CN103592400B - 毛发中阿片类物质的提取和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种毛发中阿片类物质的提取和检测方法，包括毛发的提取和净化步骤。该提取方法还可以包括一个衍生步骤。本发明还提供一种对毛发中的阿片类物质进行检测的方法，采用了气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪。与传统的毛发毒品残留检测方法相比，本发明的方法非常温和，但又能够有效富集得到阿片类物质，并有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，具有较高的灵敏度和准确度，可供政府执法部门、检验部门及药检机构使用。

Description

毛发中阿片类物质的提取和检测方法

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，特别是涉及毛发中阿片类物质的提取方法和检测方法。

背景技术

毒品和滥用成瘾性药物危害人体健康和社会安全，一直是国家依法严厉打击的对象，人体毒品残留的检测手段，对执法的辅助作用至关重要。毛发分析具有易取材、易保存、检出时限长，反映药物滥用史信息全面，易重复取样等独特优势，已广泛用于法医毒物学、临床毒物学、职业医学及兴奋剂控制等领域。毛发中常见滥用药物分析的证据性质已得到大部分国家的法庭认可。

毛发中成分复杂，存在大量干扰物质，为检测毛发中的阿片类毒品，必须建立有效的前处理方法分离提取目标物。毛发中毒品检测通常先用酸水解、碱水解、酶水解或甲醇等方法进行提取，再进行液液萃取或固相萃取达到净化的目的。酸水解法条件较为温和，释放效率较高，但该方法依然存在酸水解时间太长，不满足时效性需求的缺点，如《生物检材中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析》中头发采用0.1mol/L HCl溶液45℃水浴浸泡过夜(Journal of ForensicMedicine,February 2006,Vol.22,No.1)。碱水解药物释放完全，但条件激烈；酶水解适用范围广，释放效率高，但价格昂贵。

目前，亟需一种对毛发中的阿片类物质(包括吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁等)进行高效分离提取的方法，以及进行高灵敏度和高特异性检测的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种毛发中阿片类物质的提取方法，该方法非常温和，同时又能够有效富集得到阿片类物质。

实现上述目的的技术方案如下。

一种毛发中的阿片类物质的提取方法，包括以下步骤：

(1)清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末；

(2)加入复合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5％-10％的牛血清蛋白、0.1％-5％的吐温20，且pH值2.0-5.0；

(3)固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.5mol/L醋酸溶液、甲醇和乙酸乙酯洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱阿片类物质，得到固相萃取洗脱液。

优选地，所述复合毛发处理液是0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5％-5％的牛血清蛋白、0.1％-3％的吐温20，且pH值2.0-4.0。

优选地，步骤(2)所述的超声处理为37-85℃下进行1.0-6小时。

优选地，步骤(2)所述的超声处理为65-85℃下进行1.0-3.0小时。

优选地，步骤(3)固相萃取柱依次经甲醇和磷酸盐缓冲液进行平衡。

在其中一个实施例中，该方法还包括有衍生步骤：将固相萃取洗脱液吹干后，用体积比为1:4-4:1的乙酸乙酯：N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺混合溶液(BSTFA)进行衍生，得到衍生产物。

优选地，所述衍生步骤的条件为：65-85℃，反应15-50分钟。

本发明的另一目的在于，还提供一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，该检测方法灵敏度高，特异性好。

实现上述目的的技术方案如下：

一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，包括以下步骤：

(1)根据上述提取方法得到所述固相萃取洗脱液或衍生产物；

(2)采用气相色谱质谱联用仪(GC/MS-SIM)或液相色谱质谱联用仪(LC/MS/MS)对所述固相萃取洗脱液或衍生产物进行检测。

在其中一个实施例中，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下：

色谱柱CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；

进样口温度为180-280℃；

采用程序升温模式，柱温：

在其中一个实施例中，所述液相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下：

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C182.1×150mm,3.5μm(安捷伦公司)，接ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×12.5mm)保护柱；

柱温：室温；

流动相:乙腈-缓冲液(70：30)，缓冲液为20mmol/L乙酸铵和0.2％甲酸的溶液；

流速：300μL/min；

质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。

本发明提供的一种对毛发中的毒品残留进行提取和检测的方法，操作简单，能有效地提取毛发中的吗啡、单乙酰吗啡、可待因及度冷丁等阿片类物质，并进行定性定量分析检测。与传统方法相比，本发明的方法通过用复合毛发处理液对毛发进行预处理和固相萃取，反应条件非常温和，且有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，高效分离提取了毛发中的目标物。另外，再进一步通过衍生步骤，更能有效富集到目标物，提高了检测灵敏度和准确度高，方法特异性强，可供政府执法部门、检验部门及药检机构使用。

附图说明

图1是在阴性毛发基质中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因及度冷丁标准物质，按照实施例1中所述方法进行提取净化、气相色谱质谱联用仪分析所得的总离子流出色谱图，图中标记分别为(A)度冷丁及其内标，(B)可待因及其内标，(C)吗啡及其内标，(D)单乙酰吗啡及其内标。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步进行详细说明。

实施例1

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析。配制浓度分别为2000pg/mg及30000pg/mg的标准添加样本。在同一天每个浓度配制6个样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算浓度及CV值，确定方法的回收率及日内检测精密度；连续5天，分别配制这两个浓度标准添加样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算CV值，确定方法的日间检测精密度和准确度。实验结果请见表1和表2。

一、实验步骤：

(1)分别称取约40mg的阴性毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末；

(2)分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液(具体成分为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，10％的牛血清蛋白，0.1％的吐温20，且其pH值调节为2.5)，加入内标，在45℃下超声4小时，离心，获得上清液；

(3)依次用2mL甲醇、2mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml 0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液；

(4)吹干洗脱液，以乙酸乙酯：BSTFA(40μL:10μL)混合溶液在65℃下衍生50分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析；

(5)气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下：

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；

进样口温度：260℃；

载气：氮气，纯度≥99.99％，流速为1.5mL/min；

采用不分流进样；

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击(EI)离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。

(6)具体结果见表1、表2。在两个浓度添加水平上，该四种阿片类物质(吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁)回收率均在±15％范围内，日间、日内CV％均小于15％，该方法回收率及日间、日内精密度验证合格。

表1

表2

实施例2

本实施例是6例药物滥用者毛发中吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质的检测实验示例，将毛发样本经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析，实验结果请见表3。

一、实验步骤：

(1)分别称取约40mg的滥用者毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末；

(2)分别精确称取30mg研磨后的滥用者毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液(具体成分为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，3％的牛血清蛋白，1％的吐温20，且其pH值调节为4.0)，加入内标，在75℃下超声2小时，离心，获得上清液；

(3)依次用2mL甲醇、2mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml 0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液；

(4)吹干洗脱液，乙酸乙酯：BSTFA(25μL:25μL)70℃衍生30分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析；

(5)称取7份40mg的阴性毛发(即用作对照的正常毛发)，分别按照步骤(1)所述方法进行清洗和研磨，得到研磨后的毛发粉末；

(6)精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液，加入内标，加入标准物质工作溶液，配成0、750、1500、3000、6000、12000、25000、50000pg/mg的系列浓度标准溶液，混匀；经上述的步骤(2)-(4)进行超声处理、固相萃取和衍生后，待气相色谱质谱联用仪分析；

(7)对上述的滥用者毛发和阴性毛发经预处理、固相萃取和衍生后的最终提取物，分别进行气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下：

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；

进样口温度：260℃；

载气：氮气，纯度≥99.99％，流速为1.5mL/min；

采用不分流进样；

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击(EI)离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。

二、数据处理

(1)根据阴性毛发制成的系列浓度标准溶液的检测结果，绘制标准浓度定量曲线，具体方法如下：

采用内标法，以浓度为横坐标，对应浓度的响应值与内标物响应值的比值作为纵坐标，不强制通过原点，进行一元线性回归分析，得到的回归方程如下：

吗啡：y＝(5.123e-004)x+(12.007e-003)，(r＝0.9998)；

单乙酰吗啡：y＝(8.526e-004)x+(1.011e-003)，(r＝0.9994)；

可待因：y＝(9.585e-004)x+(1.326e-003)，(r＝0.9993)；

度冷丁：y＝(5.202e-003)x+(-2.284e-003)，(r＝0.9991)。

(2)根据滥用者毛发的检测结果，以及步骤(1)中所得定量曲线和回归方程，计算该6名滥用者毛发中毒品含量如表3所示。在检测的6例样本中，检出3例含可待因、单乙酰吗啡及吗啡，由结果可知单乙酰吗啡与吗啡的浓度比值大于1.3，且单乙酰吗啡浓度均大于200.0pg/mg，可推断该毛发样品所有者属于海洛因滥用，在检测的6例样本中未检出度冷丁。

------表示未检测该项目  ND表示未检出

表3

实施例3

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析，确定方法的回收率，实验结果请见表4。

一、实验步骤：

(1)同实施例1；

(2)分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液(具体成分为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，0.5％的牛血清蛋白，5％的吐温20，且其pH值调节为4.0)，加入内标，在80℃下超声3.0小时，离心，获得上清液；

(3)依次用2mL甲醇、2mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml 0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比90:10，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液；

(4)吹干洗脱液，以乙酸乙酯：BSTFA(10μL:40μL)混合溶液在85℃下衍生20分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析；

(5)气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下：

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；

进样口温度：260℃；

载气：氮气，纯度≥99.99％，流速为1.5mL/min；

采用不分流进样；

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击(EI)离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。

(6)具体结果见表4。在两个浓度添加水平上，该四种阿片类物质回收率均在±15％范围内，该方法回收率验证合格。

表4

实施例4

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，将毛发样本经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行LC/MS-SIM分析，确定方法的回收率。实验结果请见表5和表6。

一、实验步骤：

(1)同实施例1；

(2)分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液(具体成分为0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，3％的牛血清蛋白，2％的吐温20，且其pH值调节为2.7)，加入内标，在70℃下超声2.0小时，离心，获得上清液；

(3)依次用2mL甲醇、2mL 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml 0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比95:5，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液；

(4)吹干洗脱液，复溶于100μL液相流动相中，待液相色谱质谱仪分析；

(5)进行液相色谱质谱仪分析，具体检测条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×150mm,3.5μm)(安捷伦公司)，接ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×12.5mm)保护柱；

柱温：室温；

流动相：V(乙腈):V(乙酸铵缓冲溶液：20mmoL/L乙酸铵，0.2％甲酸)＝70：30；

流速：300μL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，正离子(MRM)检测模式；碰撞气(CAD)：Medium；气帘气(CUR)：25；离子喷雾电压(IS)：5500V；雾化气温度(TEM)：500℃；GS1：70；GS2：60。

⑦吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁的碎片特征离子如表5所示(DP：解簇电压；EP：入口电压；CXP：出口电压；CE：碰撞能量)：

表5

(6)2000pg/mg和30000pg/mg两个浓度水平回收率结果见表6。回收率均在±10％范围内，验证合格。

表6

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种毛发中的阿片类物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末；

(2)加入复合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5％-10％的牛血清蛋白、0.1％-5％的吐温20，且pH值为2.0-5.0；

(3)固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.5mol/L醋酸溶液、甲醇和乙酸乙酯洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱阿片类物质，得到固相萃取洗脱液。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：

所述复合毛发处理液是0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5％-5％的牛血清蛋白、0.1％-3％的吐温20，且pH值为2.0-4.0。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：

步骤(2)所述的超声处理为37-85℃下进行1-6小时。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于：

步骤(2)所述的超声处理为65-85℃下进行1.0-3.0小时。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，

步骤(3)中固相萃取柱依次经甲醇和磷酸盐缓冲液进行平衡。

6.根据权利要求1中所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括有衍生步骤：将固相萃取洗脱液吹干后，用体积比为1:4-4:1的乙酸乙酯：N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺混合溶液进行衍生，得到衍生产物。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述衍生条件为：65-85℃，反应15-50分钟。

8.一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据权利要求1-5任一项所述提取方法得到所述固相萃取洗脱液或根据权利要求6-7任一项所述的提取方法得到衍生产物；

(2)采用气相色谱质谱联用仪对所述衍生产物进行检测，或采用液相色谱质谱联用仪对所述固相萃取洗脱液进行检测；

所述阿片类物质为吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下：

色谱柱为CD-5MS，30m×0.25mm×0.25μm色谱柱；

进样口温度为180-280℃；

采用程序升温模式，柱温：100℃， 4分钟。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下：

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，接ZORBAX Eclipse XDB-C18保护柱；

柱温：室温；

流动相:乙腈-缓冲液＝70：30(v:v)，缓冲液为20mmol/L乙酸铵和0.2％甲酸的溶液；

流速：300μL/min；

质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。