摩尔/升的稀硫酸水溶液，于60℃水浴中反8小时，反应完毕，用蒸馏水洗涤产物至中性，再用乙醇洗涤，50℃真空干燥，制得硅胶-g-聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)-g-聚甲基丙烯酸甘油酯[silica-g-p(St-co-DVB)-g-pGMMA]，即限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶，元素分析测得碳增量为4.8％。
实施例2
在实施例1中的第2步采用下面实验条件：通N2气条件下，在干燥后的三口瓶中加入2.5克Si-Cl(引发剂含量为1.3毫摩尔/克)，甲苯14毫升，机械搅拌使硅胶分散，依次加入苯乙烯3.6克(34.6毫摩尔)、氯化亚铜0.34克(3.4毫摩尔)和2，2′-联吡啶1.07克(6.9毫摩尔)，油浴110℃加热，回流反应4小时，得到聚苯乙烯包覆硅胶。产物依次用乙醇和Na2EDTA饱和溶液洗涤，再用丙酮索氏提取12小时，50℃真空干燥后备用，得到聚苯乙烯包覆硅胶，元素分析测得碳含量为25.4％。
实施例3
在实施例1中的第2步采用如下实验条件：干燥后的三口瓶中加入2.5克Si-Cl(引发剂含量为0.6毫摩尔/克)，甲苯8毫升，机械搅拌使硅胶分散，依次加入苯乙烯0.73克(7.02毫摩尔)，二乙烯基苯0.83克(6.38毫摩尔)，2，2′-联吡啶0.4克(2.56毫摩尔)，氯化亚铜0.125克(1.26毫摩尔)，油浴110℃加热，回流反应2小时，得到聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶。产物依次用乙醇和Na2EDTA饱和溶液洗涤，再用丙酮索氏提取12小时，50℃真空干燥后备用，元素分析测得碳含量为26％。
实施例4
将实施例1中合成的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶微球，以匀浆法装入不锈钢色谱柱(150mm×4.6mm)，考察对烷基苯的分离能力，色谱结果示于图1。
色谱条件：流动相：乙腈/水，55/45，(v/v)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；样品：1.苯，2.甲苯，3.乙苯，4.丙苯；以苯为样本测得的柱理论塔板数为N＝19500每米。
实施例5
将实施例1中合成的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶微球，以匀浆法装入不锈钢色谱柱(150mm×4.6mm)，考察对7种酚类化合物的分离能力，色谱结果示于图2。
色谱条件：流动相：A.乙腈，B.水，梯度洗脱(0-25min，25％-90％A，v/v)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；样品：1.对苯二酚，2.间苯二酚，3.邻苯二酚，4.苯酚，5.对羟基苯甲酸甲酯，6.对羟基苯甲酸乙酯，7.对羟基苯甲酸丙酯。
实施例6
将合成的限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶色谱填料，以匀浆法装入不锈钢色谱柱(150mm×4.6mm)，以牛血清蛋白(BSA)溶液(5毫克/毫升)为样品，对于材料的蛋白排阻能力进行评价。以无色谱柱(两通连接色谱管路)时测得的BSA的色谱峰面积A1作为100％。以经过色谱柱得到的BSA峰面积与A1之比计算测得的BSA回收率为99.2％。说明填料对于BSA的排阻能力近于100％。
色谱条件：流动相：(0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH 7.0)/异丙醇/四氢呋喃(84/10/6，v/v)，流速：1.0mL/min，检测波长：280nm，进样体积：20微升，BAS样品浓度：5毫克/毫升。
实施例7
将合成的限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶微球，以匀浆法装入不锈钢色谱柱(150mm×4.6mm)，考察对血浆与β-阻断剂类药物的分离能力，含β-阻断剂类药物的人血浆样品以标准加入法制备(空白血浆采自健康志愿者)，加入β-阻断剂类药物后的血浆样品在离心(10000rpm)后取上清液20微升直接进样，色谱结果见图3。
色谱条件：检测波长280nm，流动相A：(0.05mol/L磷酸缓冲溶液，pH 7.0)/异丙醇/四氢呋喃(84/10/6，v/v)，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-3分钟0％B，3-6分钟0-45％B，流量为1.0mL/min；样品：1.阿替洛尔(atenolol)，2.美托洛尔(metoprolol)，3.普萘洛尔(propranolol)。
实施例8
将合成的限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶微球，以匀浆法装入不锈钢色谱柱(100mm×4.6mm)，考察该填料对血浆与磺胺类药物的分离能力，含磺胺类药物的人血浆样品以标准加入法制备(空白血浆采自健康志愿者)，加入磺胺类药物后的血浆样品在离心(10000rpm)后取上清液20微升直接进样，色谱结果见图4。
色谱条件：检测波长：280nm，流动相A；(0.05mol/L磷酸缓冲溶液，pH 7.0)/异丙醇/四氢呋喃(84/10/6，v/v)，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-3分钟：0％B；3-12分钟：0-30％B，流量为1.0mL/min；样品：1.磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，SMO)，2.磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，SMZ)，3.磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline，SQX)。
综上，本发明的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料及其制备方法：
1.在多孔硅胶微球表面引入ATRP引发剂；通过“grafting from”方法在硅胶表面化学键合可控制厚度的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆层；在聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)层表面二次接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；水解聚合物中的环氧基团，得到亲水性表层，制备成限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆的硅胶色谱填料。
2.与已知技术(文集报道)比较，在合成方法、材料结构及应用效果方面均具有很大改善，具有应用价值。
(1)本发明采用硅烷化处理后获得的ATRP引发剂的结构不同，使得引发剂密度有了很大提高(已知技术使用的氯乙醇法，硅胶所能达到的引发剂密度是本发明的五分之一)。
(2)已知技术在ATRP中采用二亚乙基三胺，而本发明的ATRP催化体系中配体采用2，2′-联吡啶，降低了催化速率，提高了反应可控性及重现性；
(3)GMA聚合物接枝方法不同，新方法能够在较短时间内得到所需的聚合物链，工艺更成熟，对于蛋白的排阻效果更好。
(4)本发明得到的材料对于芳香化合物有更高的柱效(理论塔板数达到19500每米)，而已知技术的方法得到的材料的理论塔板数最高为4342每米。说明本发明材料分离层结构与已知技术不同，更适合于色谱分离。本发明得到的限进性材料对于蛋白的回收率高于已知技术，也是结构不同的表现。
(5)本发明进行的色谱实验药物：酚类、β-阻断剂类药物、磺胺类药物的分离以前并没有发表。
总之，本发明的色谱填料内层疏水、外层亲水，具有可以结合疏水性小分子并且排阻生物大分子的功能，并能够对疏水性化合物进行分离。这种限进材料可以作为色谱固定相或固相萃取剂，进行生物或环境样品中小分子化合物的分离提取、或含蛋白的样品直接色谱进样测定，免去蛋白沉淀的前处理过程，使色谱分析更加简便、快速，达到对于生物复杂体系中小分子物质进行高效萃取、分离、分析测定的目的。
Claims (10)
1.一种限进型聚合物包覆硅胶色谱填料，其特征在于它是在硅胶表面包覆聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)，然后再接枝聚甲基丙烯酸甘油酯为限进层，其表达式如下：Silica-g-p(St-co-DVB)-g-pGMMA，其中，Silica为多孔硅胶，g表示接枝，p(St-co-DVB)表示苯乙烯-二乙烯苯共聚合物，其中，二乙烯苯比例可以是0-100％；pGMMA表示聚甲基丙烯酸甘油酯。
2.按照权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料，其特征在于所述的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆后的硅胶碳含量为23-30％；
3.按照权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料，其特征在于所述的聚甲基丙烯酸甘油酯接枝后的限进层厚度以限进层的碳含量予以表征，限进层的碳含量为4-5％。
4.按照权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料，其特征在于所述的硅胶的粒径为10-80微米，孔径为
5.按照权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料，其特征在于所述的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)用聚苯乙烯代替。
6.一种权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)在有机溶剂中，多孔硅胶与γ-氨丙基三甲氧基硅烷反应，产物和4-氯甲基苯甲酰氯反应，得到表面接有ATRP引发剂的硅胶；
(2)苯乙烯为单体或加入二乙烯苯为交联剂的情况下，以2，2′-联吡啶为配体、氯化亚铜为催化剂进行可控原子转移自由基聚合，在硅胶表面包覆聚苯乙烯或一定交联度的聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)；
(3)在聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆层的表层继续进行ATRP聚合，接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；
(4)经两次ATRP聚合包覆后的硅胶填料在酸性条件下进行水解，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯转化为聚甲基丙烯酸甘油酯，称为限进层，干燥处理，得到限进型聚[甲基丙烯酸甘油酯-g-(苯乙烯-co-二乙烯苯)]包覆硅胶色谱填料，简称为限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于多孔硅胶粒径为10-80微米，孔径为
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的固载于硅胶上的ATRP引发剂。固载化由γ-氨丙基三甲氧基硅烷与多孔硅胶进行反应后、再与4-氯甲基苯甲酰氯反应实现，用于在ATRP反应条件下进行聚合控制。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP的反应溶剂为N，N-二甲基甲酰胺/甲醇。
10.权利要求1所述的限进型聚合物包覆硅胶色谱填料的应用方法，其特征在于包括的步骤：
以限进型聚(苯乙烯-co-二乙烯苯)包覆硅胶为固定相，对血浆中β-阻断剂类药物进行色谱分离，加入β-阻断剂类药物后的血浆样品在离心后直接进样；检测波长：280nm，流动相A：(0.05mol/L磷酸缓冲溶液，pH 7.0)/异丙醇/四氢呋喃(84/10/6，v/v)，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0-3分钟0％B，3-6分钟0-45％B。
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