KR101427146B1 - 생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및 코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서, 상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고, 상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고, 이때, 상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트에 관한 것이다.

Description

생체 분자 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법{KIT FOR ANALYZING BIOMOLECULES AND METHOD FOR ANALYZING BIOMOLECULES USING THE SAME}
본 발명은 생체 분자 분석 키트 및 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 는 항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 정밀하게 분석하기 위한 분석 키트 및 이를 이용한 생체 분자 분석 방법에 관한 것이다.
항생제 또는 암세포 등과 같은 생체 분자를 신속하고 정확하게 분석하는 것은 사회 전반의 의료 및 보건 측면에서 매우 중요하다. 항생제는 인간과 가축의 치료에 널리 사용되고 있으나, 적용 분야에 따라 부작용 및 위험성이 상존하므로 항생제 잔류물의 주의 깊은 모니터링이 필요하다.
또한, 암을 진단 또는 치료하기 위해서는 암의 원인이 되거나 암으로 과다 유발되는 인자를 선택적으로 구별할 수 있어야 한다. 기존의 암 진단 마커가 이러한 원리로 사용되고 있다. 예를 들어, 전립선암 마커인 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen, PSA)은 전립선의 세포에서 합성되는 단백질로서, 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 종양 표지자이다. PSA는 건강한 인간의 혈청에 매우 낮은 수치로 존재하나, 전립선암 또는 다른 전립선 질환이 존재하는 경우 PSA 수치가 증가한다. 따라서, 혈청 PSA의 검출은 초기 단계의 전립선암의 진단 및 치료의 추적조사에 유용하게 사용될 수 있다.
그러나, 전립선염, 전립선 비대증 및 전립선 경색 등과 같은 양성 병변들 뿐만 아니라, 사정, 전립선 마사지 및 세침생검을 포함한 전립선의 조작에 의해서도 PSA 수치가 증가될 수 있으므로, PSA 수치 테스트에 의한 전립선암 진단의 정확도를 높이는 것은 어려운 문제이다. 또한, PSA는 인간 혈액에서 유리형 또는 복합형 PSA와 같은 다양한 형태로 존재한다. 혈청에서 PSA는 대부분 α1-항키모트립신과 결합된 복합체를 형성하는데, 전립선암에서는 복합형 PSA의 분획이 더욱 높아지고, 유리형 PSA가 낮아진다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, PSA의 총량에 대한 유리형 PSA의 비율을 결정하는 것이 진단 정확도를 향상시키기 위해 필요하다.
PSA에 관한 통상적인 검출법은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), SPR 바이오센서, 전기화학적 검출기 등을 이용한 방법으로서, 이들은 1.0 pg/mL 내지 0.1 μg/mL 범위의 검출 한계를 가지며, 약 10 μL 부피의 샘플을 사용한다. 최근에, 혈청 샘플에서 0.10 pg/mL의 검출 한계를 갖는 민감하면서도 특이적인 전기화학적 면역센서가 제안되었다(K. Chuah, L. M. H. Lai, I. Y. Goon, S. G. Parker, R. Amal, J. J. Gooding, Chem. Commun., 2012, 48, 3503-3505). 이러한 검출 한계는 암 진단을 위한 현재의 PSA 수치보다는 낮지만, 이 방법은 정량화 한계를 보이는 낮은 재현성으로 인해 그 유용성이 제한되는 문제가 있다.
따라서, 우수한 진단 정확도 및 신뢰도를 위해 높은 감도를 갖고 재현성이 우수한 생체 분자의 검출 방법이 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 생체 분자를 높은 검출 감도로 그리고 높은 정확도를 가지고 재현성 있게 분석할 수 있는 분석 키트 및 이를 이용한 분석 방법을 제공함에 있다. 또한 2개 이상의 생체 분자를 동시에 분석할 수 있는 분석 키트 및 분석 방법을 제공함에 있다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 생체 분자 분석 키트를 제공한다.
본 발명의 생체 분자 분석 키트는
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서,
상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및
전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
이때, 상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 M1은 CsCl2인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 M2는 Au 또는 Pt 인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 M1을 별도의 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, M1을 중성에서 금속과 킬레이션 할 수 있고, SiO2와 친화력 있는 물질을 추가하여 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 한다.
또한, 바람직하게는, SiO2로 둘러싸는 단계는 가열하는 것을 특징으로 하며, 상기 가열 온도는 40 내지 100℃이다.
또한, 본 발명은
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서,
상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및
전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석키트를 이용한 생체 분자 분석 방법으로써
시료 용액에 상기 제1 입자를 넣고 표적 생체 분자와 접촉시키고, 생체 분자와 결합하거나 결합하지 않은 제1 입자를 자성으로 분리하는 단계;
상기 제1 입자 용액에 제2 입자를 넣어, 생체 분자에 제1 입자 및 제2 입자가 결합된 복합체를 형성하고 자성으로 분리하는 단계;
상기 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)을 측정하여 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계;
상기 제1 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M1)을 측정하여 제1 입자의 감소량을 측정하는 단계; 및
상기 금속 또는 금속산화물(M2)에 의해 측정된 표적 생체 분자의 양에서 제1 입자의 감소량을 보정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 생체 분자 분석 키트는, 생체 분자와 특이적으로 결합하는 결합수단을 포함하는 제2 입자의 코어에 있는 금속 또는 금속산화물(M2)의 양을 측정함으로써 높은 감도로 생체분자의 정성 및 정량이 가능한 효과가 있다. 또한 생체분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 결합수단을 포함하는 제1 입자의 코어에 있는 자성물질에 의해 생체분자를 손쉽게 분리할 수 있고, 제1 입자의 코어에 있는 금속 또는 금속산화물(M1)에 의해 생체분자와 제1 입자의 결합 후 분리 및 세척과정에서 발생하는 제1 입자의 손실에 의한 오차를 보정해 줄 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 생체 분자 분석 키트는 세척 과정에서 발생하는 제1 입자의 손실에 대하여 쉽게 보정할 수 있어 생체 분자의 정량 분석의 정확도를 높일 수 있다. 또한 본 발명은 2개 이상의 생체 분자를 동시에 분석할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제1 입자의 구성도이다.
도 2는 본 발명에 따른 제2 입자의 구성도이다.
도 3은 본 발명에 따른 생체 분자 분석 키트와 분석 대상 생체 분자와의 결합관계를 도시한 구성도이다.
도 4는 본 발명에 따른 생체 분자 분석 키트의 구성도이다.
본 발명은
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서,
상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및
전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
이때, 상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 생체 분자 분석 키트에 대하여 구체적으로 설명한다.
제1 입자
제1 입자는 코어-셀 구조로 이루어져 있으며, 셀의 표면에는 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 제1 결합수단이 결합되어 있다.
본 발명의 제1 입자의 코어는 자성물질(magnetic particle; MP) 및 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함한다.
상기 자성물질은 수 내지 수십 나노미터 직경의 입자상 구조체로서, 외부 자력에 의해 유동하는 성질을 갖는 물질을 의미한다. 자성물질은 바람직하게는 30 nm 이하의 직경을 가질 수 있으며, Fe, Co, Ni 등의 산화물이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 금속 또는 금속산화물(M1)의 금속으로는 전이금속 또는 희토류 금속이 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 입자의 코어에 포함되는 상기 금속 또는 금속산화물(M1)은 바람직하게는 별도의 셀로 둘러싸여 있을 수 있으며, 상기 셀은 실리카일 수 있다.
상기 실리카로 둘러싸는 단계는 바람직하게는 가열에 의한 것일 수 있으며, 그 가열 온도는 40 내지 100℃이며, 바람직하게는 80℃ 이상이다.
상기 금속 또는 금속산화물(M1)은 중성에서 금속과 킬레이션 할 수 있고, SiO2와 친화력 있는 물질을 추가하여 SiO2로 둘러쌀 수 있다.
바람직하게는, 상기 중성에서 금속과 킬레이션 할 수 있고, SiO2와 친화력 있는 물질로는 수용성 alexa fluor계 염료이고, 더욱 바람직하게는, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), Cy5, Cy7 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. SiO2 이외에 다른 물질을 추가하여 함께 둘러싸는 경우 셀을 잘 형성할 수 있는 장점이 있다.
또한, 상기 금속 또는 금속산화물인 M1의 직경은 바람직하게는 10 내지 30 nm이다.
본 발명의 제1 입자의 코어의 직경은 바람직하게는 100 내지 120nm 이다.
본 발명의 제1 입자의 코어에 포함되는 금속 또는 금속산화물(M1)은 분광분석기에 의해 분석이 가능하다. 상기 분광분석기는 예를 들어, 유도결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기(graphite furnace atomic absorption spectrometry, GFAAS)일 수 있으며, 상기 금속 또는 금속산화물(M1)은 이러한 분석 기기에 의해 그 존부 및 존재량이 확인될 수 있다.
본 발명의 제1 입자는 생체분자와 반응 후 코어에 포함된 자성물질에 의해 자력에 의해 분리되고 세척된다. 이 과정에서 생체분자와 결합하거나 결합하지 않은 제1 입자가 손실될 수 있는데, 제1 입자와 생체분자와의 반응 전 및 반응/분리 후에 제1 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M1)의 양을 측정하여 비교하면 어느 정도 손실이 되었는지를 알 수 있다.
본 발명은 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)로 측정되는 표적 생체분자의 양에 대해 상기 손실을 보정해줌으로써 표적생체분자의 함량을 정확하게, 그리고 재현성 있게 측정할 수 있는 것이다.
본 발명의 제1 입자의 코어는 셀에 의해 쌓여 있으며 상기 셀은 실리카로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 입자의 셀의 표면에는 생체분자와 특이적 또는 비특이적으로결합하는 제1 결합수단을 포함한다. 상기 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단으로는 바람직하게는 NH2, COOH, OH 등의 작용기가 있으며, 이 경우 COOH, NH2 작용기를 갖는 생체 분자와 아마이드 결합 또는 에스테르 결합을 할 수 있다. 상기 제1 입자 내에 비특이적으로 결합하는 상이한 2개 이상의 결합 수단을 포함할 수 있다.
또한 제1 결합 수단으로 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 것도 사용될 수 있는데 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 항원에 대한 항체 또는 유전자의 상보적 결합 등을 들 수 있다.
제2 입자
제2 입자는 코어-셀 구조로 이루어져 있으며, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단이 결합되어 있다.
상기 셀은 SiO2를 포함하며, 상기 코어는 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함한다. 상기 금속 또는 금속산화물(M2)의 금속으로는 전이금속 또는 희토류 금속이 사용될 수 있다.
상기 제2 결합수단으로는 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 항원에 대한 항체 또는 유전자의 상보적 결합 등을 들 수 있다.
예를 들어, 생체 분자가 특정 항원으로 인식되는 부위를 포함할 경우, 제2
결합 수단은 그에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 단일 클론 항체 또는 다중 클론 항체일 수 있다. 여기서, 단일 클론 항체는 상대적으로 크기가 작을 뿐만 아니라, 하나의 항체에 분석 대상이 아닌 생체 분자가 결합할 가능성이 낮으므로, 분석 민감도가 우수하다.
생체 분자가 뉴클레오티드 중합체를 포함할 경우, 제2 결합 수단은 그에 상보적으로 결합하는 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 여기서, 상기 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오
티드는 상술한 단일 클론 항체와 같이 그 크기가 작아 주변 분자와의 상호작용이 낮아 분석 대상 생체 분자의 검출 민감도를 향상시킬 수 있다.
상기 제2 입자의 금속 또는 금속산화물(M2)은, 분광분석기에 의해 분석이 가능하다. 상기 분광분석기는 예를 들어, 유도결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS) 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기(graphite furnace atomic absorption spectrometry, GFAAS)일 수 있으며, 상기 금속 또는 금속산화물(M1)은 이러한 분석 기기에 의해 그 존부 및 존재량이 확인될 수 있다.
따라서 본 발명의 제2 입자가 표적 생체분자와 특이적으로 결합한 후 상기 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)의 양을 측정함으로써 표적 생체분자의 양을 정량 할 수 있다.
본 발명은 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)로 측정되는 표적 생체분자의 양에 대해 제1 입자의 금속 또는 금속산화물(M1)로 측정된 제1 입자의 손실을 보정해줌으로써 표적생체분자의 함량을 정확하게, 그리고 재현성 있게 측정할 수 있는 것이다. 이를 위해 상기 제1 입자의 코어에 포함되는 금속 또는 금속산화물(M1)의 금속과 제2 입자의 코어에 포함되는 금속 또는 금속산화물(M2)의 금속은 상이하여야 한다.
본 발명은 표적 생체 분자가 2개 이상일 수 있고, 이 경우 각 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 입자를 각각 반응시키며 이때 2개 이상의 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)에 포함된 금속은 서로 상이하다. 그 결과 본 발명은 2개 이상의 생체 분자를 동시에 분석할 수 있다.
또한, 상기 금속 또는 금속산화물인 M2의 직경은 바람직하게는 10 내지 30 nm이다. 상기 범위 내에 있으면 초상자성(superparamagnetic) 성질을 가질 수 있다.
본 발명의 제2 입자의 코어의 직경은 바람직하게는 100 내지 120nm 이다. 상기 범위 내에 있으면서도 core내의 자성입자의 크기는 10-30 nm 정도이므로 초상자성 성질을 가지고 있다. 또한 전체 입자의 크기가 크기 때문에 필요시 원심분리 또는 침전법으로 분리할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 제1 입자 및 제2 입자의 코어는 실리카를 포함하는 셀에 의해 쌓여 있는데 실리카로 둘러싸는 단계는 바람직하게는 가열에 의한 것일 수 있으며, 그 가열 온도는 40 내지 100℃이며, 바람직하게는 80℃ 이상이다.
본 발명에서 생체 분자는 생체 내에서 배출되거나 분리되는 물질로서, 생체에서 생성되는 물질뿐만 아니라, 생체에 투입되어 일정 시간 잔류하는 물질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 생체 분자는 항생제, 핵산, 호르몬, 효소, 세포, 종양, 암세포, 세균, 바이러스 및 이들의 분비물 등을 포함할 수 있다. 항생제의 예로는 살리노마이신, 엔로플록사신, 시프로플록사신, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 암피실린, 세팔로스포린, 네오마이신, 겐타마이신, 이세파마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 클래리스로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 린코마이신, 술파티아졸, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 설파메라진 등을 들 수 있으며, 세포 분비물의 예로는 전립선 세포에서 합성되는 단백질인 전립선 특이 항원 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및
코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서,
상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및
전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 하는 생체분자 분석키트를 이용한 생체분자 분석 방법으로써
시료 용액에 상기 제1 입자를 넣고 표적 생체 분자와 접촉시키고, 생체 분자와 결합하거나 결합하지 않은 제1 입자를 자성으로 분리하는 단계;
상기 제1 입자 용액에 제2 입자를 넣어, 생체 분자에 제1 입자 및 제2 입자가 결합된 복합체를 형성하고 자성으로 분리하는 단계;
상기 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)을 측정하여 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계;
상기 제1 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M1)을 측정하여 제1 입자의 감소량을 측정하는 단계; 및
상기 금속 또는 금속산화물(M2)에 의해 측정된 표적 생체 분자의 양에서 제1 입자의 감소량을 보정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 M1으로는 CsCl2를 사용할 수 있으며, 상기 M2로는 Au 또는 Pt를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 분석 방법에 사용되는 분석 키트에 대한 설명은 앞서 설명과 동일하다.
따라서 이하 표적 생체분자의 분석 방법을 설명한다.
표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자와 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 준비한다.
상기 준비된 제1 입자를 표적 생체 분자와 접촉시켜 표적 생체 분자와 제1 입자가 결합된 복합체를 형성한다.
상기 제1 입자의 셀의 표면에는 생체분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함한다. 비특이적으로 결합하는 결합수단으로 바람직하게는 NH2, COOH, OH 등의 작용기가 있으며, 이 경우 각각 COOH, NH2 작용기를 갖는 생체 분자와 아마이드 결합 또는 에스테르 결합을 할 수 있다. 특이적으로 결합하는 결합수단으로 바람직하게는 항원에 대한 항체 또는 유전자의 상보적 결합 등이 이용될 수 있다.
다음, 제1 입자를 외부 자력을 가하여 포집한다. 예를 들어, 영구 자석 또는 전자석 등과 같은 자기장 발생 장치를 상기 제1 입자에 인접시키는 경우, 상기 제1 입자의 자성 물질에 자력이 가해질 수 있으므로 상기 제1 입자를 포집할 수 있다. 이때 제1 입자에 결합한 표적 생체 분자가 제1 입자와 결합하지 않는 생체 물질로부터 선별되어 포집된다.
상기 포집된 제1 입자를 세척한다.
이후 상기 포집 및 세척된 제1 입자를 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합 수단을 포함하는 제2 입자와 접촉시킨다. 상기 접촉에 의해 제1 입자-표적 생체 분자-제2 입자가 결합한 복합체를 얻고, 이후 외부 자력을 가하여 제1 입자를 포집하여 표적 생체 분자와 결합하지 않은 제2 입자로부터 분리한다.
이후 표적 생체 분자와 결합한 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물을 분광분석기로 분석한다. 상기 분광분석기는 유도결합 플라즈마 방출분광기, 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기일 수 있다. 다만, 다중 검출(multiplex detection)을 위해서는 유도결합 플라즈마 질량분석기를 사용하는 것이 바람직하다. 유도결합 플라즈마 질량분석기에서 분광분석용 제2 입자는 아르곤 플라즈마에 의해 이온화되며, 생성된 이온들은 질량분석기에서 분리되고 정량화된다. 분석기로부터 측정된 신호는 생체 분자의 농도에 비례하므로, 이를 통해 분광분석용 제2 입자와 결합된 표적 생체 분자의 농도를 측정할 수 있다.
또한 최종적으로 자력에 의해 포집된 제1 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M1)을 분광분석기로 분석한다.
이때의 제1 입자는 순수한 제1 입자, 분석 대상이 아닌 생체 분자와 비특이적으로 결합한 제1 입자, 표적 생체 분자 및 제2 입자와 결합한 제1 입자를 모두 포함한다. 따라서 분석 과정에서 제1 입자의 손실이 없다면 그 양은 처음 생체 분자와의 반응에 사용한 양이어야 한다. 한편, 생체 분자와의 반응 및 이후 자력에 의한 분리 단계에서 제1 입자의 손실이 발생하였다면 그 양은 처음 생체 분자와의 반응에 사용한 양보다 적게 된다.
본 발명은 이러한 제1 입자의 손실 정도를 제2 입자에 의한 표적 생체 분자의 양에 보정을 해 주는 것이다.
즉, 실제 표적 생체 분자의 양은 하기 계산에 의해 계산될 수 있다.
표적 생체 분자의 양
= 제2 입자에 의해 측정된 표적 생체 분자의 양 x 반응에 사용한 제1 입자의 양/반응 후 제1 입자의 양
본 발명은 제2 입자에 의해 측정되는 표적 생체 분자의 양에서 자력에 의한 분리 및 세척 과정에서 손실되는 양을 보정해 줌으로써 보다 정확한 생체 분자의 양을 알 수 있는 것이다.
이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
<제조예 1: 아민기가 결합된 코어-쉘 형태의 제1 입자 제조>
1.1. 금속 또는 금속산화물( M1 )이 포함된 코어-쉘 형태의 제조.
CsCl2와 TEOS (tetraethoxysilan) 및 Cy5를 사용하여 80℃의 온도에서 가열하여 SiO2로 코팅하였다. 이 구조의 평균 직경은 SEM(scanning electron microscopy)로 측정한 결과 30 nm로 나타났다.
1.2. 자성물질 및 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자의 제조
자성물질 Fe3O4를 상기에서 제조한 M1 코어-쉘 구조와 혼합하여 새로운 코어를 형성하였다. 이후, 이 코어와 TEOS 를 80℃의 온도에서 가열하여 SiO2로 코팅하여 코어-쉘 형태의 제1 입자를 제조하였다. 이후, 상기 제1 입자를 3-(아미노프로필) 트리에톡시실란(APTEOS, 99%, Sigma-Aldrich)과 반응시켜 아민기로 관능기화시키고, 아민기가 결합된 코어-쉘 형태의 제1 입자를 제조하였다 (도 1 참조).
<제조예 2: 제2 결합수단을 갖는 코어-쉘 형태의 제2 입자 제조>
1.1. 금속 또는 금속산화물(M2)이 포함된 코어-쉘 형태 제조.
Au와 TEOS 를 사용하여 80℃의 온도에서 가열하여 SiO2로 코팅하여 코어-쉘 구조를 형성하였다.
1.2. 작용기의 부착
상기에서 제조된 코어-쉘 구조에 CA19-9의 항체를 부착하여 제2 결합수단을 포함하는 코어-쉘 형태의 제2 입자를 제조하였다(도 2 참조).
<실시예: 생체 분자 분석>
시료 용액 (SERUM)에 제조예 1에서 제조된 제1 입자를 넣고 표적 생체 분자 CA19-9 와 접촉시키고 자력으로 제1 입자를 분리하였다.
상기 제1 입자를 세척하였다. 상기 제1 입자에 제조예 2에서 제조된 제2 입자를 넣어, 생체 분자에 제1 입자 및 제2 입자가 결합된 복합체를 형성하였다.
이후, 상기 복합체가 포함된 시료 용액에 대해 검출기로 제2 입자의 M2를 정량하였다. 또한 제1 입자의 M1을 정량하여 손실된 제1 입자의 양을 측정하였고, 이 결과를 통해서 손실된 양을 보정하여 보정된 표적 생체 분자의 양을 측정하였다.
본 발명의 생체 분자 분석 키트는 제1 입자와 제2 입자의 코어로서 각각 상이한 금속 또는 금속산화물을 사용하여, 검출기로 측정하였을 때, 금속의 성질로 인해서 세척 단계에서 손실된 양을 보정하기 쉽고, 생체분자의 정량을 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 생체 분자 분석 키트를 사용하면 높은 검출감도 및 정확도를 얻을 수 있다.
100: 생체 분자 분석 키트
110: 제1 입자에 부착된 결합수단
111a: 제1 입자의 코팅층
111b: M1의 코팅층
111c: M2의 코팅층
112: 표적 생체 분자
113: 제2 입자에 부착된 결합수단

Claims (22)

  1. 코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적 또는 비특이적으로 결합하는 제1 결합수단을 포함하는 제1 입자; 및
    코어 및 셀과, 셀의 표면에 표적 생체 분자와 특이적으로 결합하는 제2 결합수단을 포함하는 제2 입자를 포함하는 생체 분자 분석 키트로서,
    상기 제1 입자의 코어는 Fe, Co 또는 Ni의 산화물로 이루어진 자성물질; 및
    전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M1)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
    상기 제2 입자의 코어는 전이금속 또는 희토류 금속의 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하고, 셀은 SiO2를 포함하고,
    상기 M1과 M2의 금속은 상이한 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 M1은 CsCl2인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 M2는 Au 또는 Pt인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 M1을 별도의 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 M1을 중성에서 금속과 킬레이션 할 수 있고, SiO2와 친화력 있는 물질을 추가하여 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 SiO2와 친화력 있는 물질은 수용성 alexa fluor계 염료인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 염료는 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), Cy5, Cy7 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 M1을 별도의 SiO2로 둘러싸는 것은 가열에 의한 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 가열 온도는 40 내지 100℃인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 입자 및 제2 입자의 코어는 가열에 의하여 SiO2를 포함하는 셀에 의해 둘러싸여진 것으로 상기 가열 온도는 40 내지 100℃인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 입자는 2개 이상이고, 상기 2개 이상의 제2입자는 각각 상이한 제2 결합 수단 및 상이한 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  12. 청구항 1의 생체분자 분석키트를 이용한 생체분자 분석 방법으로써
    시료 용액에 상기 제1 입자를 넣고 표적 생체 분자와 접촉시키고, 생체 분자와 결합하거나 결합하지 않은 제1 입자를 자성으로 분리하는 단계;
    상기 제1 입자 용액에 제2 입자를 넣어, 생체 분자에 제1 입자 및 제2 입자가 결합된 복합체를 형성하고 자성으로 분리하는 단계;
    상기 제2 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M2)을 측정하여 표적 생체 분자의 양을 측정하는 단계;
    상기 제1 입자에 포함된 금속 또는 금속산화물(M1)을 측정하여 제1 입자의 감소량을 측정하는 단계; 및
    상기 금속 또는 금속산화물(M2)에 의해 측정된 표적 생체 분자의 양에서 제1 입자의 감소량을 보정하는 단계를 포함하는 생체 분자 분석 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 M1은 CsCl2인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 M2는 Au 또는 Pt인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 키트.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 M1을 별도의 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 M1을 중성에서 금속과 킬레이션 할 수 있고, SiO2와 친화력 있는 물질을 추가하여 SiO2로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 친화력 있는 물질은 수용성 alexa fluor계 염료인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 염료는 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), Cy5, Cy7 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, SiO2로 둘러싸는 단계는 가열하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 가열 온도는 40 내지 100℃인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  21. 청구항 12에 있어서, 상기 코어에 셀을 형성하는 단계는 SiO2를 이용하여 40 내지 100℃로 가열하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
  22. 청구항 12에 있어서, 상기 표적 생체 분자 및 이와 특이적으로 결합하는 제2 입자는 2개 이상이고, 상기 2개 이상의 제2 입자는 각각 상이한 제2 결합 수단 및 상이한 금속 또는 금속산화물(M2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분석 방법.
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