KR102439357B1 - 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집 시스템을 이용한 현장용 유해물질 검출키트 및 그를 이용한 유해물질의 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식품, 환경, 의약품, 군사 등의 분야에서, 곰팡이 독소, 식중독균, 바이러스 등과 같은 위해균, 농약, 중금속 등의 다양한 유해물질을 현장에서 신속하게 검출하기 위한 1차 진단용 현장용 유해물질 검출키트, 및 그 검출키트를 이용한 농식품 등을 현장에서 상기 유해물질들을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트는, 금 나노입자 저장챔버, 저장챔버의 내측 단부와 연결되어 있는 반응챔버, 저장챔버와 반응챔버를 연통 또는 폐쇄하기 위한 밸브를 갖는 3-방향 밸브; 피검물을 주입하기 위한 주입 기구; 반응물을 여과하기 위한 여과기; 여과를 용이하게 하기 위한 가압기구; 및 여액을 시각적으로 확인하기 위한 검출확인용 용기를 포함한다.
본 발명에 따른 1차 진단용 현장용 유해물질 검출키트는 나노입자 응집에 의한 색변화 기반 시각적 지시 원리를 이용하여 현장에서 샘플을 채취한 후 실험실에서 상기 다양한 유해물질을 현장에서 즉시 검출할 수 있기 때문에 농식품의 위생 및 안전성에 대해 신속하고 효율적인 조치를 취할 수 있다.

Description

변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집 시스템을 이용한 현장용 유해물질 검출키트 및 그를 이용한 유해물질의 검출방법{Kit And Method For Detecting Hazardous Substance On-Site Using A Switchable and Functional Linker-Based Gold Nanoparticle Aggregation System}

본 발명은 식품, 환경, 의약품, 군사 등의 분야에서, 곰팡이 독소, 식중독균, 바이러스 등과 같은 위해균, 농약, 중금속 등의 다양한 유해물질을 현장에서 신속하게 검출하도록 1차 진단을 위한 현장용 유해물질 검출키트, 구체적으로는 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집 시스템을 이용한 현장용 유해물질 검출키트(이하, '현장용 유해물질 검출키트'라 하는 경우가 있음) 및 그를 이용한 유해물질의 검출방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 농식품 중 유해물질의 오염과 잦은 식중독 사고 발생으로 인하여 소비자의 농식품 안전성에 대한 우려가 증가하고 있으며, 농산물 또는 농식품을 외국에서 수입하거나 단체 급식용으로 납품 받는 경우 등에 있어서, 고품질 농식품의 위생 및 안전성에 대해 신속한 신뢰성 확보가 필요하다. 기존에는 대부분 현장에서 샘플을 채취한 후 실험실에서 고가 장비를 이용하여 검사를 하기 때문에 전문가가 필요할 뿐만 아니라 시간이 오래 걸려 신속하고 효율적인 조치를 취할 수 없었다.

건강에 대한 관심이 어느 때 보다 높은 최근의 사회 분위기 속에서 소비자의 고 품질의 안전 농식품에 대한 수요 증가는 농식품 안전성의 사전 검사에 대한 관심과 관련 기술의 필요성을 불러일으키고 있다.

종래의 식품 안전성 신속진단 기술로는 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase chain reaction), 효소 면역측정법(ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay), ATP (Adenosine Triphosphate) 생물발광법 등이 있으며, 이들 방법들은 식중독균과 같이 검사에 수 일에서 수 주가 소요되는 기존의 식품 유해물질의 검출(평판배지법)에 비해서 보다 빠르게 수행할 수 있다.

그러나, 이와 같은 신속진단 기술들은 식품 시료에서 특정 DNA 만을 분리ㆍ추출ㆍ정제하여 증폭 과정을 거치는 등 시료의 전처리 과정에서 전문적인 기술과 장비가 필요할 뿐만 아니라, 검출까지 수 시간 이상이 소요되는 단점이 있다. 따라서 불안전성과 검출 기간의 장기화 등으로 기존의 진단기술은 시장 진입에 어려움이 있는 실정이므로, 이를 해결할 수 있는 새로운 검출 방법을 활용한 신속진단 기술 개발 연구가 요구된다.

또한, DNA, 항체, 효소, 단백질 등의 생체물질로 이루어진 감지부와 압전식, 전기화학식, 광학식 방법을 이용하는 물리적인 신호 변환부로 이루어진 장치인 바이오센서를 이용한 유해물질의 검출법이 있으나, 현재는 시작 단계이며, 농식품의 안전성을 향상시킬 수 있는 식중독균 신속진단 기술을 개발하기 위해서는 핵산 탐침자와 같이 선택성과 내구성을 높일 수 있는 생물학적 탐침자 연구, 간이진단 키트의 간편성과 바이오센서의 높은 성능을 융합한 새로운 면역센서 연구와, 면역센서에서 측정된 신호를 고감도로 측정할 수 있는 신뢰성 있는 새로운 기술에 대한 연구개발이 시급하게 요구된다.

본 발명의 목적은 금 나노입자 응집에 의한 색변화를 기반으로 한 시각적 지시 원리를 이용하여 곰팡이 독소, 식중독균, 바이러스 등과 같은 유해균, 농약, 중금속 등의 다양한 유해물질을 현장에서 신속하게 검출하도록 1차 진단을 위한 현장용 유해물질 검출키트 및 그를 이용한 유해물질의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자는 상기 과제에 대해 연구한 결과, 1차 진단을 위한 특정 구성의 현장용 유해물질 검출키트 및 그를 이용한 유해물질의 검출방법을 제공함으로써 상기 과제가 해결될 수 있다는 사실을 알아내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 상기 목적은 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집 시스템을 이용한 현장용 유해물질 검출키트로서, 외측 단부가 개방되어 있고 상기 금 나노입자가 충전되어 있는 저장챔버, 양단부가 개방되어 있고 상기 저장챔버의 내측 단부와 연결되어 있으며 상기 변환기능 링커가 충전되어 있는, 피검물을 주입하기 위한 반응챔버, 상기 밸브가 개방되었을 때 금 변환기능 링커와 금 나노입자와 피검물이 접촉 반응하도록 반응챔버의 중앙에는 반응챔버와 저장챔버의 내측 단부를 연통 또는 폐쇄하기 위한 밸브를 가지며, 상기 저장챔버의 외측 단부에 형성되어 있는 저장챔버 개구와 상기 반응챔버의 양측에 형성되어 있는 반응챔버 개구를 밀폐하기 위한 마개를 갖는 3-방향 밸브; 상기 피검물을 상기 반응챔버에 주입하기 위한 주입 기구; 원통, 상기 원통 중심부에 내부와 연통되어 상기 금 변환기능 링커와 금 나노입자와 피검물의 반응물이 유입되는 반응물 유입관, 상기 원통의 바닥 중앙에 연통되도록 연결되어 있는 여액 배출관, 및 원통 내에 내장되는 여과지를 갖는 여과기;
상기 반응물의 여과를 용이하게 하도록 상기 반응챔버 내의 반응물을 가압하기 위한 가압기구; 및
여액을 수용하여 시각적으로 신호를 확인하기 위한 검출확인 용기;
를 포함하는 현장용 유해물질 검출키트에 의해 달성된다.

본 발명의 바람직한 실시형태는, 주입 기구가 피펫 또는 스포이드이고, 가압기구가 시린지이고, 검출 확인 용기가 종이, 유리병, 바이얼, 또는 튜브인 현장용 유해물질 검출키트를 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태는, 여과지의 기공 크기가 0.45 ㎛ 이하이고, 그 재질이 단백질과의 결합력이 약한 특성을 갖는 폴리비닐리덴 플루오라이드인 현장용 유해물질 검출키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 현장용 유해물질 검출키트를 이용한 유해물질 검출방법을 제공한다:
3-방향 밸브의 저장챔버 개구를 통해 금 나노입자를 저장챔버에 충전한 후 저장챔버 개구를 마개로 밀봉하는 단계(S1);
주입기구를 사용하여, 반응챔버의 일측 개구가 폐쇄된 상태에서 변환기능 링커를 주입한 다음, 반응챔버 개구를 다시 개방하여 상기 반응챔버 개구를 통해 피검물을 반응챔버에 주입한 후 마개로 밀봉한 후, 상기 3-방향 밸브를 흔들어 주어 변환기능 링커와 상기 피검물을 1차 반응시켜 1차 반응물을 얻는 단계(S2);
상기 저장챔버와 상기 반응챔버가 연통되도록 3-방향 밸브의 밸브를 열어 흔들어 줌으로써 상기 저장챔버 내의 금 나노입자와 상기 반응챔버 내의 1차 반응물과 2차 반응시켜 2차 반응물을 얻는 단계(S3);
검출확인 용기에 여과기의 배출관을 넣고, 상기 여과기의 2차 반응물 유입관에 반응챔버의 일측 개구를 삽입한 후 타측 개구에 가압기구를 삽입 및 가압하여 2차 반응물을 여과하는 단계(S4); 및
여과기의 배출관을 통해 검출확인 용기 내로 여과되어 수납된 여액에 대해 색상을 식별하는 비색확인 단계(S5).

본 발명의 바람직한 또 다른 실시형태는 단계(S2) 및 단계(S3)에서의 반응 시간이 각각 15분∼1시간 및 5∼10분인 유해물질 검출방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시형태는 여액의 색상에 있어서 적색과 투명한 색의 색 차이에 의해 유해물질의 존재여부를 판정하는 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 1차 진단용 현장용 유해물질 검출키트는 나노입자 응집에 의한 색변화 기반 시각적 지시 원리를 이용하여 현장에서 샘플을 채취한 후 실험실에서 곰팡이 독소, 식중독균, 바이러스 등과 같은 유해균, 농약, 중금속 등의 다양한 유해물질을 현장에서 즉시 검출할 수 있기 때문에 농식품의 위생 및 안전성에 대해 신속하고 효율적인 조치를 취할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트의 부품 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 변환기능 링커가 각각 바이오틴-스트렙타비딘 및 항원-항체 반응을 구성하는 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 대조군(control) 및 시험군(target)에서 변환기능 링커가 각각 피검출물과 금 나노입자와의 응집 반응 여부를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 변환기능 링커 기반의 비색 검출법 원리 및 결과를 읽는 방법을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 스위치오프 되는 여러 가지 상황들을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트를 이용한 검출 원리 및 방법의 개략도이다.
도 7은 1차 반응(검출물 인식단계)의 반응시간을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 2차 반응(비색신호 확인단계)의 반응시간을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집시스템을 활용하고, 현장용 유해물질 검출키트를 이용하여 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)을 검출한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 그러나, 이하의 실시예는 이 기술 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 다음에 기술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 '변환기능 링커'라고 불리는 링커를 기반으로 금 나노입자의 응집을 조절함으로써 유해물질을 검출하는 기술이다. 변환기능 링커는 다음과 같은 3 가지 특성을 갖고 있다. 첫째, 금 나노입자의 응집을 유도하여 침전에 의한 색 변화를 유발할 수 있고, 둘째, 유해물질을 선택적으로 결합하여 응집을 유도할 수 있으며, 셋째, 목표물질과 결합된 변환기능 링커는 금 나노입자의 대규모 응집 능력이 제한되며, 그 역도 성립한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트는 크게 3-방향 밸브(10), 주입기구(20), 여과기(30), 가압기구(40) 및 검출확인 용기(50)로 구성되어 있다.

본 발명의 현장용 유해물질 검출키트에 사용되는 3-방향 밸브(10)는 "랩-온-밸브(lab-on-valve, LOV)"라고도 불리우며, 이러한 밸브는 실험실에서 할 수 있는 모든 것을 밸브에 담았다는 개념으로 흐름 제어를 위한 새로운 기술로 등장하였다. LOV의 개념을 가지는 3-방향 밸브는 간단한 조작으로 유체의 흐름을 제어할 수 있으며 밀봉이 가능하여 반응 및 보관 챔버로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 3-방향 밸브(10)는 크게 금 나노입자를 저장하는 저장챔버(11) 및 밸브(미도시)를 통해 저장챔버(11)와 연통되는 반응챔버(12)로 구성되어 있다. 상기 밸브 위에는 밸브를 조작하기 위한 밸브 손잡이(13)가 구비되어 있다.

저장챔버(11)는 외측 단부가 개방되어 있는 저장챔버 개구(14)를 갖고, 내측 단부는 반응챔버(12)의 중앙에서 밸브를 통해 반응챔버(12)와 연통되거나 폐쇄되도록 구성되어 있다. 저장챔버 개구(14)는 금 나노입자를 저장한 후 밀봉하기 위한 마개(16)가 구비된다.

반응챔버(12)는 저장챔버(11)의 내측 단부가 반응챔버(12)의 중앙에 연결되어 있고, 밸브에 의해 연통되거나 폐쇄되도록 구성되어 있으며, 반응챔버(12)의 양 단부에는 반응챔버 개구(15)가 형성되어 있고, 또한 반응챔버 개구(15)를 밀봉하기 위한 마개(16)가 구비된다.

본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트에는 또한 피검물을 반응챔버(12)에 주입하기 위한 주입기구(20)가 포함된다. 주입기구(20)의 바람직한 예로는 피펫이나 스포이드가 있다.

현장용 유해물질 검출키트의 여과기(30)는 플라스틱 원통(33), 원통(33) 중심부에 내부와 연통되는 반응물 유입관(34), 원통(33)의 바닥 중앙에 연통되도록 연결되어 있는 여액 배출관(31), 및 상기 원통(33)에 내장되는 여과지(32)를 포함한다.

여과지(32)는 실험 및 의료용으로 널리 사용되고 있는 것으로서 친수성 또는 소수성 재질의 종이이며, 바람직하기로는 폴리비닐리덴 플루오라이드이며, 기공크기(pore size)가 0.45 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.

현장용 유해물질 검출키트의 가압기구(40)는, 도 4에 도시된 바와 같이, 반응챔버(12) 내에 있는 반응물이 여과지(32)를 신속하게 통과하도록 반응챔버 개구(15)에 삽입하여 반응물을 가압하기 위해 사용된다. 본 발명에서는 가압기구(40)의 바람직한 예로서 일반적으로 사용되는 시린지가 사용되고 있지만, 다른 적절한 기구를 사용할 수 있음은 물론이다. 검출 시스템의 경우, 금 나노입자의 응집체가 일정 크기 이상으로 커질 경우, 침전이 발생되었다. 본 발명에서는 가압기구(40)를 사용함으로써 여과 시간을 획기적으로 줄이고자 하였다.

본 발명에서는, 상술한 바와 같이, 반응물을 가압하여 여과되는 여액을 수집하기 위한 검출확인 용기(50)를 구비하고 있다. 상기 검출확인 용기(50)는 육안으로 색상을 식별할 수 있도록 투명한 용기라면 어느 것을 사용해도 좋다.

본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트를 이용하여 식자재와 같은 피검물에 대한 유해물질 검출방법은 크게 저장챔버(11)에 금나노 입자를 충전하는 단계(S1), 반응챔버(12)에 변환기능 링커와 피검물을 주입하여 1차 반응시키는 단계(S2), 밸브를 모두 열어 금나노 입자와 변환기능 링커 및 피검물의 반응물과를 2차 반응시키는 단계(S3), 2차 반응물을 여과기(30)를 통해 여과시키는 단계(S4), 및 여액을 비색 확인하는 단계(S5)로 구성된다.

이하, 도 4를 참조하면 더 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

금나노 입자 충전 단계(S1)에서는, 저장챔버(11)의 밸브가 폐쇄된 상태에서 저장챔버 개구(14)를 통해 금나노 입자를 충전한 후 저장챔버 개구(14)를 마개(16)로 밀봉한다.

1차 반응단계(S2)에서는, 반응챔버(12)의 양측 개구 중 일측 개구(15)를 마개(16)로 폐쇄한 상태에서, 피펫이나 스포이드 등과 같은 주입기구(20)를 사용하여, 반응챔버(12)의 타측 개구(15)를 통해 변환기능 링커를 주입한 후, 다시 피검물을 주입한 후 마개(16)로 밀봉한다.

2차 반응 단계(S3)에서는, 저장챔버(11)와 반응챔버(12)가 연통되도록 3-방향 밸브(10)의 밸브를 연 다음, 흔들어 줌으로써 저장챔버(11) 내의 금 나노입자와 반응챔버(12) 내의 변환기능 링커 및 피검물의 반응물이 충분히 반응하도록 한다.

2차 반응물을 여과하는 단계(S4)에서는, 검출확인 용기(50)에 여과기(30)의 배출관(31)을 넣고, 반응챔버(12)의 일측 개구(15)의 마개(16)를 개방한 다음, 그 개구(15)를 여과기(30)의 2차 반응물 유입구(34)에 삽입한 후, 타측 반응챔버 개구(15)에 가압기구(40)를 삽입하여 가압하여 여과를 신속하게 한다.

마지막으로, 여액의 비색확인 단계(S5)에서는, 상기 여과기(30)의 배출관(31)을 통해 검출확인 용기(50) 내로 여과되어 수집된 여액에 대해 색상을 확인한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 피검물에 유해물질이 없는 대조군(control)에는 청색을 띄며, 유해물질, 예를 들면 살모넬라균(target)이 있는 경우에는 적색을 띄게 된다.

대조군에서는 금나노 입자가 살모넬라 항체와 결합하여 그 결합물인 금 나노응집체의 크기가 커져서 여과지를 통과하지 못하여 금나노 입자가 여액에 없기 때문이며, 반대로 시험군에서는 피검물에 있는 살모넬라 항원의 스위치-오프(switch-off) 결과로, 금 나노입자가 살모넬라 항체와 결합한 그 결합물인 금 나노응집체는 크기가 충분히 커지지 못하고 여과지를 통과하여 적색을 띄게 된다.

도 2는 변환기능 링커의 구성을 나타낸 것으로, 항체(IgG)의 뼈대(청색)에 바이오틴(biotin)(하늘색)이 가지처럼 붙어 있는 구조이며, 바이오틴-스트랩타비딘(연두색) 결합으로 금 나노입자와 결합할 수 있으며, 항체의 항원 인식부위(epitope)를 통하여 피검출물과 항원-항체 반응으로 결합할 수 있는 것을 나타낸다.

도 3은 대조군과 시험군의 반응을 나타낸 것으로, 대조군에서는 변환기능 링커가 스위치-온(switch-on) 상태로 바이오틴-스트랩타비딘 반응을 통해서 금 나노입자의 응집을 유도할 수 있고, 시험군에서는 변환기능 링커가 항원-항체 반응으로 피검출물과 결합되어 스위치-오프(switch-off)되어서 금 나노입자의 응집반응을 유도하는 데 있어서 제한이 발생하는 것을 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트를 사용하여, 피검물에 대한 유해물질 여부를 검출하는 방법을 단계별로 도시하였다. 본 발명에 따른 검출방법은 피검물 인식단계인 1단계(반응 1)와 비색신호 발생단계인 2단계(반응 2)로 구성되며, 검출물이 있는 시험군과 검출물이 없는 대조군으로 시험하는 것을 나타낸다. 우선, 3-방향 밸브(10)는 변환기능 링커를 함유한 반응챔버(12)와 금 나노입자를 함유한 저장챔버(11)로 구성된다.

도 5는 본 발명에 따라 스위치오프 되는 여러 가지 상황들을 나타낸 모식도이다. 'a'는 고정된 양을 가지는 금 나노입자와 서로 다른 양을 가지는 변환기능 링커는 응집의 정도가 다르게 나타나며, 금 나노입자의 응집 정도에 따라서 색의 차이가 나타나는 영역 3 부분(region 1, 2, 3)을 나타낸다. ‘b’는 변환기능 링커가 쪼개지거나(cleave), 완전히 활성을 잃거나(knock-out), 한쪽만 기능을 잃거나(block), 서로 결합되는(conjugate) 등에 의해서 스위치 오프가 발생되는 여러 가지 상황을 나타낸다, ‘c’와‘d’는 각 상황에 따라서 스위치 오프된 링커에 의해서 금 나노입자의 응집을 나타낸다.

또한, 도 5에서 흑색 원은 스위치 오프된 SL에 의해 점유된 결합부위를 나타내고, 적색 원은 스위치 오프된 SL에 의해 점유되지 않은(vacated) 결합부위를 나타내고, 적색 화살표는 스위치 오프된 링커에 의해 브리지 결합할 수 없다는 것을 나타내고, 자주색 화살표는 스위치 오프된 링커의 결과로, 점유되지 않은 결합 부위가 결합된다는 것을 나타낸다.

도 6은 본 발명에 따른 현장용 유해물질 검출키트를 이용한 검출 원리 및 방법의 개략도이다. 목표 대상이 없는 대조군에서 변환기능 링커와 금 나노입자의 정량적 상관관계에 의해서 침전이 발생하는 응집체가 형성되는 영역 2(region 2)가 결정된다. 이를 바탕으로 목표 대상이 있는 시험군에서 목표 대상에 의해서 변환기능 링커가 일부 스위치오프 되면 대조군에서 형성된 정량적 상관관계는 재설정되며, 더 높은 링커영역에서 대규모 응집체가 형성되는 양적 관계를 나타나게 된다. 이를 통하여 전체적으로 대조군 대비 시험군에서 침전에 의한 색 변화가 나타나는 영역 2가 더 높은 링커 농도로 이동함을 확인함으로써 목표 대상의 정량적 검출이 가능하다.

실시예 (피검물의 살모넬라균 검출 실험)

살모넬라 균을 직접 배지로 키워서 팹톤수, PBS 등의 완충용액에 희석하여 유해물질로서 살모넬라 균 시료 200 ㎕를 준비하였다.

저장챔버(11)의 밸브가 폐쇄된 상태에서, 저장챔버 개구(14)를 통해 금나노 입자 200 ㎕를 충전한 후 저장챔버 개구(14)를 마개(16)로 밀봉하였다.

주입기구(20)로서 피펫을 사용하여, 반응챔버(12)의 일측 개구(15)가 폐쇄된 상태에서, 변환기능 링커 100 ㎕를 주입한 다음, 반응챔버(12)의 타측 개구(15)를 통해 피검물 시료 100 ㎕를 반응챔버(12)에 넣고 마개(16)로 밀봉한 후, 번환기능 링커와 피검물이 충분히 반응하도록 30초 동안 흔들어 준 뒤 약 20분 동안 정치시켰다.

이 후, 밸브 손잡이(13)를 돌려서 미리 충전되어 있는 저장챔버(11)의 금 나노입자를 반응챔버(12)로 흘려보내낸 뒤, 금 나노 입자와 변환기능 링커 및 피검물의 반응물이 충분히 반응하도록 3-방향 밸브(10)를 약 30초 동안 흔들어준 뒤 5분 동안 정치시켰다.

반응이 종료된 후, 검출확인 용기(50)로서 리더기(바이알)를 반응챔버(12)의 일측 단부에 있는 반응챔버 개구(15) 아래에 배치시키고, 여과기(30)의 배출관(31)을 반응챔버 개구(15)와 밀폐 가능하도록 삽입하였다.

그 다음, 반응챔버(12)의 타측 단부에 있는 반응챔버 개구(15)에 가압기구(40)로서 시린지를 삽입한 후 가압하여 여과지를 통과한 여액을 검출확인 용기(50)에 수집하였다.

비교예 (대조군의 검출 실험)

살모넬라를 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예와 동일한 방법으로 실시하여 반응물의 색을 확인하였다. 그 결과 살모넬라 균이 없는 시료에서는 여액의 색상은, 도 4에 나타낸 바와 같이 적색이 나타나지 않았다.

실험예 1 (1차 반응의 최적 시간 측정)

본 발명에서는 1차 반응(단계 S2)에서, 검출물과 변환기능 링커가 반응하는데 필요한 최소한의 시간을 측정하기 위하여 15분 간격으로 반응에 의한 색 변화를 측정하였다. 그 결과 색 차이를 나타내는데 걸린 시간은 30분으로 나타났으며(도 7 참조). 따라서 1차반응(검출물 인식단계)에 필요한 최적 시간을 30분으로 결정하였다.

실험예 2 (2차 반응의 최적 시간 측정)

또한, 본 발명에서는 2차 반응(단계 S3)에서, 여과가 가능할 만큼 큰 응집체가 형성되는 최적의 시간을 결정하기 위해서 다음과 같이 시험을 실시하였다. 금 나노입자의 응집체 크기가 0.45 ㎛의 여과지에 걸러질 정도로 커질 때까지 걸리는 시간을 측정하였다. 그 결과 DLS에서 금 나노입자의 응집체가 필터지 크기만큼 커지는데 걸리는 시간과 여과지에 의해서 색의 차이가 나타나는 시간을 토대로 2차반응의 최적시간을 5 내지 10분으로 결정하었다. 그 결과를 도 8에 도시하였다.

도 8은 반응 시간을 줄이기 위한 목적으로 시각적 검출 신호를 나타내는 금 나노입자의 응집체를 여과하기 위한 여과에 필요한 반응시간을 최적화한 실험 결과이며, 여과에 필요한 시간이 7분 이상에서부터 금 나노입자의 색인 적색이 사라지는 것을 확인하였고, 금 나노입자가 시간별로 응집되는 크기를 DLS로 추적한 결과, 여과지의 구멍 크기인 약 0.45 ㎛ 까지 커지는데 걸린 시간이 약 7분으로 나타난 것을 통하여 최종적으로 여과에 필요한 반응시간을 7분으로 결정한 결과이다.

도 9는 본 발명에 따라, 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집시스템을 활용한 현장용 유해물질 검출키트를 이용하여 Salmonella Typhimurium을 검출한 결과를 나타낸 것이다. 본 검출법의 민감도를 확인한 결과, 시료 100 ㎕ 당 살모넬라 균 10 CFU 이하부터 10⁶ CFU까지 검출할 수 있음을 확인하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

10: 3-방향 밸브 11: 저장챔버
12: 반응챔버 13: 밸브 손잡이
14: 저장챔버 개구 15: 반응챔버 개구
16: 마개
20: 주입 기구
30: 여과기
31: 배출관 32: 여과지
33: 원통 34: 반응물 유입관
40: 가압기구
50: 검출확인 용기

Claims (6)

1. 변환기능 링커 기반의 금 나노입자의 응집 시스템을 이용한 현장용 유해물질 검출키트로서,
   외측 단부가 개방되어 있고 상기 금 나노입자가 충전되어 있는 저장챔버(11), 양단부가 개방되어 있고 상기 저장챔버(11)의 내측 단부와 연결되어 있으며 상기 변환기능 링커가 충전되어 있는, 피검물을 주입하기 위한 반응챔버(12), 밸브가 개방되었을 때 금 변환기능 링커와 금 나노입자와 피검물이 접촉 반응하도록 반응챔버(12)의 중앙에는 반응챔버(12)와 저장챔버(11)의 내측 단부를 연통 또는 폐쇄하기 위한 밸브를 가지며, 상기 저장챔버(11)의 외측 단부에 형성되어 있는 저장챔버 개구(14)와 상기 반응챔버(12)의 양측에 형성되어 있는 반응챔버 개구(15)를 밀폐하기 위한 마개(16)를 갖는 3-방향 밸브(10);
   상기 피검물을 상기 반응챔버(12)에 주입하기 위한 주입 기구(20);
   원통(33), 상기 원통(33) 중심부에 내부와 연통되어 상기 금 변환기능 링커와 금 나노입자와 피검물의 반응물이 유입되는 반응물 유입관(34), 상기 원통(33)의 바닥 중앙에 연통되도록 연결되어 있는 여액 배출관(31), 및 원통(33) 내에 내장되는 여과지(32)를 갖는 여과기(30);
   상기 반응물의 여과를 용이하게 하도록 상기 반응챔버(12) 내의 반응물을 가압하기 위한 가압기구(40); 및
   여액을 수용하여 시각적으로 신호를 확인하기 위한 검출확인 용기(50);
   를 포함하는 현장용 유해물질 검출키트.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 주입 기구(20)가 피펫 또는 스포이드이고, 상기 가압기구(40)가 시린지이고, 상기 검출 확인 용기(50)가 종이, 유리병, 바이얼, 또는 튜브인 것을 특징으로 하는 현장용 유해물질 검출키트.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 여과지(32)의 기공 크기가 0.45 ㎛ 이하이고, 그 재질이 단백질과의 결합력이 약한 특성을 갖는 폴리비닐리덴 플루오라이드인 것을 특징으로 하는 현장용 유해물질 검출키트.
4. 현장용 유해물질 검출키트를 이용한 유해물질 검출방법으로서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유해물질 검출방법:
   3-방향 밸브(10)의 저장챔버 개구(14)를 통해 금 나노입자를 저장챔버(11)에 충전한 후 저장챔버 개구(14)를 마개(16)로 밀봉하는 단계(S1);
   주입기구(20)를 사용하여, 반응챔버(12)의 일측 개구(15)가 폐쇄된 상태에서 변환기능 링커를 주입한 다음, 반응챔버 개구(15)를 다시 개방하여 상기 반응챔버 개구(15)를 통해 피검물을 반응챔버(11)에 주입한 후 마개(16)로 밀봉한 후, 상기 3-방향 밸브(10)를 흔들어 주어 변환기능 링커와 상기 피검물을 1차 반응시켜 1차 반응물을 얻는 단계(S2);
   상기 저장챔버(11)와 상기 반응챔버(12)가 연통되도록 3-방향 밸브(10)의 밸브를 열어 흔들어 줌으로써 상기 저장챔버(11) 내의 금 나노입자와 상기 반응챔버(12) 내의 1차 반응물과 2차 반응시켜 2차 반응물을 얻는 단계(S3);
   검출확인 용기(50)에 여과기(30)의 배출관(31)을 넣고, 상기 여과기(30)의 2차 반응물 유입관(34)에 반응챔버(12)의 일측 개구(15)를 삽입한 후 타측 개구(15)에 가압기구(40)를 삽입 및 가압하여 2차 반응물을 여과하는 단계(S4); 및
   여과기(30)의 배출관(31)을 통해 검출확인 용기(50) 내로 여과되어 수납된 여액에 대해 색상을 식별하는 비색확인 단계(S5).
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 단계(S2) 및 단계(S3)에서의 반응 시간이 각각 15분∼1시간 및 5∼10분인 것을 특징으로 하는 유해물질 검출방법.
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 여액의 색상에 있어서 적색과 투명한 색의 색 차이에 의해 유해물질의 존재여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 유해물질 검출방법.
   
   

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