KR20130040715A - 두 종 입자를 이용한 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체 - Google Patents

두 종 입자를 이용한 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미생물 등을 검출하는 바이오센서로 이용되는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체에 관한 것이다.
상기 다기능 생체물질 접합체의 제조방법은 (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시키는 단계; (b) 상기 단백질이 코팅된 제 1 나노입자에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 접합체에 생체물질을 흡착시켜 다기능 생체물질 접합체를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 다기능 생체물질 접합체의 제조방법은 두 종의 입자를 이용함으로써, 나노입자의 침전을 방지하면서 생체물질을 손쉽게 고정화할 수 있으며, 멀티 기능을 가지는 생체물질 접합체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된 다기능성 생체물질 접합체는 미생물 검출을 위하여 사용할 수 있으며, 101 cfu 농도의 미생물까지 검출할 수 있다.

Description

두 종 입자를 이용한 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체 {Method for Preparing Multi-functional Biomolecular Conjugates Using Two Kinds of Particle and Multi-functional Biomolecular Conjugates Prepared Therefrom}
본 발명은 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미생물 등을 검출하는 바이오센서로 이용되는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법 및 이로부터 제조된 다기능 생체물질 접합체에 관한 것이다.
생체물질이 결합된 나노 및 마이크로 입자는 식품, 의료, 진단, 생명과학과 같은 다양한 분야에서 바이오센싱, 바이오이미징, 분리 등에 활용되고 있다. 예를 들어, 면역센서에서 항원-항체 간의 결합에 의한 대상물질 검출을 위해 항체-자기 나노입자 결합체가 이용되고, 항체-금나노입자가 이용되고 있다 (Yu-Hui Bai. et al., Anal. 135:1672-1679, 2010).
항원-항체 반응 결합체 형성에 큰 영향을 미치는 것 중의 하나가 항체 고정화 방법으로 여러 가지 고정화 기술들이 개발되어 왔으며, 단백질을 결합시키는 방법은 다양하다. 예를들면, 화학적 물리적 흡착을 이용한 방법, 그리고 금과 특이적으로 결합하는 아미노산인 시스테인(cysteine)을 이용하여 금나노입자에 단백질을 결합하는 방법, 금나노입자에 단분자조립막을 생성시킨 후 단분자막의 기능기를 이용하여 단백질과 공유결합으로 접합시키는 방법, 금나노입자 표면에 아비딘 단백질을 흡착시킨 후 바이오틴이 결합된 단백질을 결합시키는 방법 (ZHANG zhiFeng et al., Sci china ser B-Chem. 50(1):127-134, 2007) 등이 있다.
그러나, 기존에 개발된 고정화 기술은, 단백질의 특성에 따라 pH와 같은 고정화 반응 조건이 다르게 되며, 나노입자의 경우 분산이 잘 이루어지지 않고 뭉쳐지는 문제점이 있었다.
한국 등록특허 제0962286호는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금나노입자 및 그 제조방법, 상기 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법을 개시하였는데, 이는 자성물질을 포함하는 자성체 코어를 제작하는 단계; 상기 자성체 코어의 표면을 아민(amine) 기능기로 개질시키는 단계; 및 상기 아민(amine)기능기로 표면 개질된 자성체 코어 표면에 금 입자층을 형성시키는 단계를 포함하는 특징이 있다.
그러나, 이는 자성체 코어 표면에 아민 기능기로 개질시킬 때, 일어나는 화학 반응의 재현성이나 효율성이 떨어질 수 있고, 용액상에서 엉김 발생이 일어날 수 있는 문제가 있다. 또한 금 입자층을 형성 시키기 위한 반응 시간이 오래 걸리고, 별도의 장비인 SPR을 이용하여야만 식중독균을 검출할 수 있다는 번거로움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질을 코팅시킨 다음, 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조하고, 생체물질을 접합체에 흡착시킬 경우, 번거로운 개질과정을 거치지 않고도, 나노입자의 침전을 방지하면서 생체물질을 손쉽게 고정화시킬 수 있으며, 또한 제1 나노입자에 코팅되는 단백질의 특성과 제2 나노입자에 흡착되는 생체물질의 특성을 이용하여 다기능적으로 목적물질을 검출이나 분리할 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 다기능적으로 목적물질을 검출이나 분리할 수 생체물질 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 현장에서 간단한 방법으로 미생물을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시키는 단계; (b) 상기 단백질이 코팅된 제 1 나노입자에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 접합체에 생체물질을 흡착시켜 다기능 생체물질 접합체를 제조하는 단계를 포함하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 생체물질이 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 다기능 생체물질 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 검출 대상 미생물과 특이적으로 결합하는 항체가 흡착되어 있는 다기능 생체물질 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 다기능 생체물질 접합체를 투과시키고, 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 다기능 생체물질 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 다기능 생체물질 접합체의 제조방법은 두 종의 입자를 이용함으로써, 나노입자의 침전을 방지하면서 생체물질을 손쉽게 고정화할 수 있으며, 멀티 기능을 가지는 생체물질 접합체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 제조된 다기능성 생체물질 접합체는 미생물 검출을 위하여 사용할 수 있으며, 101 cfu 농도의 미생물까지 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자기 나노입자와 금나노입자의 복합체를 제조한 후, 상기 복합체에 항체를 고정화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 금나노입자를 이용하지 않고 항체를 고정화시킨 MNP(CMX)-anti-Staphylococcus aureus mAb와 금나노입자를 이용하여 항체를 고정화시킨 MNP(CMX)-AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb를 사용하여 105 cfu의 Staphylococcus aureus를 분리한 것과 상등액의 생균수를 측정한 그래프이다 (control(A), MNP-BSA(B), MNP-anti-Staphylococcus aureus mAb 10ug/ml(C), BSA 단백질이 코팅된 MNP-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb 10ug/ml(D) + 105 cfu Staphylococcus aureus).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별에 대해 접합체의 고정화 상태를 확인한 결과이다 (100 cfu(A), 5x104 cfu(B), 5x105 cfu(C), 5x106 cfu(D) + BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 4는 본 발명에 따른 고정화 방법을 이용하여 제조된 접합체를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별에 대해 (도3) 접합체의 금나노입자의 증폭 처리를 통해, 고정화 상태를 확인한 결과이다 (100 cfu(A), 5x104 cfu(B), 5x105 cfu(C), 5x106 cfu(D) + BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus Ab를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (100 cfu(A), 5x104 cfu(B), 1x105 cfu(C) 5x105 cfu(D), 5x106 cfu(E) + BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 6은 도 5를 은나노입자의 증폭 처리를 통해, Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (100 cfu(A), 5x104 cfu(B), 1x105 cfu(C) 5x105 cfu(D), 5x106 cfu(E) + BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 7은 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb에 대해서 다른 균류와 교차반응이 일어나는지 확인한 결과이다 (100 cells(A), 5x105 cfu Salmonella cells(B), 5x105 cfu Listeria monocytogenes cells(C), 5x105 cfu S. aureus cells(D), 5x105 cfu E. coli cells(E) + MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 8은 금나노입자를 이용하지 않고 항체를 고정화시킨 MNP(PAS)-anti-Staphylococcus aureus mAb와 금나노입자를 이용하여 항체를 고정화시킨 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb를 사용하여 Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (100 cfu(A,D), 5x105 cfu(B,E), 5x106 cfu(C,F) + MNP(PAS)-anti-Staphylococcus aureus mAb, BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 9는 도 8을 금나노입자의 증폭 처리를 통해, Staphylococcus aureus를 농도별로 측정한 결과이다 (100 cfu(A,D), 5x105 cfu(B,E), 5x106 cfu(C,F) + MNP(PAS)-anti-Staphylococcus aureus mAb, BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-5x AuNP-anti-Staphylococcus aureus mAb).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-C-reactive protein pAb와 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AuNP-anti-C-reactive protein pAb을 사용하여 CRP 농도별에 대해 형광신호를 통한 CRP 측정한 결과이다 (BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-C-reactive protein pAb, BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AuNP-anti-C-reactive protein pAb + 0ug/ml(A,D,A',D'), 1ug/ml(B,E,B',E'), 10ug/ml(C,F,C',F') + AuNP-anti-C-reactive protein mAb, AgNP-anti-C-reactive protein mAb)
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-C-reactive protein pAb을 사용하여 CRP 농도별에 대해 측정한 결과이다 (BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-C-reactive protein pAb + 0ug/ml(A), 1ug/ml(B), 10ug/ml(C) + AuNP-anti-C-reactive protein mAb).
도 12는 본 발명에 따른 고정화 방법을 이용하여 제조된 BSA 단백질이 코팅된 80 ㎚와 90 ㎚ MNP(Fe3O4 , Fe3O4-SiO2)-5x AuNP-anti-C-reactive protein mAb 각각을 사용하여 CRP 농도별에 측정한 결과이다 (0(A,E), 10 ng/㎖(B,F), 100 ng/㎖(C,G), 1 ㎍/㎖(D,H) CRP + BSA 단백질이 코팅된 80, 90㎚ MNP(Fe3O4 , Fe3O4-SiO2)-5x AuNP-anti-C-reactive protein mAb).
도 13은 본 발명에 따른 고정화 방법을 이용하여 제조된 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H1 mAb를 사용하여 H1N1 바이러스 농도별에 대해 형광 측정한 결과이다 (BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H1 mAb + 100 pfu(A), 101 pfu(B), 102 pfu(C), 103 pfu(D) + 104 pfu(E) + MNP(CMX)-H1 mAb).
도 14는 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H1 mAb에 대하여 서로 다른 아형 바이러스와 교차 반응이 일어나는지 여부를 확인한 결과이다 (BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H1 mAb + 100 pfu(A), 103 pfu H1N1(B), 103 pfu H3N2(C), 103 pfu H5N2(D) + MNP(CMX)-H1mAb).
도 15는 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H5 mAb에 대하여 서로 다른 아형 바이러스와 교차반응이 일어나는지 여부를 확인한 결과이다 (BSA 단백질이 코팅된 fluorescent latex bead-5x AgNP-anti-H5 mAb + 100 pfu(A), 103 pfu H1N1(B), 103 pfu H3N2(C), 103 pfu H5N2(D) + MNP(CMX)-H5mAb).
도 16은 은(Ag)나노입자를 사용하지 않고 항체를 고정화시킨 undyed latex bead-anti-human CD3Ab와 은나노입자를 이용하여 항체를 고정화시킨 undyed latex bead-5x AgNP-anti-human CD3 Ab를 사용하여 혈액의 mononuclear cell에서 T cell 분리율을 확인한 결과이다 (control(A), undyed latex bead-anti-human CD3 Ab(B), control(C), BSA 단백질이 코팅된 undyed latex bead-5x AgNP-anti-human CD3 Ab(D) + blood).
도 17은 HRP가 코팅된 금(Au)나노입자-금나노입자 항체 접합체를 이용하고 later-flow assay 스트립과 화학방광법을 결합하여 Troponin I를 분석한 결과이다.
본 발명에서는 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시킨 다음, 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 제조한 접합체에 다시 생체물질을 흡착시킬 경우, 생체물질이 뭉쳐지지 않고, 고정이 잘되며, 제 1 나노입자에 코팅된 단백질 및 생체물질의 특성을 활용하여 검출이나 분석능을 향상시킬 수 있는 다기능 생체물질 접합체를 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시킨 후, 단백질이 코팅된 제 1 나노입자에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조한 다음, 접합체에 생체물질을 흡착시켜 다기능 생체물질 접합체를 제조하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자(MNP)-금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)-항체와 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(fluorescent latex beads, LB)-은나노입자(silver nanoparticle, AgNP) 또는 금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)-항체를 제조한 결과, 항체의 고정화 효율이 우수할 뿐만 아니라, 이를 이용할 경우 Staphylococcus aureus 를 우수한 감도로 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시키는 단계; (b) 상기 단백질이 코팅된 제 1 나노입자에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 접합체에 생체물질을 흡착시켜 다기능 생체물질 접합체를 제조하는 단계를 포함하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 다른 관점에서, 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 생체물질이 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 나노입자는 자성 또는 형광특성을 가지는 것을 이용할 수 있으며, 라텍스, 마그네틱, 실리카, 양자점, 금속나노입자 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 나노입자는 금속특성을 가지는 것을 이용할 수 있으며, 금, 은, 구리, 백금 등을 예시할 수 있다. 상기 제2 나노입자는 단백질을 잘 흡착하는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
여기서, "나노입자"란 크기가 1 nm에서 100 nm 정도의 크기를 가지는 극미세 입자를 말한다. 아주 작은 크기의 나노입자들은 일반적인 덩어리 물질과는 다른 특성을 가진다. 나노입자는 기존 물질에 비해 현저히 증가된 비표면적을 가진다. 이러한 높은 비표면적 때문에 기존 물질과는 다른 표면효과를 가지게 되는데, 입자의 크기가 작아질수록 표면에 위치한 분자의 수가 증가한다. 입자의 입경이 5 nm가 되면 입자를 구성하는 분자 중 50%가 표면에 위치하게 되고, 입자의 크기가 2 nm가 되면 그 비율은 90%에 이른다. 표면에 위치한 분자의 비율이 상대적으로 높기 때문에 나노입자들은 기존 물질에 비해 표면에너지의 결합에너지에 대한 비가 더 커지게 된다. 표면에너지의 결합에너지에 대한 비율은 입자의 크기가 20 nm에서 1 nm로 작아질수록 5% 에서 약 30%로 증가하게 된다. 입자를 구성하고 있는 원자들은 주변의 원자들 간의 상호 작용에 의해 인력과 반발력이 평형을 이루는 에너지의 안정 상태에 있게 된다. 하지만 표면에 위치한 원자는 내부 원자에 의한 인력만 존재하므로 고 에너지 상태에 놓이게 있다. 이러한 표면 효과로 인해 나노입자는 촉매나 촉매의 표면반응에서 보이는 표면활성, 녹는점 강하, 저온 소결성 등의 성질을 가지게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 나노입자는 제2 나노입자보다 입자의 크기가 큰 것을 이용하는 것이 바람직하다.
예를 들어 상기 제1 나노입자의 크기는 20~500 ㎚이고, 상기 제2 나노입자의 크기는 5~100 ㎚이다.
제1 나노입자는 제2 나노입자보다 입자의 크기가 큰 것을 이용할 경우 작은 나노입자를 용이하게 흡착하는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 나노입자를 코팅하는 단백질은 고정할 생체물질을 흡착되는 특성을 이용해 개질과정 없이 쉽게 고정화시키기 위한 것으로서, BSA, 퍼옥시다제, 알칼린포스파타제, 글루코스옥시다제, 콜린옥시다제, 스트렙타비딘, 스킴밀크(skim milk), 혈청, 펩타이드 등을 이용할 수 있다.
즉, 상기와 같이 제1 나노입자를 단백질로 코팅할 경우 단백질을 잘 흡착하는 제 2 나노입자를 이용해 다기능 생체물질을 흡착방법만으로 접합하는 효과가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체물질은 항체, 효소, DNA, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 다기능 생체물질 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예에서는 미생물과 특이적으로 결합하는 항체를 생체물질로 하여 다기능 생체물질 접합체를 제조한 후, 이를 미생물과 반응시킬 경우 미생물을 고속검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 검출 대상 미생물과 특이적으로 결합하는 항체가 흡착되어 있는 다기능 생체물질 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계; (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 다기능 생체물질 접합체를 투과시키고, 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및 (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 다기능 생체물질 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출방법에 관한 것이다.
상기의 미생물 고속 검출방법에서 이용되는 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막, 분리방법 그리고, 측정방법은 본원발명의 발명자가 먼저 출원한 공개특허 제10-2011-0058711호에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.
예를 들어, 상기 미생물 응집용 필름은 PDMS (polydimethylsiloxane), 접착성이 있는 고분자 및 알루미늄 테이프, 고무 및 라텍스, 및 스크린 프린팅용 페이스트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게 상기 미생물 응집용 필름은, 은 페이스트 또는 탄소 페이스트와 같은 스크린 프린팅용 페이스트를 상기 포획용 여과막에 일정한 크기의 구멍을 가진 모양으로 스크린 프린팅 기법으로 도포하여 제조한 필름일 수 있다. 이로써, 응집용 필름과 포획용 여과막을 일체형으로 구성할 수 있으며, 스크린 프린팅 기법은 당해 업계에 널리 알려진 방법을 이용할 수 있다.
스크린 프린팅 기법의 일례로, 나일론(Nylon), 데트론(Polyester) 또는 스테인레스 스틸등으로 짜여진 스크린 망사를 나무나 알루미늄 등의 틀에 고정시켜 그 위에 수공적 또는 광화학적 방법으로 판막을 만들어 필요한 화상 이외의 부분을 막고 그 안에 스크린 프린팅용 페이스트를 넣어, 스퀴지(Squeegee)라 불리는 주걱으로 스크린 내면을 가압하면서 움직이면 페이스트는 판막이 없는 부분의 망사를 통과하여 판 밑에 놓여 있는 피인쇄체에 프린팅되는 기법일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막의 세공크기는 100 nm - 10 μm인 것을 특징으로 한다. 미생물과 결합하지 않은 항체가 고정된 나노입자는 포획용 여과막을 통과하고, 항체가 고정된 나노입자와 결합하지 않은 미생물은 포획용 여과막에 걸리더라도 신호를 보이지 않게 된다. 따라서, 항체가 고정된 나노입자와 결합한 미생물만이 포획용 여과막에 항체가 고정된 나노입자가 가진 고유의 색깔, 형광 등을 보이게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 세공크기가 1.2 μm인 포획용 여과막을 사용하였으나 이에 한정되지 않음은 당업자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 항체가 고정된 나노입자와 반응한 미생물이 포획되는 100 nm 내지 10 μm 사이의 세공크기에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포획용 여과막은 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리술폰 및 폴리에탄술폰로 구성된 군에서 선택되는 포획용 여과막을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 선택적으로 분리하는 단계는, 진공, 원심분리 또는 흡수법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다시 말해, 응집용 필름을 거쳐 포획용 여과막으로 나노입자-항체-미생물 복합체가 걸러질때, 진공을 걸어주거나, 원심분리를 하거나, 또는 여과막에 흡수되는 원리를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 측정은, CCD 카메라 또는 흡광도를 이용하여 측정할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자기나노입자의 항체 접합체 및 형광비드의 항체 접합체 제조
실시예 1-1: 자기나노입자( MNP )-단백질( bovine serum albumin , BSA )-단백질이 코팅된 자기나노입자( MNP )-금나노입자( gold nanoparticle , AuNP )-항체
자기나노입자(magnetic nanoparticle, MNP) 용액에 BSA(bovine serum albumin) 용액(pH 7.4, 10 mM Phosphate 완충용액에 녹인 것)을 최종 부피가 1 ㎖ 되게 첨가하여 혼합 후, 10 mM의 N-hydroxysuccinnimide (NHS, Biacore Inc)와 2 mM의 EDC(Biacore Inc)를 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 용액에 100 mM glycin 용액(pH 7.4, 10 mM Phosphate 완충용액에 녹인 것) 0.1 ㎖를 첨가하여 30분 동안 정치시킨 후, 200 ㎕씩 분주하여 4℃에서 6,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 그 후, borate 완충용액(10 mM, pH 8.5) 0.2 ㎖를 첨가하여 혼합한 후, 6,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리한 후 다시 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복한 후 최종적으로 0.1% BSA(pH 8.8, 10 mM sodium bicarbonate 완충용액에 녹인 것) 용액을 100 nm 자기나노입자-BSA 0.4 ㎖를 첨가하여 BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자를 제조하였다.
상기 자기나노입자 용액은 matrix가 Carboxymethyl-dextran으로 된 100 ㎚ 자기나노입자 용액(CMX, 25 ㎎/㎖, Chemicell) 100 ㎕, polyacrylic acid로 된 100 ㎚ 자기나노입자 용액(PAS, 50 ㎎/㎖, Chemicell) 60 ㎕, 80 ㎚ 자기나노입자(Fe3O4 , 포항공대 전상민 교수로부터 제공받음) 180 ㎍ 및 90 ㎚ 자기나노입자(Fe3O4-SiO2 , 포항공대 전상민 교수로부터 제공받음) 430 ㎍를 사용하였다.
상기 원심 분리한 후 상등액을 제거한 BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자에 5배로 농축시킨 10 nm 금나노입자 용액(BB International, borate 완충용액 10 mM, pH 8.5) 1 ㎖를 첨가하여 30분간 흡착시켰다.
금나노입자가 흡착된 CMX와 PAS의 100 ㎚ 자기나노입자 용액에 항 Staphylococcus aureus 단클론 항체(anti-S. aureus mAb, Abcam)을 10 ㎍을 각각 첨가하였고, 80 ㎚ 자기나노입자(Fe3O4)와 90 ㎚ 자기나노입자(Fe3O4-SiO2)용액에 항 C-reactive protein 단클론 항체(anti-CRP mAb, Abcam)를 10 ㎍을 첨가하였다.
30분 후, 10% BSA(bovine serum albumin) 용액(pH 8.8, 10 mM sodium bicarbonate 완충용액에 녹인 것) 0.1 ㎖을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 용액을 200 ㎕씩 분주하여 4℃에서 5,500 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거한 다음, 다시 0.1% BSA 용액 0.2 ㎖을 첨가하여 혼합 후, 5,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA(pH 8.8, 10 mM sodium bicarbonate 완충용액으로 녹인 것)용액을 100 nm 자기나노입자(CMX, PAS)-금나노입자-항 Staphylococcus aureus 단클론 항체에 0.4 ㎖을 첨가하였고, 80 nm과 90 nm 자기나노입자(Fe3O4 , Fe3O4-SiO2)-금나노입자-항 C-reactive protein 단클론 항체에 0.1 ㎖ 첨가하여 혼합 후, 0.45 ㎛ 주사기 필터로 거른 후에 냉장고에 보관하였다.
실시예 1-2: 단백질이 코팅된 형광 또는 undyed 라텍스 비드( fluorescent latex beads , LB )- 은나노입자 ( silver nanoparticle , AgNP ) 또는 금나노입자( gold nanoparticle, AuNP )-항체
표면이 카르복실기로 수식된 라텍스 비드 50 ㎕을 4℃에서 5,000 rpm으로 3분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 라텍스 비드에 BSA의 코팅은 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 라텍스 비드 용액은 2 ㎛ 형광 라텍스 비드(sigma)와 0.9 ㎛ 라텍스 비드(undyed, sigma)를 사용하였다.
상기 BSA가 코팅된 2 ㎛ 형광 라텍스 비드에 5배로 농축시킨 20 ㎚ 은나노입자 용액 (BB International, borate 완충용액 10 mM, pH 8.5) 및 10 ㎚ 금나노입자 용액(BB International, borate 완충용액 10 mM, pH 8.5)을 각각 1 ㎖씩 첨가하여 30분간 흡착시켰고, 항 C-reactive protein 다클론 항체(anti-CRP pAb, Abcam) 10 ㎍을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 항 H1 단클론 항체(anti-H1 mAb, LS-BIO)와 항 H5 단클론 항체(anti-H5 mAb, Abcam)는 상기 은나노입자가 코팅된 형광 라텍스 비드에만 10 ㎍을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다.
상기 BSA 단백질에 의해 은 또는 금나노입자가 흡착된 형광 라텍스 비드 용액은 실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였고, 제조과정 중, 원심분리기는 5000rpm에 10분 돌렸으며, 주사기 필더로 거르지 않고, 최종적으로 0.1% BSA(pH 8.8, 10 mM sodium bicarbonate 완충용액으로 녹인 것)용액을 0.4 ㎖을 첨가하여, 냉장고에 보관하였다.
실시예 1-3: HRP ( horeradish peroxidase )가 코팅된 금나노입자 - 금나노입자 항체 접합체 제조
20 nm 금나노입자 용액(BB International) 1 ㎖에 borate 완충용액(0.1 M, pH 8.5) 0.1 ㎖과 항 aldehyde activated HRP(Thermo) 10 ㎍을 첨가하였다. 30분 후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 원심분리를 다시 실시한 후, 15 nm 금나노입자 용액(BB International) 1 ㎖을 첨가한 후, 완충용액(0.1M, pH 8.5) 0.1 ㎖과 Troponin I 단클론 항체(Abcam, 검출항체) 10 ㎍을 첨가하였다. 1시간 경과 후, 0.1% BSA(pH 7.4, 10 mM phosphate 완충용액에 녹인 것) 용액을 0.2 ㎖ 첨가하여 혼합하여(5X), 금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)-항체를 냉장고에 보관하였다.
실시예 2: 금속나노입자의 항체 접합체 제조
실시예 2-1: 금나노입자 ( gold nanoparticle , AuNP )-항체 제조
20 ㎚ 금나노입자 용액(BB International) 1 ㎖에 borate 완충용액(0.1 M, pH 8.5) 0.1 ㎖과 항 C-reactive protein 단클론 항체(capture Ab인 anti-CRP mAb, Abcam) 10 ㎍을 첨가하였다.
30분 후, 10% BSA(bovine serum albumin) 용액(pH 8.8, 10 mM sodium carbonate 완충용액에 녹인 것) 0.1 ㎖을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다. 상기 용액을 4℃에서 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 0.1% BSA(pH 8.8, 10 mM sodium carbonate 완충용액에 녹인 것)용액 0.2 ㎖을 첨가하여 혼합 후, 10,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복 후 최종적으로 0.1% BSA(pH 8.8, 10 mM sodium carbonate 완충용액에 녹인 것)용액을 0.2 ㎖ 첨가하여 혼합하여, 금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)-항체를 냉장고에 보관하였다.
실시예 2-2: 은나노입자 ( silver nanoparticle , AgNP )-항체 제조
20 ㎚ 은나노입자 용액(BB International) 1 ㎖에 borate 완충용액(0.1 M, pH 8.5) 0.1 ㎖과 항 C-reactive protein 단클론 항체(capture Ab인 anti-CRP mAb, Abcam) 10 ㎍을 첨가하여 30분 동안 정치시켰다.
상기 항체가 고정된 은나노입자 용액은 실시예 2-1과 동일한 방법으로 제조 하였고, 은나노입자(silver nanoparticle, AgNP)-항체를 냉장고에 보관하였다.
실시예 3: 구멍을 가진 PDMS ( polydimethylsiloxane ) 필름 제작
PDMS 용액(Sylgard 184A, Dow Corning, USA)과 경화제(Sylgard 184B, Dow Corning, USA)를 10:1의 비율로 혼합하여 지름 150 ㎜의 평평한 패트리 접시에 부었다. 그리고 진공 펌프를 이용하여, 혼합액 내의 기포를 제거하고, 60℃에서 24시간 경화시켰다. 이후 경화된 PDMS 필름을 상온에서 식힌 후, 지름 15 ㎜의 천공기를 이용하여 6개의 구멍을 뚫었다. 그 결과, 구멍을 가진 PDMS 필름을 제조하였음을 확인하였다.
비교예 1: 자기나노입자( magnetic nanoparticle , MNP )-항체 접합체 제조
표면이 카르복실기로 수식된 자기나노입자 용액에 10 mM Phosphate buffer(PB, pH 7.4)를 최종 부피가 1 ㎖가 되게 첨가하여 혼합한 후, 10 mM의 N-hydroxysuccinnimide(NHS, Biacore Inc)와 2 mM의 EDC(Biocore Inc), 10 ㎍의 항체를 첨가하여 약 2시간 동안 정치시켰다.
상기 자기나노입자 용액은 matrix가 Carboxymethyl-dextran로 된 100 nm의 자기나노입자 용액(CMX, 25㎎/㎖, Chemicell) 100 ㎕, polyacrylic acid로 된 100 nm 자기나노입자 용액(PAS, 50㎎/㎖, Chemicell) 60 ㎕를 사용하였으며, 항체는 항 Staphylococcus aureus 단클론 항체(anti-S. aureus mAb, Abcam)를 첨가하였다. 항 H1 단클론 항체(anti-H1 mAb, LS-BIO)와 항 H5 단클론 항체(anti-H5 mAb, Abcam)는 Carboxymethyl-dextran으로 된 100 nm 자기나노입자 용액에만 첨가하였다.
상기 항체가 고정된 자기나노입자 용액은 실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 2: undyed 라텍스 비드 ( latex beads , LB )-항체 접합체 제조
표면이 카르복실기로 수식된 0.9 ㎛ 라텍스 비드(sigma) 50 ㎕을 4℃에서 5,000 rpm으로 3분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상기 라텍스 비드에 10 mM Phosphate buffer(PB, pH 7.4)를 최종 부피가 1 ㎖가 되게 첨가하여 혼합한 후, 10 mM의 N-hydroxysuccinnimide(NHS, Biacore Inc)와 2 mM의 EDC(Biacore Inc), 항 human CD3 항체(anti-human CD3 Ab, BD)의 10 ㎍을 첨가하여 2시간 동안 정치시켰다.
상기 항 human CD3 항체가 고정된 라텍스 비드 용액은 실시예 1-2와 동일한 방법으로 제조하였다.
실험예 1: BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자( MNP , matrix : CMX )-금나노입자( AuNP )-항체를 이용한 Staphylococcus aureus 분석
실험예 1-1: 항체의 고정화 효율을 생균수로 확인
실시예 1-1의 방법으로 제조된 MNP(CMX)-BSA, BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 10 ㎍/㎖와 비교예 1의 방법으로 제조된 MNP(CMX)-anti-S. aureus mAb 접합체의 각 용액 40 ㎕와 Staphylococcus aureus(S. aureus)를 PBS에 현탁시킨 용액 10 ㎕(105 cfu)와 PBS 용액 100 ㎕를 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다. 30분 후, PBS 용액 100 ㎕를 첨가하고 상기 용액을 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액과 각각의 자기나노입자 접합체와 반응한 S. aureus 복합체를 회수하였다.
회수한 상등액과 자기나노입자 접합체-S. aureus 혼합액을 페트리 디쉬에 담긴 한천 배지(Trypticase soy broth (BD 211825) 3%, 한천 분말 2%)에 100 ㎕씩 도말하고 37℃에서 16~24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 배지 상에서 형성되는 생균수 측정을 통해 자기나노입자에 금나노입자를 이용한 항체 고정화 방법의 효과를 확인하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 항체를 자기나노입자에 직접 고정화한 방법에 비해, BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자(MNP)-금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)-항체 접합체를 이용할 경우, 항체 고정화 효율이 약 30% 가량 증가되었음을 확인하였다.
실험예 1-2: Staphylococcus aureus 분석
본 발명에 따른 고정화 방법을 이용하여 제조된 자기나노입자 접합체의 항체가 금나노입자에 의해 고정화된 상태를 확인하였다. S. aureus를 PBS에 현탁시킨 용액 10 ㎕(100-5x106 cfu)와 실시예 1-1의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb (Abcam) 접합체 용액 40 ㎕와 PBS 용액 50 ㎕를 각각 혼합하여 30분 동안 약하게 흔들어 주었다.
상기 용액에 PBS 용액 100 ㎕을 첨가하고, 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액을 제거하고, BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체와 반응한 S. aureus를 회수하였다.
포획용 여과막은 Pore 크기가 1.2 ㎛인 nitrocelluolose(NC) 막(Millipore)에 1% BSA 용액(PBS에 녹인 것)을 도포한 후, 건조시킨 것을 사용하였다. 가지가 있는 100 ㎖ 삼각 플라스크에 장착한 필터 위에 상기 NC 막을 올려놓고, NC 막 위에 실시예 3에서 제작된 PDMS 필름을 덮었다. 플라스크의 가지를 통해 진공을 걸어주면서, PDMS 필름 구멍으로 상기 회수한 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체와 반응한 S. aureus의 혼합용액을 통과시켜 S. aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과 도 3에서 나타나는 것과 같이, 100 cfu S. aureus에서 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체가 여과용 막에 남아있지 않은 것을 확인하였고, S. aureus의 농도가 증가할수록 여과용 막에 남아있는 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 이로써 금나노입자에 의해 항체가 고정된 자기나노입자와 결합한 미생물만이 포획용 여과막에 남아 있음으로써 나노입자가 가진 고유의 색깔로 육안을 통해 균의 유무 및 농도별로 측정이 가능함을 알 수 있었다.
실험예 1-3: 금나노입자 증폭 처리를 통한 Staphylococcus aureus 분석
실험예 1-2의 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체와 반응한 S. aureus의 복합체를 여과한 상기 포획용 여과막에 5 mM 하이드록실 아민(hydroxyl amine), 25 mM 사염화 은(hydrogen tetrachloroaurate(III))이 함유된 10 mM 사이트레이트 완충용액 (citrate buffer, pH 3.0)을 떨어뜨려, 상온에서 약 15분 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 4에서 나타나는 바와 같이, 금 환원용액을 이용하여 금을 환원시켜, 여과막에 있는 BSA 단백질이 코팅된 MNP(CMX)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체의 심색화로, 균에 대한 농도별 측정의 감도를 높일 수 있는 장점을 확인할 수 있었다.
실험예 2: BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자( MNP , matrix : PAS )-금나노입자( AuNP )-항체를 이용한 Staphylococcus aureus 분석 및 다른 균과의 교차반응 확인
실험예 2-1: Staphylococcus aureus 분석
실시예 1-1의 방법으로 제조된 matrix가 polyacrylic acid로 된 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체를 사용하여, 상기 실험예 1-2와 동일한 절차에 따라 S. aureus의 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에서 나타나는 것과 같이, polyacrylic acid로 된 MNP(PAS)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체의 사용에도 도 3과 비슷한 경향성을 보였고, 항체가 고정된 나노입자가 가진 고유의 색깔로 균의 유무 및 농도별 측정을 할 수 있었다.
실험예 2-2: 은나노입자 증폭 처리를 통한 Staphylococcus aureus 분석
은나노입자 증폭을 위한 용액 A(silver salt)와 B(hydroquinone initiator)의 용액 1:1 비율로 섞어 혼합용액을 제조하고, 상기 혼합용액을 실험예 2-1의 포획용 여과막에 떨어뜨려, 상온에서 약 10분 동안 반응시켰다. 그 결과, 도 6에서 나타나는 바와 같이, 은나노입자 증폭 처리를 통해, S. aureus의 농도가 증가할수록 여과막에 있는 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체의 심색화로, 균에 대한 농도별 측정의 감도를 높일 수 있었다.
실험예 2-3: 다른 균과의 교차반응 확인
본 발명에 따른 다기능 생체물질 접합체가 선택적으로 미생물을 검출 할 수 있는지 확인하기 위하여 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-AuNP-anti-S. aureus mAb를 사용하여 상기 실험예 2-1과 동일한 절차에 따라 균의 종류만 변화시켜 실험을 진행 하였다. 총 4종류의 균, Salmonella typimurium , Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Escherichia coli에 대해 MNP(PAS)-AuNP-anti-S. aureus mAb 접합체와 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 나타나는 바와 같이, Salmonella typimurium , Listeria monocytogenes, Escherichia coli에서는 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-AuNP가 나타나지 않았고 Staphylococcus aureus에 대해 선택적으로 BSA 단백질이 코팅된 MNP(PAS)-AuNP가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2-4: 항체의 고정화 용량을 Staphylococcus aureus 로 비교
anti-S. aureus mAb를 MNP(PAS)에 직접적으로 고정화한 접합체와 BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자(MNP, PAS)-금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)에 anti-S. aureus mAb를 고정화한 접합체를 사용하여 상기 실험예 2-1과 동일한 절차에 따라 균의 농도별 측정을 육안으로 비교하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 항체를 직접적으로 MNP(PAS)에 고정화한 접합체보다 BSA 단백질이 코팅된 자기나노입자(MNP, PAS)-금나노입자(gold nanoparticle, AuNP)에 의해 항체 고정화된 접합체가 금나노입자의 붉은색에 의해, 신호가 증가했고, 도 9와 같이 은나노입자 증폭 처리를 통해, 더 큰 신호를 얻을 수 있었다.
실험예 3: BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드( latex beads , fluorescent yellow-green, LB )- 은나노입자 ( silver nanoparticle , AgNP ) 또는 금나노입자( gold nanoparticle , AuNP )-항체를 이용한 CRP 측정
실험예 3-1: 형광신호를 통한 CRP 측정
실시예 1-2의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(latex beads, fluorescent yellow-green, 2 ㎛ LB)-은나노입자(silver nanoparticle, 20 ㎚ AgNP )-항 C-reactive protein 다클론 항체(anti-CRP pAb) 접합체와 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(latex beads, fluorescent yellow-green, 2 ㎛ LB)-금나노입자(gold nanoparticle, 20 ㎚ AuNP)-항 C-reactive protein 다클론 항체(anti-CRP pAb) 접합체 각각 1 ㎕와 각기 다른 농도 0, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖의 CRP 항원과 실시예 2-1의 방법으로 제조된 금나노입자(gold nanoparticle, 20 ㎚ AuNP)-항 C-reactive protein 단클론 항체(anti-CRP mAb) 접합체 또는 실시예 2-2의 방법으로 제조된 은나노입자(silver nanoparticle, 20 ㎚ AgNP)-항 C-reactive protein 단클론 항체 접합체 각각 10 ㎕을 첨가하여 Phosphate Buffered Saline(PBS, pH 7.4)으로 최종 부피 200 ㎕를 맞춰, 30분간 반응시켰다.
상기 반응액을 실험예 1-2와 동일한 방법으로 응집용 필름(PDMS) 및 0.8 ㎛ MMM(asymetric super-micron membrane) 여과막에 순차적으로 통과시켜, 막에 포집하여 형광 신호를 비교하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, AuNP-anti-CRP mAb 접합체에 의해, 형광 신호의 세기가 증가하였고, 특히, BSA 단백질이 코팅된 LB(2 ㎛)-AgNP-anti-CRP pAb 접합체와 반응하였을 때, 형광 신호의 세기가 더 높음을 확인할 수 있었다. 이로써, 본 발명에 따른 금나노입자 또는 은나노입자를 이용한 항체 고정화방법은 입자의 종류에 제한없이 고정할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3-2: FTH ( flow - through - hole ) 막을 이용한 CRP 측정
정사각형 모양으로 잘라진 흡수패드와 세 개의 구멍이 뚫린 양면 테이프를 준비하여, 흡수패드 위에 0.8 ㎛ MMM(asymetric super-micron membrane) 여과막을 올리고, 그 위에 구멍 뚫린 양면테이프를 붙여, 각 구멍에 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-CRP pAb 접합체 1 ㎕씩 로딩 하였다. 상기 구멍에 0, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖의 CRP 항원 10 ㎕ 씩과 AuNP-anti-CRP mAb 5 ㎕ 씩 각각 순차적으로 로딩한 후, CRP의 농도 측정을 하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, CRP의 농도가 증가할수록 여과용 막에 남아있는 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-CRP pAb 접합체-CRP-AuNP-anti-CRP mAb의 복합체의 양이 증가하는 것을 확인하였고, 이것은 형광 라텍스 비드와 금나노입자의 고유의 색깔로 CRP 농도별 측정을 할 수 있었다.
실험예 3-3: 면역스트립(lateral flow assay)을 이용한 CRP 측정
180 sec nitrocelluolose(NC) 막에 2nd Ab인 anti-mouse IgG Ab (control, 1㎎/㎖)와 anti-CRP pAb(1㎎/㎖)를 각각 0.3 ㎕ 씩 스팟팅(spotting)하여, 상온에서 약 20분 동안 건조시켰다. 실시예 1-1의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 80 ㎚와 90 ㎚ 자기나노입자(Fe3O4 , Fe3O4-SiO2)-금나노입자-항 C-reactive protein 단클론 항체 접합체 10 ㎕와 각기 다른 농도 0, 10 ng/㎖, 100 ng/㎖, 1 ㎍/㎖의 CRP 항원과 각 1%의 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 계면활성제(surfactant 10G)를 첨가하여 CRP free serum (high purified)으로 최종 부피 100 ㎕를 맞춰, 이 혼합액에 상기 스트립(strip)의 끝이 닿도록 살짝 담가 두었다.
혼합액이 스트립을 타고 올라가면서 면역반응이 일어났을 때, 신호가 나타나는지 여부를 관찰하여 자기나노입자-금나노입자-항체 접합체의 고정화 상태를 확인할 수 있었다. 반응이 완료된 후 Phosphate Buffered Saline(PBS, pH 7.4)로 nitrocelluolose(NC)을 씻어냈다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 면역스트립상에서도 nitrocelluolose(NC) 막에 고정된 항체와 항원과 단백질이 코팅된 자기나노입자-금나노입자-항체 접합체가 면역반응을 함으로써 나노입자의 종류와 관계없이 접합체의 나노입자 색에 의해 붉은색 신호가 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 4: BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드( latex beads , fluorescent Red, LB )- 은나노입자 ( silver nanoparticle , AgNP )-항체를 이용한 H1N1 바이러스 분석 및 다른 아형 바이러스와의 교차반응 확인
실험예 4-1: 형광 측정을 통한 H1N1 분석
실시예 1-2의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(latex beads, fluorescent Red, 2 ㎛ LB)-은나노입자(silver nanoparticle, 20 ㎚ AgNP)-항 H1 바이러스 단클론 항체(anti-H1 mAb) 접합체 1 ㎕와 100, 101, 102, 103, 104 , 105 pfu의 H1N1 바이러스를 PBS로 최종 부피 100 ㎕를 맞춰, 20분간 반응 시킨 후, 비교예 1의 방법으로 제조된 자기나노입자(MNP, CMX)-항 H1 바이러스 단클론 항체(anti-H1 mAb) 접합체 1 ㎕를 첨가하여 20분 동안 반응시켰다.
상기 반응액에 PBS 용액 100 ㎕을 첨가하고, 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액을 제거하고, PBS를 100 ㎕를 첨가하고, 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액을 제거하고, PBS를 100 ㎕ 첨가하여 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H1 mAb 접합체-H1N1 바이러스-MNP(CMX)-H1 mAb의 복합체를 회수하였다. 상기 과정을 한번 더 반복한 후, 상기 용액을 실험예 1-2와 동일한 방법으로 0.8 ㎛ MMM(asymetric super-micron membrane) 여과막에 통과시켜, 막에 포집하여 형광 신호를 확인하였다.
도 13의 (A)는 바이러스와 농도별 형광 신호를 나타낸 이미지이며, (B)는 형광신호 세기를 측정한 결과를 수치화한 그래프이다. .
도 13에 나타낸 바와 같이, H1N1 바이러스의 농도가 증가함에 따라 형광 신호의 세기가 증가하였고, 최소 10 pfu까지 측정이 가능하였다. 이것은 바이러스와 반응한 은나노입자에 의해 항체가 고정된 형광 라텍스 비드가 포획용 여과막에 남아 있음으로써 비드의 형광을 통해 측정이 가능함을 알 수 있었다.
실험예 4-2: 서로 다른 아형 바이러스에 대해 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드 ( latex beads , fluorescent Red , 2 ㎛ LB )- 은나노입자( silver nanoparticle, 20 nm AgNP )-항 H1 바이러스 단클론 항체( anti - H1 mAb ) 접합체와의 교차반응 확인
본 발명에 따른 다기능 생체물질 접합체가 선택적으로 바이러스를 검출할 수 있는지 확인하기 위하여 비교예 1의 방법으로 제조된 자기나노입자(MNP, CMX)-항 H1 단클론 항체(anti-H1 mAb) 접합체 1 ㎕와 서로 다른 아형 바이러스인 H1N1, H3N2, H5N2의 각 103 pfu 바이러스를 PBS로 최종 부피 100 ㎕를 각각 맞춰, 20분 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액을 제거하고, PBS 100 ㎕를 첨가하여 현탁시켰다.
상기 각 용액에 실시예 1-2의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(latex beads, fluorescent Red, 2 ㎛ LB)-은나노입자(silver nanoparticle, 20 nm AgNP)-항 H1 바이러스 단클론 항체(anti-H1 mAb) 접합체 1 ㎕를 각각 첨가하고, 20분 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 상온에서 자석을 이용하여 자기나노입자를 약 3분 동안 분리한 후 상등액을 제거하고, PBS를 100 ㎕ 첨가하여 각각의 MNP(CMX)-H1 mAb 접합체-바이러스-BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H1 mAb의 복합체를 회수하였다. 상기 과정을 한번 더 반복한 후, 상기 용액을 실험예 4-1과 동일한 방법으로 0.8 ㎛ CA(Cellulose Acetatemembrane) 여과막에 통과시켜, 막에 포집하여 형광 신호를 확인하였다.
그 결과 도 14에 나타난 바와 같이, 서로 다른 아형 바이러스인 H3N2, H5N2에서는 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H1 mAb에 의한 형광 신호가 나타나지 않았고, H1N1에 대해서만 선택적으로 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H1 mAb의 형광 신호가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4-3: 서로 다른 아형 바이러스에 대해 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드 ( latex beads , fluorescent Red , 2 ㎛ LB )-은나노입자( silver nanoparticle, 20 nm AgNP )-항 H5 바이러스 단클론 항체( anti - H5 mAb ) 접합체와의 교차반응 확인
비교예 1의 방법으로 제조된 자기나노입자(MNP, CMX)-항 H5 단클론 항체(anti-H5 mAb) 접합체와 실시예 1-2의 방법으로 제조된 BSA 단백질이 코팅된 형광 라텍스 비드(latex beads, fluorescent Red, 2 ㎛ LB)-은나노입자(silver nanoparticle, 20 nm AgNP)-항 H5 바이러스 단클론 항체(anti-H5 mAb) 접합체를 사용하여 서로 다른 아형 바이러스인 H1N1, H3N2, H5N2에 대해 상기 실험예 4-2와 동일한 방법으로 반응시킨 후 분석하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, H1N1, H3N2에서는 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H5 mAb에 의한 형광 신호가 나타나지 않았고, H5N2에 대해서만 선택적으로 BSA 단백질이 코팅된 fluorescent LB(2 ㎛)-AgNP-anti-H5 mAb의 형광 신호가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: BSA 단백질이 코팅된 라텍스 비드 ( undyed latex beads , LB )-금나노입자( gold nanoparticle , AuNP )-항체를 이용한 T cell ( CD3 ) 분리
실험예 5-1: 항체의 고정화 효율을 T cell 분리율로 확인
비교예 2와 실시예 1-2의 방법으로 제조된 라텍스 비드(undyed latex bead, 0.9 ㎛ LB)-항 human CD3 항체(anti-human CD3 Ab) 접합체와 BSA 단백질이 코팅된 라텍스 비드(undyed lates bead, 0.9 ㎛ LB)-금나노입자(gold nanoparticle, 20 nm AuNP)-항 human CD3 항체(anti-human CD3Ab) 접합체 용액을 각각 혈액과 혼합하여 상온에서 20분간 정치시켰다. 상기 반응액에 동일한 부피의 2% FBS-PBS를 첨가하여 잘 섞어준 후 density medium(Ficoll) 위에 올려, 상온에서 30분간 2,000 rpm, break off 조건으로 원심분리 하였다. 원심분리 후, Ficoll의 Density medium plasma 경계 부분에 있는 세포를 회수하여 FACS를 통해 T cell(CD3) 존재 유무와 T cell(CD3)을 선택적 분리율(제거)를 확인함으로써 라텍스 비드에 금나노입자를 이용한 항체 고정화 방법의 효과를 확인하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, 항체를 라텍스 비드에 직접 고정화한 방법에 비해, BSA 단백질이 코팅된 라텍스 비드(LB)-금나노입자(gold nanoparticles, AuNP)-항체 접합체를 이용할 경우, T cell(CD3)의 분리(제거) 효율성이 높음을 확인함으로써, 항체 고정화 효율이 증가하였음을 확인하였다.
실험예 6: HRP 가 코팅된 금나노입자 - 금나노입자 항체 접합체를 이용한 Troponin I 분석
Dispensor(Zeta)를 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 각각 항 마우스 IgG 항체(Control line)와 Troponin I 항체(Test line)를 8 mm 간격으로 0.1 mg/㎖의 농도를 도포하였다. 도포된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 3.8 mm 간격으로 커팅하여 스티립 센서를 제조하였다(센서당 항체 도포량 = 38 ng/strip). Triponin I의 농도별 측정을 위하여 상기 실시에 1-3에서 제조된 HRP가 코팅된 금나노입자- 금나노입자 항체 접합체를 1X, 2% polyvinylpyrrolidone(PVP)(sigma)과 2% Surfactate 10G(Fitzgerald)가 포함된 인간혈청(sigma) 용액에 0~1000 ng/㎖의 농도로 Troponine I를 혼합하여 96 well plate에 넣은 후, 상기 제조된 스트립 센서를 넣고 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 스트립은 다시 PBS 완충용액이 분주된 96 well plate에 넣어 20분간 세척하였다. 세척이 완료된 스트립의 sample pad를 제거하고 2 mM luminol(sigma), 0.5 mM p-coumaricacid(sigma), 2 mM의 hydrogen peroxide가 녹여진 0.1 M Tris-HCl(pH 8.8) 완충용액을 스트립에 20 ㎕처리한 후, Chemi-Doc(Bio-Rad)를 이용하여 화학 발광 신호를 120초간 측정하였으며, 그 측정된 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17의 test line에 나타난 바와 같이 Troponin I 0.1 ~ 1,000 ng/㎖ 농도의 범위에서 농도 증가에 따른 신호 증가를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 다음의 단계를 포함하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법:
    (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제 1 나노입자에 단백질을 코팅시키는 단계;
    (b) 상기 단백질이 코팅된 제 1 나노입자에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자를 흡착시켜 접합체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 접합체에 생체물질을 흡착시켜 다기능 생체물질 접합체를 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 나노입자는 라텍스, 마그네틱, 실리카, 양자점 및 금속나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 나노입자는 금, 은, 구리, 백금 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 나노입자는 제2 나노입자보다 입자의 크기가 큰 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 나노입자를 코팅하는 단백질은 BSA, 퍼옥시다제, 글루코스옥시다제, 콜린옥시다제, 알칼린포스파타제, 스트렙타비딘, 스킴밀크(skim milk), 혈청 및 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체물질은 항체, 효소, DNA, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체의 제조방법.
  7. 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 생체물질이 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 나노입자는 라텍스, 마그네틱, 실리카, 양자점 및 금속나노입자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제2 나노입자는 금, 은, 구리, 백금 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 제1 나노입자는 제2 나노입자보다 입자의 크기가 큰 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  11. 제7항에 있어서, 상기 제1 나노입자를 코팅하는 단백질은 BSA, 퍼옥시다제, 글루코스옥시다제, 콜린옥시다제, 알칼린포스파타제, 스트렙타비딘, 스킴밀크(skim milk), 혈청 및 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  12. 제7항에 있어서, 상기 생체물질은 항체, 효소, DNA, 압타머, PNA(peptide nucleic acids) 및 리간드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다기능 생체물질 접합체.
  13. 제7항의 다기능 생체물질 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  14. 다음의 단계를 포함하는, 다기능 생체물질 접합체를 이용한 미생물의 고속 검출방법:
    (a) 자성 또는 형광특성을 가지는 제1 나노입자에 단백질이 코팅되어 있고, 상기 단백질에 금속 특성을 가지는 제2 나노입자가 흡착되어 있으며, 상기 제2 나노입자에 검출 대상 미생물과 특이적으로 결합하는 항체가 흡착되어 있는 다기능 생체물질 접합체 및 검출 대상 미생물이 함유된 시료를 혼합하여 반응시키는 단계;
    (b) 상기 반응액을 미생물 응집용 필름 및 미생물 포획용 여과막에 순차적으로 통과시켜, 미생물과 반응하지 않은 다기능 생체물질 접합체를 투과시키고, 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체를 선택적으로 분리시키는 단계; 및
    (c) 상기 포획용 여과막에 포획된 다기능 생체물질 접합체-미생물 복합체의 유무 또는 농도를 측정하는 단계.
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