CN103592400A - 毛发中阿片类物质的提取和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种毛发中阿片类物质的提取和检测方法，包括毛发的提取和净化步骤。该提取方法还可以包括一个衍生步骤。本发明还提供一种对毛发中的阿片类物质进行检测的方法，采用了气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪。与传统的毛发毒品残留检测方法相比，本发明的方法非常温和，但又能够有效富集得到阿片类物质，并有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，具有较高的灵敏度和准确度，可供政府执法部门、检验部门及药检机构使用。

Description

毛发中阿片类物质的提取和检测方法

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，特别是涉及毛发中阿片类物质的提取方法和检测方法。 

背景技术

毒品和滥用成瘾性药物危害人体健康和社会安全，一直是国家依法严厉打击的对象，人体毒品残留的检测手段，对执法的辅助作用至关重要。毛发分析具有易取材、易保存、检出时限长，反映药物滥用史信息全面，易重复取样等独特优势，已广泛用于法医毒物学、临床毒物学、职业医学及兴奋剂控制等领域。毛发中常见滥用药物分析的证据性质已得到大部分国家的法庭认可。 

毛发中成分复杂，存在大量干扰物质，为检测毛发中的阿片类毒品，必须建立有效的前处理方法分离提取目标物。毛发中毒品检测通常先用酸水解、碱水解、酶水解或甲醇等方法进行提取，再进行液液萃取或固相萃取达到净化的目的。酸水解法条件较为温和，释放效率较高，但该方法依然存在酸水解时间太长，不满足时效性需求的缺点，如《生物检材中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析》中头发采用0.1mol/L HCl溶液45℃水浴浸泡过夜（Journal of Forensic Medicine,February2006,Vol.22,No.1）。碱水解药物释放完全，但条件激烈；酶水解适用范围广，释放效率高，但价格昂贵。 

目前，亟需一种对毛发中的阿片类物质（包括吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁等）进行高效分离提取的方法，以及进行高灵敏度和高特异性检测的方法。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种毛发中阿片类物质的提取方法，该方法非常 温和，同时又能够有效富集得到阿片类物质。 

实现上述目的的技术方案如下。 

一种毛发中的阿片类物质的提取方法，包括以下步骤： 

（1）清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末； 

（2）加入复合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%-5%的吐温20，且pH值2.0-5.0； 

（3）固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.5mol/L醋酸溶液、甲醇和乙酸乙酯洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱阿片类物质，得到固相萃取洗脱液。 

优选地，所述复合毛发处理液是0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐温20，且pH值2.0-4.0。 

优选地，步骤（2）所述的超声处理为37-85℃下进行1.0-6小时。 

优选地，步骤（2）所述的超声处理为65-85℃下进行1.0-3.0小时。 

优选地，步骤（3）固相萃取柱依次经甲醇和磷酸盐缓冲液进行平衡。 

在其中一个实施例中，该方法还包括有衍生步骤：将固相萃取洗脱液吹干后，用体积比为1:4-4:1的乙酸乙酯：N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺混合溶液（BSTFA）进行衍生，得到衍生产物。 

优选地，所述衍生步骤的条件为：65-85℃，反应15-50分钟。 

本发明的另一目的在于，还提供一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，该检测方法灵敏度高，特异性好。 

实现上述目的的技术方案如下： 

一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，包括以下步骤： 

（1）根据上述提取方法得到所述固相萃取洗脱液或衍生产物； 

（2）采用气相色谱质谱联用仪（GC/MS-SIM）或液相色谱质谱联用仪（LC/MS/MS）对所述固相萃取洗脱液或衍生产物进行检测。 

在其中一个实施例中，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 

色谱柱CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 

进样口温度为180-280℃； 

采用程序升温模式，柱温：

在其中一个实施例中，所述液相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×150mm,3.5μm(安捷伦公司)，接ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1×12.5mm）保护柱； 

柱温：室温； 

流动相:乙腈-缓冲液（70：30），缓冲液为20mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸的溶液； 

流速：300μL/min； 

质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。 

本发明提供的一种对毛发中的毒品残留进行提取和检测的方法，操作简单，能有效地提取毛发中的吗啡、单乙酰吗啡、可待因及度冷丁等阿片类物质，并进行定性定量分析检测。与传统方法相比，本发明的方法通过用复合毛发处理液对毛发进行预处理和固相萃取，反应条件非常温和，且有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，高效分离提取了毛发中的目标物。另外，再进一步通过衍生步骤，更能有效富集到目标物，提高了检测灵敏度和准确度高，方法特异性强，可供政府执法部门、检验部门及药检机构使用。 

附图说明

图1是在阴性毛发基质中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因及度冷丁标准物质，按照实施例1中所述方法进行提取净化、气相色谱质谱联用仪分析所得的 总离子流出色谱图，图中标记分别为（A）度冷丁及其内标，（B）可待因及其内标，（C）吗啡及其内标，（D）单乙酰吗啡及其内标。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步进行详细说明。 

实施例1 

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析。配制浓度分别为2000pg/mg及30000pg/mg的标准添加样本。在同一天每个浓度配制6个样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算浓度及CV值，确定方法的回收率及日内检测精密度；连续5天，分别配制这两个浓度标准添加样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算CV值，确定方法的日间检测精密度和准确度。实验结果请见表1和表2。 

一、实验步骤： 

（1）分别称取约40mg的阴性毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末； 

（2）分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS），10%的牛血清蛋白，0.1%的吐温20，且其pH值调节为2.5），加入内标，在45℃下超声4小时，离心，获得上清液； 

（3）依次用2mL甲醇、2mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 

（4）吹干洗脱液，以乙酸乙酯：BSTFA（40μL:10μL）混合溶液在65℃下衍生50分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析； 

（5）气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下： 

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 

进样口温度：260℃； 

载气：氮气，纯度≥99.99%，流速为1.5mL/min； 

采用不分流进样； 

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击（EI）离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。 

（6）具体结果见表1、表2。在两个浓度添加水平上，该四种阿片类物质（吗啡、单乙酰吗啡、可待因、度冷丁）回收率均在±15%范围内，日间、日内CV%均小于15%，该方法回收率及日间、日内精密度验证合格。 

表1 

表2 

实施例2 

本实施例是6例药物滥用者毛发中吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质的检测实验示例，将毛发样本经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析，实验结果请见表3。 

一、实验步骤： 

（1）分别称取约40mg的滥用者毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末； 

（2）分别精确称取30mg研磨后的滥用者毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，3%的牛血清蛋白，1%的吐温20，且其pH值调节为4.0），加入内标，在75℃下超声2小时，离心，获得上清液； 

（3）依次用2mL甲醇、2mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 

（4）吹干洗脱液，乙酸乙酯：BSTFA（25μL:25μL）70℃衍生30分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析； 

（5）称取7份40mg的阴性毛发（即用作对照的正常毛发），分别按照步骤（1）所述方法进行清洗和研磨，得到研磨后的毛发粉末； 

（6）精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液，加入内标，加入标准物质工作溶液，配成0、750、1500、3000、6000、12000、25000、50000pg/mg的系列浓度标准溶液，混匀；经上述的步骤（2）-（4）进行超声处理、固相萃取和衍生后，待气相色谱质谱联用仪分析； 

（7）对上述的滥用者毛发和阴性毛发经预处理、固相萃取和衍生后的最终提取物，分别进行气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下： 

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 

进样口温度：260℃； 

载气：氮气，纯度≥99.99%，流速为1.5mL/min； 

采用不分流进样； 

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击（EI）离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。 

二、数据处理 

（1）根据阴性毛发制成的系列浓度标准溶液的检测结果，绘制标准浓度定量曲线，具体方法如下： 

采用内标法，以浓度为横坐标，对应浓度的响应值与内标物响应值的比值作为纵坐标，不强制通过原点，进行一元线性回归分析，得到的回归方程如下： 

吗啡：y=(5.123e-004)x+(12.007e-003)，(r=0.9998)； 

单乙酰吗啡：y=(8.526e-004)x+(1.011e-003)，(r=0.9994); 

可待因：y=(9.585e-004)x+(1.326e-003)，(r=0.9993)； 

度冷丁：y=(5.202e-003)x+(-2.284e-003)，(r=0.9991)。 

（2）根据滥用者毛发的检测结果，以及步骤（1）中所得定量曲线和回归方程，计算该6名滥用者毛发中毒品含量如表3所示。在检测的6例样本中，检出3例含可待因、单乙酰吗啡及吗啡，由结果可知单乙酰吗啡与吗啡的浓度比值大于1.3，且单乙酰吗啡浓度均大于200.0pg/mg，可推断该毛发样品所有者属于海洛因滥用，在检测的6例样本中未检出度冷丁。 

------表示未检测该项目ND表示未检出 

表3 

实施例3 

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析，确定方法的回收率，实验结果请见表4。 

一、实验步骤： 

（1）同实施例1； 

（2）分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，0.5%的牛血清蛋白，5%的吐温20，且其pH值调节为4.0），加入内标，在80℃下超声3.0小时，离心，获得上清液； 

（3）依次用2mL甲醇、2mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比90:10，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 

（4）吹干洗脱液，以乙酸乙酯：BSTFA（10μL:40μL）混合溶液在85℃下衍生20分钟，冷却，待气相色谱质谱联用仪分析； 

（5）气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下： 

色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 

进样口温度：260℃； 

载气：氮气，纯度≥99.99%，流速为1.5mL/min； 

采用不分流进样； 

采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

采用离子轰击（EI）离子源质谱检测，离子源温度230℃，接口温度280℃。 

（6）具体结果见表4。在两个浓度添加水平上，该四种阿片类物质回收率均在±15%范围内，该方法回收率验证合格。 

表4 

实施例4 

本实施例是阴性毛发中添加吗啡、单乙酰吗啡、可待因和度冷丁等阿片类物质标准品，将毛发样本经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行LC/MS-SIM分析，确定方法的回收率。实验结果请见表5和表6。 

一、实验步骤： 

（1）同实施例1； 

（2）分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，3%的牛血清蛋白，2%的吐温20，且其pH值调节为2.7），加入内标，在70℃下超声2.0小时，离心，获得上清液； 

（3）依次用2mL甲醇、2mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、2ml0.1M醋酸溶液、1mL甲醇、1mL乙酸乙酯洗涤杂质，压干5分钟，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比95:5，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 

（4）吹干洗脱液，复溶于100μL液相流动相中，待液相色谱质谱仪分析； 

（5）进行液相色谱质谱仪分析，具体检测条件如下： 

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×150mm,3.5μm)(安捷伦公司)，接ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1×12.5mm）保护柱； 

柱温：室温； 

流动相：V(乙腈):V(乙酸铵缓冲溶液：20mmoL/L乙酸铵，0.2%甲酸)=70：30； 

流速：300μL/min； 

进样量：10μL； 

质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），正离子（MRM）检测模式；碰撞气（CAD）：Medium；气帘气（CUR）：25；离子喷雾电压（IS）：5500V；雾化气温度（TEM）：500℃；GS1：70；GS2：60。 

7○氯胺酮、去甲氯胺酮、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDA、MDEA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮的碎片特征离子如表5所示（DP：解簇电压；EP： 

入口电压；CXP：出口电压；CE：碰撞能量）： 

表5 

（6）2000pg/mg和30000pg/mg两个浓度水平回收率结果见表6。回收率均在±10%范围内，验证合格。 

表6 

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (10)

1.一种毛发中的阿片类物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末； 

（2）加入符合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%-5%的吐温20，且pH值为2.0-5.0； 

（3）固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.5mol/L醋酸溶液、甲醇和乙酸乙酯洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱阿片类物质，得到固相萃取洗脱液。 

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于： 

所述复合毛发处理液是0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐温20，且pH值为2.0-4.0。 

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于： 

步骤（2）所述的超声处理为37-85℃下进行1-6小时。 

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于： 

步骤（2）所述的超声处理为65-85℃下进行1.0-3.0小时。 

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于， 

步骤（3）中固相萃取柱依次经甲醇和磷酸盐缓冲液进行平衡。 

6.根据权利要求1中所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括有衍生步骤：将固相萃取洗脱液吹干后，用体积比为1:4-4:1的乙酸乙酯：N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺混合溶液进行衍生，得到衍生产物。 

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述衍生条件为：65-85℃，反应15-50分钟。 

8.一种对毛发中的阿片类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）根据权利要求1-5任一项所述提取方法得到所述固相萃取洗脱液或根据权利要求6-7任一项所述的提取方法得到衍生产物； 

（2）采用气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪对所述固相萃取洗脱液或衍生产物进行检测。 

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 

色谱柱CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 

进样口温度为180-280℃； 

采用程序升温模式，柱温：

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，接ZORBAX Eclipse XDB-C18保护柱； 

柱温：室温； 

流动相:乙腈-缓冲液=70：30（v:v），缓冲液为20mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸的溶液； 

流速：300μL/min； 

质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。 

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