KR100962286B1 - 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자 및 그제조방법, 상기 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법 - Google Patents

식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자 및 그제조방법, 상기 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자성물질을 포함하는 자성체 코어를 제작하는 단계와; 상기 자성체 코어의 표면을 아민(amine)기능기로 개질시키는 단계와; 상기 아민(amine)기능기로 표면개질된 자성체 코어 표면에 금 입자층을 형성시키는 단계;를 포함하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법에 관한 것으로,
상기 제조방법에 제조된 금 나노입자는 그 입자크기를 5 ~ 30nm 수준으로 제작하여 표면적을 극대화시켜 식중독균과의 반응활성도를 증가시킴과 동시에 자성입자 성질에 의해 식중독균을 분리 및 농축시킬 수 있으며, 수용액 중에서 자성체 코어 표면을 아민기능기로 개질시킨 다음 그 표면에 금 이온성 물질을 환원 및 흡착반응을 통하여 입자 형태로 성장시킴에 따라 공정상의 위험성이 적으며 제작방법이 단순하여 대량생산에 적합하다.
자성체, 코어, 금, 나노입자, 복합체, 단일체

Description

식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자 및 그 제조방법, 상기 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법{A Manufacturing Method of Magnetic Gold Nanoparticle for Detecting Food-borne Pathogens and, Detecting Method Food-borne Pathogens of using a Magnetic Gold Nanoparticle}
본 발명은 식품 내에 함유된 식중독균을 검출하기 위한 자성 코어 금 나노입자를 간단한 공정을 통해 대량으로 생산이 가능한 제조방법 및 상기와 같이 제조된 자성 코어 금 나노입자를 활용하여 특정 식중독균 분리 및 농축과 동시에 검출할 수 있는 새로운 검출 방법에 관한 것이다.
최근 집단급식과 외식의 증가로 인하여 식인성 질병의 발생빈도가 증가하는 추세에 있으며, 이러한 식인성 질병은 건강을 해치는 주요한 원인이 되고 있다.
상기와 같은 식인성 질병중 가장 많은 문제를 일으키는 식중독균의 경우 구토, 설사, 복통, 발열, 식은 땀과 혈압하강 등을 동반하는 질병으로서, 대부분은 세균에 의하여 발생되는 세균성 식중독이기 때문에 상기 식중독 균에 대한 신속하고 정확한 검출과 평가기술 개발이 식품 안전에 대한 국민의 신뢰성 확보와 더불어 국가 경제, 산업적인 손실을 감소시킬 수 있다.
현재 식품 중에 포함된 식중독 균을 검출하기 위하여 상용화된 병원성 미생물 진단 kit는 생화학적 특성을 이용하는 방법과 표지 유전자의 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 이용하여 확인하는 방법, 그리고 효소면역 반응을 이용하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 분석하고자 하는 식품 내에 있는 미생물을 12시간 이상 배양해야하는 단점을 지니고 있어서 급식장이나 식당 등의 현장에서 실시간 검출에 사용하는 데는 무리가 따른다.
이에, 최근에는 상기 배양시간을 단축하기 위하여 자성을 가지는 마이크로 또는 나노크기의 입자를 사용하여 미생물 배양시간을 단축시켜 전체적인 검출시간을 줄이는 면역자성분리법이 활용되고 있으며, 이러한 면역자성분리방법은 자성체 표면에 표적 핵산 또는 미생물과 반응할 수 있는 생체활성 물질을 고정시킨 후 표적물에 흡착시켜 자석으로 분리시키는 방법이다.(WU, V.C.H. et al., Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 12, 57-67, 2004, Arthur, T.M et al., Jouranl of Food Protection, 68, 1566-1574, 2005, 한국 등록 특허 10-0720044)
그러나, 상기 면역자성분리법은 핵산 또는 미생물을 분리 및 농축시키는 것까지는 간단하지만, 이와 같이 분리 및 농축된 미생물을 정성 또는 정량적 판단을 위해서는 또 다른 분석기법이 적용되어야 한다. 예를 들어, 핵산 또는 미생물을 분리한 후 발색물질로 전처리한 후 분광기를 이용하여 검출하는 방법을 이용해야 하며, 이로 인해 검출 공정이 복잡하며 시료전처리에 따른 일관성 있는 정보를 얻기 힘들며 숙련된 분석 전문가를 필요로 하게 된다.
그 외에도 또한, 식중독균을 검출하기 위하여 리포좀을 이용한 화학 발광 면역센서, 실시간 폴리머라제 연쇄반응(PCR), 수정발진자 마이크로밸런스(QCM), 표면플라즈몬 공명(SPR) 등을 이용한 면역 센서법이 개발되고 있으며, 다만 이러한 방법들은 103cfu/ml 이상의 낮은 검출감도를 가지고 있어 그 활용성이 매우 낮은 편이다. (Yacoub-George, E. et al., Analytica Chimica Acta 457, 3-12, 2002, Ho, J. A., et al., Analytical Biochemistry, 339, 342-349, 2004, Wu, V. C.H. et al., Biosensors and Bioelectronics 22, 2967-2975, 2007, Fu, Z. et al., International Journal of Food Microbiology 99, 47-57, 2005, Yang, L. et al., Analytical Chemistry, 76, 1107-1113, 2004, Waswa, J., et al., LWT, 40, 187-192, 2007)
한편, 금 나노입자의 경우 유기 발색분자에 비해 백만배 이상 큰 몰흡광계수(·= 109 ~ 1011)로 인하여, 예전부터 핵산이나 단백질과 같은 생체 활성물질 탐지를 위한 발색제로 많이 이용되었을 뿐만 아니라 나노입자 표면 굴절율변화에 따른 파장이동 및 표면플라즈몬 공명(SPR) 신호 증가에 응용되고 있는데, 최근에는 전술한 면역자성분리법에 적용하기 위하여 자성 금 나노입자를 개발하고자 하는 시도가 다방면으로 이루어지고 있다.
이러한 자성 금 나노입자는 공지된 자성 나노입자 제조방법(Shengchun Qu, et al., Journal of Colloid and Interface Science 215, 190-192, 1999, D. K. Kim, et al., Chem. Mater. 15, 1617-1627, 2003, M. Mikhaylova, et al., Langmuir 20, 2472-2477, 2004)과, 금 나노입자 제조방법(K. Kneipp, Applied Spectroscopy 48, 951-955, 1994)을 적용하면 그 제조가 가능하다.
특히, 최근 일본특허 출원번호 제2007-205911호와 Z. Xu 그룹(J. Am. Chem. Soc. 129, 8698-8699, 2007)에서 자성체 코어에 금 나노입자를 셀 형태로 제작하는 방법이 최근 소개됨에 따라 자성 금 나노입자에 대한 본격적인 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
그러나, 지금까지 소개된 자성 금 나노입자의 제조방법들은 유기용매속에서 300℃ 이상의 고온에서 환류시켜 제작하기 때문에 제조공정상 위험이 따르며, 수용액에 분산시키기 위해 나노입자 표면을 개질시켜야 하는 추가공정을 필요로 하며 나노입자의 크기를 수십 나노미터이하로 제작하기 어려운 문제점이 있었다.
이에 본 발명자는 상기 자성 금 나노입자가 특정 식중독균의 검출방법에도 적용할 수 있음을 확인하고, 상기 식중독균에 대한 높은 반응활성을 갖는 자성 금 나노입자를 간단한 공정을 통하여 제조한 다음, 이를 활용하여 현장에서 신속하게 식중독균을 정량 및 정성적인 분석까지 가능한 검출방법을 연구한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 그 입자크기를 5 ~ 30 나노미터 수준으로 제작하여 표면적을 극대화시켜 식중독균과의 반응활성도를 증가시킴과 동시에 자성입자 성질에 의해 식중독균을 분리 및 농축시킬 수 있으며, 그 제조공정상 위험성이 적고 공정단계를 단순화하여 대량생산이 가능한 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 자성 코어 금 나노입자에 식중독균과 선택적으로 흡착할 수 있는 항체 고정화 기술을 제공하고 그 자성체 성질을 이용하여 식중독균을 선택적으로 분리하고 농축시켜 현장에서 간단한 방법으로 정량 및 정성분석까지 신속하게 시행할 수 있는 검출방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
자성물질을 포함하는 자성체 코어를 제작하는 단계와; 상기 자성체 코어의 표면을 아민 기능기로 개질시키는 단계와; 상기 아민 기능기로 표면개질된 자성체 코어 표면에 금 입자층을 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법을 제공함으로써 달성된다.
또한, 본 발명은 상기 금 입자층이 아민기로 표면개질된 자성체 코어를 수용액상에서 5 ~ 30nm 크기의 금 나노입자와 반응시켜 그 표면에 결합시켜 형성됨을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 금 입자층이 아민기로 표면개질된 자성체 코어를 HAuCl4 수용액에 첨가하여 환원시켜 형성됨을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조되어 5 ~ 30nm 나노크기의 자성체 코어의 외주면에 금 나노입자가 결합된 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조되어 나노크기의 자성체 코어의 외주면에 금 코팅층이 형성된 단일체 형태인 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 단일체 또는 복합체 구조를 가지는 자성 코어 금 나노입자를 제작하는 단계와; 상기 자성 코어 금 나노입자 표면에 식중독균 항체를 고정시키고 식중독균의 표면에 흡착시켜 식중독균의 선택적 수집 및 농축하는 단계와; 상기 자성 코어 금 나노입자에 의해 농축된 식중독균의 유무 및 함량을 표면플라즈몬 공명(SPR)을 통해 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 코어 금 나노입자를 이용한 식중독균의 검출방법을 제공한다.
상술한 바와 같이 본 발명의 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자는 입자크기가 200 ~ 300nm이였던 종래의 제조방법과는 달리 그 입자크기를 5 ~ 30nm 수준으로 제작하여 표면적을 극대화시켜 식중독균과의 반응활성도를 증가시킴과 동시에 자성입자 성질에 의해 식중독균을 분리 및 농축시킬 수 있으며, 수용액 중에서 자성체 코어 표면을 아민(amine)기능기로 개질시킨 다음 그 표면에 금 이온성 물질을 환원 및 흡착반응을 통하여 입자 형태로 성장시킴에 따라 공정상의 위험성이 적으며 제작방법이 단순하여 대량생산에 적합하다는 효과를 가져온다.
또한, 본 발명의 자성 코어 금 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법은 자성 코어를 이용하여 면역분리하고 금 나노입자를 이용하여 가시선 흡수 또는 표면플라즈몬 공명 증가에 이용하여 식중독균을 간단한 방법으로 정량 및 정성분석까지 신속하게 고감도로 검출할 수 있으며, 따라서 본 발명의 검출방법의 경우 균을 배양하는 기존 검출법에 비해 짧은 시간에 높은 검출감도를 가지기 때문에 향후 미량의 식중독균 검출에 유용하다는 효과를 가져온다.
본 발명의 식중독균의 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자에 대하여 그 제조방법을 통해 설명하면 다음과 같다.
먼저, 나노입자 크기의 자성체 코어를 제작하게 되는데, 이러한 자성체 코어로는 산화철, 코발트, 니켈 등의 금속을 주원료로 하여 열분해, 열증착 및 콜로이드 방법에 의해 제조가 가능하다.
그 일례로서, 산화철(Fe3O4)를 주성분으로 하는 자성체 코어를 제작하는 방법을 살펴보면, 먼저 NaOH과, FeCl2·4H2O, Fe3Cl6·4H2O, HCl를 혼합하고 mechanical stirrer를 이용하여 교반하게 되는데, 이 때 교반속도는 2000rpm의 속도로 하며, 그 온도는 80℃를 유지한 상태에서 30분간 진행한다. 이와 같이 교반이 완료되면, 영구자석을 이용하여 상층액을 분리하고 HCl을 사용하여 중화시킨 다음, 증류수 및 에탄올을 이용하여 세척하고 에탄올로 분산시켜 산화철(Fe3O4)의 나노입자인 자성체 코어 제작이 가능하다.
다만, 본 발명에 사용되는 자성체 코어는 상술한 방법으로만 제조되는 것으로 한정되는 것은 아니며, 자성을 갖는 금속을 나노입자 형태로 제조하는 공지된 종래방법은 모두 사용가능함을 밝혀둔다.
그 다음 단계로서, 상기와 같이 제작된 자성체 코어는 아미노프리필트리메톡시실란(Aminopropyltrimethoxysilane) 또는 아미노프리필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane)이 용해된 에탄올과 24시간 반응시켜 그 표면을 아민 기능기로 개질시킨 다음, 원심분리 또는 영구자석을 이용하여 에탄올로 3 ~ 5회 세척한 후 증류수로 다시 분산시킨다. 이러한 개질반응은 자성체 코어와 그 표면에 부착될 금 나노입자를 연결하기 위한 것으로 자성체 코어에는 실란기(-SiO-)를 가지면서 금 나노입자가 결합될 다른쪽 말단에는 아민(-NH2) 또는 티올(-SH) 기능기를 갖도록 하기 위함이다.
이와 같이 아민기로 표면개질된 자성체 코어를 제작한 다음 그 표면에 금 입 자층을 형성하게 되는데, 이 때 자성체 코어 표면에 금 입자를 형성하는 방법에 따라 크게 복합체와 단일체의 두 가지 형태의 금 입자층을 갖는 자성 코어 금 나노입자를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 두가지 형태의 자성 코어 금 나노입자를 나타낸 모식도로서, 이에 도시된 바와 같이 전 단계에서 제작된 자성체 코어(11)에 금 나노입자(12)를 결합시키면 (a)와 같은 복합체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10a)가 제조되며, 그 반면 자성체 코어 표면(11)에 금 함유 수용액과 반응시켜 금 코팅층(13)이 형성된 (b)와 같은 단일체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10b)를 제조할 수 있다.
먼저, 복합체 자성 코어 금 나노입자(10a)는 수용액상에 아민(amine)기로 표면개질된 자성체 코어(11)와 평균입경이 5nm인 금 나노입자(12)를 첨가한 후 12시간 반응시키고 영구자석을 이용하여 증류수로 세척함으로써 정제 및 제조가 가능하며, 이 때 자성체 코어의 크기는 3 ~ 5nm 크기였으며, 그 표면에 코팅된 금 나노입자(12)의 크기는 5 ~ 30nm이다.
반면, 단일체 자성 코어 금 나노입자(10b)는 아민기로 표면개질된 자성체 코어(11)를 HAuCl4·3H2O 수용액에 첨가하고 환류 교반시킨 다음, sodium citrate(C6H5Na3O·2H2O)를 첨가하고 2시간 반응하여 수용액 상의 Au3 +를 Au0로 환원시켜 자성체 코어(11) 표면에 금 입자로 이루어진 코팅층(13)을 형성시킨 후 영구자석을 이용하여 정제함으로써 제조가 가능하다. 이 때 제조된 단일체 자성 코어 금 나노입자(1a)의 전체 크기는 첨가하는 HAuCl4·3H2O와 sodium citrate의 농도를 변화시키면 10 ~ 100nm까지 제작될 수 있다.
상기와 같이 두가지 형태로 제조되는 자성 코어 금 나노입자(10a,10b)는 식중독균을 검출하는 기능에 있어서는 큰 차이가 없으나, 복합체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10a)의 경우 그 제조방법상 단일체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10b)보다 제조가 간편하고 입자의 크기 조절이 용이하다는 장점이 있다. 다만, 복합체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10a)는 단일체 구조의 자성 코어 금 나노입자(10b) 보다 용액상에서 안정화되지 못하여 엉김 발생이 발생될 수 있으며, 이 경우 식중독균 검출시 신호변화가 재현성이 떨어지는 현상이 발생된다.
따라서, 상기 두가지 형태의 금 입자층을 갖는 자성 코어 금 나노입자(10a,10b)는 그 사용용도에 따라 하나의 구조를 선택적으로 사용될 수 있으나, 두가지 구조의 자성 코어 금 나노입자(10a,10b)를 서로 혼합하여 사용함으로써 각각의 단점을 상쇄시킨 상태로 사용할 수도 있다.
이상과 같이 제조된 본 발명의 자성 코어 금 나노입자는 수용액 중에서 자성체 코어 표면을 아민기능기로 개질시킨 다음 그 표면에 금 이온성 물질을 환원 및 흡착반응을 통하여 입자 형태로 성장시킴에 따라 종래 제조방법과 비교하여 공정상의 위험성이 적으며 제작방법이 단순하여 대량생산에 적합하며 금 나노입자 고유의 발색 성질(500 ~ 600nm의 가시광선 영역 흡수)을 이용할 수 있어 식중독균의 검출에 유용하다고 할 수 있다.
아울러, 상기와 같이 제조된 자성 코어 금 나노입자를 이용하여 식중독균을 검출하는 방법에 대해 설명하면 다음과 같다.
먼저, 전술한 방법에 따라 단일체 또는 복합체 구조를 가지는 자성 코어 금 나노입자를 제작한 다음, 상기 나노입자 표면에 식중독균 항체를 고정시키고 식중독균의 표면에 흡착시켜 항체에 의한 식중독균의 선택적 수집 및 농축이 이루어지도록 한다.
도 2는 본 발명의 자성 코어 금 나노입자 표면에 항체를 고정시킨 후 항원 표면에 흡착시키는 과정을 나타낸 모식도로서, 이에 도시된 바와 같이 복합체 및 단일체 자성-금 나노 입자(10a,10b)의 표면에 식중독균과 선택적으로 결합할 수 있는 항체(21)를 각각 고정시킨 다음, 상기 항체가 고정된 금 나노입자(20)를 식중독균(22) 표면에 흡착시킨다. 이와 같이 흡착된 자성 코어 금 나노입자(10a,10b)로 인하여 식중독균(22)은 자장에 의해 분리 및 농축되며, 이 때 식중독균과 선택적으로 결합하는 항체(21)는 단클론 및 폴리클론 항체 뿐만 아니라 앱타머를 포함한다.
상기 단계에서 자성체 코어 금 나노입자에 항체를 고정화하는 방법으로는, 자성 코어 금 나노입자를 1mM Mercaptohexadecanoic acid(MHDA)가 용해된 에탄올과 12시간 반응시키고, 영구자석을 이용하여 MHDA가 고정된 자성 코어 금 나노입자를 분리 및 정제시킨 후, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) 와 N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) 용액에서 5분 동안 반응시킨 다음, 항체가 용해된 PBS(pH 7.4)용액에 자성 코어 금 나노입자와 2시간 동안 반응시켜 그 표면에 항체를 고정화시킨다. 후처리로 비특이적 반응을 제거하기 위해 0.1M ethanolamine과 30분 동안 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 정제하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 자성 코어 금 나노입자에 의해 농축된 식중독균의 유무 및 함량을 검출하게 되는데, 그 검출방법은 공지된 바와 같이 표면플라즈몬 공명(SPR) 기기에 장착한 후 분리 및 농축된 식중독균 미생물을 주입한 후 공명각 변화를 확인함으로써 알 수 있다.
도 3은 본 발명의 식중독균의 SPR 검출을 위한 SPR 칩제작 모식도로서, 이에 도시된 바와 같이 고체기질(30)에 식중독균이 선택적으로 흡착될 수 있는 항체(21)를 전술한 방법과 동일한 방법으로 고정시켜 SPR 칩을 제작하고, SPR 기기를 이용하여 식중독균이 칩상에 흡착될 때 변화되는 표면 굴절율의 변화를 공명각 변화로 감지하여 그 검출유무 및 검출량을 검출하게 된다. 이 때 사용된 고체기질(30)은 금이 50 nm 두께로 증착된 유리기판상이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 검출방법의 대상이 되는 식중독균은 살모넬라, 비브리오 파라헤몰리티커스, 캄필로박터 제주니, 리스테리아 모노사이토게네스, 대장균 0157:H7, 스타필로코커스 아우레우스, 클로스트리움 페르프린겐스, 바실러스 세레우스 등이 된다.
이상과 같은 본 발명의 식중독균 검출방법은 공지된 종래 자성면역분리법을 기반으로 하고 있으나, 종래 방법상 정성 및 정량분석을 위한 별도의 분석기법이 필요하여 검출단계가 복잡하고, 시료전처리에 따른 일관성 있는 정보를 얻기 힘들 며 숙련된 분석 전문가를 필요로 하는 문제점을 해결한 것으로, 특히 본 발명의 경우 자성 코어를 이용하여 면역분리하고 금 나노입자를 이용하여 가시선 흡수 또는 표면플라즈몬 공명 변화에 이용하여 식중독균을 간단한 방법으로 정성 및 정량분석까지 신속하게 고감도로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 검출방법의 경우 균을 배양하는 기존 검출법에 비해 짧은 시간에 높은 검출감도를 가지기 때문에 향후 미량의 식중독균 검출에 유용하다.
이하 실시예에서는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<제조예 1>
-자성 코어 금 나노입자의 제작-
먼저, 0.5M NaOH와 0.1M FeCl2·4H2O, 0.2M Fe3Cl6·4H2O, 0.4M HCl가 혼합된 혼합 수용액 25ml을 mechanical stirrer를 이용하여 2000rpm의 속도로 80oC에서 30분간 교반하고, 상기 교반액으로부터 영구자석을 이용하여 상층액을 분리하고 0.04M HCl을 사용하여 중화시킨 다음, 증류수 및 에탄올을 이용하여 세척하고 최종 200ml가 되도록 에탄올에 분산시켜 나노입자 크기의 Fe2O3 또는 Fe3O4 자성체 코어를 제작하였다. 상기와 같이 제작된 자성체 코어 표면에 amine 기능기로 개질시키기 위하여 1.0M Aminopropyltriethoxysilane을 에탄올 50ml에 녹인 후 에탄올에 분산된 나노입자와 24시간 반응시킨 다음, 원심분리 또는 영구자석을 이용하여 에탄올로 3 ~ 5회 세척한 후 최종 100ml 증류수에 분산시켰다.
먼저, 복합체 구조의 지성 코어 금 나노입자는 상기 아민기로 표면개질된 자성체 나노입자의 분산액 100ml에 평균입경 5nm의 금 나노입자를 각각 10, 30ml 씩 첨가한 후 12시간 반응시켜 영구자석을 이용하여 증류수로 세척하여 제작하였다.
이와 별도로, 단일체 구조의 자성 코어 금 나노입자는 상기 아민기로 표면개질된 자성체 나노입자의 분산액 100ml에 0.08g의 HAuCl4·3H2O이 용해된 증류수 70ml를 첨가하고 환류 교반시킨 다음, 1% sodium citrate를 첨가한 후 2시간 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 정제하여 제작하였다.
<실시예 1>
상기 제조예 1을 통하여 제조된 자성체 코어와, 단일체 자성 코어 금 나노입자를 각각 전자현미경으로 촬영하여 도 4에 도시하였다.
상기 도 4의 (a)는 제조예 1의 과정에서 제작된 자성체 코어의 사진으로 그 크기가 3 ~ 5nm임을 확인할 수 있었으며, (b)는 상기 자성체 코어에 금 나노입자층을 코팅시킨 단일체 자성 코어 금 나노입자의 사진으로 그 전체크기가 10 ~ 15nm임을 확인하였다.
<실시예 2>
상기 제조예 1을 통하여 제조된 자성체 코어와, 단일체 자성 코어 금 나노입 자에 대하여 영구자석을 통해 자장의 영향력에 대해 실험하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 중앙의 자석을 기준으로 왼쪽은 자성체 코어에 대한 자장의 영향력을 실험하여 촬영한 사진이고, 중앙의 자석을 기준으로 오른쪽은 단일체 자성 코어 금 나노입자에 대한 자장의 영향력을 실험하여 촬영한 사진으로서, 이를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 실시예에 따라 제조된 단일체 자성 코어 금 나노입자(자석기준 오른쪽)의 경우 금 입자를 코팅시키기 전인 자성체 코어와 동일한 자성체 성질을 가지고 있음을 확인하였으며, 이는 본 발명에 따라 금 나노입자를 표면에 형성시키더라도 자성은 유지됨을 알 수 있다.
<실시예 3>
상기 제조예 1을 통하여 제조된 단일체 자성 코어 금 나노입자에 대하여 가시선 영역에 대한 흡수율을 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 스펙트럼상에 순수한 20nm의 크기를 가지는 금 나노입자 (Au particle)는 536nm 정도를 나타냈고, 본 발명의 자성 코어 금 나노입자 (Au-Mag. particle)는 542nm 정도 흡수한 것으로 나타난 반면, 순수한 자성체 코어(Mag. particle)는 어떠한 흡수 영역을 가지지 않는다. 따라서 본 발명의 자성 코어 금 나노입자는 금 나노입자와 같은 광학적 성질을 가지고 있으면서 자장에 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
-SPR을 이용한 E.coli O157:H7의 검출-
제조예 1에 의해 제조된 자성 코어 금 나노입자를 1mM Mercaptohexadecanoic acid(MHDA)가 용해된 에탄올과 12시간 반응시킨 다음, 영구자석을 이용하여 MHDA가 고정된 자성 코어 금 나노입자를 분리 및 정제하고, 0.4M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC) 와 0.1M N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS)의 용액에서 5분 동안 반응시킨 후, 항체 10μg/ml가 용해된 PBS(pH 7.4) 용액 2시간 동안 반응시켜 자성 코어 금 나노입자 표면에 항체를 고정화하였다. 그 후, 비특이적 반응을 제거하기 위해 0.1M ethanolamine과 30분 동안 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 정제한 다음, E.coli O157:H7이 포함된 PBS 완충용액에 항체가 고정된 자성-금 나노입자를 첨가하여 1시간 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 분리 및 정제하였다.
SPR을 이용하여 나노입자가 흡착된 E.coli O157:H7을 검출하기 위하여 SPR 칩을 다음과 같이 제작하였다. 금이 50nm 두께로 증착된 유리기판상에 1mM MHDA, 0.4M EDC, 0.1M NHS 및 항체를 전술한 방법과 동일하게 각각 고정시키고, 자성 코어 금 나노입자가 흡착된 E.coli O157:H7을 주입한 후 이동한 SPR 공명각 변화를 확인하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이 때 각각 사용된 E.coli O157:H7의 농도는 50, 102, 103, 105, 107 cells/ml이다.
E.coli O157:H7에 의한 공명각 변화와 비특이적 결합에 의해 나타나는 자성 코어 금 나노입자에 의한 공명각 변화를 비교한 결과, 자성-금 나노입자를 사용하지 않은 일반적 SPR칩만 사용한 경우 105cells/ml 이상에서 공명각 변화가 나타나기 시작하였으며, 이는 문헌에 보고된 E.coli O157:H7 검출에 SPR을 이용한 결과와 유사함을 알 수 있다(Yacoub-George, E. et al., Analytica Chimica Acta 457, 3-12, 2002, Ho, J. A., et al., Analytical Biochemistry, 339, 342-349, 2004, Wu, V. C.H. et al., Biosensors and Bioelectronics 22, 2967-2975, 2007, Fu, Z. et al., Inteernational Journal of Food Microbiology 99, 47-57, 2005, Yang, L. et al., Analytical Chemistry, 76, 1107-1113, 2004, Waswa, J., et al., LWT, 40, 187-192, 2007). 그러나, 자성-금 나노입자를 흡착시킨 E.coli O157:H7은 100 cells/ml 이하까지 검출할 수 있음을 알 수 있으며, 이는 그 검출한계가 훨씬 낮은 것으로 나타났다.
특히, 이상의 실험결과로부터 자성-금 나노입자를 제작하여 나노입자 표면에 항체를 고정시킨 후 식중독균인 E.coli O157:H7에 흡착시켜 SPR을 이용하여 공명각 변화를 확인하였을 때 100 cells/ml 이하까지 검출할 수 있음을 확인하였으며, 자성 코어 금 나노입자를 사용하지 않았을 때 보다 1000배 이상의 우수한 검출감도를 보임을 알 수 있다.
도 1은 본 발명의 두가지 형태의 자성 코어 금 나노입자를 나타낸 모식도
도 2는 본 발명의 자성 코어 금 나노입자 표면에 항체를 고정시킨 후 항원표면에 흡착시키는 과정을 나타낸 모식도
도 3은 본 발명의 식중독균의 SPR 검출을 위한 SPR 칩제작 모식도
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제작된 자성 코어 금 나노입자의 전자현미경 사진
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 제작된 자성 코어 금 나노입자의 자장에 영향에 대한 사진
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 자성 코어 금 나노입자에 대한 가시선 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 자성 코어 금 나노입자를 이용한 식중독균 검출에 따른 SPR 공명각 변화를 나타낸 그래프
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10a : 복합체 자성 코어 금 나노입자
10b : 단일체 자성 코어 금 나노입자
11 : 자성체 코어
12 : 금 나노입자
13 : 금 코팅층
20 : 항체가 고정된 단일체 나노입자
21 : 항체
22 : 식중독 균
30 : SPR칩

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. NaOH와, FeCl2·4H2O, Fe3Cl6·4H2O, HCl를 혼합하고 mechanical stirrer를 이용하여 교반한 다음, 영구자석을 이용하여 상층액을 분리하고 HCl로 중화시킨 후, 증류수 및 에탄올을 이용하여 세척하고 에탄올로 분산시켜 자성체 코어를 제작하는 단계와;
    상기 자성체 코어에 실란기(-SiO-)가 위치되고 금 나노입자가 결합될 다른쪽 말단에는 amine (-NH2)또는 thiol (-SH) 기능기가 위치되도록 하기 위해, 상기 자성체 코어에 Aminopropyltriethoxysilane 또는 Aminopropyltrimethoxysilane이 용해된 에탄올과 24시간 반응시킨 다음, 원심분리 또는 영구자석을 이용하여 에탄올로 3 ~ 5회 세척한 후 증류수로 다시 분산시킴으로서 상기 자성체 코어의 표면을 아민(amine)기능기로 개질시키는 단계와;
    상기 아민(amine)기로 표면개질된 자성체 코어에 금 입자층을 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 금 입자층은 아민기로 표면개질된 자성체 코어를 HAuCl4·3H2O 수용액에 첨가하고 환류 및 교반시킨 다음, sodium citrate(C6H5Na3O·2H2O)를 추가로 첨가하고 2시간 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 정제하여 형성된 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 청구항 7의 제조방법에 의해 제조되어, 나노크기의 자성체 코어의 외주면에 금 코팅층이 형성된 단일체 형태인 것을 특징으로 하는 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자.
  10. 삭제
  11. 청구항 3의 제조방법에 의해 자성 코어 금 나노입자를 제작하는 단계와;
    상기 자성 코어 금 나노입자를 Mercaptohexadecanoic acid(MHDA)가 용해된 에탄올과 12시간 반응시키고, 영구자석을 이용하여 MHDA가 고정된 자성 코어 금 나노입자를 분리 및 정제한 후, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS) 용액에서 5분 동안 반응시킨 다음, 다시 자성 코어 금 나노입자를 다시 분리 및 정제하고, 항체가 용해된 PBS(pH 7.4) 용액에 2시간 동안 반응시킴으로서 상기 자성체 코어 금 나노입자에 식중독균 항체를 고정시키고 상기 식중독균의 표면에 흡착시켜 식중독균을 선택적 수집 및 농축하는 단계와;
    상기 자성 코어 금 나노입자에 의해 농축된 식중독균의 유무 및 함량을 Surface Plasmon Resonacne(SPR)을 통해 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 코어 금 나노입자를 이용한 식중독균의 검출방법
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체 고정화 후 비특이적 반응을 제거하기 위해 ethanolamine과 30분 동안 반응시킨 후 영구자석을 이용하여 정제하는 것을 특징으로 하는 자성 코어 금 나노입자를 이용한 식중독균의 검출방법.
  13. 삭제
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