CN108181475A - 一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒 - Google Patents

一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质修饰富集分析领域，具体涉及一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法和试剂盒。本发明利用磁性纳米材料Fe3O4/APTES与经水解成的磷酸化多肽螯合作用，以及Fe3O4/APTES中3‑氨丙基三乙基硅烷的正电荷与磷酸化多肽的负电荷的静电作用实现初次富集，并外加磁场分离溶液，再通过纳米TiO2对分离后的溶液进行二次富集；本发明还结合上述方法发明了相应的试剂盒。本发明相比于单一采用磁性纳米材料或普通TiO2进行富集，有效提高了磷酸化蛋白质的选择性富集效果，提升了质谱检测精度。

Description

一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于蛋白质修饰富集领域，特别是一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法和试剂盒。
背景技术
蛋白质磷酸化是生物体中最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，所以磷酸化一直是生物学研究的重点与热点。
由于翻译后修饰的蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广，因此在进行液相色谱、质谱分析前需要对修饰的蛋白质进行富集以提高其丰度。经丰度提升后，可对经富集的磷酸化蛋白修饰进行高通量鉴定，一次可鉴定磷酸化蛋白的成百上千个修饰位点。研究对象包括动物、植物、微生物的组织、细胞及血清、尿液、脑脊液等体液样本。
现有技术中，如授权公告号CN103940894B提供的一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法，只通过使用磁性材料Fe3O4@NH2和外加磁场进行单次富集，富集后溶液中还残留有少量磷酸化肽段，对检测精度有一定影响。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法和试剂盒，具体通过以下技术实现。
一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，包括以下步骤：
S1、通过蛋白水解酶水解磷酸化蛋白质，得到溶于缓冲液中的磷酸化多肽溶液；
S2、在磷酸化多肽溶液中加入磁性纳米材料，初次富集磷酸化蛋白质，得混合溶液；
S3、在步骤S2所得混合溶液中外加磁场，使磁性纳米材料与溶液分离，得初次上层清液和初次下层固体；
S4、收集初次下层固体，用Tris缓冲液清洗初次下层固体且外加磁场，分离得到二次上层清液和二次下层固体收集备用；
S5、将初次上层清液和二次上层清液混匀，加入纳米TiO2进行二次富集，分离得三次下层固体和三次上层清液；
S6、分别对二次下层固体和三次下层固体分别进行质谱分析。
优选地，所述步骤S1的磷酸化多肽溶液的浓度为10ng/μL～50ng/μL，溶于25mmol/L 的Tris缓冲液中。
优选地，所述步骤S2的磁性纳米材料为通过3-氨丙基三乙基硅烷修饰的Fe3O4/APTES 纳米复合颗粒，所述Fe3O4/APTES纳米复合颗粒是以FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；所述磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，所述3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.2～0.4mL。
优选地，所述步骤S5的纳米TiO2是以钛酸四丁酯为原料，采用水解法制备得到。
优选地，步骤S2中磁性纳米材料富集的温度为30～40℃，富集时间为6～8min；步骤S5的二次富集温度为32～42℃，富集时间为2～2.5min。
本发明还提供了一种磷酸化蛋白质修饰富集的试剂盒，内含一种用于溶解磷酸化多肽的缓冲液、一种磁性纳米材料固体、一种纳米TiO2固体。
优选地，所述缓冲液为浓度为25mmol/L的Tris缓冲液；所述一种磁性纳米材料固体为通过3-氨丙基三乙基硅烷修饰的Fe3O4/APTES纳米复合颗粒。
本发明的提供的一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法和试剂盒，有益之处在于：通过 Fe3O4/APTES纳米复合颗粒进行第一次富集后，再通过纳米TiO2进行第二次富集，纳米TiO2的吸附富集功能相比于普通TiO2更强，有效提升了磷酸化蛋白的富集效果，提高了质谱检测的精度。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法的富集能力试验，包括以下步骤：
将FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.2mL。通过酪蛋白水解酶水解配置得到50ng/μL的磷酸化多肽溶液，磷酸化多肽溶液的溶剂为溶于25mmol/L 的Tris缓冲液；将Fe3O4/APTES纳米复合颗粒放入上述溶液中反应6～8min，温度为30～ 40℃；然后外加磁场使Fe3O4/APTES纳米复合颗粒与溶液分离，得初次上层清液和初次下层固体；将初次下层固体用Tris缓冲液(25mmol/L)清洗且外加磁场，分离得到二次上层清液和二次下层固体；将初次上层清液和二次上层清液混匀后加入纳米TiO2进行二次富集，富集时间2～2.5min，富集温度32～42℃，分离后得到三次下层固体和三次上层清液；最后分别对二次下层固体和三次下层固体分别进行质谱分析。
实施例2
一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法的富集能力试验，本实施例的试验步骤与实施例1 基本相同，不同之处在于：
将FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.4mL。
比较例1
一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法的富集能力试验，包括以下步骤：
将FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.15mL。通过酪蛋白水解酶水解配置得到50ng/μL的磷酸化多肽溶液，磷酸化多肽溶液的溶剂为溶于25mmol/L 的Tris缓冲液；将Fe3O4/APTES纳米复合颗粒放入上述溶液中反应6～8min，温度为30～ 40℃；然后外加磁场使Fe3O4/APTES纳米复合颗粒与溶液分离，得初次上层清液和初次下层固体；将初次下层固体用Tris缓冲液(25mmol/L)清洗且外加磁场，分离得到二次上层清液和二次下层固体；将初次上层清液和二次上层清液混匀后加入纳米TiO2进行二次富集，富集时间2～2.5min，富集温度32～42℃，分离后得到三次下层固体和三次上层清液；最后分别对二次下层固体和三次下层固体分别进行质谱分析。
比较例2
一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法的富集能力试验，本比较例的实验步骤与比较例1 基本相同，不同之处在于：
将FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.45mL。
分别观测实施例1、2和比较例1、2的采用Fe3O4/APTES纳米复合颗粒和纳米TiO2的质谱图，纵坐标为质谱峰相对强度(100％Intenstity)，横坐标为质荷比(m/z)。通过对比可知，比较例1和2的富集前和富集后磷酸化肽段的单电荷峰和双电荷峰的高度(即相对强度)明显低于实施例1和实施例2；这是由于磁性溶液中Fe3O4磁性颗粒的含量与 3-氨丙基三乙基硅烷用量的比例显著减弱了最终合成的Fe3O4/APTES纳米复合颗粒的磁性。由此得出，实施例1、2中的磁性溶液中Fe3O4磁性颗粒的含量与3-氨丙基三乙基硅烷用量最优。经过水解和富集的磷酸化蛋白可以被选择性的富集下来。

Claims (7)

1.一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过蛋白水解酶水解磷酸化蛋白质，得到溶于缓冲液中的磷酸化多肽溶液；
S2、在磷酸化多肽溶液中加入磁性纳米材料，初次富集磷酸化蛋白质，得混合溶液；
S3、在步骤S2所得混合溶液中外加磁场，使磁性纳米材料与溶液分离，得初次上层清液和初次下层固体；
S4、收集初次下层固体，用Tris缓冲液清洗初次下层固体且外加磁场，分离得到二次上层清液和二次下层固体收集备用；
S5、将初次上层清液和二次上层清液混匀，加入纳米TiO2进行二次富集，分离得三次下层固体和三次上层清液；
S6、分别对二次下层固体和三次下层固体分别进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，其特征在于，所述步骤S1的磷酸化多肽溶液的浓度为10ng/μL～50ng/μL，溶于25mmol/L的Tris缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，其特征在于，所述步骤S2的磁性纳米材料为通过3-氨丙基三乙基硅烷修饰的Fe3O4/APTES纳米复合颗粒，所述Fe3O4/APTES纳米复合颗粒是以FeCl3和FeSO4为原料制备的磁性溶液与3-氨丙基三乙基硅烷搅拌制得；所述磁性溶液为50mL，固体含量8mg/mL，所述3-氨丙基三乙基硅烷为分析纯，用量为0.2～0.4mL。
4.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，其特征在于，所述步骤S5的纳米TiO2是以钛酸四丁酯为原料，采用水解法制备得到。
5.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质修饰富集的方法，其特征在于，步骤S2中磁性纳米材料富集的温度为30～40℃，富集时间为6～8min；步骤S5的二次富集温度为32～42℃，富集时间为2～2.5min。
6.一种磷酸化蛋白质修饰富集的试剂盒，其特征在于，内含一种用于溶解磷酸化多肽的缓冲液、一种磁性纳米材料固体、一种纳米TiO2固体。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为浓度为25mmol/L的Tris缓冲液；所述一种磁性纳米材料固体为通过3-氨丙基三乙基硅烷修饰的Fe3O4/APTES纳米复合颗粒。
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